caracterização de bactérias psicrotróficas gram negativas

XXXV Semana da Química – Rio de Janeiro: Produzindo
Ciência há 450 anos
VIII Jornada da Pós-Graduação em Alimentos
CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS PSICROTRÓFICAS GRAM
NEGATIVAS ISOLADAS DE LEITE ORGÂNICO
COMERCIALIZADO NO RIO DE JANEIRO
Cínthia Aparecida Costa Rabêlo1, Lorena Nunes Machado1, Hannah Barbosa de Mello Borges1, Barbara
Cristina Euzebio Pereira Dias de Oliveira1,2, Janaina dos Santos Nascimento1, Thais Souza Silveira1,
Leonardo Emanuel de Oliveira Costa1
[email protected]
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Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro – IFRJ
IOC/Fiocruz
Palavras-chave: psicrotróficas, leite, enzimas deterioradoras
Introdução
A população, mais consciente da necessidade
de se ter uma alimentação saudável, está cada vez
mais interessada em consumir alimentos orgânicos.
Houve um aumento do consumo destes alimentos [1].
O leite é um alimento amplamente consumido e os
orgânicos apresentam a vantagem de não conter
resíduos de antibióticos e medicamentos veterinários
[2]. O leite em geral é meio de crescimento de
inúmeras bactérias que podem ser patogênicas ou
decompositoras prejudicando as características
organolépticas dos alimentos [3]. Com a difusão da
utilização da refrigeração no transporte e
acondicionamento
do
leite
favoreceu-se
a
disseminação de bactérias psicrotróficas em
detrimento das mesófilas que deixaram de ser os
principais deteriorantes do produto [4]. As
psicrotróficas conseguem se desenvolver em
temperaturas entre 0 e 7ºC, temperaturas de
refrigeração [5]. As bactérias psicrotróficas produzem
proteases, lipases e lecitinases que degradam o
alimento produzindo alterações indesejáveis em sua
textura, sabor e odor. As alterações levam a rejeição
do leite pelo consumidor, reduzem sua vida prateleira
e impossibilitam seu uso pela indústria gerando
grandes perdas econômicas para produtores [6]. As
psicrotróficas são facilmente destruídas no
processamento, mas suas enzimas são resistentes e
podem permanecer no produto após o processamento
e alterar suas características [7]. Além disso estas
bactérias são formadoras de biofilmes que dificultam
sua eliminação das superfícies e as protegem da ação
de agentes químicos [8]. A contaminação por estas
bactérias e consequentemente por suas enzimas
podem ocorrer em todas as etapas desde a ordenha até
a distribuição do produto [3]. Normalmente sua
presença no leite se dá pelo processamento térmico
ineficiente ou pela contaminação após o
processamento. Para se obter um leite nutritivo, de
qualidade e com características microbiológicas
adequadas deve-se utilizar uma matéria prima de boa
procedência e seguir rigorosamente as boas práticas
de fabricação reduzindo assim a presença destes
microrganismos críticos para a indústria leiteira.
Diante do exposto, o presente projeto visa à
contagem de bactérias psicrotróficas gram negativas,
o isolamento e identificação de bactérias
psicrotróficas de leite orgânico, sua caracterização
fenotípica quanto a produção de proteases, lipases e
lecitinases, verificar se algum isolado do gênero
Pseudomonas é portador do gene aprX e a capacidade
de produção de biofilmes destas bactérias.
Metodologia
1. Amostras
Serão adquiridas 15 amostras de conveniência
de leite orgânico pasteurizado em estabelecimentos
comerciais da cidade do Rio de Janeiro. As amostras
serão transportadas até o Laboratório de
Microbiologia do campus Rio de Janeiro do IFRJ. O
leite será armazenado a 4ºC e analisado em até 24
horas.
2. Contagem de bactérias gram negativas
psicrotróficas e identificação dos isolados
Será realizada a contagem de bactérias
psicrotróficas gram negativas em meio Agar Cristal
Violeta Tetrazólio e cerca de 10% dos isolados de
cada placa serão selecionadas para purificação e
identificação. As culturas puras obtidas serão
submetidas a coloração de gram e teste da oxidase. As
bactérias oxidase negativa serão armazenadas em
glicerol e as bactérias oxidase positiva serão
identificadas utilizando o Kit Bactray III (Laborclin)
Instituto Federal do Rio de Janeiro / Campus Rio de Janeiro – 19 a 24 de Outubro de 2015
de acordo com as recomendações do fabricante e
posteriormente armazenadas em glicerol.
