Hepatitis C Virus - hepatopernambuco

BIOLOGIA MOLECULAR NAS
HEPATITES B e C
XV WORKSHOP INTERNACIONAL DE HEPATITES VIRAIS
DE PERNAMBUCO
IV SIMPÓSIO DE TRANSPLANTE HEPÁTICO E
HIPERTENSÃO PORTA – BRASIL/INGLATERRA
2011
André Castro Lyra
Prof. Adjunto e Livre Docente da Univ. Federal da Bahia
Coordenador do Serviço de Gastro-Hepatologia do
Hospital São Rafael
O VÍRUS DA HEPATITE C
Biologia Molecular do Vírus da Hepatitis C
Vírus com uma única fita de RNA positiva com
envelope de lipídio
Tamanho do genoma: 9.5 Kb
Família Flaviviridae
Partículas virais de 50-75 nm
Partículas virais de baixa densidade (1.03 g/ml)
são mais infecciosas; partículas de alta
densidade (1.20 g/ml), menos infecciosas
Estrutura do Genoma do VHC
81 bp
HVR1
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
NS2
NS3
NS4b NS5a
Estruturais
Não-estruturais
NS5b
Região Não-codificante 5’ (5’UTR)
341 nucleotídeos
Altamente conservada
É a suposta região do “IRES” (internal ribosome entry site)
Alvo de testes diagnósticos

HCV-RNA por PCR

Genotipagem por RFLP
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
Estruturais
NS2
NS3
NS4b NS5a
Não-estruturais
NS5b
Região aberta para leitura (ORF)
Codifica uma grande poliproteína
Processada em 10 polipeptídeos
Processamento mediado pelo hospedeiro:

core, E1, E2, NS2
Processamento mediado pelo vírus:

NS3, NS4, NS5
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
Estruturais
NS2
NS3
NS4b NS5a
Não-estruturais
NS5b
Proteínas estruturais
Proteína do capsídeo/core

Ligação com RNA viral

Indução de esteatose em camundongos
transgênicos

Indução de CHC?

Quantificação do core por Elisa se
correlaciona com níveis séricos de RNA
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
Estruturais
NS2
NS3
NS4b NS5a
Não-estruturais
NS5b
Proteínas estruturais
Duas proteínas do envelope (E1, E2)

31 kd and 70 kd

Inclui a HVR1 - epitopos neutralizantes

Escape imunológico

Ligação com membranas celulares

E1 - Padrão-ouro para genotipagem por sequenciamento
para a aplicação clínica
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
Estruturais
NS2
NS3
NS4b NS5a
Não-estruturais
NS5b
Vírus C da Hepatite
Região Hipervariável (HVR1)
81 bp
nt 1491
HVR1
1571
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
NS2
NS3
NS4b NS5a
Estruturais
Não-estruturais
NS5b
Ligação do VHC com a CD81
CD81 é uma proteína de superfície celular
A alça extracelular principal é altamente
conservada em humanos e chimpanzés
CD81 expressa em hepatócitos e linfócitos
Proteína E2 do envelope do VHC se liga
especificamente ao CD81
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
Estruturais
NS2
NS3
NS4b NS5a
Não-estruturais
NS5b
Proteínas Não-estruturais
NS4A
NS2

Proteína
Protease de cisteína - cliva
NS2/3
co-fator
NS4B
•Proteína de 27 kDa,
inibição da tradução de
proteínas celulares?
NS3



pequena (8 kDa) –
70 kDa
Protease de serina
NTPase/helicase
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
Estruturais
NS2
NS3
NS4b NS5a
Não-estruturais
NS5b
Três Domínios da Helicase do HCV-RNA:
“
”
HCV Protease
Proteínas Não-estruturais
NS5A

Fosforilada

Função? – Interação com PKR? Mutações adaptativas?

