isolamento de linhagens de bactérias láticas de

ISOLAMENTO DE LINHAGENS DE BACTÉRIAS LÁTICAS DE PRODUTOS
VEGETAIS PROVENIENTE DA REGIÃO DO SEMI-ÁRIDO BAIANO,
VISANDO A SUA UTILIZAÇÃO EM PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS.
Ana Paula OLIVEIRA1, Elinalva Maciel PAULO2, Ivelise SANTIAGO³
1
Bolsista PROBIC/UEFS, Graduanda do curso de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana,
email: [email protected]
2
Orientadora: Docente do Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, email:
[email protected]
³Participante do Projeto, Graduada em Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Feira de Santana, email:
[email protected]
Palavras chave: Semiárido, bactérias láticas, isolamento bacteriano.
Introdução
A região do semiárido baiano é considerada um ambiente extremófilo, contendo
uma vasta biodiversidade de micro-organismos. Dentre eles destacam-se os microorganismos pertencentes ao grupo das bactérias láticas. Estas possuem potencial
biotecnológico de grande interesse industrial (PAULO, 2010).
A importância de tais bactérias reside no fato da maioria delas serem seguras para
consumo humano, não causando enfermidades aos consumidores, razão pelo qual são
bastante utilizadas como culturas iniciadoras em alimentos fermentados, como produtos
probióticos, bioconservantes de alimentos e como inibitórios de patógenos causadores
de infecção alimentar (PAULO, 2010).
Os vegetais são um meio adequado para o crescimento destes micro-organismos.
Esse crescimento é favorecido também pela alta atividade de água, baixa acidez e
potencial de oxi-redução relativamente alto dos vegetais (FRANCO, 2002). O pH destes
produtos não favorece, em geral, a proliferação de micro-organismos, principalmente os
patogênicos, podendo haver apenas desenvolvimento de micro-organismos deteriorantes
como bolores, leveduras, bactérias lácticas e outros microrganismos ácido tolerantes
como bactérias acéticas. (TORREZAN, 2000).
Numa perspectiva biotecnológica, as BAL têm um potencial de aplicação
diversificado, desde o controle do processo fermentativo na produção de alimentos
fermentados até a sua utilização como probióticos na saúde humana e animal (INÊS et
al., 2008). De acordo com o exposto este trabalho tem como objetivo obter bactérias
láticas provenientes da biodiversidade microbiana da região do semiárido baiano com o
intuito de utilizá-las como cultura "starter" na elaboração de produtos fermentados
derivados do leite.
Materiais e métodos
Foi utilizado a uva como substrato para isolamento das BAL. A amostra foi
coletada em feira-livre localizada na cidade de Feira de Santana-BA, uma cidade
integrante do semiárido baiano. Todos os procedimentos de coleta e transporte da
amostra foram realizados de forma asséptica.
Isolamento e caracterização morfo-fisiológica dos isolados de Bactérias Láticas
O isolamento das BAL procedeu-se de acordo com Paulo (2010), onde foi
utilizado o meio DE MAN, ROGOSA e SHARPE - MRS (1960).
Inicialmente realizaram-se testes preliminares de identificação de bactérias
láticas que consistiu em: coloração de Gram, teste da catalase e redução do nitrato a
nitrito. Em seguida, realizaram-se alguns testes de caracterização bioquímica dos
isolados: produção de gás a partir da glicose; lactofermentação a 15ºC, 35ºC e 45ºC;
tolerância bacteriana ao cloreto de sódio em diferentes concentrações (4%, 6% e 8%);
produção de amônia a partir da arginina; fermentação de diferentes carboidratos
(CHAVES, 1999). Todos os testes foram realizados em triplicatas.
Caracterização molecular dos isolados de Bactérias Láticas
A caracterização molecular foi realizada através do sequenciamento do
gene 16S. Para tal, procedeu-se a extração de DNA, Reação em Cadeia de Polimerase
(PCR) e Eletroforese, seguindo os procedimentos de Moitinho (2013). As amostras
obtidas foram sequenciadas no GenBank pelo programa BLAST.
