Biogeociclos: Uma visão molecular das enzimas e dos mecanismos

Biogeociclos: Uma visão molecular das
enzimas e dos mecanismos envolvidos
nos ciclos dos elementos - Parte III
CARLA CARNEIRO* E JOSÉ J . G MOURA '
Parte III: Biogeociclo do
Hidrogénio e do Carbono
Título corrente: Biogeociclos dos elementos
dência as partes dos ciclos para os
lares de organismos: nos metanogéni-
quais existe um conhecimento detalha-
cos (Methanobacterium, Methanococ-
do da estrutura tridimensional do bioca-
cus e Methanosarcina sp.), pois o H2 é
talisador envolvido. Mais ainda, são
essencial à sua sobrevivência; em orga-
apresentadas hipóteses mecanísticas
nismos que se podem adaptar e utilizar
Palavras chave: Ciclos dos elementos,
que resultam, muitas delas, da análise
o H, como única fonte de energia (R.
Azoto, Enxofre, Hidrogénio, Carbono
estrutural. Os avanços da biologia mole-
europha, B. japonicum, R. capsulatus);
cular e das técnicas de análise estrutu-
em organismos fixadores de azoto (Rhri-
ral permitem, que neste momento, haja
zobium, Anabaena, Azotobacter e Fran-
Nota prévia
disponível um conjunto de informação
kia sp.) ou ainda, dadas as interelações,
Este a rt igo é a parte Ill de uma série de
que permite uma análise detalhada das
entre o metabolismo do H 2 e outros pro-
artigos publicados neste Boletim que
relações estrutura e função dos biocata-
cessos bioquímicos e fisiológicos. Para
pretendem dar uma visão molecular es-
lisadores que controlam as transforma-
os fixadores de azoto, o H2 é tanto um
trutural e mecanísticas das enzimas en-
ções occorentes nos ciclos.
produto obrigatório, como um potencial
volvidas nos principais ciclos dos ele-
O a rt igo é dividido em 3 pa rt es:
inibidor da redução do N 2 pela nitroge-
1 — Biogeociclo do AZOTO
aumentar a eficiência da fixação do N2
... a circulação dos elementos químicos
2 — Biogeociclo do ENXOFRE
(hipótese de reciclagem do H 2 ). Compa-
no planeta é um processo complexo
3 — Biogeociclo do HIDROGÉNIO e do
mentos.
nase; assim, as hidrogenases podem
Relembrando que foi dito anteriormente
com muitas e variadas ve rt entes. Os vá-
rativamente com os procariotas existem
CARBONO
rios ciclos elementares são muito mais
tante para algumas ordens, tais como:
do que simples reacções químicas. São
em parte biológicos e em parte geoquí-
3. Ciclo do Hidrogénio
micos, pois envolvem a participação de
3.1. Introdução
microrganismos e estão associados a
grupos de elementos metálicos. Uma
variedade de enzimas e múltiplos transportadores electrónicos (que com estas
interactuam) asseguram a catálise,
passo a passo, por formação de intermediários chave.
poucos estudos em eucariotas apesar
do facto da produção de H2 ser impor-
Vários aspectos do metabolismo do hi-
protozoários anaeróbios, algas verdes
unicelulares e alguns fungos anaeróbios
(Robson, 2001).
3.2. Hidrogenases
drogénio têm sido estudados, com
algum detalhe, em cerca de sessenta
São conhecidas pelo menos 13 classes
espécies, na sua maioria organismos
de hidrogenases. Todas, à excepção de
procariotas com uma gama de funções
uma estão directa ou indirectamente
alargada que inclui: aeróbios e anaeró-
envolvidas no metabolismo energético e
bios, autotrófos e heterotrófos, fotossin-
podem ser classificadas com base na
téticos, metanogénicos, redutores do
sua função fisiológica em consumidoras
aspectos estruturais das enzimas envol-
sulfato, fixadores de azoto, organismos
ou produtoras de H2. As consumidoras,
vidas nos ciclos dos elementos. Os ci-
fermentativos, hipertermófilos, protozoá-
catalisam a oxidação do H 2 acoplada a
clos não são apresentados de modo
rios, parasitas e fungos anaeróbios. O
reacções de conservação de energia (fo-
exaustivo, mas procura-se pôr em evi-
estudo tem incidido em classes particu-
tossíntese, respiração, formação de
É objectivo desta série de a rt igos rever
1
REQUIMTE, Depa rtamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, 2829-516 Monte de Caparica, Po rt ugal
Morada: Professor José J. G. Moura, Depa rtamento de Química, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, Quinta da Torre, 2829516 Monte de Caparica, Portugal. Tel: +351-21-2948382, Fax: +351-21-2948550, e-mail: [email protected], web www.dq.fct.unl.pt/bioin/
Morada presente: Depa rtamento de Sistemas e Informática, Escola Superior de Tecnologia, Instituto Politécnico de Setúbal, Rua Vale de Chaves, EstefaniIha, 2910-761 Setúbal.
48
QuÌMICA
A
temente, não necessitam desta enzima
Glucose
(Robson, 2001).
As hidrogenases catalisam a activação
reversível do hidrogénio molecular, de
r
transportadores
electrónicos (oxd)
acordo com a seguinte equação:
H2
H2r=>2H'+2e
transportadores
electrónicos (red)
ATP
H'
Todas, com excepção de duas famílias,
são metaloenzimas contendo, centros
de Fe-S e/ou centros de NiFe (com propriedades de coordenação não usuais)
ou grupos hémicos. Algumas contêm
Piruvato
também grupos prostéticos não metálicos, FAD e FMN. Todas as metalo
CoA
drogenases contêm Fe e/ou Ni e podem
transportadores
electrónicos (oxd)
C O,
hi-
J
H2
ser divididas em duas classes: as que
contêm apenas ferro (FeH) e as que
transportadores
electrónicos (red)
contêm níquel e ferro (NiFeH). As pri-
H+
meiras são bidireccionais e as segundas
efectuam essencialmente a oxidação do
H 2 (Lemon e Peters, 2001; Robson,
2001; Moura et al., 1998; Pereira,
Acetil-CoA
2001; Carepo, 2002).
Os organismos contendo estes dois
H2
B
2H'
2e-
Metanogénese
Acetogénese
Desnitrificação
Redução do azoto
Fotossíntese
Redução do sulfato
Redução do enxofre
Redução do fumarato
tipos de hidrogenases geralmente coexistem em nichos anaeróbios, impedindo a acumulação de H2. A relação simbiótica existente entre um organismo
autotrófico, um produtor de H2 e de CO
e um hospedeiro que utilize o H2 e
o CO
para produção de adenosina trifosfato
(ATP) e metano, constitui a base de evo-
figura 1. (A) Função fisiológica das hidrogenases produtoras de hidrogénio no catabolismo da
glucose a acetil-CoA. (B) Papel das hidrogenases consumidoras de hidrogénio como fonte de
equivalentes redutores noutros processos metabólicos (Adaptado de Lemon e Peters, 2001).
lução dos eucariotas (Frey et al., 2001;
Lemon e Peters, 2001).
A principal função das hidrogenases em
bactérias anaeróbias é a regeneração da
NAD(P)H, redução do azoto ou do sul-
transporte electrónico, fotossintética e
fato, metanogénese); as produtoras de
respiratória (Frey et al., 2001; Lemon e
H2, catalisam a redução de H' acoplada
Peters, 2001; Robson, 2001).
à eliminação de excesso de poder redutor através da re-oxidação de nucleotídeos de piridina reduzidos e transporta-
Em alguns organismos o papel das hi-
forma oxidada dos transportadores electrónicos gerada em caminhos catabólicos. O H2 produzido neste ciclo pode ser
utilizado como fonte de energia noutros
drogenases é ainda mais relevante pelo
processos metabólicos em que o H2
facto destes possuirem mais do que
serve como fonte de electrões, em pro-
dores electrónicos (figura 1). No
uma hidrogenase: em E. coli e M. voltae
entanto, duas outras funções foram atri-
são conhecidas quatro, em D. vulgaris e
buídas, nos últimos anos, às hidrogena-
R. eutropha três. Muitos sistemas
ses: uma família parece funcionar como
podem ser expressos simultaneamente,
sensor de um complexo genético que
mas noutros, as enzimas são expressas
controla a expressão de outras hidroge-
diferencialmente dependendo das con-
nases e a outra, as hidrogenases bidi-
dições de crescirnento. Outros organis-
sulfato e nitrato e as hidrogenases
reccionais, que podem servir como tam-
mos possuem apenas uma hidrogenase
estão normalmente associadas a trans-
porizadores redo X da cadeia de
(A. vinelandii) e muitos outros, aparen-
portadores electrónicos de membrana.
cessos redutivos tais como a fixação do
azoto molecular. Quando o H2 é utilizado na produção de ATP, esta está acoplada à redução de pequenas moléculas, tais como o dióxido de carbono,
QUÍMICA 49
3.2.1. Hidrogenases contendo
ferro (FeH)
As FeH são encontradas exclusivamente em organismos anaeróbios estritos,
razão pela qual, são rápida e irreversivelmente inibidas pelo oxigénio (Albracht, 2001). Estão também presentes
em D. vulgaris, um redutor do sulfato, e
no organismo sacarolítico C. pasteuria-
num nos quais, a enzima actua tanto no
consumo como na produção de H2.