“interferon-sensitivity determining region” (ISDR)
NS5B

“motif” GDD característico de RNA-polimerase RNA dependente

Genotipagem por sequenciamento (Padrão-Ouro) ou RFLP para a
aplicação clínica
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
Estruturais
NS2
NS3
NS4b NS5a
Não-estruturais
NS5b
New Antiviral Targets
C
E1
NS3 Protease
domain
E2
p7
NS2
NS3 Helicase
domain
NS3
NS4A
NS4B
NS3 Bifunctional
protease / helicase
NS5A
NS5B
NS5B RNA-dependent
RNA polymerase
Região não codificante 3’ – 3’UTR
Consiste de:

Área não conservada

Cauda poly(U)

Elemento conservado de 98 bp
Estrutura secundária muito estável
? importante para a iniciação da da replicação da fita
RNA negativa
NS4a
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
Estruturais
NS2
NS3
NS4b NS5a
Não-estruturais
NS5b
Resumo
Alvos da terapia antiviral para o VHC
Inibidores da Protease,
Helicase
Antisense
Ribozimas
Ligação CD81
Inibidores da RNA
Polimerase
3’UTR
5’UTR
C
E1
E2
NS2
NS3
NS4b NS5a
Estruturais
Não-estruturais
NS5b
Variabilidade Genética
do VHC
Diversidade Genética do VHC
Graus de diversidade
Genotipos (1 a 6)
31-35%
Subtipos
20-23%
Quasispecies
1-9%
Definição de Quasispecies
 População de variantes do VHC diferentes,
porém muito relacionadas, as quais diferem
entre si por apenas poucos nucleotídeos nos
seus genomas, sendo observadas em um
único indivíduo infectado.
Quasispecies do VHC
#cd-0-8
TTG ATT GTG TTG CTA CTC TTT ACC GGC GTT
#cd-0-7
... ... ... C.A ... ... ... ... ... ...
#cd-0-6
... ... ... ... ..G ... ... ... ... ...
#cd-0-5
... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
#cd-0-4
... ... ... ... ..G ... ... ... ... ...
#cd-0-3
... ... ... ... ..G ... ... ... ... ...
#cd-0-2
... ... ... ... ..G ... ... ... ... ...
#cd-0-1
... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Vírus da Hepatite B
Vírus DNA, dupla fita, genoma de 3,2 kb;
envelope
Família Hepadnaviridae
Tamanho: 42nm
4 (ORFs) regiões abertas para leitura:

S, C, P e X
Genoma do vírus da hepatite B e seus
produtos antigênicos
PréS2
PréS1
(-)
S
(+)
Produtos
AgHBs
DNA Polimerase
AgHBx
AgHBc / AgHBe
5’
Gene C
5’
Gene P
Gene X
Vírus da Hepatite B
Genótipos: A-G (divergência de pelo
menos 8% nos genomas)
Genótipo H
(Arauz-Ruiz P; J Gen Virol 2002)
Subtipos: adr, adw, ayr, ayw
Sorotipos: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr,
adw2, adw4, adrq+, adrqChu & Lok, Gastroenterology 2002
Métodos de Genotipagem
Região pré-S ou S
Sequenciamento direto
 RFLP
 “Line probe”
 Elisa