Resultados e Discussões
No primeiro teste não houve crescimento de bactérias láticas, sendo observado
apenas o crescimento de leveduras que pode ser justificado pelo baixo pH (1,5) que a
amostra possuía antes da diluição. No segundo teste foi adicionado o suco de uva
comercial diluído que contém anti-fúngicos (sorbato de potássio) utilizado com o
objetivo de inibir o crescimento de leveduras. Foi adicionado também 2% de frutose
que de acordo com Stamer (1970) é responsável pelo início do crescimento das BAL.
Porém, foi observado um crescimento pequeno de BAL, talvez por conta da
concentração do sorbato de potássio. No terceiro teste foi utilizado o suco de uva
comercial diluído em 40% e 2% de frutose, o que possibilitou um maior crescimento de
BAL na amostra. O pH também foi de grande importância para o crescimento destes
micro-organismos, pois inicialmente encontrava-se a 1,5 e foi corrigido para 5,0 no
segundo e terceiro teste.
Segundo Inês et al., (2008), o pH é um dos parâmetros mais importantes que
afeta o comportamento das BAL na uva, influenciando a duração da fase de latência, a
taxa de crescimento e consequentemente a duração da FML (Fermentação Malolática),
as espécies que crescem no vinho, o seu comportamento metabólico e a sua
sobrevivência. O etanol, metabolito principal resultante da FA (Fermentação Alcoólica)
por Saccharomyces cerevisiae, também afeta os parâmetros de crescimento das BAL e a
sua atividade maloláctica. A capacidade de sobrevivência e crescimento das BAL
decresce à medida que as concentrações de etanol aumentam (WIBOWO et al., 1985).
Devido as dificuldades para isolamento, foram obtidas apenas 9 colônias da
Uva, sendo estas purificadas no meio MRS através do método de semeadura em estria
composta com esgotamento de inoculo. Dentre as 9 colônias isoladas, 7 foram bacilos
Gram-positivos, 2 foram cocobacilos Gram-positivos e todos os isolados apresentaram
catalase negativa. Os isolados foram preservados em meio LEL (Leite extrato levedura)
e acondicionados imediatamente no ultra freezer, para testes posteriores (PAULO,
2010). De acordo com os critérios de Chaves (1999), no teste de produção de gás a
partir da glicose, 7 isolados foram considerados homofermentativos, por não
produzirem gás e 2 isolados foram consideradas heterofermentativos, por produzirem
gás.
No teste de lactofermentação apresentado, observa-se que dos 9 isolados, todos
cresceram a 35ºC, sendo todos os integrantes do grupo das bactérias láticas que são
considerados essencialmente mesófilicos. Nas demais temperaturas houve variação dos
isolados com relação ao crescimento neste substrato; crescimento a 15ºC e a 45°C,
crescimento a 15ºC, mas não a 45ºC, crescimento a 45ºC, mas não a 15ºC. Também
neste teste de lactofermentação foram observadas algumas características importantes
para identificação dessas bactérias láticas, a saber; aspecto do crescimento no meio
LDR 10%, produção de soro, aspecto do coagulo (firme ou caseínoso) e produção de
gás nas diferentes temperaturas. As informações de crescimento das bactérias láticas no
leite são importantes para a escolha da linhagem que devera ser utilizada na elaboração
dos tipos de produtos derivados de leite fermentado.
No teste de tolerância bacteriana ao cloreto de sódio apresentou crescimento de
todos os isolado a 4 %, 6% e 8%, podendo assim serem classificados como halófilos.
Segundo Poffo (2011), as taxas de crescimento de algumas bactérias tendem a aumentar
com o aumento da concentração salina. No teste da arginina apenas 2 isolados
produziram amônia. A capacidade das culturas de fermentar diferentes carboidratos foi
testada como descrita por Davis (1955) (Tabela 1), sendo crucial para a identificação
dos isolados. Os resultados obtidos foram classificados segundo o Manual Bergey.
Desta forma identificou-se que os isolados possam pertencer aos gêneros Lactobacillus
e Leuconostoc.