Apesar de estruturalmente relacionadas, as FeH, apresentam diferenças
quanto ao número de centros de Fe-S e
podem, genericamente, ser divididas
em dois grupos: um caracterizado por
um conteúdo de aproximadamente 14
átomos de Fe/mole de enzima e o segundo, representado pelas hidrogenases com 20 átomos de Fe/mole. São, em
geral, heterodímeros a(3, enzimas penplasmáticas (D. desulfuricans, D. vulga-
ris) ou citoplasmáticas (C. pasteurianum). C. pasteurianum possui duas
figura 2. Representação esquemática da FeH de C. pasteurianum. Os co-factores estão
representados por modelos "stick and ball" (Adaptado de Lemon e Peters, 2001).
hidrogenases, Cpl e Cpll, distintas pela
sua preferência na redução do protão
A FeH de C. pasteurianum (Cpl) (figura
protónicos (Lemon e Peters, 2001).
ou oxidação do H2.
2), uma enzima monomérica de 60 kDa,
Para a FeH dimérica de D. desulfuri-
Foram obtidas as estruturas de Raios-X
para duas FeH, a de C. pasteurianum
(Peters et at., 1998) e a de D. desulfuri-
está organizada em quatro domínios:
cans, a subunidade maior inclui o sítio
um designado activo e três acessórios.
activo e o domínio tipo Fd, enquanto
O domínio activo, o maior (correspon-
que a mais pequena está enrolada á
cans (Nicolet etal., 1999). As FeH de C.
dente a dois terços da proteína global)
pasteurianum e de D. desulfuricans
coordena o sítio activo, um centro bime-
possuem em comum um domínio, que
tálico com dois átomos de ferro, o agre-
contém o sítio activo e três centros de
gado H, e os domínios acessórios alber-
[4Fe-4S], mas diferem no facto da pri-
gam os restantes centros de Fe-S,
meira ser citoplasmática e constítuida
possivelmente envolvidos no transpo rt e
bunidade menor, necessário para a
por uma única cadeia polipeptídica e a
electrónico de/para o sítio activo. Dois
translocação da proteína para o espaço
segunda ser periplasmática e composta
resíduos adjacentes, uma cisteína e
periplasmático (Fontecilla-Camps et al.,
por duas subunidades.
uma lisina, funcionam como doadores
2001).
volta da molécula e é semelhante ao Cterminal da Cpl. A diferença na estrutura quaternária deve-se à existência de
um peptídeo sinal, no N-terminal da su-
figura 3. 0 agregado H de C. pasterianum (A) e de D. desulfuricans (B) (Adaptado de Lemon e Peters, 2001).
5O
I QUÍMICA
figura 4 Disposição espacial e possível percurso electrónico entre o
agregado H e os centros de Fe-S mais próximos da superfície na FeH
de C. pasteurianum (Adaptado de Lemon e Peters, 2001)
No domínio activo, o agregado H está lo-
cluem a ligação em ponte, por uma cis-
atribuídos com base na semelhança es-
calizado na base de uma abertura for-
teína (Cis382), entre os sub-agregados,
trutural de dois deles, com ferredoxinas
mada por dois lóbulos essencialmente
2Fe e 4Fe. No sub-agregado 2Fe, os
conhecidas. O N-terminal contém o
equivalentes, consistindo cada um
átomos de ferro estão ligados por dois
centro de [2Fe-2S1 e é composto por
deles em quatro folhas
enxofres em ponte mas pertencem a
apenas duas folhas 13 perpendiculares e
R
torcidas, ro-
deadas por hélices a. As quatro cisteí-
uma molécula de 1,3-propanoditiol; um
uma única hélice a; os ligandos, quatro
nas, que funcionam como ligandos,
oxigénio, coordenado assimetricamente
cisteínas, pe rt encem ao "loop" que liga
estão localizadas nos "loops" que ligam
a um dos ferros pode eventualmente
uma das folhas
as folhas (3 individuais. O agregado H (fi-
funcionar como o ligando em ponte (em
proximal do N-terminal contém um cen-
gura 3A) pode ser considerado como
substituição do ligando CO em ponte). A
tro de [4Fe-4S] (FS4C), coordenado por
sendo formado por um sub-agregado de
diferença mais significativa entre as
três cisteínas e uma histidina (His94)
[2Fe-2S] (2Fe) ligado a um sub-agrega-
duas estruturas prende-se com a posi-
envolvida na modelação do potencial
do de [4Fe-4S1 (4Fe) por uma cisteína
ção de coordenação vaga no átomo de
deste centro, de modo a facilitar a trans-
em ponte (Cis503). No sub-agregado de
ferro distal do agregado H. Para Cpl o
ferência electrónica de/para o agregado
2Fe, os átomos de ferro estão coordena-
ferro está coordenado por uma molécu-
H e parceiros electrónicos. O domínio
dos por dois ligandos diatómicos, não
la de água, duas moléculas diatómicas e
anterior, está ligado ao domínio catalíti-
R à hélice a. O domínio
proteícos (uma molécula de CO e outra
três ligandos em ponte. Em D. desulfu-
co por um domínio que contém os ou-
de CN) e estão ligados em ponte por
ricans existe uma posição de coordena-
tros dois centros de [4Fe-4S], FS4B e
dois enxofres e uma molécula adicional
ção vaga, no que se propõe ser o estado
FS4A, coordenados exclusivamente por
de CO. Esta molécula diatómica serve
reduzido da FeH, pelo que a estrutura
cisteínas. O arranjo espacial dos centros
para afinar as propriedades electrónicas
obtida para Cpl representa a forma oxi-
sugere a existência de um percurso
do ferro na activação do H 2 , o mesmo
dada. A verificar-se o proposto, as dife-
electrónico entre estes e o agregado H.
acontecendo nas NiFeH. O ferro distal
renças observadas podem ser atribuí-
Existem, contudo, dois caminhos alter-
do subagregado 2Fe, está ainda ligado a
das às diferentes condições de
nativos, que ligam o agregado H a doa-
uma molécula de água que desempe-
cristalização (os cristais de D. desulfuri-
dores/aceitadores externos: através dos
nha uma função catalítica (Lemon e Pe-
cans foram preparados na presença de
centros FS2 ou FS4C, via FS4A e FS4B
ters, 2001).
ditionito e hidrogénio como agentes re-
(figura 4) (Lemon e Peters, 2001).
O agregado H de D. desulfuricans (figura 3B) apresenta características co-
dutores) (Fontecilla-Camps etal., 2001;
Lemon e Peters, 2001).
Um possível mecanismo para a oxidação do H2 pode envolver a libertação da
muns com o descrito anteriormente
Os três domínios que contêm os agrega-
molécula de água ligada ao ferro distal
para Cpl mas, existem diferenças im-
dos adicionais de Fe-S, três centros de
do centro 2Fe e concomitante ligação
portantes a registar. As semelhanças in-
[4Fe-4S1 e um centro [2Fe-2S1, foram
do H2 formando hidreto. Os electrões do
QUÍMICA
figura 5. Representação esquemática da NiFeH de D. gigas. Os cofactores estão representados por modelos "stick and ball" (Adaptado de
Frey et al., 2001).
de oxi-
H2 seriam então transferidos a partir do
pelo substrato (o H 2 ) na ausência
centro 2Fe para o centro 4Fe e, daqui,
génio (Albracht, 2001; Robson, 2001).
através dos agregados adicionais, para o
aceitador final. A Cis299 e a Lis358 funcionariam como doadores de protões. O
mecanismo de produção do H2 é menos
claro. Apesar de reconhecida a importância do ligando permutável do ferro
distal na catálise, a protonação envol-
Aparentemente, as NiFeH e as FeH, não
Com quatro estruturas disponíveis, D.
cia de aminoácidos, no entanto, o sítio
gigas (Volbeda et al., 1995), D. vulgaris
activo parece ser semelhante. As hidro-
(Higuchi etal., 1997), D. fructosovorans
genases, sensora de H2 e bifuncional,
(Montet et al., 1997), D. desulfuricans
são também NiFeH (Robson, 2001).