Global Distribution of the 8 HBV
Genotypes
A
G
A, B, C,
D, G
A, D, E
H, F
A,D, F,
B,C
D
B, C
D
A, B, C, D
Arauz-Ruiz P, et al. J Gen Virol. 2002;83:2059-2073. Bell SJ, et al. J Clin Virol. 2005;32:122-127.
Chu CJ, et al. Gastroenterology. 2003;125:444-451. Kidd-Ljunggren K, et al. J Gen Virol. 2002;83:1267-1280. Keeffe EB,
et al. Clin Gastroenterol Hepatol. 2004;2:87-106.
HBV Genotype Prevalence in the
US (2001-2002)
Nationwide study of 694 consecutive chronic HBV-infected
patients seen at 17 US liver centers
Prevalence of HBV genotypes
Prevalence of HBV genotypes by
place of birth/ethnicity
100
Prevalence (%)
Prevalence (%)
100
80
60
40
34.7
30.8
22
20
10.4
0.4
0.6
1.1
A
B
C
D
E
F
G
80
Chu CJ, et al. Gastroenterology. 2003;125:444-451.
64 60
60
35
40
20
0
0
78
61
China
Taiwan
Korea
Vietnam
32 32
14
10 25
2 06 3
A
B
C
D
Genótipos do HBV no Brasil
Autor/ano
n
Região
Genótipos
Araújo, 2004
119
multicêntrico
A (78%)
Sitnik, 2004
103
multicêntrico
A (49,5), B (2,9%), C (13,6%),
D (24,3%) e F (9,7%)
Conde, 2004
51
Rezende, 2005
50
Ribeiro, 2006
76
Bahia
Melo, 2007
303
multicêntrico
Gouveia, 2008
(HBV-HDV)
17
Bottecchia, 2008
32
Leste Amazônia A (89,1%)
D (56,5%), A (41,3%), F (2,2%)
A (87%), F (11%), B (2%)
A (48,5%), D sul (84,3%) e centro
(47,6%), F (13%)
Leste Amazônia A (100%)
multicêntrico
A (75%), D (9,3%), F (3%), C (1%)
Mutações
Mutações que resultam
em ↓ expressão do
HBeAg
Mutações que resultam em
resistência antiviral
Precore e promotor do
core
Gene da polimerase
Características dos genótipos do
HBV
A freqüência das mutações nas regiões pré-core e promotor do core
promoter varia de acordo com os genótipos do HBV
Genótipo
Comprimento do
genoma
(nucleotídeos)
Mutação pré-core
G1896A
Mutações core promoter
A1762T e G1764A
A
3221
rara
comum
B
3215
comum
comum
C
3215
comum
comum
D
3182
comum
comum
E
3212
intermediária
não descrita
F
3215
rara
não descrita
G
3248
muito comum
não descrita
H
3215
não descrita
não descrita
Bartholomeusz et al., 204; Wai et al., 2004; Locarnini et al., 2003; Locarnini et al., 2006
Distribuição dos genótipos e subtipos do VHB na
hepatite aguda B – Salvador-Bahia
Lyra et al J Clin Gastroenterol 2005
adw2 (N=35)
A
F
D
ayw2 (N=1)
ayw3 (N=2)
adw4 (N=2)
Distribution of hepatitis B virus genotypes among patients with
chronic infection.
Ribeiro NR et al . Liv Int 2006.
N= 76 pacientes
65
adw2
adw4
adw2
1
10
HBBA-064_97
HBBA-065_96
HBBA-038_ 99
HBBA-150_97
HBBA-207_96
HBBA-307_99
HBBA-004_98
HBBA-011_96
HBBA-355_99
HBBA-128_98
HBBA-106_97
HBBA-120_97
HBBA-197_98
HBBA-005_95
HBBA-155_98
HHVBA X75666
HBBA-297_99
HBBA-048_98
85 HBBA-035_96
HPBSAG J02205
HBBA-340_99
HBBA-018_97
HBBA-130_96
HBBA-103_97
HBBA-126_96
HBBA-033_97
HBBA-132_98
HBBA-313_99
HBBA-350_99
HHVBAMAM X75669
HBBA-085_97
HBBA-315_99
73
HBBA-139_98
HBBA-248_99
HBBA-143_97
HBBA-171_99
HBBA-023_95
70 HBBA-104_97
IG29227 AF160501
S74815 S74815
81
HPBADW3 D00331
98
HPBADW1 D00329
71
88
HBU19777 U19777
98
HHVBCS X75792
HHVBC1 X75667
HHVBBAS X75657
HHVBE4 X75664
99
HBVPS12SM X77308
HBBA-030_97
85
HHVBD X75668
HBBA-027_95
70
HPBHBVAA M32138
HBBA-138_96
97
HHVBFFOU X75658
HHVBFS X75661
HBVADW4A X69798
95
HBBA-072_96
95 HBBA-294_99
79
WHV M11082
0.05
Genótipo A
Genótipo G
Genótipo B
Genótipo C
Genótipo E
Genótipo D
Genótipo F
Vírus do “Woodchuck”
Importância clínica dos genótipos do
HBV
Soroconversão
do HBeAg
História natural da
hepatite B
Resposta terapêutica
ao tratamento com
análogos?
Remissão espontânea
do HBsAg
Fator de risco para a
hepatite fulminante
Fator de risco
independente
para o HCC
Resposta terapêutica
ao tratamento com
IFNs