3. Produção de enzimas deteriorantes
Os isolados obtidos após a identificação serão
caracterizados quanto a produção das enzimas extracelulares proteases, lipases e lecitinases.
4.Detecção do gene aprX.
Será realizado a extração de DNA total dos
isolados utilizando o Kit Wizard® Genomic DNA
Purification (Promega) de acordo com as
recomendações do fabricante. A detecção do gene
aprX que codifica uma metalaprotease será realizado
por PCR, utilizando os oligonucleotídeos iniciadores
SM2F (5’-AAA-TCG-ATA-GCT-TCA-GCC-AT-3’)
e SM3R (5’-TTG-AGG-TTG-ATC-TTC-TGG-TT-3’)
que amplificam fragmento de aproximadamente 850
pb. As condições de amplificação serão aquelas
descritas por Marchand e colaboradores [9].
5. Detecção de bactérias produtoras de biofilme e
caracterização do biofilme por Microscopia
Confocal de fluorescência.
A triagem inicial dos isolados será feita em
placas contendo Ágar vermelho Congo e as placas
serão incubadas a 24h por 37ºC em condições
aeróbicas.
A produção de biofilme semi-quantitativa será
realizada em placas de 96 poços de fundo chato
utilizando solução de cristal violeta 0,5% (p/v)
utilizando como controle positivo uma linhagem
produtora de biofilme segundo Stepanovic e
colaboradores [10].
O biofilme dos isolados fortemente produtores
serão avaliados por Microscopia Confocal de
fluorescência por varredura a laser (CLSM) no
Laboratório de Patologia do Instituto Oswaldo Cruz
(IOC).
Resultados Esperados
Isolar, identificar e quantificar bactérias psicrotróficas
em leites orgânicos comercializado no Rio de Janeiro.
Verificar se as bactérias psicrotróficas são as
principais contaminantes do produto assim como são
em leites convencionais. Nós avaliaremos se as
bactérias encontradas são capazes de produzir as
enzimas deterioradoras proteases, lipases e lecitinases
que comprometem as características sensórias e
tecnológicas do leite. Verificaremos também e se as
espécies são formadoras de biofilmes. Os biofilmes
protegem as bactérias da ação de agentes mecânicos e
químicos as deixando mais resistentes. As formações
dos biofilmes contribuem para sua permanência dos
microrganismos nas superfícies de utensílios e
equipamentos favorecendo a contaminação da matéria
prima antes e após o processamento.
Agradecimentos: IFRJ, CNPq, FAPERJ.
Referências
[1] FERNANDEZ, V. N. V. Avaliação da qualidade do leite e de queijos
produzidos pela agricultura familiar, em sistemas de produção ecológico e
convencional, no leste do Rio Grande do Sul. 2010. p. 99 (Mestrado).
Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
Porto Alegre, Rio Grande do Sul.
[2]
Ministério
da
Agricultura,
2015.
Disponível
em:
<http://www.agricultura.gov.br/portal/page/portal/Internet-MAPA/paginainicial/desenvolvimento-sustentavel/organicos/o-que-e-agriculturaorganica/perguntas-e-respostas > Acesso em: 07 de ago. 2015.
[3] VACHEYROU, M.; NORMAND, A. C.; GUYOT, P.; CASSAGNE,
C.; PIARROUX, R.; BOUTON, Y. Cultivable microbial communities in
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[4] MUNSCH-ALATOSSAVA, P.; ALATOSSAVA, T. Phenotypic
characterization of raw milk-associated psychrotrophic bacteria.
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[6] DE JONGHE, V.; COOREVITS, A.; VAN HOORDE, K.; MESSENS,
W.; VAN LANDSCHOOT, A.; DE VOS, P.; HEYNDRICKX, M.
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Refrigerated Raw Milk. Applied and Environmental Microbiology, v. 77,
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[9] MARCHAND, S.; VANDRIESCHE, G.; COOREVITS, A.;
COUDIJZER, K.; DE JONGHE, V.; DEWETTINCK, K.; DE VOS, P.;
DEVREESE, B.; HEYNDRICKX, M.; DE BLOCK, J. Heterogeneity of
heat-resistant proteases from milk Pseudomonas species. International
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[10] STEPANOVIC, S.; VUKOVIC, D.; DAKIC, I.; SAVIC, B.;
SVABIC-VLAHOVIC, M. A modified microtiter-plate test for
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Microbiological Methods, v. 40, n. 2, p. 175-179, 2000.
Instituto Federal do Rio de Janeiro / Campus Rio de Janeiro – 19 a 24 de Outubro de 2015