(Matias et al., 2001) e Dm. Baculatum,
As NiFeH são heterodímeros que parti-
dada a pa rt icipação de dois ácidos de
lham duas subunidades em comum: a
Lewis (Lemon e Peters, 2001).
maior (a) que contém o sítio activo, um
e ferro (NiFeH)
2001).
são relacionadas em termos da sequên-
vendo uma espécie metal-hidreto é rara,
3.2.2. Hidrogenases contendo níquel
R. capsulatus, A. vinelandii, W. succinogenes) (Frey et al., 2001; Robson,
centro binuclear de Ni-Fe, e a mais pequena (13) que geralmente contém três
uma NiFe(Se)H (Garcin et al., 1999), a
estrutura de D. gigas, a primeira a ser
determinada, é considerada o protótipo
destas enzimas (Fontecilla-Camps et al.,
2001).
centros de Fe-S, dois centros de [4Fe-
A estrutura de Raios-X da NiFeH de D.
As NiFeH são um grupo mais diverso,
4S] e um centro de [3Fe-4S]. Apesar da
gigas (figura 5) revela um heterodímero,
do que as FeH, e estão presentes em or-
variabilidade no que diz respeito à com-
de forma globular, extremamente com-
ganismos anaeróbios e aeróbios, tais
posição das subunidades, a subunidade
pacto em resultado de inúmeras inte-
como redutores de sulfato, chemohete-
de Ni é conservada. São enzimas peri-
racções entre a subunidade maior e a
rotróficos, chemolitotróficos, metanogé-
plasmáticas (género Desulfovibrio) ou
menor. A subunidade maior coordena,
nicos e fototróficos. Apesar da inactiva-
podem estar em interacção com a face
para além do sítio activo, o centro binu-
cão pelo oxigénio, a maioria destas
exterior da membrana citoplasmática
clear de Ni-Fe, um ião magnésio (Mg 2 1
enzimas pode ser activada por redução,
(em B. japonicum, E. coli, R. eutropha,
no C-terminal (ou um ferro como em
A
B
figura 6. Estruturas do sítio activo de diferentesNiFe A) hidrogenase de
D. gigas no estado nativo B) hidrogenase de D. vulgaris M estado nativo
C) hidrogenase NiFeSe de Dm baculatus reduzida D) hidrogenase de D.
vulgartis M reduzida. A verde está representado o Ni, a vermelho o Fe,
a amarelo o S. O C a cinzento, a azul o N e a lilás o O. (coordenadas
retiradas do PDB).
c
o
51
52
I QUÍMICA
Ni -A
Ni -B
H'.c
Fite'
rip do
ka no
né
Ni -SU Levi&
n opid•
— Ni SI,
dois distantes, numa geometria pirâmi-
O mapa de densidade electrónica da es-
de quadrangular muito distorcida, en-
trutura refinada a 2,54
quanto que o átomo de ferro possui seis
a existência de densidade electrónica,
ligandos numa geometria octaédrica
na posição em ponte entre os dois me-
distorcida. Três dos ligandos do ferro
tais, revelando um outro ligando em
são moléculas diatómicas, dois CN (en-
ponte entre o Ni e o Fe. A natureza
volvidos em ligações por pontes de hi-
deste ligando em ponte tem sido sujeita
-
activaçAo
redutiva
11 2
Ni-L
n^ ur°
1I' é yo. + H
Ni-C)
H',f
ree;klu ^
M,,d
(Ni -R)
A mostrou ainda
drogénio com a proteína) e um CO
a debate, tendo no entanto sido propos-
(completamente rodeado por resíduos
to tratar-se de uma espécie oxigenada,
hidrofóbicos). Um ligando g-oxo (deriva-
baseado em estudos anteriores de EPR
do do 0 2 ), em ponte entre os metais
de 17 0 e ENDOR que revelaram a exis-
completa a esfera de coordenação. O
tência de alargamento de linha dos si-
ião magnésio, no C-terminal, possui
nais de Ni nos estados inactivos do en-
uma coordenação octaédrica. Os ligan-
zima (Ni-NB).
dos, são três moléculas de água, um
figura 7. Intermediários estáveis e respectivas
interconversões na NiFeH de D. gigas
A estrutura tridimensional da NiFe de D.
glutamato (G1u46), um grupo carbonilo
vulgaris M foi obtida com uma resolução
(Adaptado de Frey et al., 2001).
da cadeia principal e uma histidina
de 1,8
(His536) (Frey etal., 2001).
centro activo é muito semelhante ao ob-
Dm. baculatus). Na subunidade menor,
A estrutura de Raios-X da hidrogenase
servado para a hidrogenase de D.Gigas.
A
de D. Gigas foi obtida inicialmente com
As diferenças observadas são relativas
os três centros de Fe-S, a cerca de 12
A e o sistema de coordenação do
de distância e num arranjo quase linear,
uma resolução de 2,85
A, e revelou que
aos ligandos diatómicas do Fe, quenes-
formam um corredor interno que permi-
o centro activo da enzima era um centro
ta altura foram identificadas como um
te a transferência de electrões, entre o
heterodinuclear de Ni e outro metal. A
SO, uníco e um CN . Também o ligando
sítio activo e um transportador específi-
natureza do segundo metal no sítio acti-
em ponte é, neste caso, proparo tratar-
co, um citocromo b ou c. Uma cisteína
vo, só ficou clara após resolução da es-
(Cis533) em ponte no sítio activo, ligan-
trutura a 2,54
do apical do níquel, pode estar envolvi-
banda-0 de 57 Fe , tendo este sido identi-
da na catálise (Frey et al., 2001; Rob-
A e de estudos de ENDOR
ficado como um Fe (figura 6A).
-
-se de um enxofre inorgânico. A coordenação dos ligandos no Fe é octaédrica,
ligeiramente distorcida, enquanto que
os ligandos do Ni assumem um sistema
penta coordenado de pirâmide qua-
son, 2001).
A subunidade maior está organizada em
três camadas dispostas de modo paralelo, relativamente à interface das subunidades, e compreende cinco domínios
(Frey et al., 2001).
No sítio activo, o Ni é coordenado por
drangular (figura 2.3.B). Em D. gigas a
quatro tiolatos provenientes de 4 cisteí-
forma oxidada (que corresponde à
nas, duas terminais (Cis 65 e Cis530) e
forma inactiva da enzima) é denomina-
duas em ponte com o Fe (Cis68 e
da estado Ni-A, enquanto que em D.
Cis533). O Fe para além dos dois tiola-
vulgaris corresponde ao estado Ni-B.
tos em ponte com o Ni é coordenado
Permanece, no entanto, por esclarecer
A da su-
por três moléculas diatómicas. Estudos
se esta diferença se deve á diferente na-
perfície, está ligado à enzima por quatro
combinados de estrutura de Raios-X e
tureza do ligando em ponte (um oxigé-
cisteínas. Duas, ligam em ponte os dois
espectroscopia de FTIR identificaram
nio ou um enxofre respectivamente), ou
metais e as outras duas ligam apenas o
estes ligandos como dois CN e um CO
se reflecte uma alteração no estado fun-
níquel. Na forma oxidada, o átomo de
revelando assim a natureza organome-
cional. A conversão do estado Ni-A (não
níquel possui três ligandos próximos e
tálica deste centro.
reactivo) numa forma reactiva (figura 7)
O sítio activo (figura 6), a 30
-
figura 8. (A) Percurso electrónico do sítio activo ao aceitador externo e (B) transferência protónica entre o Ni e o Mg na NiFeH de D. gigas (Adaptado de
Frey et al., 2001).
