universidade luterana do brasil giorgia moura de bortoli

20
UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
DIAGNÓSTICO GENÉTICO E MOLECULAR
EFEITO DOS PRINCIPAIS METABÓLITOS ACUMULADOS NA ACIDEMIA
ISOVALÉRICA SOBRE PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO
EM CÉREBRO DE RATOS
GIORGIA MOURA DE BORTOLI
Orientador: Prof. Dr. MOACIR WAJNER
Co-orientadora: Profa. Dra. ALEXANDRA SUSANA LATINI
Dissertação para obtenção do título de Mestre
apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em
Diagnóstico
Genético
Molecular
Universidade Luterana do Brasil
Canoas RS, 2007.
da
“Não passo pela vida
e você também não deveria passar.
Bom mesmo é ir luta com determinação,
abraçar a vida e
viver com paixão,
perder a classe e vencer
com ousadia, porque o mundo
pertence a quem se atreve
e a vida é muito para ser insignificante.”
(Chaplin)
AGRADECIMENTOS
A todos do grupo de Erros Inatos do Metabolismo pelo excelente convívio.
Às amigas, bolsistas, e futuras colegas biomédicas: Bianca, Ângela, Carol,
Fernanda e Alana pela parceria sempre.
Aos meus colegas de faculdade, profissão, pós-graduação e acima de tudo
grande amigos: Vanessa, Paula, Silvana e Luis Fernando obrigado pela amizade.
À Manu, por ser a minha família aqui em Porto Alegre, pelas conversas,
desabafos, obrigada por ser uma amiga tão especial com quem pude contar em
todos os momentos.
Ao César, obrigado por ser sempre tão prestativo comigo.
Aos queridos Gus, Pati, Carol Viegas, Anelise e Anna Laura pelas dicas,
excelente convívio, e pelo clima alegre que sempre proporcionaram.
À Lucila, pelo coleguismo e ajuda com os trabalhos.
Aos queridos Rafa, Alexandre Solano e Carolzinha, pessoas incríveis, pelas
conversas, risadas, e por tornar meus dias no laboratório mais divertidos.
À Ana Paula, obrigada pelos conselhos, ajuda, carinho e amizade.
Ao Guilhian, “o chefe do estresse oxidativo”, indispensável para realização
desse trabalho, obrigada por estar sempre presente, ter paciência comigo, e
principalmente por ser um amigo maravilhoso.
Ao meu querido bolsista Alexandre, fundamental pela sua competência
dedicação, obrigada por tudo.
Ao professor Moacir, pela oportunidade maravilhosa de trabalhar em seu
laboratório, pelo carinho e dedicação demonstrados desde o primeiro momento.
Pelos ensinamentos, broncas, e elogios que com certeza me tornaram uma pessoa
melhor.
À Lali, minha amiga e co-orientadora, por estar sempre disposta a me ajudar,
e por ter me dado todo o apoio que precisei, te adoro baby.
Aos primos Débora e Luciano, por todo carinho.
Às minhas irmãs, pela amizade, companheirismo, respeito, e amor
incondicional...
Ao meu querido namorado, pela disposição de pegar um ônibus todos finais
de semana para ficar comigo, obrigado pela paciência, carinho e compreensão...
por estar sempre ao meu lado, fazer todas as minhas vontades, me apoiar em tudo,
e me fazer tão feliz.
Aos meus pais, pelo exemplo de amor, caráter... Por confiarem em mim,
acreditarem em mim, e acima de tudo por fazerem dos meus sonhos, os seus.
Dedico minha conquista a vocês, os melhores pais do mundo.
A Deus por ser tão generoso comigo.
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas
Lista de Figuras
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................
19
1.1 Erros Inatos do Metabolismo..................................................................
19
1.1.1 Acidemias Orgânicas..............................................................................
21
1.1.1.1 Acidemia Isovalérica.............................................................................
22
1.1.1.1.1 Aspectos Clínicos..............................................................................
25
1.1.1.1.2 Aspectos Bioquímicos.......................................................................
26
1.1.1.1.3 Deficiência da enzima.......................................................................
27
1.1.1.1.4 Aspectos moleculares........................................................................
27
1.1.1.1.5 Diagnóstico.......................................................................................
28
1.1.1.1.6 Tratamento.......................................................................................
29
1.2 Radicais livres..........................................................................................
30
1.2.1 Lipoperoxidação......................................................................................
32
1.2.2 Defesas antioxidantes.............................................................................
33
1.2.3 Estresse Oxidativo...................................................................................
33
1.2.4 Estresse Oxidativo em mitocôndrias ......................................................
35
1.2.5 Estresse Oxidativo e doenças neurodegenerativas................................
36
2 OBJETIVOS DO ESTUDO...........................................................................
39
2.1 Objetivo Geral.............................................................................................
39
2.2 Objetivos Específicos.................................................................................
39
3 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................
41
3.1 Reagentes..................................................................................................
41
3.1.2 Reagentes utilizados.............................................................................
41
3.1.3 Equipamentos e outros materiais............................................................
42
3.2 Caracterização da amostra........................................................................
43
3.3 Estudos in vitro........................................................................................
43
3.3.1 Preparação de frações enriquecidas de mitocôndrias............................
43
3.3.2 Preparação de membranas mitocondriais...............................................
44
3.4 Estudos ex vivo........................................................................................
44
3.4.1 Cirurgia Cerebral.....................................................................................
44
3.4.1.1 Procedimentos cirúrgicos.....................................................................
44
3.4.1.2 Anestesia..............................................................................................
44
3.4.1.3 Coordenadas do ventrículo lateral........................................................
45
3.4.1.4 Craniotomia e injeção da substância estudada....................................
45
3.4.1.5 Sacrifício dos animais e isolamento das substancias estudadas.........
46
3.4.1.6 Preparação dos homogeneizados de córtex, estriado e hipocampo
cerebral.............................................................................................................
46
3.5 Parâmetros de estresse oxidativo..........................................................
46
3.5.1 Lipoperoxidação....................................................................................
46
3.5.1.1 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS)........................
46
3.5.1.2 Quimiluminescência induzida por Ferro e Ácido Ascórbico..................
47
3.5.2 Medida da oxidação de proteínas........................................................
47
3.5.2.1 Medida de grupamentos sulfidrila em membranas mitocondriais.........
47
3.5.2.2 Formação de carbonilas.......................................................................
48
3.5.3 Medida das atividades antioxidantes não enzimáticas......................
48
3.5.3.1 Potencial antioxidante total (TRAP)......................................................
48
3.5.3.2 Determinação das concentrações de glutationa reduzida
(GSH)................................................................................................................
49
3.5.4 Medida das atividades das enzimas antioxidantes............................
49
3.5.4.1 Glutationa Peroxidase (GPx)................................................................
49
3.5.4.2 Catalase (CAT).....................................................................................
50
3.5.4.3 Superóxido Dismutase (SOD)..............................................................
50
3.6 Dosagem de proteínas ............................................................................
51
3.7 Análise estatítica......................................................................................
51
4 RESULTADOS..............................................................................................
52
4.1 Estudos in vitro...........................................................................................
52
4.1.1 Efeito in vitro dos metabólitos acumulados na acidemia isovalérica
sobre as substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em
preparações
mitocondriais
isoladas
de
cérebro
de
ratos 52
jovens................................................................................................................
4.1.2. Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a quimiluminescência induzida por íon ferroso (Fe2+) e
ácido ascórbico (ASC) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de
ratos jovens......................................................................................................
54
4.1.3 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre o conteúdo de grupamentos sulfidrila em membranas
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens...........................................
56
4.1.4 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a formação de carbonilas em preparações mitocondriais
isoladas de cérebro de ratos jovens ................................................................
58
4.1.5 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre o potencial antioxidante total (TRAP) em preparações
mitocondriais isoladas de ratos jovens.............................................................
60
4.1.6 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre as concentrações de glutationa reduzida (GSH) em
preparações
mitocondriais
isoladas
de
cérebro
de
ratos
jovens................................................................................................................
62
4.1.7. Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx) em
preparações
mitocondriais
isoladas
de
cérebros
de
ratos
jovens................................................................................................................
64
4.1.8 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) em
preparações
mitocondriais
isoladas
de
cérebro
de
ratos
jovens................................................................................................................
66
4.2 Estudos ex vivo.........................................................................................
68
4.2.1 Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico sobre a medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBA-RS) em córtex cerebral, hipocampo e estriado de cérebro de ratos
jovens 24 horas após a injeção........................................................................
4.2.2 Efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
68
isovalérico sobre o conteúdo de grupos sulfidrila em córtex cerebral,
estriado e hipocampo de cérebro de ratos jovens 24 horas após a injeção.....
70
4.2.3 Efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico (IVA) sobre as concentrações de glutationa reduzida (GSH) em
homogeneizado de córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos jovens 24
horas após a injeção.........................................................................................
71
4.2.4 Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico (IVA) sobre a atividade da glutationa peroxidase (GPx) em córtex
cerebral, hipocampo e estriado de cérebro de ratos jovens 24 horas após a
injeção..............................................................................................................
72
4.2.5 Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico (IVA) sobre a atividade da catalase (CAT) em córtex cerebral,
estriado e hipocampo de cérebro de ratos jovens 24 horas após a injeção ....
73
4.2.6 Efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD), em córtex
cerebral, estriado e hipocampo de cérebro de ratos jovens 24 horas após a
74
injeção..............................................................................................................
5 DISCUSSÃO..................................................................................................
76
6 CONCLUSÕES..............................................................................................
80
BIBLIOGRAFIA................................................................................................