TABELA 1: Fermentação em diferentes açúcares
Amostras
A
B
C
D
E
F
G
+
+
+
+
+
+
U103
+
+
+
+
+
+
U203
+
+
+
+
+
+
U204
+
+
+
+
+
+
U205
+
+
+
+
+
+
U206
+
+
+
+
+
+
U207
+
+
+
+
+
+
MC4
+
+
+
+
+
+
MC7
+
+
+
+
MC8
A-Arginina. B-Manitol. C-Esculina. D-Lactose. E-Arabinose. F-Trealose. G-Sorbitol. H-Amido.
H
-
Para a realização da identificação molecular foram selecionadas as estirpes que
tiveram a identificação fenotípica referente ás bactérias de interesse na produção de
produtos fermentados. Após a extração do DNA foi feita uma eletroforese para
confirmação, prosseguindo com a realização da PCR, sendo realizada outra eletroforese
para confirmar a amplificação.
As bactérias foram identificadas no GenBank pelo programa BLAST como
mostra o resultado na tabela 2.
Tabela 2. Identificação das sequências.
Amostra
Linhagem Identificada
U103
MC08
Acetobacter malorum
Staphylococcus sp. clone CH2
Percentual de
identificação
95
97
Na identificação fenotípica os isolados U103 e MC08 foram identificados como
pertencentes ao grupo de bactérias láticas. No entanto, na identificação molecular foi
encontrada alta similaridade destes isolados para as bactérias Acetobacter malorum e
Staphylococcus sp. clone CH2, respectivamente. O gene 16S rRNA é uma região
altamente conservada entre diferentes especies de bacteria e archaea, sendo este gene
usado para estudos filogenéticos (WEISBURG, 1991). Por ser um primer universal pode
ter acontecido o fragmento de DNA extraído das bactérias láticas possuírem sequências
de nucleotídeos de alta similaridade com as espécies encontradas.
Considerações Finais
As bactérias do ácido lático isoladas da Uva são utilizadas na elaboração de
diversos produtos, a saber, bebidas láticas ou alcoólicas fermentadas, constituindo
serem de grande potencial biotecnológico.
Os resultados da identificação molecular não foram congruentes com os
resultados da identificação fenotípica, isso pode ter acontecido porque foram utilizadas
regiões intergênicas universais para bactérias.
Sendo o grupo das Bactérias Láticas constituído por espécies diversas, sugere-se
que sejam construídos primers específicos para o grupo das BAL e que se realize novos
processos de amplificação e sequenciamento do DNA destas estirpes.
Referências Bibliográficas
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Bezerros. Rev. bras. zootec., v.28,n.5, p.1086-1092, 1999.
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Geberal Microbiology, 13: 481-93, 1955.
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Alimentos. Editora Atheneu, São Paulo, 2002.
INÊS, A., Tenreiro, T., Tenreiro, R., Mendes-Faia, A. (2008), Revisão: As bactérias
do ácido láctico do vinho – Parte I, Ciência Técnica Vitivinícola 23, 81-96.
PAULO, E. M. Produção de exopolissacarídeos (EPS) por bactérias láticas visando
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drying. 2010. Tese 212f. (Doutorado em Biotecnologia), Departamento de Ciências
Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana, 2010.
POFFO, F. SILVA, Marcus A. C. Caracterização taxonômica e fisiológica de
bactérias ácido-láticas isoladas de pescado marinho. Cienc. Tecnol. Aliment.,
Campinas, 31(2): 303-307, abr.-jun. 2011
STAMER J.R., 1979. Food Technology, chapter The lactic acid bacteria: microbes
of diversity, pp. 60-65.
TORREZAN, R. EIROA, M. N. U. PFENNING, L. Identificação de microorganismos isolados em frutas, polpas e ambiente industrial. B.CEPPA, Curitiba, v.
18, n. 1, p. 2738, jan./jun.2000
WEISBURG, W.G. BARNS, S. M. PELLETIER, D. A. LANE, D. J. 16S ribosomal
DNA amplification for phylogenetic study. J Bacteriol. 173 (2): 697–703. January,
1991.
WIBOWO D., Eschenbruch R., Davis C., Fleet G., Lee T., 1985. Occurrence and
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