QUÍMICA
figura 9 Representação esquemática da CODH de O.
carboxidovorans. Os co factores estão representados por
modelos "stick and ball" (Adaptado de Dobbek et a1., 2001 a).
envolve uma conversão rápida a Ni-SU
O percurso entre o sítio activo e a su-
das à transferência de protões, e podem
seguida de uma conversão lenta, for-
perfície, envolvendo electrões, protões e
de ce rt o modo, justificar a existência do
mando-se Ni-SI. A activação completa,
H2, é efectuado por caminhos específi-
centro de magnésio, perto da superfície.
por redução, gera o estado Ni-C. Os re-
cos, facilitado pelo arranjo espacial dos
Este facto pode conferir uma função
sultados experimentais são consistentes
três centros. O centro proximal pode di-
adicional, para além da função estrutu-
e reflectem diferenças conformacionais
rectamente permutar electrões com o
ral óbvia, e um possível envolvimento no
significativas entre os estados Ni-A, Ni-
sítio activo, enquanto que, o distal me-
processo proteolítico do C-terminal da
B, Ni-SI e Ni-C; a inactivação, na pre-
deia através da histidina, as permutas
subunidade maior imaturada (Fontecilla
sença de oxigénio, é também explicada
electrónicas com um parceiro electróni-
etal., 2001; Frey etal., 2001).
por oxidação e conversão ao estado Ni-
co, um citocromo multihémico provavel-
A (Fontecilla-Camps etal., 2001; Frey et
mente (figura 8A). A participação do
al., 2001).
centro [3Fe-45] é ainda pouco clara na
medida em que, o potencial que apre-
Na subunidade menor podem ser defi-
senta, é muito mais elevado do que os
nidos dois domínios: o primeiro, o N-ter-
centros redox envolvidos na activação
minal que coordena o centro [4Fe-4S] dst
do H2. Existem também vários canais
(perto da superfície), consiste em cinco
protónicos que ligam o sitio activo à su-
folhas
Uma rede de canais hidrofóbicos, que
liga o sítio activo à superfície, funciona
na permuta do H2, facilitando a sua rápida difusão de/para o sítio activo. A
função de cada um dos canais foi testada utilizando xenon e contrariamente ao
que acontece com as moléculas de
H2,
o Xe, não é difundido para o sítio activo;
paralelas rodeadas por várias
perfície, incluem a cisteina, grupos car-
hélices a, com uma topologia típica das
boxilato (de glutamatos conservados) e
o H2, difunde sempre pelos canais hi-
flavodoxinas. O segundo, o C-terminal,
moléculas de água interiores. Um cami-
drofóbicos e nunca ao acaso. Assim,
que liga os centros de [3Fe-4S1 e de
nho possível para os protões (figura 8),
estes canais hidrofóbicos, desempe-
[4Fe-4S1 pro , (perto do sítio activo), é
dentro da subunidade maior, começa
nham um papel funcional de extrema
menos organizado e mais variável em
na cisteína (Cis530) ligada ao centro de
impo rt ância na transferência e armaze-
termos da composição em centros de
Ni-Fe (que é substituida por Se nas Ni-
namento do gás na molécula, e um
Fe-S e na sequência de aminoácidos. A
FeSeH), que estabelece ligações por
papel instrumental no metabolismo do
distribuição espacial destes centros, es-
pontes de hidrogénio com um resíduo
gás (Fontecilla et al., 2001; Frey et al.,
sencialmente ao longo de uma linha
conservado (G1u18 em D. gigas). Este
2001).
recta, revela que o centro de [3Fe-4S1
carboxilato está ligado a uma molécula
está localizado a meia distância dos dois
de água do magnésio, pe rt o da superfí-
R
centros de [4Fe-45]. Nos centros de
cie, por uma serie de ligações por pon-
[3Fe-4S] e o de [4Fe-4S] pr0 „ cada ferro,
tes de hidrogénio envolvendo quatro
num arranjo aproximadamente tetraé-
moléculas de água estruturais, o C-ter-
drico, está ligado a três enxofres inorgânicos e a uma cisteína. O centro de
[4Fe-4S] ds , possui uma coordenação invulgar, pelo facto de estar coordenado
por três cisteínas e a uma histidina ex-
minal da cadeia principal e uma molécula de água adicional e um outro resíduo conservado (G1u46 em D. gigas)
(Fontecilla-Camps et al., 2001; Frey et
al., 2001).
Na tentativa de esclarecer o mecanismo
de catálise têm sido efectuados diversos
estudos envolvendo compostos modelo,
que revelam compatibilidade entre estruturas semelhantes, para o sítio activo,
com cargas globais muito diversas.
A estrutura de Raios-X para a forma reduzida apresenta duas possibilidades
de ligação do substrato: envolvendo o ligando em ponte ou a posição de coor-
posta ao solvente (Fontecilla-Camps et
As ligações moléculas de água-metal
denação vaga no níquel; ambas pode-
al., 2001; Frey etal., 2001).
parecem ser específicas e bem adapta-
riam ligar o H2 ou o hidreto (formado na
53
54 I QUÍMICA
pa rt ir do substrato, via molibdénio, para
aceitadores externos como seja o citocromo b561 (Dobbek etal., 2001 a).
As estruturas de Raios-X, existentes
para Ohgotropha (O.) carboxidovorans
(figura 9) e Hidrogenophaga (H.) pseu-
doflava, apresentam uma topologia global e um arranjo das subunidades semelhantes. São dímeros, em forma de
borboleta, resultado da disposição de
topo entre as duas molibdoproteínas e
figura 10. Representação esquemática da
CODH de O. carboxidovorans. Os co-factores
estão representados por modelos "stick and
ball" (Adaptado de Dobbek et al., 2001 a).
figura 11. Representação esquemática da
subunidade L da CODH de O. carboxidouorans
(Adaptado de Dobbek et al., 2001 a).
cuja inte rface é essencialmente hidrofóbica (Dobbek etal., 2001 a).
A subunidade L (figura 10), em forma
de coração, pode ser subdividida em
clivagem heterolítica do H 2 ). Contudo a
as Mo-[2Fe-2S]-FAD CODH, de bacté-
dois domínios. O N-terminal, exclusiva-
posição apical livre, no níquel é o local
rias aeróbias e as Ni-[4Fe-4S1 CODH, de
mente em folha
mais acessível e, como tal, mais prová-
bactérias anaeróbias. Algumas Ni-
pode ser adicionalmente subdividido
vel à ligação do H2, facto consistente
CODH, enzimas bifuncionais, formam
em duas partes. A primeira parte é com-
com a pequena distância existente entre
um complexo com a sintetase da acetil
posta por duas zonas, em hélice a, se-
os dois metais. Deste modo, o mecanis-
CoA (ACS/Ni-CODH) (Dobbek et al.,
guidas de folha
mo de catálise não é ainda consensual,
2001 b).
maioria das interacções existentes no
dada a ince rt eza relativamente ao estado de oxidação do níquel ou do grau de
protonação e oxidação das suas cisteínas, e só nova investigação permitirá o
seu esclarecimento (Frey etal., 2001).
As CODH catalisam a reacção de oxidação do CO de acordo com a seguinte
reacção:
CO + H 2 0 —>CO 2 + 2H+ + 2e4.2.1. Desidrogenases do monóxido
4. Ciclo do carbono
4.1. Introdução
0 monóxido de carbono (CO), um gás
atmosférico, contribui para a eliminação
de radicais hidroxilo na atmosfera; apenas um quinto é utilizado por microrga-
de carbono contendo molibdénio (MoCODH)
As Mo-CODH para além de catalisarem
a oxidação do CO apresentam também
actividade de desidrogenase do hidrogénio molecular (Dobbek etal., 2001 a).
[3, e o C-terminal que
13 e é responsável pela
dímero, e a segunda pa rt e, que consiste em três folhas f3 antiparalelas, rodeadas por seis hélices a. O co-factor MCD
está ligado entre os dois domínios por
inúmeras ligações por pontes de hidrogénio. O enrolamento global desta subunidade é muito semelhante à correspondente na Mop, exceptuando no canal de
acesso do substrato que é mais estreito
(Dobbeck etal., 2001 a).
A subunidade M (figura 11) liga a molécula de FAD e pode ser subdividida em
três domínios. O N-terminal, responsá-
nismos do solo contribuindo, desta
A Mo-CODH é uma enzima membranar,
vel pela ligação da molécula de FAD, é
forma, para restabelecer o equilíbrio
que gera uma força proto motriz, via ci-
composto por três folhas j3 paralelas, ro-
deste elemento. O CO é absorvido ape-
tocromo b561 , para uma cadeia respira-
deadas por duas hélices a e apresenta
nas nas camadas superficiais em condi-
tória insensível ao CO. É composta por
um motivo com duas glicinas. O domí-
ções aeróbias e tem um tempo de vida
dois heterotrímeros com uma massa
nio central, com uma topologia mista,
cu rt o no solo (Dobbek et al., 2001 a).
molecular de 273 kDa. Cada heterotrí-
em hélice a/folha
mero é constituído por três subunidades
nucleotídeo da molécula de FAD. O C-
diferentes: a subunidade L, que contém
terminal, contém quatro folhas 13 antipa-
a molibdopterina (do tipo MCD), a su-
ralelas, que terminam num feixe de três
4.2. Desidrogenases do monóxido de
carbono
[3, rodeia a porção di-
A capacidade de oxidar o CO é uma ca-
bunidade M, a flavoproteína, com uma
hélices a, e está ligado ao domínio cen-
racterística metabólica de vários grupos
molécula de FAD ligada de um modo
tral por um "loop" flexível que interactua
de Bacteria e Archaea. O CO é utilizado
não covalente, e a subunidade S, que
apenas com o anel isoaloxazina da mo-
como substrato no crescimento de uma
contém dois centros de [2Fe-2S1, com
lécula de FAD, que é o co-factor mais
variedade de bactérias, incluindo as
massas de 88,7, 30,2 e 17,8 kDa, res-
exposto ao solvente (a porção dinucleo-
bactérias redutoras de sulfato (BRS). A
pectivamente. O sítio activo é único, um
tídeo está acessível a pa rt ir do solvente).
desidrogenase do monóxido de carbono
agregado [MoSCui, em que o molibdé-
No entanto, o arranjo das subunidades
(CODH) é a enzima chave na utilização
nio da MCD está coordenado ao cobre
L, M e S permite o acesso ao anel isoa-
de CO, como fonte de carbono no cres-
por uma cisteína em ponte. Os centros
loxazina apenas, por um dos lados da
cimento de bactérias carboxidotróficas.
de Fe-S e a molécula de FAD estão en-
subunidade M, pe rt o da região de inter-
Podem-se definir dois tipos de CODH:
volvidos na transferência electrónica, a
face (Dobbek et al., 2001 a).