82
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
3- OHIVA – ácido 3-hidroxiisovalérico
ABAP- 2, 2´-azo-bis-(2-amidinopropano)
ANOVA – análise de variância de uma via
ASC - ácido ascórbico
CAT- catalase
CG - cromatografia gasosa
DCF - 2, 7-diclorofluoresceína
DCFH-DA - diacetato de 2,7-diclorofluoresceína
DTNB – ácido 5,5’-ditio-bis (2-nitrobenzóico)
EDTA – ácido etileno-diamino-tetra-acético
EIM – erros inatos do metabolismo
ERN – espécies reativas de nitrogênio
ERO – espécies reativas de oxigênio
Fe II – íon ferroso
Fe III – íon férrico
GSH – glutationa reduzida
GSSG – glutationa oxidada
ICV - intracerebroventricular
IVA – ácido isovalérico
IVG – isovalerilglicina
LDL – lipoproteína de baixa densidade
L-NAME – N -nitro-L-argininametiléster
LOOH – hidroperóxido lipídico
LOO – radical peroxila
NAD+ – nicotinamida adenina dinucleotídeo
SNC – sistema nervoso central
SOD – superóxido dismutase
SPSS – pacote estatístico para ciências sociais
TBA – ácido tiobarbitúrico
TBA-RS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA – ácido tricloroacético
TRAP – potencial antioxidante total
TRO – trolox
LISTA DE FIGURA
Figura 1.1
Catabolismo da leucina.........................................................
Figura 1.2
Formação de espécies reativas de oxigênio via complexos
da cadeia respiratória............................................................
Figura 4.1
24
36
Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre as
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em
preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos
jovens....................................................................................
Figura 4.2
53
Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
sobre as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de
ratos jovens...........................................................................
Figura 4.3
Efeito
in
vitro
da
isovalerilglicina
(IVG)
sobre
53
as
substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em
preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos
jovens....................................................................................
Figura 4.4
Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a
quimiluminescência em preparações mitocondriais isoladas
de cérebro de ratos jovens....................................................
Figura 4.5
isoladas de cérebro de ratos jovens......................................
Efeito
in
vitro
da
isovalerilglicina
(IVG)
sobre
55
a
quimiluminescência em preparações mitocondriais isoladas
de cérebro de ratos jovens....................................................
Figura 4.7
55
Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
sobre a quimiluminescência em preparações mitocondriais
Figura 4.6
54
56
Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a medida de
grupos sulfidrila em membranas mitocondriais isoladas de
cérebro de ratos jovens.........................................................
57
Figura 4.8
Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
sobre a medida de grupos sulfidrila em membranas
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens...............
Figura 4.9
57
Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a medida de
grupos sulfidrila em membranas mitocondriais isoladas de
cérebro de ratos jovens.........................................................
Figura 4.10
58
Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a formação
de carbonilas em membranas mitocondriais isoladas de
cérebro de ratos jovens.........................................................
Figura 4.11
59
Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (30HIVA) sobre
a formação de carbonilas em membranas mitocondriais
isoladas de cérebro de ratos jovens......................................
Figura 4.12
59
Efeito in vitro da isovaleriglicina (IVG) sobre a formação de
carbonilas em membranas mitocondriais isoladas de
cérebro de ratos jovens.........................................................
Figura 4.13
60
Efeito do ácido isovalérico (IVA) sobre o potencial
antioxidante total (TRAP) em preparações mitocondriais
isoladas de cérebros de ratos jovens....................................
Figura 4.14
61
Efeito do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre o
potencial antioxidante total (TRAP) em preparações
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens...............
Figura 4.15
Efeito
da
isovalerilglicina
(IVG)
sobre
o
potencial
antioxidante total (TRAP) em preparações mitocondriais
isoladas de cérebro de ratos jovens.....................................
Figura 4.16
62
Efeito do ácido isovalérico (IVA) sobre as concentrações
de
glutationa
reduzida
(GSH)
em
preparações
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens...............
Figura 4.17
61
63
Efeito do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre as
concentrações
de
glutationa
reduzida
(GSH)
em
preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos......
63
Figura 4.18
Efeito da isovalerilglicina (IVG) sobre as concentrações de
glutationa (GSH) em preparações mitocondriais isoladas
de cérebro de ratos jovens....................................................
Figura 4.19
64
Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade
da enzima glutationa peroxidase (GPx) em preparações
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens...............
Figura 4.20
65
Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx)
em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos
jovens....................................................................................
Figura 4.21
65
Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da
enzima glutationa peroxidase (GPx) em preparações
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens...............
Figura 4.22
66
Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade
da enzima superóxido dismutase (SOD) em preparações
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens...............
Figura 4.23
67
Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA)
sobre a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD)
em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos
jovens...................................................................................
Figura 4.24
67
Efeito in vitro da isovalerilgicina (IVG) sobre a atividade da
enzima superóxido dismutase (SOD) em preparações
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens...............
Figura 4.25
68
Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) de
ácido isovalérico sobre os níveis das substancias reativas
ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em córtex cerebral (A),
hipocampo (B) e estriado (C) de cérebro de ratos jovens 24
horas após a injeção............................................................
Figura 4.26
Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.)
sobre a formação de grupamentos sulfidrila em córtex
cerebral (A), hipocampo (B) e estriado (C) de cérebro de
69
ratos jovens 24 horas após a injeção...................................
Figura 4.27
70
Efeito da administração I.C.V. do ácido isovalérico sobre
os níveis de glutationa reduzida (GSH) em homogeneizado
de córtex cerebral (A), estriado (B) e hipocampo (C) de
ratos jovens 24 horas após a injeção...................................
Figura 4.28
72
Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.)
sobre a atividade da enzima antioxidante glutationa
peroxidase (GPx) em homogeneizado de córtex (A),
estriado (B) e hipocampo (C) de cérebro de ratos jovens 24
horas após a injeção.............................................................
Figura 4.29
73
Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.)
sobre a atividade da enzima antioxidante catalase (CAT)
em homogeneizado de córtex (A), estriado (B) e
hipocampo (C) de cérebro de ratos jovens 24 horas após a
injeção...................................................................................
Figura 4.30
74
Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.)
sobre a atividade da enzima antioxidante superóxido
dismutase (SOD) em homogeneizado de córtex (A),
hipocampo (B) e estriado (C) de cérebro de ratos jovens 24
horas após a injeção.............................................................
75
RESUMO
A acidemia isovalérica é uma doença hereditária neurometabólica causada
pela deficiência da isovaleril-CoA desidrogenase da rota de degradação da leucina.
É caracterizada bioquimicamente pelo acúmulo nos tecidos e líquidos biológicos dos
pacientes principalmente dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3OHIVA), bem como da isovalerilglicina (IVG). Os pacientes apresentam também
acidose metabólica, acidúria lática, cetonúrica, e hiperamonemia moderadas.
Clinicamente a doença caracteriza-se por sintomas neurológicos severos, tais como
convulsões, coma e letargia. Tendo em vista que os mecanismos envolvidos no
dano cerebral dessa doença até o momento são pouco conhecidos, o presente
trabalho teve por objetivo verificar se os principais compostos acumulados nos
tecidos de pacientes com acidemia isovalérica provocam dano oxidativo celular in
vitro e ex vivo em cérebro de ratos jovens (30 dias) com o intuito de contribuir para
uma melhor compreensão da fisiopatogenia do dano neurológico dessa doença.
Nossos resultados in vitro demonstraram que a presença de IVG no meio de
incubação provocou um aumento seletivo dos níveis de quimiluminescência em
preparações mitocondriais de cérebro de ratos jovens, indicando que a IVG induz a
lipoperoxidação. Além disso, os IVA e 3-OHIVA foram capazes de aumentar
significativamente a formação de carbonilas, indicando dano oxidativo a proteínas
em preparações mitocondriais. Os outros parâmetros estudados não foram alterados
por
estes
metabólitos.
Estudamos
também
os
efeitos
da
administração
intracerebroventricular I.C.V. do IVA sobre vários parâmetros de estresse oxidativo
em homogeneizado de córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos jovens.
Verificamos um aumento significativo nos níveis da substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBA-RS) em homogeneizado de córtex e estriado, sem alteração no
hipocampo. Encontramos também um aumento significativo na oxidação de
proteínas, através da medida de grupamentos sulfidrila em homogeneizado de
córtex cerebral, sem que houvesse alteração dessa medida em hipocampo e
estriado. Além disso, a administração I.C.V. do IVA não alterou os níveis de
glutationa reduzida (GSH) (a principal defesa antioxidante não enzimática do
cérebro) em todos os tecidos estudados. No que se refere às defesas antioxidantes
enzimáticas, as atividades da glutationa peroxidase e da superóxido dismutase
também não foram alteradas pelo IVA nas estruturas cerebrais estudadas, enquanto
a atividade da catalase foi significativamente aumentada em estriado pelo IVA. Os
aumentos de TBA-RS (lipoperoxidação) e da atividade da catalase no córtex
cerebral ex vivo indicam que radicais peróxidos ou derivados possam estar atuando
neste efeito. A análise conjunta dos resultados in vitro e ex vivo indica que os
principais metabólitos acumulados na acidemia isovalérica não provocam um dano
oxidativo extenso em cérebro de ratos jovens. Entretanto, é possível que as
pequenas
alterações
encontradas
nos
parâmetros
de
estresse
oxidativo
identificados no presente trabalho possam agir sinergicamente com outros
mecanismos, como por exemplo, uma disfunção energética para explicar a disfunção
neurológica encontrada pelos pacientes afetados pela acidemia isovalérica.
ABSTRACT
Isovaleric acidemia is an inherited neurometabolic disorder caused by
deficiency of isovaleryl-CoA dehydrogenase of the catabolism of leucine. It is
biochemically
characterized
by
accumulation
of
isovaleric
acid
(IVA),
3-
hydroxyisovaleric acid (3-OHIVA), as well as isovalerylglycine (IVG) in tissues and
biological fluids of the affected individuals. Patients also present metabolic acidosis,
lactic
aciduria,
ketonuria
and
moderate
hiperammonemia.
Clinically,
it
is
characterized by severe neurological symptoms, such as convulsions, coma and
lethargy. Since the mechanisms involved in the cerebral damage in this disorder are
still poorly known, the present work aimed to investigate whether the major
compounds accumulating in tissues of isovaleric academic patients cause cellular
oxidative damage in vitro and in vivo in brain of young (30-day-old) rats in the hope to
contribute to the understanding of the pathogenesis of the neurologic damage in this
disorder. Our in vitro data showed that the presence of IVG in the incubation medium
provoked a selective increase of quimiluminescence levels in mitochondrial
preparations, indicating that IVG induces lipid peroxidation. Furthermore, IVA and 3OHIVA significantly increased carbonyl formation, suggesting a protein oxidative
damage in mitochondrial preparations. The other parameters evaluated were not
altered by these metabolites. We also evaluated the effects of intracerebroventricular
(I.C.V.) administration of IVA on various oxidative stress parameters in homogenates
from cerebral cortex, striatum and hippocampus of young rats. We verified a
significant increase of reactive substances to barbituric acid (TBA-RS) in cerebral
cortex and striatum homogenates, with no alteration in the hippocampus. We also
found a significant increment of protein oxidation, determined by sulfhydryl groups in
cerebral cortex homogenates, but no alteration of this measure in hippocampus and
striatum. Besides, ICV administration of IVA did not alter reduce glutathione (GSH)
(the main nonenzymatic antioxidant brain defense) in all tissues studied. Regarding
the enzymatic antioxidant defenses, the activities of glutathione peroxidase and
superoxide dismutase were not altered by IVA in all brain tissues, whereas that of
catalase was significantly increased in the cerebral cortex by this organic acid. The
increases of TBA-RS (lipid peroxidation) ex vivo and of catalase activity ex vivo
indicate that peroxide radicals or their derivatives may be involved in this effect.