QUÍMICA
A subunidade S (figura 12), muito se-
do ligando em ponte para o molibdénio,
melhante à Mop nas estruturas primá-
reduzindo-o. A regeneração da forma
rias e terciária, está localizada entre as
fechada do agregado [MoSCu], conduz
subunidades L e M e pode ser dividida
à libe rt ação do CO 2 e à reoxidação do
em dois domínios, cada um contendo
molibdénio (por reposição do ligando hi-
um centro de [2Fe-2S]. O N-terminal,
droxo por uma molécula de água) num
semelhante ao encontrado nas ferredo-
processo conce rt ado, cuja força motriz
xinas de plantas contendo centros de
é a estabilidade do produto formado. Os
[2Fe-2S], é composto por uma hélice
centros de Fe-S facilitam a reoxidação
perpendicular e cinco "13 barrel" parciais
do molibdénio por transferência electró-
e contém o centro de [2Fe-2S] d , s1 (distal
nica, pois o co-factor MCD está adja-
relativamente à MCD) ou centro de
cente ao centro de [2Fe-2S] 5 , 0, Daqui,
ferro-enxofre do tipo II. Está localizado
são transferidos para a molécula de
na inte rf ace das subunidades M e L e é
FAD, via centro de [2Fe-2S] ds ,, para
responsável por mediar a transferência
doadores externos, como por exemplo o
electrónica entre o centro do tipo I e a
citocromo b
molécula de FAD. O domínio C-terminal,
contém um feixe de quatro hélices a,
com uma simetria dupla e alberga no
seu interior (a cerca de 11
A da superfí-
1
(Dobbek etal., 2001 a).
4.2.2. Desidrogenases do monóxido
de carbono contendo níquel (Ni-
figura 12. Representação esquemática do
CODH)
subunidade S da CODH de O. carboxidouorans
(Adaptado de Dobbek et al., 2001 a).
cie) o centro de [2Fe-2S]prox ou do tipo
As Ni-CODHs podem ser divididas em
I (Dobbek etal., 2001 a).
quatro classes (figura 14). As ACS/Ni-
As subunidades S, M e L são estabilizadas, essencialmente, por interacções hidrofílicas.
CODH das classes I e II são enzimas
compostas por cinco subunidades; a
classe I está presente em organismos
que sintetizam acetil CoA, a partir de
O sítio activo (figura 13), na subunidade
CO 2 e H2, e a classe II pe rt ence a orga-
A da superfície, está acessível
nismos que efectuam uma metanogé-
por um túnel hidrofóbico e é formado
nese acetoclástica. As ACS/Ni-CODH da
M a 17
xilação da acetil CoA a CO 2 (Lindahl,
2002). Estas enzimas estão presentes
apenas em organismos primitivos e,
para além de desempenharem um
papel fundamental no ciclo do carbono
e na degradação de poluentes, podem
estar implicadas na origem da vida.
por um centro dinuclear único, um
classe Ill consistem em duas proteínas
Para as enzimas monofuncionais, as es-
agregado [MoSCu]. O molibdénio, está
independentes, um tetrâmero a213 2
truturas de Raios-X existentes para as
ligado a um cobre por uma cisteína em
(ACS/Ni-CODH) e um heterodímero y8
Ni-CODHs de Carboxidothermus (C.)
ponte. O molibdénio apresenta uma
(CoFeSP). As subunidades a,
0, ye 8 da
hydrogenoformans e Rhodospirillum
geometria pirâmide quadrangular; a po-
classe I/II são homólogas das subunida-
(R.) rubrum são essencialmente equiva-
sição apical é ocupada por um ligando
des G3, a, y e 8, respectivamente, da
lentes. A única diferença diz respeito ao
oxo e os ligandos equatorias são os dois
classe Ill. A classe IV é constituída por
agregado C, agregado de Dobbek no
ditiolenos do anel de pirano da pterina,
enzimas monofuncionais do tipo a 2 , que
caso de C. hydrogenoformans e agrega-
um ligando oxo e o enxofre coordenado
catalisam apenas a conversão reversível
do de Drennan, para R. rubrum (Dob-
ao cobre. O cobre está ligado ao enxofre
CO/CO 2 . A subunidade a é homóloga da
bek et al., 2001 b; Drennan et al.,
equatorial, em ponte, e a uma cisteína
subunidade a das classes I/II e da su-
2002).
(Cis388), estabelecendo a ligação cova-
bunidade ¡3 da classe Ill (Lindahl,
lente do co-factor de molibdénio à ca-
2002).
deia da polipeptídica (Dobbek et al.,
2001 a).
Apesar de filogeneticamente relacionadas, as Ni-CODH diferem em termos
Ilações relativas ao mecanismo reaccio-
metabólicos, na composição das subu-
nal foram obtidas utilizando um análogo
nidades e na função catalítica. As enzi-
do substrato, o n-butil isocianato (n-
mas monofuncionais catalisam exclusi-
BIC). O substrato (CO) chega ao agrega-
vamente a oxidação reversível do CO a
do [MoSCu] através de um canal pró-
CO 2 , de acordo com a equação descrita
prio. A inserção do CO entre o cobre e o
anteriormente. As enzimas bifuncionais,
enxofre em ponte liberta o cobre, dando
que adicionalmente catalisam a síntese
origem á "forma aberta" do agregado.
de acetil CoA, são designadas por sinte-
Este, sofre então um ataque nucleofíli-
tases da acetil CoA/desidrogenares do
co, do grupo hidroxo do molibdénio, re-
monóxido de carbono (ACS/Ni-CODH).
sultando em CO 2 ligado. Os electrões li-
Um segundo grupo destas enzimas
bertados são então transferidos, através
pode, no entanto, catalisar a descarbo-
figura 13. Representação esquemática do co-
factor da CODH de O. carboxidouorans
(Adaptado de Dobbek et al., 2001 a).
-,^•Gln 240
r T MCD
r
!
Mo
f^'^
• /
Cu
' . 2 s-4Cis388
' „
^^
•GIu 763
55
56
QU[MICA
Classe I e II
agregados
BCDEF
fA
o
Classe Ill
Y
a
agregados
Classe IV
figura 14. As quatro
S
BCD
classes de Ni -CODH
(Adaptado de Lindahl, 2002).
a
C. hydrogenoformans acopla a oxidação
rotação (Dobbek etal., 2001 b; Lindahl,
do CO à redução de protões a hidrogé-
2002).