Taken together our in vitro and ex vivo results, it may be presumed that the
metabolites accumulating in isovaleric acidemia do not provoke a substantial
oxidative damage in brain of young rats. However, it is feasible that the little
alterations found in the oxidative stress parameters detected in the present study
may synergistically act with other mechanisms, such as energetic dysfunction in
order to explain the neurologic dysfunction found in patients affected by isovaleric
acidemia.
1 INTRODUÇÃO
1.1. Erros inatos do metabolismo
Erros inatos do metabolismo são distúrbios hereditários, na maioria dos casos
de herança autossômica recessiva, cuja característica bioquímica principal é a
deficiência ou ausência da atividade de uma enzima específica de uma rota
metabólica (WABER, 1999).
O termo erros inatos do metabolismo (EIM) foi utilizado pela primeira vez por
Archibald Garrod em 1908 durante estudos realizados com pacientes com
alcaptonúria, doença em que os pacientes afetados excretam grandes quantidades
de ácido homogentísico na urina. O pesquisador observou que, freqüentemente, um
ou mais indivíduos da mesma família eram afetados sem que seus pais ou demais
parentes apresentassem a doença. Baseado também na observação da maior
incidência de consangüinidade entre os pais dos pacientes e nas leis de Mendel,
Garrod propôs um modelo de herança autossômica recessiva para este distúrbio.
Através da determinação do ácido homogentísico na urina de pacientes com
alcaptonúria e da observação de que esta substância era um metabólito normal da
degradação da tirosina, ele relacionou este acúmulo a um bloqueio na conversão do
ácido homogentísico até fumarato e acetoacetato. Verificou-se mais tarde que tais
alterações resultavam da síntese qualitativa ou quantitativamente anormal de uma
proteína, enzimática ou não (SCRIVER et al., 2001).
EIM ocorrem na maioria das vezes devido a um defeito enzimático específico
que determina um bloqueio de uma via metabólica. Este bloqueio, por sua vez,
ocasiona o acúmulo do substrato ou a deficiência do produto da reação, ou então o
desvio da rota metabólica com formação de outro produto final. Individualmente
raros, têm uma incidência em conjunto estimada em 1:500 a 1:1000 recém-nascidos
vivos
(TRIFILETTI
&
PACKARD,
1999;TOUATI
et
al.,
2003).
Mais
20
de 500 erros inatos do metabolismo foram descritos e a maioria deles, envolve
processos de síntese, degradação, transporte e armazenamento de moléculas no
organismo (SCRIVER et al., 2001).
Os pacientes portadores de EIM apresentam sintomatologia variada e
inespecífica, mesmo aqueles que possuem o mesmo distúrbio. Essa variação
fenotípica deve-se a diferentes graus de deficiência enzimática, áreas do
metabolismo envolvidas e tecidos afetados. No entanto, as manifestações clínicas
mais comuns são as disfunções neurológicas com retardo neuropsicomotor e
neurodegeneração progressiva (BURTON, 1987).
Os EIM foram classificados por Sinclair (1982), em quatro grupos,
dependendo da função exercida pela enzima deficiente e do tecido envolvido, bem
como dos aspectos clínicos, bioquímicos, patológicos e terapêuticos:
1) Desordens de transporte: afetam basicamente o transporte renal e/ou
intestinal de moléculas orgânicas ou inorgânicas. Exemplos: deficiências de
dissacaridases, defeito no transporte de magnésio e Doença de Hartnup.
2) Desordens de armazenamento, degradação e secreção: envolvem
proteínas de organelas celulares como o aparelho de Golgi ou os lisossomas. Ocorre
o acúmulo de macromoléculas em tecidos específicos. Exemplos: doenças
lisossômicas de depósito, glicogenoses e cistinose.
3) Desordens de síntese: deficiência na síntese de proteínas ou outras
substâncias com funções importantes tais como hormônios, proteínas plasmáticas e
de defesa imunológica. Exemplos: hiperplasia adrenal congênita por deficiência da
enzima 21-hidroxilase da rota da síntese do cortisol.
4) Desordens do metabolismo intermediário: caracterizam-se por deficiências
enzimáticas das rotas do metabolismo intermediário de moléculas pequenas,
comprometendo importantes rotas, como o ciclo do ácido tricarboxílico, o ciclo da
uréia, ou outras rotas. Assim, o substrato da enzima deficiente se acumula e, a
menos que haja uma rota alternativa para metabolizá-lo, o produto final da reação
21
não será formado. Os mecanismos de dano tecidual podem ocorrer pela ação do
substrato acumulado que pode ser tóxico, levando a alterações bioquímicas e danos
em determinados tecidos por ser liberado na circulação e transportado para todo o
organismo, por seus metabólitos tóxicos ou pela falta de substâncias essenciais ao
desenvolvimento do organismo, causada pelo bloqueio metabólico. Considerados os
mais freqüentes EIM, esse grupo de desordens têm como exemplo as acidúrias
orgânicas, as aminoacidopatias, as desordens do metabolismo das purinas e
pentoses, e outros.
1.1.1. Acidemias Orgânicas
As acidemias ou acidúrias orgânicas são erros inatos do metabolismo nos
quais um ou mais ácidos orgânicos acumulam-se nos tecidos dos pacientes afetados
devido à deficiência da atividade de uma enzima do metabolismo de aminoácidos,
lipídeos ou carboidratos (CHALMERS & LAWSON, 1982; SCRIVER et al., 2001).
Vários ácidos orgânicos estão presentes no sangue e na urina de indivíduos
normais, porém em concentrações reduzidas. Nos pacientes com estes distúrbios,
estes ácidos encontram-se em altas concentrações no sangue e, principalmente, na
urina.
Devido ao desconhecimento da classe médica, pela falta de laboratórios
especializados e pela dificuldade de diagnóstico, a freqüência destas doenças na
população em geral é pouco conhecida. Na Holanda, país considerado referência
para o diagnóstico de erros inatos do metabolismo, a incidência destas doenças é
estimada em 1: 2.200 habitantes, enquanto que na Alemanha, Israel e Inglaterra é
de aproximadamente 1:6.000 – 1:9.000 recém-nascidos (HOFFMANN et al., 2004).
Na Arábia Saudita, onde a taxa de consangüidade é elevada, a freqüência é de 1:
740 nascidos vivos (RASHED et al., 1994).
No início da década de 80, foi demonstrado que estes distúrbios eram os
erros inatos do metabolismo mais freqüentes em crianças severamente enfermas
22
(CHALMERS et al., 1980), o que motivou maiores estudos clínico-laboratoriais e
epidemiológicos nos anos que se seguiram.
As acidemias orgânicas provocam principalmente manifestações neurológicas
que
incluem
o
retardo
mental,
desordem
de
movimentos,
epilepsia
e
leucoencefalopatia (BARTH et al., 1992; HÜMER et al., 1998; KÖLKER et al., 2006).
Há um subgrupo de acidemias orgânicas chamado “acidemias orgânicas
cerebrais”, porque o quadro clínico dos afetados é exclusivamente neurológico.
Entretanto os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral das acidemias
orgânicas são pouco entendidos (HOFFMANN et al., 1994).
Clinicamente os pacientes afetados apresentam regressão neurológica,
convulsões, coma, ataxia, hipotonia, hipertonia, irritabilidade, tremores, movimentos
coreatetóticos, tetraparesia espástica, atraso no desenvolvimento psicomotor e
outros. As mais freqüentes manifestações laboratoriais são cetose, cetonúria,
neutropenia, trombocitopenia, acidose metabólica, baixos níveis de bicarbonato,
hiperglicinemia, hiperglicinúria, hiperamonemia, hipo/hiperglicemia, acidemia lática,
aumento dos níveis séricos de ácidos graxos livres, bem como cheiro peculiar na
urina e/ou suor (SCRIVER et al., 2001). A tomografia computadorizada e
ressonância magnética nuclear mostram que os pacientes afetados por estas
doenças
freqüentemente
apresentam
alterações
de
substância
branca
(hipomielização e/ou desmielização), atrofia cerebral generalizada ou de gânglios da
base (necrose ou calcificação), megaencefalia, atrofia frontotemporal e atrofia
cerebelar (MAYATEPEK et al., 1996).
1.1.1.1. Acidemia Isovalérica
A acidemia isovalérica (IVA [MIM 243500]) é um erro inato do catabolismo da
leucina
causado
pela
deficiência
da
atividade
da
enzima
isovaleril-CoA
desidrogenase (IVD), uma flavoproteína mitocondrial que transfere elétrons via
cadeia respiratória (Figura 1.1) (TANAKA et al., 1966). O defeito enzimático resulta
no acúmulo de derivados de isovaleril-CoA que se converte em ácido isovalérico, o
23
qual está geralmente aumentado no plasma e na urina. As concentrações de
isovalerilglicina e do ácido 3-hidroxiisovalérico também se elevam na urina dos
pacientes afetados (BAULNY e SAUDUBRAY, 2002).
Foi o primeiro distúrbio do metabolismo de ácidos orgânicos diagnosticado
por cromatografia gasosa (GC), sendo esta técnica até o momento o melhor método
analítico disponível para ácidos orgânicos (TANAKA et al., 1966; VOLCKEY &
ENSENAUER, 2006). Mais de 70 casos de acidemia isovalérica já foram relatados.
A tecnologia da espectrometria em massa em Tandem (MS/MS ou MS em Tandem)
também tem se tornado útil para o diagnóstico da acidemia isovalérica pela detecção
da elevação da isovalerilcarnitina no sangue.