17), está covalentemente ligado à ca-
nio molecular (H,), no processo de obtenção de energia. A Ni-CODH (figura
15), em forma de cogumelo e com uma
O agregado C (e C') de Dobbek (figura
deia polipeptídica por cinco cisteínas e
Cada subunidade é composta por três
domínios: o N-terminal, o do meio e o C-
uma histidina e pode ser dividido em
dois subagregados: um agregado
topologia essencialmente em hélice a, é
terminal. O N-terminal, predominante-
composta por duas subunidades idênti-
mente em hélice a, é composto por dois
cas (67,5 kDa), ligadas de um modo co-
subdomínios funcionais: o primeiro con-
e um agregado [3Fe-4S1. Em ambos os
valente e com uma orientação o rt ogonal
tém as regiões de ligação dos agregados
subagregados, o ferro possui uma geo-
entre si. Contém cinco agregados de Fe-
B e D e o segundo possui duas folhas j3
metria tetraédrica; contudo, no primeiro
S de três tipos, denominados B, C e D.
que contribuem para a ligação dos dois
está coordenado a três enxofres e um
azoto (Cis295, His261), enquanto que
[NiSFe], que inclui o ferro FCII (coordenado a uma cisteína e a uma histidina),
Os agregados B (e B') e D são centros
centros de Fe-S. O agregado B, (ou B')
de [4Fe-4S], cubanos típicos, envolvi-
está coordenado por quatro cisteínas
no segundo, está coordenado a quatro
dos nas transferências intra e intermole-
(Cis48, Cis51, Cis56 e Cis70), segundo
enxofres. O níquel, com uma geometria
cular, respectivamente. Os agregados C
um padrão típico das Fd. O agregado D,
quadrangular plana, possui quatro en-
(e C'), novos agregados assimétricos do
o vértice do "V" invertido, está coorde-
xofres como ligandos e está deslocado
nado, de um modo covalente às duas
do plano em cerca de 0,3
subunidades, através de dois resíduos
2002).
tipo [NiFe,S 5 ], constituem o sítio activo;
como distam entre si cerca de 33
A,
funcionam como dois sítios activos independentes. Em cada subunidade, o
agregado D, dista cerca de
10 A do
agregado B e a 11 A de distância está o
agregado C da outra subunidade, num
arranjo em forma de "V" invertido (figura
de cisteína (Cis39 e Cis47). Os domínios
"do meio" e o C-terminal, possuem uma
A (Lindahl,
O agregado C de Drennan (figura 18), é
essencialmente um cubano do tipo
topologia de "Rossmann" e ligam o agre-
[NiFe 3 S 4 1, ligado a um ferro FCII. As
gado C, que se situa na interface dos
duas estruturas são semelhantes, ex-
três domínios. Dois resíduos carregados
cepto num enxofre que liga em ponte o
positivamente estão envolvidos na catá-
níquel e o ferro FCII, e no ligando adi-
duas subunidades e está localizado
lise: a Lis563, que liga em ponte o ní-
cional do níquel, presumivelmente um
pe rt o da superfície, segundo o eixo de
quel e o ferro, por ligação por ponte de
CO. No entanto, este tipo de agregado
hidrogénio, e a His93, que pa rt icipa na
misto, entre um metal e um centro de
16). 0 agregado D, liga em ponte as
figura 15. Representação esquemática da Ni-
CODH de C. hydrogenoformans (Adaptado de
Dobbek et al., 2001 b).
estabilização do substrato ligado (Dob-
[4Fe-4S], está presente na redutase do
bek etal., 2001 b). O canal que conduz
sulfito e nas hidrogenases contendo
A da
ferro (Dobbek et al., 2001 b; Lindahl,
ao sítio activo, o agregado C a 18
superfície, possui uma densidade positi-
2002).
va perto da superfície e acomoda várias
O mecanismo de oxidação do monóxido
moléculas de água, mas apresenta um
de carbono (CO a CO 2 ) mais aceite,
carácter hidrofóbico junto do centro de
neste momento, (figura 19) envolve a li-
níquel. As ramificações existentes, perto
gação do CO ao níquel e de uma molé-
dos agregados B, constituem locais de
cula de água ao ferro FCII. Após ataque
entrada de moléculas de água necessá-
nucleofílico ao CO ligado, o protão car-
rias durante o ciclo catalítico (Dobbek et
boxílico é provavelmente aceite por resí-
al., 2001 b; Lindahl, 2002).
duos básicos (Lis563 e His93), facilitan-
QUÍMICA
do deste modo a dissociação da molécula de dióxido de carbono (CO 2 ). Os
dois electrões entregues à enzima originam o estado C r„,. Se os electrões
B
saem, um de cada vez, via agregado
51
B/agregado D, forma-se então o estado
C,, para o qual existem evidências ex-
446'
70
70'
446
perimentais. No entanto, o modo como
ma enquanto o CO 2 se dissocia, não
11
^t A
os dois electrões são entregues à enzi-
C
'
está ainda completamente esclarecido,
ficando por determinar onde se depositam os dois electrões no agregado C. Es
261'
-
tudos de mutagénese dirigida revelaram
que a His299 e a Cis675 são resíduos
figura 16. Arranjo espacial dos co-factores na Ni-CODH de C. hydrogenoformans (Adaptado de
Dobbek et al., 2001 b).
importantes na catálise (Lindahl, 2002).
As enzimas bifuncionais (as ACS/NiCODH) possuem, como sítio activo, um
outro agregado denominado agregado
A, no qual o níquel está acoplado a um
centro de [4Fe-4S] (figura 20). No esta-
entre o agregado A e o grupo metilo; as
metano como produto final. Ë no entan-
espécies a reduzir antes da sua transfe-
to, o heterodisulfito (e não o metano)
rência são ainda desconhecidas (Lin-
que desempenha um papel funcional
dahl, 2002).
chave nestes organismos; a sua redu-
do A o „ o níquel está coordenado por
A dupla função das ACS/Ni-CODH está
uma cisteína (ligando em ponte), duas
associada ao facto do produto da reac-
histidinas e uma metionina. Duas cisteí-
ção redox ser o substrato da reacção de
nas conservadas formam uma ligação
síntese. O CO formado no agregado C,
dissulfureto, constituindo o local D na
por redução do CO 2 , é transpo rt ado ao
forma oxidada (D ox ) (Lindahl, 2002).
agregado A, por um túnel específico,
O mecanismo de síntese proposto (figura 21) envolve a redução dielectrónica
do local D (distinto do agregado D),
transferência do grupo metilo para o níquel, enquanto o local D é oxidado. O
grupo metilo é transferido sob a forma
de um catião (CH 3 *), numa reacção do
tipo SN 2 pouco usual, pois envolve a
pa rt icipação do centro metálico. De seguida, liga-se a molécula de CO, que se
insere na ligação formada, originando
onde é utilizado na síntese de acetil CoA
(Lindahl, 2002).
4.3. Metil coezima M redutase (MCR)
A metil coenzima M redutase (MCR) catalisa a redução da metil-coenzima M
(sulfonato de 2 -(metiltio) etano) com a
coenzima B (fosfato de treonina 7 -mercaptoheptanol) com formação de metano e heterodisulfito (figura 22), de acordo com a reacção:
um intermediário H 3 C-C(0)-Ni 2 i. Uma
CH 3 -S -CoM + H-S -CoB —>
base (provavelmente uma histidina)
CH4 + CoM -S-S -CoB
capta um protão da CoA e o tiolato resultante ataca o grupo carbonilo do intermediário H 3 C-C(0)-Ni 2 +. Finalmente,
o local D é novamente reduzido e a acetil CoA é libertada. O "local D", permite
que o níquel mantenha o estado de oxi-
ção (no citoplasma), a coenzima M
(CoM) e coenzima B (C oB), está associado a um processo de conservação de
energia (envolve complexos membranares e está acoplada ao transpo rt e electrónico). Desta forma os metanogénicos
vivem como os redutores de sulfato, às
custas da clivagem da ligação disulfureto (a metil-CoM é um intermediário central no metabolismo energético), com a
diferença de que os primeiros são independentes de uma fonte externa de enxofre (como aceitador electrónico) pois
podem reoxidar o "enxofre reduzido"
com o CO 2 ou outro substrato carbonado. Os dois processos estão acoplados
via reacção da MCR (Grabarse et ai.,
2001).
A MCR é uma enzima solúvel, com uma
massa molecular de 300 kDa, compos-
A MCR foi, até à data, isolada exclusiva-
ta por três subunidades diferentes: a
mente de arqueobactérias metanogéni-
(McrA, 66 kDa), (3 (McrB, 48kDa) e 7
cas, anaeróbios estritos que crescem
(McrG, 37 kDa), formando um hetero-
em, H 2 e CO 2 , formato, acetato, metila-
hexâmero do tipo a2R2
minas, metiltiois ou metanol formando
co-factor, duas coenzima F 430r um tetra-
figura 17. Agregado de Dobbek (Adaptado de
figura 18. Agregado de Drennan.
Sobreposição (a fino) do agregado de Dobbek
(Adaptado de Lindahl, 2002).
-
2.
Possui como
dação (Ni 2 +) durante a metilação (Lindahl, 2002).
A inserção do CO e as reacções de eliminação são comuns na química organometálica; porém, são pouco frequentes em biologia, pelo que está ainda por
esclarecer a ordem segundo a qual, o
mecanismo decorre. Do mecanismo
proposto é conhecida apenas a ligação
Lindahl, 2002)
57
58
I
QUÍMICA
H :B
:ii-H
F
Niz\ S ^Fe^ ^ Ni`+ ep+
H :B
rÓ-H
CO H'
o
r—:B
:B
:b\^ 0 H
CE---•O - H
r
Fez*
Ni^+
S/
11
(Ci red t)
H20 }
e
Ni 2+
Ni l+
Fe2+
e(Cünt)
figura 19 Mecanismo proposto para oxidação
do CO e redução do CO2 pelas Ni-CODHs
(Adaptado de Lindahl, 2002).
pirrol de níquel, fo rt emente ligadas de
• 1'
^, ^Q,:
H`:B
:B
Fez +
i ez+
Ni\
Fe2+
H':B
^ 6^i\+ ^ e 2+
H'.ã kCired2^ Go2
pelas subunidades a, a', R e (3'. As subunidades y e estão dispostas acima e
está disposta de tal modo que o plano
um modo não covalente. A coenzima
(figura 23) é o tetrapirrol mais satu-
abaixo deste centro (Grabarse et al.,
canal. O níquel, apresenta uma geome-
2001).
tria octaédrica em que os quatro ligan-
F430
rado de entre os conhecidos; possui
apenas cinco ligações duplas, das quais
dois pares estão conjugados, mas estão
separadas por duas ligações simples
formando um sistema com pouca
conjugação. A sua cor amarela, em contraste, com a cor vermelha das porfirinas e corrinoides é, muito provavelmente, resultado deste baixo grau de
conjugação. Biosinteticamente a coenzima
F430
do sirohemo e da VitB 12 . A MCR
é rapidamente inactivada por 0 2 e CHCI 3
por conversão do Ni (I), activo, a Ni (II),
inactivo. Um aminoácido modificado
(tio-Glia445) é proposto ter uma participação activa na catálise (Grabarse etal.,
2001).
A subunidade a pode ser dividida em
quatro domínios: o do N-terminal, o domínio a+(3, o domínio em hélice a e o Cterminal, todos envolvidos na ligação da
coenzima
F430.
Os domínios N- e C-ter-
minal, são responsáveis pelas interacções com as subunidades adjacentes. A
topologia do domínio a+(3, com quatro
folhas (3 antiparalelas ladeadas por hélices a, é semelhante ao encontrado na
transferase do formilo. O domínio em
hélice a é composto por oito hélices a,
do anel pirrólico é perpendicular ao
dos equatoriais são os azotos do anel
pirrólico e o quinto é um oxigénio (da
cadeia lateral da Glna'147); a sexta posição está vaga e disponível para ligar o
substrato. Para além da cavidade estreita, que liga a superficie e o co-factor de
níquel, existe uma cavidade adicional
correspondente ao sítio de ligação da
metil-CoM; dada a geometria da cavidade, esta entra com o seu grupo sulfonato, em primeiro lugar. Os factores que
conduzem a esta orientação, não são no
de diferentes dimensões, formando
entanto conhecidos, mas a existência
uma estrutura em sanduíche organiza-
de resíduos carregados positivamente,
da em três camadas. A subunidade (3 é
na parte mais estreita, podem determi-
essencialmente igual à subunidade a;
nar esta orientação. A sua entrada antes
A estrutura de Raios-X obtida para M.
muito provavelmente evoluiram de um
da CoB é também essencial, porque
thermoautotrophicum (figura 24) revela
ancestral comum. A subunidade yapre-
após entrada desta última a cavidade
uma molécula compacta com forma
senta um enrolamento misto a/ 1 3, no
fica bloqueada. A CoB está orientada de
elíptica. O hetero-hexâmero pode ser
qual quatro folhas 13 antiparalelas estão
forma que o grupo tioheptanol aponta
descrito como sendo um dímero de trí-
rodeadas por duas hélices a. Tal como
na direccção do níquel e os grupos fos-
meros a13y, em que o centro é formado
as subunidades a e 13 também o N- e o
fato na direcção da entrada (Grabarse et
C-terminal, desta subunidade, funcio-
al., 2001).
nam como elo de ligação com as outras
figura 20. Agregado A (adaptado de Lindahl,
2002).
subunidades (Grabarse et al., 2001).
O mecanismo catalítico proposto (figura
26), com base em estudos bioquímicos
A MCR possui dois sítios activos inde-
e espectroscópicos, pressupõe a forma-
A. Cada sítio
ção de um anião radical disulfito como
pendentes que distam 50
activo é composto por uma coenzima
intermediário. A reacção tem início no
apenas acessível, a pa rt ir da super-
estado Ni(I) para o qual a MCR não pos-
fície, por um longo canal, em forma de
sui substratos ligados (A). A metil-CoM
funil. Este é formado por resíduos das
liga-se, através o seu grupo metilo, ao
F430
(B) e ocorre uma
subunidades a, a', (3 e y (ou a', a, (3' e
Ni(I) da coenzima
/) evidenciando que um trímero não é
clivagem heterolítica, no carbono sulfu-
suficiente para a catálise. No fundo
rado, formando-se metil-Ni(III)
deste canal, a coenzima
F430
(figura 25)
F430
F430 (C).
0 anião tiolato da CoM, formado ante-
QUÍMICA 59
:B
R—S Ni t+
2e' VIpI
CH 3 -Co 3 +
J
B
Co
\ ^
RS: Sg . Ni +
CO
CH3 :B
\
S —S^
^ N 2+
CH3
^
I
^°
H*,\
R^' :S^
CH3 C
^
\$ CADA \
l
H + :B
N 2+
d
l
:B
R$—S+ N2 c=_O
:
¡ .B
H+,B
:O^ ,CH3 b
c—^SCoA
^i
RS--- •N 2 '
C
R --.
°Q^ ,c1-1,
C
H8CoA
Ni '
c^\" R—§--.Ni
HCoASH
+
R
figura 21. Agregado A (adaptado de Lindahl,
2002)
riormente, é então oxidado pela espécie
sulfito é, deste modo, facilitada (Grabar-
Ni(III), altamente reactiva, formando um
se
etal., 2001).
radical S'. Concomitantemente a metilNi(III) F430 é reduzida a metil-Ni(II) (D).
A clivagem heterolítica proposta é consistente com uma inversão na esterioquímica. Seguidamente a metil-Ni(II)
F430
é irreversivelmente protonada for-
mando-se CH 4 e Ni(II)
F430
(E); este
conformacionais que induzem a exclusão da CoM-S-S-CoB.
No entanto, este mecanismo não é con-
Na presença dos substratos a única mo-
sistente com algumas observações ex-
lécula de água encontrada no sítio acti-
perimentais, nomeadamente o facto de
vo (entre a CoM e a CoB) é excluída, o
ser necessário a redução da MCR com
que indica que a catálise decorre num
Ti(III) para que esta se torne activa.
ambiente completamente hidrofóbico e
Assim é proposto que o resíduo modifi-
facilita a formação do produto, o meta-
cado (tio-Glia445) funcione como re-
no. Foram identificados três canais para
cão da CoB e transferência do seu pro-
ceptor de electrões, através da sua liga-
o solvente, que ligam o sítio activo à su-
tão à Tira367, por intermédio do radical
ção tio, formando um anião radical
perfície, um dos quais com evidências
passo, está acoplado com a desprotona-
S' CoM. No passo final o radical S' reage
tiocetil. O Ni(II) seria então reduzido a
experimentais que demostram a sua re-
com o anião tiolato da CoB formando-se
Ni(I) e o radical tiocetil regenerado pela
levância para o ciclo catalítico. Assim,
o anião radical heterodisulfito (F), um
transferência electrónica do anião radi-
redutor fo rt e, capaz de reduzir o Ni(II) a
cal disulfito. O facto de tio-GIia445 fun-
Ni(I) (G) por um mecanismo ainda des-
cionar como parceiro redox na catálise
conhecido. Conjugando o facto de que o
apresenta vantagens, pois a formação
Ni(I) adopta, preferencialmente, uma
de Ni(I) antes da formação do heterodi-
um número equivalente de moléculas
de solvente, devem entrar ou sair quando os substratos entram e os produtos
da reacção saem (Grabarse
et al.,
2001).
coordenação quadrangular plana, e que
sulfito previne a formação de um aduc-
o ligando axial (Glna'147) pode aumen-
to, pouco favorável, Ni(II)-S-CoM, para
tar a nucleofilicidade do níquel, na
além de que a re-redução da tioligação
Nesta série de 3 a rt igos abordámos as-
coenzima
pode ser responsável pelas alterações
pectos moleculares de ciclos de ele-
F430,
a expulsão do heterodi-
Conclusão
(A), CoB
(B) e heterodisulfito (C) (Adaptado de
Grabarse et al., 2001).
figura 22. Estruturas da metil-CoM
60
I QUÍMICA
mentos relevantes do ponto de vista bio-
feito nas correlações estrutura/função.