24
Enzima
Metabólitos
L-Leucina
Transaminase
Ácido 2-Oxo-Isocapróico
Ácido 2-Oxo Desidrogenase
Isovaleril-CoA
Isovaleril-CoA Desidrogenase
3-Metilcrotonil-CoA
3-Metilcrotonil-CoA Carboxilase
3-Metilglutaconil-CoA
3-Metilglutaconil-CoA Hidratase
3-Hidroxi-3-Metilglutaril-CoA
3-Hidroxi-3-Metilglutaril-CoA
Liase*
Redutase
*
Ácido Isovalérico
Isovlerilglicina
Ácido 3-OH-Isovalérico
Ácido 4-OH-isovalérico
Ácido Mesacônico
Ácido Metilsuccinico
Isovalerilglucoronídeo
Ácido Isovalerilglutâmico
Isovalerilalanina
Isovalerilsarcosina
Ácido3-OH-Isoheptanóico
Isovalerilcarnitina
Ácido 3-Metilcrotônico
3-Metilcrotonilglicina
Ácido 3-OH-Isovalérico
3-OH-Isovalerilcarnitina
Ácido3-Metilglutacônico
Ácido 3-Metilglutárico
3-Metilglutarilcarnitina
Ácido 3-OH-3-Metil
glutárico
*
Ácido Acetoacético Acetil-CoA Ácido Mevalônico
Colesterol
Figura 1.1- Catabolismo da Leucina (adaptado de Scriver et al., 2001)
Mevalono
Lactona
25
1.1.1.1.1 Aspectos Clínicos
A acidemia isovalérica pode apresentar fundamentalmente dois fenótipos
diferentes (TANAKA, 1990; SWEETMAN & WILLIANS, 2001). O primeiro é a forma
aguda, no qual os pacientes têm sintomas neurológicos severos nos primeiros dias
de vida (TANAKA et al., 1966; BUDD et al., 1967; EFRON, 1967; LOTT et al., 1972;
LEVY et al., 1973; ELSAS & NAGLAK, 1988). O segundo grupo é caracterizado por
sintomas relativamente não específicos e de apresentação crônica (forma
intermitente crônica) (LEVY et al., 1973; SHIH et al., 1984; BERRY et al., 1988;
ELSAS & NAGLAK, 1988, MEHTA et al., 1996).
Aproximadamente metade dos pacientes apresenta a doença neonatal severa
e aguda e a outra metade a forma intermitente e crônica. As duas formas são
devidas ao mesmo defeito bioquímico, ou seja a deficiência da atividade da
desidrogenase da isovaleril-CoA.
Na forma severa aguda, 3 a 6 dias após o nascimento as crianças começam a
recusar o alimento, iniciam a vomitar, tornando-se desidratadas, desatentas e
letárgicas. Podem também se apresentar hipotérmicas, com tremores e convulsões
(COHN et al., 1978). Um odor de pés suados devido à elevação do ácido isovalérico
é descrito. Também ocorrem acidose metabólica com suave a moderada cetonúria,
acidemia lática, hiperamonemia, trombocitopenia, neutropenia ou pancitopenia e
hipocalcemia (FISCHER et al., 1981). Após, os pacientes tornam-se cianóticos e
entram em coma seguido de morte. Mais da metade dos pacientes inicialmente
relatados com a forma aguda não sobreviveram, mas com o rápido diagnóstico e as
recentes melhoras na terapia, com a administração de glicina e carnitina, o resultado
do tratamento tem sido muito mais favorável nos últimos anos.
Na forma crônica é menos grave. O primeiro episódio da doença geralmente
ocorre durante o primeiro ano de vida. Os episódios subseqüentes freqüentemente
ocorrem após infecções respiratórias ou aumento da ingestão de alimentos ricos em
proteínas. Tipicamente envolvem vômitos, letargia progredindo para o coma, acidose
com cetonúria e o característico odor de pés suados (SHIH et al., 1984). Nestas
26
situações, é necessária a restrição de proteínas e infusão de glicose. Achados
adicionais
que
podem
ocorrer
durante
os
episódios
incluem
diarréia,
trombocitopenia, neutropenia, pancitopenia, e em alguns casos alopecia e
hiperglicemia; o último pode ser erroneamente confundido com cetoacidose
diabética. Hiperglicemia pode ocorrer em várias acidemias orgânicas, incluindo a
acidemia isovalérica.
Alguns pacientes com a forma crônica intermitente da
acidemia isovalérica tem desenvolvimento psicomotor normal, mas alguns têm o
desenvolvimento atrasado e lento ou mesmo retardo mental severo. Muitos
pacientes adquirem uma aversão natural para alimentos ricos em proteínas.
Recentemente, um terceiro grupo de indivíduos com anormalidades
bioquímicas leves foi identificado através da análise de sangue de recém nascidos
por espectrometria em massa em Tandem (MS/MS) (triagem neonatal em massa).
Estes pacientes assintomáticos apresentam mutações no gene da IVD e apresentam
pequenas alterações bioquímicas e estão sendo identificados em um numero cada
vez maior, podendo, portanto, representar um fenótipo adicional da acidemia
isovalérica (ENSENAUER, 2004).
1.1.1.1.2 Aspectos bioquímicos
O nome acidemia isovalérica deriva da concentração elevada de ácido
isovalérico encontrada no sangue dos pacientes (TANAKA et al., 1966). A
concentração normal de ácido isovalérico no plasma é menor do que 10 M. Durante
a remissão da doença em tratamento os pacientes podem ter uma concentração de
ácido isovalérico normal ou até 10 vezes o normal (10-100
M), mas durante
episódios severos os níveis alcançam até 100 a 500 vezes os níveis normais (600 a
5.000 M). A quantidade do ácido isovalérico na urina dos pacientes afetados é na
ordem de 8 a 300 mol/dia (normal menos que 2 mol/dia).
Por outro lado, o metabólito da isovaleril-CoA que mais se acumula devido à
deficiência de atividade da isovaleril-CoA desidrogenase não é o seu produto da
hidrólise, o ácido isovalérico, mas um composto amido produzido pela conjugação
com a glicina, a isovalerilglicina. Essa reação é catalizada pela enzima mitocondrial
27
glicina N-acilase, a qual também forma benzoilglicina (ácido hipúrico) a partir de
benzoil-CoA. A excreção urinária de isovalerilglicina por pacientes com acidemia
isovalérica varia de 2.000 a 15.000 mol/dia, comparado com excreções normais de
menos do que 15 mol/dia. A excreção é maior durante episódios agudos, mas é
ainda muito alta durante a remissão. Durante episódios agudos, quando a
quantidade de isovaleril CoA é muito aumentada, a capacidade da glicina N-acilase
é excedida, e o ácido isovalérico livre se torna elevado. Um segundo metabólito do
ácido isovalérico que foi identificado é o ácido 3-hidroxi-isovalérico. Ele é excretado
em quantidades anormais durante episódios agudos, quando pode estar tão alto
quanto 3.000 mol/dia. A isovaleril-CoA pode formar também isovalerilcarnitina. No
plasma ou em sangue em papel de filtro, a detecção de isovalerilcarnitina elevada é
importante para o diagnóstico da doença (ROE et al., 1984).
1.1.1.1.3 Deficiência da Enzima
A enzima isovaleril-CoA desidrogenase é um homopolímero de quatro
subunidades idênticas. A oxidação do ácido isovalérico para CO2 em leucócitos e a
oxidação da leucina para CO2 em fibroblastos é deficiente em pacientes com
acidemia isovalérica. Uma técnica sensível para medir a atividade da isovaleril-CoA
desidrogenase baseia-se na liberação de trício da isovaleril-CoA. A atividade da
enzima na mitocôndria isolada de fibroblastos de pacientes com acidemia isovalérica
é da ordem 0 a 3,5% do normal (SHIH et al., 1973).
1.1.1.1.4 Aspectos moleculares
A acidemia isovalérica é uma doença autossômica recessiva. O gene da
isovaleril-CoA desidrogenase está localizado no cromossomo humano 15q14-q15,
consistindo de 12 exons e aproximadamente 15 kb de DNA (PARIMOO & TANAKA,
1993). Análises moleculares do gene IVD em pacientes com sintomática acidemia
isovalérica tem identificado diferentes mutações (DUBIEL et al., 1983; VOCKLEY et
al., 2006). A apresentação aguda neonatal e a forma intermitente crônica podem
ocorrer na mesma família, sugerindo que a heterogeneidade clínica é causada por
28
fatores não genéticos ou por genes reguladores. Porém, os estudos genéticos
complementares indicam que os pacientes afetados com a doença apresentam
envolvimento de um único locus.
1.1.1.1.5 Diagnóstico
O diagnóstico da acidemia isovalérica requer análise de ácidos orgânicos,
porque os aspectos clínicos são comuns para várias acidúrias orgânicas. Um odor
de pés suados durante os episódios agudos pode ser sugestivo de acidemia
isovalérica, mas deve ser distinguido de um odor similar que pode ocorrer na
acidúria glutárica tipo II devido ao acúmulo dos ácidos isobutírico, 2-metilbutírico e
isovalérico. A acidemia isovalérica deve ser considerada no diagnóstico diferencial
de recém nascidos ou crianças mais velhas em que ocorre uma combinação de
recusa
alimentar,
vômitos,
letargia,
coma,
acidose
metabólica,
cetose,
hiperamonemia, hipocalcemia, neutropenia, trombocitopenia, e pancitopenia. A
análise de ácidos orgânicos de cadeia curta voláteis no plasma mostra elevação do
ácido isovalérico sem elevação dos outros ácidos de cadeia curta, sugerindo o
diagnóstico de acidemia isovalérica. No entanto, análises confiáveis de ácidos de
cadeia curta no plasma são difíceis, e com freqüência não são prontamente
disponíveis. Assim, prefere-se a análise do perfil geral de ácidos que mostra
elevações da isovalerilglicina e do ácido 3-hidroxi-isovalérico (TANAKA et al., 1980;
LOOTS et al., 2005). Além disso, também se encontra elevações não específicas de
lactato, bem como dos ácidos 3-hidroxibutírico e acetoacético (corpos cetônicos).
Durante a remissão, o único metabólito observado comumente é a isovalerilglicina
(1000 a 3000 mmol/mol de creatinina). A análise dos ésteres de carnitina no sangue
e urina é complementar à análise de ácidos orgânicos para o diagnóstico da
acidemia isovalérica. As acil-CoAs estão em equilíbrio com as suas acilcarnitinas,
sendo as últimas presentes no plasma e prontamente excretadas na urina. A
isovalerilcarnitina, portanto, em pequenas quantidades (10 a 20 mmol/mol de
creatinina) tem sido identificada por tandem MS na urina de pacientes com acidemia
isovalérica, mesmo durante a remissão. A administração oral 100mg/kg de Lcarnitina aumenta a excreção de isovalerilcarnitina até aproximadamente 3200
29
mmol/mol de creatinina, sugerindo que a administração de L-carnitina aumentaria a
confiabilidade do diagnóstico da acidemia isovalérica por detecção de acilcarnitinas
na urina.
O diagnóstico da acidemia isovalérica pode ser confirmado pela deficiência
severa da atividade da isovaleril-CoA desidrogenase em fibroblastos pela liberação
de trício (HYMAN et al., 1986; LOOTS, 2005).
O diagnóstico pré-natal da acidemia isovalérica pode ser feito pela detecção
da atividade da isovaleril-CoA desidrogenase em cultura de amniócitos ou pela
detecção do ácido isovalérico e da isovalerilglicina em concentrações elevadas no
líquido amniótico colhido durante amniocentese (HINE et al., 1986; SHIGEMATSU et
al., 1991).
1.1.1.1.6 Tratamento
O tratamento de pacientes afetados por acidemia isovalérica durante os
episódios agudos é praticamente o mesmo dos afetados por outras acidúrias
orgânicas e consta fundamentalmente de hidratação, infusão de glicose para prover
calorias e reduzir o catabolismo protéico endógeno e infusão de bicarbonato de
sódio para controlar a acidose. O tratamento durante a recuperação e remissão
geralmente consiste na restrição de uma dieta natural protéica (1,5 g/Kg de proteína
por dia), bem como de leucina na dieta que é precursora do ácido isovalérico. Este
tratamento tem sido efetivo na diminuição da freqüência dos episódios de
descompensação metabólica.
Por outro lado, a concentração de glicina no plasma de pacientes com
acidemia isovalérica tende a diminuir durante episódios agudos, sugerindo que
quantidades insuficientes de glicina estão disponíveis para a síntese da
isovalerilglicina. Assim, o aumento da concentração de glicina plasmática através da
ingestão de glicina (250 mg/Kg por dia de glicina dividida em 3 doses) é
aconselhável no tratamento desses pacientes à longo prazo, o que provocaria um
aumento da razão isovaleril-glicina/ácido isovalérico por aumento da concentração
30
de isovalerilglicina. Quando a glicina foi dada oralmente com um competidor da
leucina para um paciente com acidemia isovalérica o usual aumento do ácido
isovalérico no plasma foi prevenido e a excreção de isovalerilglicina dobrado (DE
SOUZA et al., 1986; ELSAS & NAGLAK, 1988).
Além disso, vários pacientes com acidemia isovalérica apresentam uma
deficiência de carnitina total e alta percentagem de carnitina esterificada no plasma e
na urina. Daí ser aconselhável tratá-los rotineiramente com L-carnitina (100 mg/Kg
por dia).
1.2. Radicais livres
Um radical livre (RL) é uma estrutura química que possui um elétron
desemparelhado, ou seja, ocupando um orbital atômico ou molecular sozinho. Isso o
torna muito instável, extraordinariamente reativo e com enorme capacidade para
combinar-se inespecificamente com as diversas moléculas (HALLIWELL &
GUTERIDGE, 2000; HALLIWELL & GUTERIDGE, 2006). Os radicais livres podem
ser formados pela perda de um elétron de um não-radical ou pelo ganho de um
elétron por um não-radical.
Radicais podem também ser formados em um processo de fissão homolítica,
no qual uma ligação covalente é quebrada e cada elétron do par compartilhado
permanece com cada um dos átomos envolvidos (HALLIWELL & GUTTERIDGE,
1999; HALLIWELL & GUTERIDGE, 2006). Quando um radical livre reage com um
composto não-radical, outro radical livre pode ser formado; assim, a presença de um
único radical pode iniciar uma seqüência de reações em cadeia de transferência de
elétrons (redox) (MAXWELL, 1995). Nas reações em cadeia induzidas pelos radicais
livres, um radical reativo leva à formação de um produto que também é um radical
livre e que, por sua vez, reage produzindo um terceiro radical. Em condições
fisiológicas do metabolismo celular aeróbio, o oxigênio molecular (O2) sofre redução
tetravalente, com aceitação de quatro elétrons, resultando na formação de água
(H2O). No entanto, aproximadamente 5% do oxigênio utilizado na cadeia respiratória
31
mitocondrial não é completamente reduzido à água, podendo ser convertido a
intermediários reativos como o radical superóxido (O2•−) e hidroxila (OH•), e também
o peróxido de hidrogênio (H2O2), processo esse que pode ser exacerbado em
condições patológicas (BOVERIS & CHANCE, 1972).
O termo genérico espécies reativas de oxigênio (ERO) é usado para incluir
não só os radicais formados pela redução do O2 (O2•− e OH•), mas também alguns
não-radicais derivados do oxigênio, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), o
oxigênio singlet (1O2) (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Além dessas, existem
ainda as espécies reativas de nitrogênio (ERN), sendo o óxido nítrico (NO•) e o
peroxinitrito (ONOO-) as principais representantes.
As ERO e ERN ocorrem tanto em processos fisiológicos quanto patológicos
do organismo. Fisiologicamente essas espécies reativas apresentam diversas
funções (BERGENDI et al., 1999). Assim, um aumento da liberação local de radicais
livres pode ser benéfico, como é o caso da liberação de espécies tóxicas oxidantes
pelos neutrófilos, que podem atuar na defesa do hospedeiro contra uma infecção
(DELANTY & DICHTER, 1998; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2000). Participam
ainda de processos de sinalização celular e também estão envolvidos na síntese e
regulação de algumas proteínas (WARD & PETERS, 1995).
Por outro lado, quando formadas em excesso, essas espécies altamente
reativas tem o potencial de oxidar moléculas biológicas incluindo proteínas, lipídios e
DNA (MAXWELL, 1995). Com relação aos efeitos prejudiciais das reações oxidantes
ao organismo, os radicais livres podem promover lipoperoxidação; podem causar a
oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (LDL); podem reagir com proteínas,
levando à sua inativação e conseqüente alteração de sua função; e podem também
reagir com o DNA e RNA, levando a mutações somáticas e a distúrbios de
transcrição (DELANTY & DICHTER, 1998), entre outros efeitos.
32
1.2.1 Lipoperoxidação
Antes de ser vista como um mecanismo de dano oxidativo, a lipoperoxidação
deve ser considerada como um processo fisiológico contínuo que ocorre
normalmente nas membranas celulares. Além de ser um fator de renovação da
membrana, este processo é essencial na síntese de prostaglandinas e leucotrienos,
bem como na fagocitose e pinocitose. No entanto, por serem formadas em grande
parte por lipídios insaturados e proteínas, as membranas são particularmente
vulneráveis ao ataque oxidativo. Assim, quando a produção de espécies reativas
aumentar além da capacidade de detoxificação, esse processo será exacerbado, e
com isso, a lipoperoxidação poderá acarretar profundas alterações na estrutura e na
permeabilidade das membranas celulares. Isso irá causar perda de seletividade na
troca iônica, liberação do conteúdo de organelas e formação de produtos citotóxicos
como o malondialdeído e o 4-hidroxinonenal, entre outros eventos (FERREIRA &
MATSUBARA, 1997; BECKMAN & AMES, 1998).
A lipoperoxidação é representada pelas etapas de iniciação, propagação e
terminação. A iniciação é causada pelo ataque a um lipídio de membrana por parte
de qualquer espécie que tenha reatividade suficiente para abstrair um átomo de
hidrogênio de um grupo metileno (-CH2-). Nesse contexto, radicais hidroxila podem
prontamente iniciar a lipoperoxidação. Já que o átomo de hidrogênio tem apenas um
elétron, a abstração de H• de um grupo metileno deixa um elétron desemparelhado
no carbono (-•CH-). Esse radical formado é geralmente estabilizado por um rearranjo
molecular, formando um dieno conjugado. O destino mais provável desse radical é
reagir com o O2, formando um radical peroxila (ROO•). Os radicais peroxila, por sua
vez, são capazes de abstrair um próton de outra molécula lipídica, sendo esta fase
conhecida como a fase de propagação. O radical de carbono formado pode reagir
com o O2 para formar outro radical peroxila, e assim sucessivamente. A abstração
de um hidrogênio de outro lipídio por parte do radical peroxila gerará um
hidroperóxido lipídico (LOOH). O término da reação poderá ocorrer quando dois
radicais produzidos nas etapas anteriores reagirem entre si, formando um produto
estável (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999; HALLIWEL & GUTTERIDGE, 2006).
33
1.2.2 Defesas Antioxidantes
Para evitar os efeitos danosos das espécies reativas, existem mecanismos
eficientes para a detoxificação das mesmas, entre os quais a produção endógena de
enzimas antioxidantes e alguns antioxidantes não-enzimáticos. Embora diferindo na
composição, as defesas antioxidantes estão amplamente distribuídas no organismo
e compreendem:
* agentes que removem cataliticamente os radicais livres, como as enzimas
superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, entre outras;
* proteínas que minimizam a disponibilidade de pró-oxidantes (íons de ferro e
cobre, por exemplo), ao se ligarem aos mesmos como as transferrinas;
* proteínas que protegem biomoléculas de danos (incluindo dano oxidativo)
por outros mecanismos;
* agentes de baixo peso molecular que aprisionam espécies reativas de
oxigênio e nitrogênio, como glutationa, α-tocoferol, ácido ascórbico e a bilirrubina.
1.2.3 Estresse Oxidativo
Em condições normais em organismos saudáveis, a produção de espécies
reativas é em sua maior parte balanceada pelos sistemas de defesa antioxidante do
organismo. No entanto, em determinadas condições patológicas pode haver um
desequilíbrio entre a produção de oxidantes e as defesas antioxidantes, favorecendo
a ocorrência de estresse oxidativo.