Jorge Pereira pela ajuda na obtenção de
lógico: enxofre, azoto, hidrogénio e car-
Adicionalmente, uma melhor definição
inúmeras figuras.
bono. A resolução a nível atómico das
das distâncias entre centros redox e a
estruturas 3D de enzimas chave envolvi-
identificação de parceiros redox especí-
das nestes processos permite explorar,
ficos permite uma análise detalhada da
propôr e interpretar propriedades catalí-
cinética (intra e intermolecular), definir
ticas e conduz a uma melhor com-
percursos de transferência electrónica,
preensão de dados espectroscópicos.
Um avanço considerável tem vindo a ser
detalhar a forma de reconhecimento
desses parceiros, bem como inferir
pp 110-158, Taylor & Francis
• Cammack, R. (2001) "The catalytic machinery" in Hydrogen as a fuel, (R. Cammack,
M. Frey, R. Robson, Eds), Cap 8, pp 159180, Taylor & Francis
Como nota final devemos referir que
• Carepo, M., Tierney, D. L., Brondino C. D.,
muitos destes ciclos se interpenetram.
Yang, T. C., Pamplona, A., Telser, J., Moura,
bactérias redutoras de sulfato (BRS)
que podem utilizar nitrato como via alternativa respiratória ao sulfato, como
resposta/adaptação a condições ambientais (fig. 27). Este caso permite
compreender e integrar as necessidades químicas e biológicas envolvidas no
I., Moura, J. J. G., Hoffman. B. M. (2002)
JACS , 281-286
• Dobbek, H., Gremer, L., Meyer, 0., Huber,
R. (2001 a) "CO dehydrogenase" in Handbook of Metalloproteins, (A. Messerschmidt,
R. Huber, T. Poulos, K. Wieghardt, Eds), Vol
2, pp 1136-1147, John Wiley & Sons, LTD
• Dobbek, H., Svetlitchnyi, V., Gremer, L.,
Huber, R., Meyer, O. (2001 b) "Crystal struc-
metabolismo destes organismos, que
ture of a carbon monoxide dehydrogenase
têm a capacidade de participar num
reveals a [Ni-4Fe-5S1 cluster", Science, 293,
grande "ciclo biogeoquímico", com in-
1281-1285
tervenção de várias enzimas chave. Este
• Drennan, C.L., Heo, J., Sintchak, M.D.,
exemplo demonstra que, na ausência
Schreiter, E., Ludden, P.W. (2002) "Life on
de sulfato e na presença de nitrato, são
carbon monoxide: x-ray structure of Rhodos-
induzidas enzimas dissimilativas (redu-
pirillum rubrum NiFeS carbon monoxide
tases do nitrato e nitrito, ver Pa rte I). O
dehydrogenase", PNAS, 98, 11973-11978
metabolismo do hidrogénio é também
• Fontecilla-Camps, J.-C., Frey, M., Garcin,
integrado e representa um modo subtil
E., Higuchi, Y., Montet, Y., Nicolet, Y., Volbe-
de suplementar equivalentes redox (na
da, A. (2001) "Molecular architectures" in
ausência de compostos orgânicos) ou
Hydrogen as a fuel, (R. Cammack, M. Frey,
utilizar excesso de electrões (em condições limitantes de substratos respiratófigura 24. Representação esquemática aa MCR
de M. thermoautotrophicum. Os co-factores
estão representados por modelos "stick and
ball" (Adaptado de Grabarse et al., 2001).
Cammack, M. Frey, R. Robson, Eds), Cap 7.
volvidos.
Um bom exemplo é o metabolismo de
figura 23. Estrutura do tetrapirrol de níquel,
coenzima F430, presente na MCR de M.
thermoautotrophicum (Adaptado de Grabarse
et al., 2001).
• Albracht, S.P.J. (2001) "Spectroscopy-the
functional puzzle" in Hydrogen as a fuel, (R.
sobre a regulação dos metabolismos en-
H,NOC
COOH
Bibliografia
rios — sulfato ou nitrato) conduzindo à
evolução de hidrogénio. O consórcio
com bactérias formadoras de metano
R. Robson, Eds), Cap 6, pp 93-109, Taylor
& Francis
• Frey, M., Fontecilla-Camps, J.C., Volbeda,
A. (2001) "Nickel-iron hydrogenases" in
Handbook of Metalloproteins, (A. Messerschmidt, R. Huber, T. Poulos, K. Wieghardt,
(BFM) é mais um exemplo de integração
Eds), Vol 2, pp 880-896, John Wiley & Sons,
de ciclos biológicos, utilizando hidrogé-
LTD
nio e dióxido de carbono na formação
• Garcin, E., Vernède, X., Hatchikian, E.C.,
de metano. Um exemplo que integra
Volbeda, A., Frey, M., Fontecilla-Camps, J.C.
pa rtes dos ciclos do azoto, enxofre, car-
(1999) "The crystal structure of a reduced
bono e hidrogénio.
[NiFeSe] hydrogenase provides an image of
the activated catalytic center", Structure
Fold. Des., 7, 557-66
• Grabarse, W., Shima, S., Mahlery, F., Duin,
E.C., Thauer, R.K., Ermler, U. (2201)
Agradecimentos
Os autores agradecem ao PRAXIS e
COST apoio financeiro. Um agradecemento aos grupos de Bioinorgânica,
Biofísica de Proteínas e Cristalografia de
figura 25 Co -factor da MCR de M.
thermoautotrophicum (Adaptado de Grabarse
et al., 2001).
Proteínas do R EQU I MTE/CQFB/DQ/
FCT/UNL por muitas contribuições. Ao
"Methyl-coenzyme M reductase" in Handbook of Metalloproteins, (A. Messerschmidt,
R. Huber, T. Poulos, K. Wieghardt, Eds), Vol
2, pp 897-914, John Wiley & Sons, LTD
• Higuchi, Y., Yagi, T., Yasuoka, N. (1997)
"Unusual ligand structure in Ni-Fe active
center and an additional Mg site in hydrogenase revealed by high resolution X-ray struc-
QUÍMICA I
HS-Co-B
Co-B-SH
Co-M-SCH3
HO-Tir
'
N ^ N
Co-M-S
HO-Tir
CH3
N— N
N
N/
Nim/
—^
I
Co-M-S-S-Co-B
S-Co -B
Co- M - V
B
yl - HS-Co-B
HO - Tir
Co-M-S
N—N
CH3 HO-Tir
/ NiV
N---N
/Ni a
/
O
I C
N-N
SLo-B
Co-M-S y
HO-Er
Co-M-S•
S-Co-B
HO-Tir HCH3
y
l HS-Co-B
Co-M S_ •
CH3 HO-Er
N—N
N„,/
N O
`s,/
NO/
N
figura 26. Mecanismo proposto para a
formação do heterodisulfito pela MCR de M.
thermoautotrophicum (Adaptado de Grabarse
et al., 2001).
figura 27. Integração do metabolismo por
acção conjunta de urna bactéria de sulfato
(BRS) e uma bactéria metanogénica (BFM).
ture analysis", Structure (London), 5, 1671-
and modelling studies of its interaction with
• Pereira, A. S., Tavares, P., Moura, I.,
80
the tetraheam cytochrome c(3)", J. Biol.
Moura, J. .J. G., Huynh B. H., (2001) JACS,
• Lemon, B.J., Peters, J.W. (2001) 'Iron-only
Inorg. Chem., 6, 63-81
hydrogenases" in Handbook of Metalloproteins, (A. Messerschmidt, R. Huber, T. Poulos, K. Wieghardt, Eds), Vol 2. pp 738-751,
• Moura, J. .J. G., Moura, I., Teixeira, M.,
Xavier, A. V., Fauque, G. D., LeGall, J.
123.2771-2782
• Peters, J.W., Lanzilotta, W.N., Lemon, B.J.,
Seefeldt, L.C. (1998) "X-ray crystal structure
of the Fe-only hydrogenase (Cpl) from Clos-
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tridium pasteurianum to 1,8 angstrom reso-
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314, Marcel Dekker, Inc., New York and
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light at the end of the tunnel?", Am. Chem.
Basel.
genases" in Hydrogen as a fuel, (R. Cam-
Soc., 41, 2097-2105
• Matias, P.M., Soares, C.M., Saraiva, L.M.,
Coelho, R., Morais, J., LeGall, J., Carrondo,
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mack, M. Frey, R. Robson, Eds), Cap 2, pp
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• Volbeda, A., Charon, M.-H, Piras, C., Hatchikian, E.C., Frey, M., Fontecilla-Camps,
sulfovibrio desulfuricans ATCC 27774: gene
se: the structure shows unusual coordination
sequencing, three-dimensional structure de-
to an active site Fe binuclear center", Struc-
iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas",
termination and refinement at 1,8 angstrom
ture Fold. Des., 7, 13-23
Nature (London), 373, 580-7
J.C. (1995) "Crystal structure of the níquel-
61
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