Assim, o termo “estresse oxidativo” é usado para se referir à situação na qual
a geração de espécies reativas ultrapassa a capacidade das defesas antioxidantes
teciduais disponíveis. Pode resultar tanto de uma diminuição das defesas
antioxidantes quanto de uma produção aumentada de oxidantes, bem como da
34
liberação de metais de transição ou a combinação de quaisquer desses fatores
(HALLIWELL, 2001).
O estresse oxidativo pode promover adaptação, dano ou morte celular:
* Adaptação: as células podem geralmente tolerar um estresse oxidativo
moderado, que geralmente resulta em aumento da síntese dos sistemas de defesa
antioxidante a fim de restaurar o balanço oxidante/antioxidante. Apesar disso, nem
sempre o estresse oxidativo precisa envolver defesas antioxidantes aumentadas.
* Dano celular: o estresse oxidativo pode danificar todos os alvos moleculares
incluindo DNA, proteínas, carboidratos e lipídios (HALLIWELL & GUTTERIDGE,
1999; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).
* Morte celular: pode ocorrer tanto por necrose quanto por apoptose.
Na morte celular por necrose, a célula incha e se rompe, liberando seu
conteúdo para o meio extracelular. Pode haver a liberação de antioxidantes, como a
catalase e a glutationa, e também de pró-oxidantes, como os íons cobre e ferro e
proteínas do grupo heme, agentes esses que podem afetar as células adjacentes,
podendo até mesmo impor a elas um estresse oxidativo.
Já na apoptose, o mecanismo intrínseco de suicídio celular é ativado, e não
há a liberação do conteúdo celular. A morte celular por apoptose pode ser acelerada
em certas doenças, como as desordens neurodegenerativas, havendo envolvimento
do estresse oxidativo.
Além da indução de necrose e apoptose, o estresse oxidativo pode levar a um
aumento da lipoperoxidação cujos produtos, malondialdeído e 4-hidroxinonenal,
entre outros, são altamente neurotóxicos, e a um dano oxidativo tanto às proteínas,
inibindo a atividade de diversas enzimas e alterando a função celular, quanto ao
DNA, causando alteração de bases púricas e pirimídicas (HALLIWEL &
GUTTERIDGE, 1999; HALLIWEL & GUTTERIDGE, 2007).
35
1.2.4 Estresse oxidativo em mitocôndrias
As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas no citosol e
principalmente na mitocôndria. Cada mitocôndria é capaz de gerar cerca de 10-7M
radicais livres por dia e alterações na cadeia de transporte de elétrons podem elevar
ainda mais os níveis de radicais livres dentro da mitocôndria. Além disso, uma
disfunção mitocondrial causada por diminuição da atividade dos complexos da
cadeia respiratória com um conseqüente prejuízo no transporte de elétrons, o que
pode levar a uma dispersão dos elétrons na forma de radicais livres potencialmente
danosos à célula levando a necrose e apoptose neuronal (DUARTE et al., 2005).
Recentemente tem sido observado que os prováveis sítios de formação do
radical O2•- seriam o complexo I e complexo III da cadeia respiratória (Figura 2).
Durante o processo de transferência de elétrons, a coenzima Q é oxidada gerando a
ubisemiquinona, um radical intermediário que pode entrar em contato com o oxigênio
e produzir radicais O2•- (NICHOLLS & FERGUSON, 2001). Juntamente com a
geração de O2•-, existem evidencias da formação de outras ERO na mitocôndria,
como H2O2 e o radical OH•.
Estudos também levaram a descoberta de que a mitocôndria é capaz de
produzir também NO• através de uma oxido nítrico sintase (NOS) cálcio dependente,
localizada na membrana interna mitocondrial (GIULIVI et al., 1998).
A geração desses oxidantes levaria a oxidação de proteínas e a liberação do
citocromo c para o citoplasma, dando início a apoptose celular (GHAFOUIFAR et al.,
1999).
36
e- ee-ee- e-
H+++H++2OH
H
H
+`
H+`
O2
.OH
Ciclo
de
Krebs
OH--
..
OO- MnSOD
H2O2
Fe2+
GPx
Cat
H2O + O2
Figura 1.2. Formação de espécies reativas de oxigênio via complexos da cadeia respiratória
(adaptada de Mandavilli et al., 2002).
1.2.5 Estresse Oxidativo e Doenças Neurodegenerativas
O cérebro é muito dependente de energia para o seu funcionamento normal e
a mitocôndria é a estrutura intracelular responsável pela produção dessa energia.
Para a produção eficiente de energia na forma de ATP, a mitocôndria possui uma
alta demanda por oxigênio, já que utiliza uma grande quantidade de O2 em uma
massa de tecido relativamente pequena, o que torna esse tecido altamente
susceptível à ação de espécies reativas (KOKOSZKA et al., 2001; CHONG et al.,
2005).
Outros fatores também contribuem para essa susceptibilidade como o alto
conteúdo de ferro presente no cérebro, que pode favorecer a lipoperoxidação, o seu
alto conteúdo lipídico em relação aos outros tecidos, principalmente lipídios de
cadeia lateral altamente poliinsaturadas, que são extremamente suscetíveis a
lipoperoxidação e suas reduzidas defesas antioxidantes, sendo os níveis de catalase
particularmente
baixos
em
muitas
HALLIWELL & GUTTERIDGE, 2007).
regiões
cerebrais
(HALLIWELL,
1996;
37
Espécies reativas de oxigênio geradas no cérebro podem oxidar lipídios de
membrana, proteínas ou DNA, induzindo apoptose ou necrose (HALLIWELL, 2001).
Vários estudos já demonstraram a relação existente entre a apoptose induzida por
aumento de radicais livres e a patogênese das doenças neurodegenerativas (YUAN
& YANKNER, 2000; JUNN & MOURADIAN, 2001).
Estudos postmortem demonstraram uma diminuição na atividade do complexo
I da cadeia respiratória em cérebros de pacientes portadores de doença de
Parkinson. Essa inibição do complexo I acarreta a geração de espécies reativas, tais
como ânion superóxido, radicais hidroxila e peroxinitrito, as quais poderiam causar
um prejuízo ainda maior na cadeia transportadora de elétrons. Dessa forma, é
possível que o estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial formem um ciclo vicioso
na doença de Parkinson (SCHAPIRA et al., 1989, SCHAPIRA et al., 1990; GU et al.,
1998; JANETSKY et al., 1994;).
Na
doença
de
Alzheimer,
a
mais
comum
dentre
as
doenças
neurodegenerativas, é possível que o estresse oxidativo tenha um papel chave na
morte neuronal. Têm sido proposto que o
chamadas
placas
senis,
tenha
a
peptídeo
capacidade
-amilóide, o formador das
de
gerar
radicais
livres
espontaneamente. Estudos posmortem in vivo também evidenciaram um dano
oxidativo em cérebros humanos com doença de Alzheimer através da observação de
aumento de 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina (8-OHdGA), produtos de oxidação de outras
bases e de RNA, carbonilas de proteínas, nitrotirosina e marcadores de peroxidação
lipídica (SMITH et al., 1991; MARKESBERY et al., 1999; NOUROOZ-ZADEH et al.,
1999; LOVELL et al., 2000).
Por outro lado, vários estudos têm evidenciado um dano oxidativo importante
em pacientes portadores da doença de Huntington, particularmente representado
pela formação de 3-nitrotirosina nas áreas cerebrais afetadas (ALEXI et al., 2000).
Entretanto, o dano oxidativo observado nessa doença aparentemente tem menor
importância do que nas doenças de Parkinson e Alzheimer.
38
Considerando a importância dos radicais livres e do estresse oxidativo como
importante mecanismo fisiopatogênico de doenças neurodegenerativas, têm surgido
diversas drogas para a terapia de pacientes portadores dessas doenças baseadas
em um mecanismo antioxidante, tais como seqüestradores de ânion superóxido,
análogos da vitamina E, inibidores da peroxidação lipídica e inibidores da enzima
óxido nítrico sintase, entre outras.
Apesar da acidemia isovalérica ser caracterizada predominantemente por
disfunção neurológica e atrofia cerebral, praticamente nada se sabe sobre os
mecanismos etiopatogênicos nesta doença e não há até o presente momento
tratamento eficaz para essa patologia. Tendo em vista que os mecanismos de
neurotoxicidade na acidemia isovalérica são pouco conhecidos e que dano oxidativo
tem sido sugerido em várias doenças neurodegenerativas, no presente trabalho
estudamos as ações in vitro e ex vivo dos principais metabólitos acumulados nesta
doença sobre parâmetros importantes de estresse oxidativo em homogeneizado e
mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos jovens, com a expectativa de elucidar, ao
menos parcialmente, os mecanismos responsáveis pelo dano cerebral nesta doença.
39
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Verificar se os principais compostos acumulados nos tecidos de pacientes
com acidemia isovalérica provocam dano oxidativo celular em cérebro de ratos
jovens com o intuito de contribuir para uma melhor compreensão da fisiopatogenia
do dano neurológico dessa doença.
2.2 Objetivos Específicos
a) Determinar os efeitos in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3hidroxiisovalérico (3-OHIVA), bem como da isovalerilglicina (IVG) sobre a
peroxidação lipídica medida através das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBA-RS) e da quimiluminescência em mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos de
30 dias de vida.
b) Determinar os efeitos in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3hidroxiisovalérico (3-OHIVA), bem como da isovalerilglicina (IVG) sobre a oxidação
de proteínas, determinadas através da formação de carbonilas e da medida de
grupamentos sulfidrila em mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos de 30 dias de
vida.
c) Determinar os efeitos in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3hidroxiisovalérico (3-OHIVA), bem como da isovalerilglicina (IVG) sobre as defesas
antioxidantes não enzimáticas, medidas pelo potencial antioxidante total (TRAP) e
glutationa reduzida (GSH) em mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos de 30 dias
de vida.
40
e) Determinar os efeitos in vitro dos ácidos isovalérico (IVA) e 3hidroxiisovalérico (3-OHIVA), bem como da isovalerilglicina (IVG) sobre as atividades
das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase
(SOD) em mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos de 30 dias de vida.
f) Determinar os efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do
ácido isovalérico (IVA) sobre a peroxidação lipídica medida através dos níveis da
substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em homogeneizado de córtex,
hipocampo e estriado de cérebro de ratos de 30 dias de vida.
g) Determinar os efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do
ácido isovalérico (IVA) sobre a oxidação de proteínas, através da medida de
grupamentos sulfidrila em homogeneizado de córtex, hipocampo e estriado de
cérebro de ratos de 30 dias de vida.
h) Determinar os efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do
ácido isovalérico (IVA) sobre a defesa antioxidante não enzimática (GSH) em
homogeneizado de córtex, hipocampo e estriado de cérebro de ratos de 30 dias de
vida.
i) Determinar os efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do
ácido isovalérico (IVA) sobre as atividades das enzimas antioxidantes glutationa
peroxidase
(GPx),
catalase
(CAT)
e
superóxido
dismutase
(SOD)
em
homogeneizado de córtex, hipocampo e estriado de cérebro de ratos de 30 dias de
vida.
41
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Reagentes
Todos os reagentes utilizados no presente trabalho foram de grau de pureza
pró-análise (p.a.). Os ácidos isovalérico e 3-hidroxiisovalérico, bem como a
isovalerilglicina, foram sempre dissolvidos e diluídos na solução tampão específica
para cada técnica, no dia da realização dos ensaios.
3.1.2. Reagentes Utilizados
•
2-Deoxi-D-Ribose – Sigma
•
2, 2’-Azo-Bis-(2-Amidinopropano) (ABAP) – Wako
•
2, 7-Diclorofluoresceína – Sigma
•
Ácido 6-Hidroxi-2, 5, 7, 8-Tetrametil-Cromano-2-Carboxílico
(Trolox) – Sigma
•
Ácido Ascórbico – Sigma
•
Ácido Isovalérico – Prof Dr Ernesto Brunet (Universidade
Autonoma de Madrid, Espanha)
•
Ácido 3-hidroxiisovalérico- Prof Dr Ernesto Brunet (Universidade
Autonoma de Madrid, Espanha)
•
Isovalerilgicina - Prof Dr Ernesto Brunet (Universidade Autonoma
de Madrid, Espanha)
•
Ácido Metafosfórico – Aldrich
•
Ácido Tiobarbitúrico – Merck
•
Ácido Tricloroacético – Synth
•
Albumina – Sigma
•
Carbonato de Sódio – Isofar
•
Cloreto Férrico – Synth
42
•
Cloreto de Potássio – Nuclear
•
Diacetato de 2, 7-Diclorofluoresceína – Sigma
•
Etilenodiaminotetracético (EDTA) – Sigma
•
Fosfato de Sódio Dibásico – Vetec
•
Fosfato de Sódio Monobásico – Vetec
•
Hidróxido de Sódio – Synth
•
Glicina – Sigma
•
Glutationa – Sigma
•
L-Quinurenina – Sigma
•
Luminol – Sigma
•
Orto-Ftaldialdeído – Sigma
•
Sulfato Cuproso – Merck
•
Tartarato de Potássio – Merck
3.1.3. Equipamentos e outros materiais
-
Agitador de tubos modelo Maxi Mix Plus (Thermolyne).
-
Agitador magnético modelo 1005 (Fisaton).
-
Balança analítica digital (Sartorius Basic).
-
Balança digital modelo 430-21 (Kern).
-
Banho metabólico (Dubnoff).
-
Banho-maria modelo 1052 (Biomatic).
-
Centrífuga modelo 5403 (Eppendorf).
-
Contador de cintilação líquida modelo 1409 (Wallac).
-
Deionizador.
-
Destilador.
-
Espectrofotômetro de leitura cinética e com controlador de temperatura
modelo U-2001(Hitachi).
-
Espectrofotômetro modelo Spectronic Genesys 5 (Milton Roy).
-
Freezer -20° modelo H5 Electrolux (Prosdócimo).
-
Freezer -70°C (Scien Temp).
-
Geladeira (Brastemp).
43
-
Guilhotina.
-
Homogenizador
elétrico
modelo
Potter
S
(B.
Braun
Biotech
International).
-
Máquina de fazer gelo (Everest).
-
Material cirúrgico: tesouras, bisturis e espátulas.
-
Micropipetas de volume regulável (Gilson).
-
Microultracentrífuga modelo Himac CS 120 GX (Hitachi).
-
Potenciômetro modelo Tec-2 (Tecnal).
-
Tubos plásticos (Eppendorf).
-
Vidraria: provetas, pipetas graduadas, potter de vidro, balões
volumétricos, placas de PetrI, pipetas Pasteur, tubos de ensaio, béqueres, funis,
cubetas, vials.
3.2. Caracterização da amostra
Foram utilizados 150 ratos Wistar de 30 dias de idade, machos, fornecidos
pelo Biotério do Departamento de Bioquímica, ICBS, UFRGS. Os ratos foi mantidos
em ciclos de claro-escuro de ±12 horas a uma temperatura de 24±1°C. Os animais
tiveram livre acesso à água e ao alimento (ração Supra ou Purina, São Leopoldo,
RS). A utilização dos animais seguiu um protocolo experimental aprovado pelo
Comitê de Ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e os Princípios de Cuidados
de Animais de Laboratório (Principles of Laboratory Animal Care, Instituto Nacional
de Saúde dos Estados Unidos da América, NIH, publicação número 85-23, revisada
em 1985).
3.3 Estudos in vitro
3.3.1 Preparação de frações enriquecidas de mitocôndrias
No dia do experimento os animais foram sacrificados por decapitação e o
cérebro total separado e homogeneizado a 700 x g em tampão fosfato de sódio pH
7,4 contendo 0,3 M de sacarose, 5 mM de MOPS, 1 mM de EGTA e 0,1% de
44
albumina sérica humana, na proporção de 1:10 (peso/volume). Posteriormente o
homogeneizado foi centrifugado durante 10 minutos a 1500 x g a 4°C. O
sobrenadante desta primeira centrifugação foi novamente centrifugado a 13.000 x g
durante 10 minutos a 4°C e o sedimento ressuspenso no tampão de
homogeneização (CASSINA et al., 1996).
3.3.2 Preparação de membranas mitocondriais
No dia do experimento os animais foram sacrificados por decapitação e o
cérebro separado e homogeneizado a 700 x g em tampão Tris 10mM pH7,4
contendo 0,25M de sacarose, na proporção 1: 5 (peso/volume). Posteriormente o
homogeneizado foi centrifugado durante 10 minutos a 750 x g a 4°C.
O sobrenadante foi centrifugado a 25000 x g a 4°C por 15 minutos. Depois
dessa nova centrifugação o sedimento contendo as mitocôndrias foi ressuspendido
novamente em tampão Tris 0,1M pH 8,0 e armazenado em alíquotas de 500 L, em
tubos do tipo Eppendorf, a -70°C. No dia do experimento as alíquotas foram
congeladas e descongeladas 3 vezes e centrifugadas a 15000 x g por 2 minutos
para separar as membranas mitocondriais. O sedimento foi lavado três vezes com
TCA 6,5% e centrifugado a 15,000 x g por 2 minutos. O sedimento final foi
ressuspendido em 200 L de tampão Tris 0,5M, pH 8,3, contendo 0,5mM de EDTA e
utilizado para a medida de grupos sulfidrila em membranas de mitocôndria
(KOWALTOSKI et al, 1997).
3.4 Estudos ex vivo
3.4.1 Cirurgia cerebral
3.4.1.1 Procedimento cirúrgico
3.4.1.2. Anestesia
Antes da cirurgia os animais foram anestesiados com a mistura de cetamina
(Francotar, Virbac) e xilazina (Coopazine; Coopers). O anestésico Cetamina foi
administrada
por
via
intraperitoneal
(i.p.)
conjuntamente
com
o
45
sedativo/miorrelaxante/analgésico xilasina, respectivamente nas doses de 75mg/kg e
10mg/kg (FLECKNELL, 1996).
3.4.1.3 Coordenadas do ventrículo lateral
As coordenadas para injeção do ácido isovalérico (IVA), medidas a partir do
bregma, foram: AP: antero-posterior; LL: látero-lateral; DV: dorso-ventral, sempre
com inclinação da cabeça de -0,33 cm, a partir de indicações do Atlas de Paxinos &
Watson (1996).
Ventrículo lateral: AP= ± 0,6mm; LL= ± 1,0mm; DV= ± 3,2mm
A posição correta das coordenadas foi verificada através de cirurgias-piloto,
com injeção de azul de metileno 4% dissolvido em solução salina.
3.4.1.4 Craniotomia e injeção do ácido isovalérico
Cada animal operado foi cuidadosamente colocado em um aparelho
estereotáxico (David Kopf, modelo 1404), sua cabeça imobilizada com barras interauriculares e a barra de pressão do incisivo (inclinação de -0,33cm), sendo, então, a
superfície de seu crânio exposta mediante incisão sagital com um bisturi com
lâminas de número 20 ou 21.
Uma craniotomia bilateral foi realizada com o emprego de uma broca
odontológica nos locais (sobre o crânio exposto) correspondentes às coordenadas
antero-posteriores (AP) e látero-laterais (LL) da estrutura.
O ácido isovalérico (IVA, 5 µmol, 2 µL) foi injetado lentamente durante 3
minutos em ambos os ventrículos laterais, utilizando-se uma agulha fina (calibre 30)
conectada por um tubo de polietileno a uma seringa Hamilton de 10 µL. A agulha foi
mantida no local por mais um minuto antes de ser suavemente removida, sendo o
tempo cirúrgico de aproximadamente 4 minutos para cada hemisfério. O grupo
46
controle recebeu injeção i.c.v. de solução de NaCl (5 µmol, 2 µL) de maneira
semelhante.
3.4.1.5 Sacrifício dos animais e isolamento das estruturas estudadas
Os animais foram divididos em dois grupos experimentais e sacrificados por
decapitação 24 horas após o procedimento cirúrgico. O cérebro foi rapidamente
retirado, o sangue removido e as estruturas estudadas (córtex, estriado e
hipocampo) foram rapidamente dissecadas, e congeladas a -80°C até o momento da
realização dos testes. O período máximo entre o isolamento das estruturas e a
determinação dos parâmetros de estresse oxidativo foi sempre menor do que sete
dias.
3.4.1.6 Preparação de homogeneizados de córtex, estriado e hipocampo
cerebral
No dia do experimento as estruturas cerebrais congeladas foram cortadas
manualmente com o uso de um bisturi e depois foram pesadas e homogeneizadas
em tampão fosfato de sódio 20 mM, contendo cloreto de potássio 140 mM, pH 7,4,
na proporção de 1:10 (peso/volume) e o homogeneizado obtido foi levado à
centrifugação a 650 g durante 10 min a 4 ºC. O sobrenadante foi empregado para a
medição dos diferentes parâmetros de estresse oxidativo.
3.5. Parâmetros de estresse oxidativo
3.5.1. Lipoperoxidação
3.5.1.1 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS)
Os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) foram
determinados de acordo com o método de Yagi (1998) modificado. Uma alíquota de
amostra foi adicionada a dois volumes de ácido tricloroacético 10 % e de um volume
de ácido tiobarbitúrico 0,67 % preparado em sulfato de sódio. Os tubos contendo a
47
mistura foram incubadas durante 90 min em banho de água fervente e após a
incubação resfriados durante 5 min. A formação de TBA-RS gera uma coloração
rósea que foi extraída com 450 µL de butanol. A fluorescência da fase orgânica lida
a 515 nm e 553 nm como comprimentos de onda de excitação e emissão,
respectivamente, em fluorímetro. A curva de calibração realizada utilizando-se
1,1,3,3-tetrametoxipropano e submetida ao mesmo tratamento que as amostras. Os
níveis de TBA-RS foram calculados como nmol / mg de proteína.
3.5.1.2. Quimiluminescência induzida por Ferro e Àcido Ascórbico
A
determinação
da
quimiluminescência,
que
representa
a
emissão
espontânea de luminescência, principalmente de lipídios peroxidados, foi realizada
de acordo com GONZALEZ-FLECHA e colaboradores (1991). Foram adicionados
3,5 mL de tampão fosfato de sódio 20 mM contendo KCl 140 mM, pH 7,4 em frascos
de cintilação. Esses frascos colocados durante cinco minutos em cintilador líquido
beta (Tri-carb 2100TR) para a medida da quimiluminescência basal. Após esta
leitura, foi adicionada uma alíquota de amostra, 10µl de ácido ascórbico [0,4mM] e
10µl de Ferro [50mM]. Essa mistura foi deixada no escuro por 10 minutos e em
seguida a luminuscência foi medida por mais 30 minutos (GUTIÉRREZ et al., 2001).
O procedimento foi realizado em sala escura e a temperatura ambiente. A contagem
basal foi descontada do valor total e o resultado calculado como cpm / mg de
proteína, e foram expressos em percentual do controle.
3.5.2. Medida da oxidação de proteínas
3.5.2.1 Medida de grupamentos sulfidrila em membranas mitocondriais
A medida de grupos sulfidrilas em membranas mitocondriais foi feita utilizando
um ensaio baseado na redução de tiois a partir do ácido 5,5´- ácido ditio bis (DTNB),
gerando um produto final amarelo medido espectrofotometricamente a 412nm
(KOWALTOWSKI et al., 1997).
48
Uma alíquota de 40µL das membranas mitocondriais foi incubada a 370C por
30’ minutos com IVA, 3-OHIVA e IVG. Após a incubação, 1mL de DTNB 0,1mM
preparado em tampão TRIS 0,5M contendo 0,5mM de EDTA, pH 8,0 foi adicionado,
e incubado a temperatura ambiente e no escuro por 30 minutos. A absorvancia foi
medida a 412nm, o conteúdo de sulfidrilas é tido como um dano oxidativo
irreverssível a proteínas, e o resultado foi expresso nmolsTNB/mg de proteínas.
3.5.2.2 Formação de Carbonilas
A formação de carbonilas, um marcador de oxidação a proteínas, foi medida
em espectrofotômetro de acordo com REZNICK & PACKER (1994). Uma alíquota de
100 L da incubação foi tratada com 400µL de 10mM 2,4-(DNFH) dissolvida em 2,5N
HCL e para o branco 2,5N HCl, e colocada no escuro por uma hora. A amostra foi
precipitada com 500µL de TCA 20% e centrifugada por 5 minutos a 10.000 x g. O
sedimento foi lavado com etanol: acetato de etila (1:1, V/V) e dissolvido em 550µL
de guanidina 6M preparada em HCl, e incubado a 370C. A diferença entre as
amostras tratadas com DNFH e tratadas com HCL (branco) foi usada para
determinar o conteúdo de carbonilas a 365nm. O conteúdo de carbonilas foi
calculado em nmol/mg de proteína, e os resultados expressos em percentual do
controle.
3.5.3. Medida das atividades antioxidantes não enzimáticas
3.5.3.1 Potencial Antioxidante Total (TRAP)
A medida da capacidade antioxidante total (TRAP) do tecido foi realizada
segundo o método de LISSI et al. (1992). Esta determinação é dada pela medida da
intensidade de quimiluminescência do luminol induzida pelos radicais peroxila
gerados através da decomposição térmica do 2, 2’-azo-bis-(2-amidinopropano)
(ABAP) a temperatura ambiente. Para a preparação das soluções de uso (ABAP 10
mM, luminol 4 mM e Trolox 80 µM) foi utilizado tampão glicina 0,1 M, pH 8,6. A
solução de ABAP foi utilizada como formadora de radicais livres, a de luminol como
amplificadora do sinal de quimiluminescência e a de Trolox (α-tocoferol) como
padrão antioxidante. Os tubos utilizados para o ensaio permaneceram vazios no
49
escuro por pelo menos 30 minutos. Para a contagem basal (120 segundos), foram
adicionados 4 mL de solução de ABAP 10 mM a um frasco de cintilação. A seguir,
10 µL da solução de luminol foram acrescentados e lidos por mais 120 segundos.
Posteriormente a contagem basal, foram adicionados 10 µL de solução de Trolox 80
µM (padrão antioxidante) ou de amostra o que provocará uma diminuição de
luminescência por determinado tempo até retornar a valores próximos dos iniciais. O
tempo necessário para a luminescência retornar ao valor inicial foi considerado o
tempo de indução. O tempo indução é diretamente proporcional à capacidade
antioxidante do tecido comparado com o tempo de indução do Trolox. O resultado
calculado como nmol de Trolox / mg de proteína, e foram expressos em percentual
do controle.
3.5.3.2. Determinação das concentrações de glutationa reduzida (GSH)
As concentrações de GSH foram determinadas através do método descrito
por BROWNE & ARMSTRONG (1998). As amostras, foram diluídas em 10 volumes
de tampão fosfato de sódio, pH 8,0 contendo EDTA 5mM. Foram adicionados a 100
µL dessa preparação 100 µL de o-ftaldeído (1mg / mL preparado em metanol) e a
mistura será incubada durante 15 minutos a temperatura ambiente e posteriormente
lida em fluorímetro a 350 nm (emissão) e 420 nm (excitação). As concentrações de
GSH foram calculadas a partir de uma curva padrão de GSH (0,01 – 1 mM) como
nmol / mg de proteína.
3.5.4. Medida das atividades das enzimas antioxidantes
3.5.4.1. Glutationa peroxidase (GPx)
A atividade da GPx foi determinada pelo método de WENDEL (1981) usando
hidroperóxido de tert-butila como substrato. Em uma cubeta de quartzo foram
adicionados os seguintes reagentes: 600 µL de tampão fosfato de potássio 100 mM,
pH 7,0, contendo EDTA 1 mM, 10 µL de azida sódica 40 mM, 15 µL de glutationa
100 mM, 15 µL glutationa redutase 10 U / ml, 10 µL NADPH 10 mM e 10 µL de
amostra (0,1 – 0,3 µg de proteína). Esta mistura foi incubada a 25 0C durante 1
minuto, a fim de estabilizar o meio e após foram adicionados 50 µL de hidroperóxido
50
de tert-butila 10 mM para iniciar a reação. Os brancos foram preparados substituindo
a amostra por tampão fosfato. A queda da absorvância a 340 nm foi lida durante 240
segundos e a atividade da GPx calculada utilizando-se o coeficiente de extinção do
NADPH a 340 nm de 6,2 mM-1 cm-1. A atividade da GPx foi calculada como U / mg
de proteína (1U = 1 µmol NADPH consumido / min).
3.5.4.2 Catalase (CAT)
A atividade desta enzima foi determinada através do método de AEBI (1984).
Em 100 µL do sobrenadante serão adicionados 10 µl de Triton 0,1 % seguido de
agitação, esta mistura será conservada em banho de gelo durante 15 minutos. Em
50 mL de tampão fosfato de potássio 10 mM pH=7,0 serão adicionados 100µl de
H2O2 30% (V/V). Foram pipetados 600 µl deste meio em cubeta de quartzo, e o
aparelho estabilizado contra um branco corrido separadamente de tampão fosfato.
Após adição de 25 µl de amostra foi realizada a leitura da queda da absorvância do
H2O2 em espectrofotômetro a 240nm, em temperatura ambiente (220C ± 2), durante
100 segundos. Para o cálculo da CAT foi utilizará o coeficiente de extinção do H2O2
de 43.6 mM-1cm-1. Os resultados da atividade da CAT foram expressos em U / mg
proteína (1U =1 µmol H2O2 consumido / min
3.5.4.3 Superóxido Dismutase (SOD)
A atividade da SOD foi medida mediante a utilização do Kit Randox. O
método baseia-se na formação do vermelho de formazan através da reação do
ânion superóxido (produzido no meio a partir de um sistema xantina-xantina oxidase)
e do cloreto de 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenol)-5-feniltetrazolio gerando um complexo
rosa que é lido a 505 nm. A inibição de formação do cromôgeno foi proporcional à
atividade da SOD.
51
3.6 Dosagem de Proteínas
A determinação da concentração de proteínas foi feita através do método de
LOWRY et al. (1951) e pelo método de BRADFORD et al. (1976) usando como
padrão a albumina sérica bovina.
3.7 Análise estatística
Os dados foram analisados através da análise de variância de uma via
(ANOVA) seguida pelo teste de raios múltiplos de Duncan quando o valor de F for
significativo. O teste t de Student para amostras pareadas e a análise de variância
com regressão linear também foram aplicados. A análise estatística foi realizada
através do programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) em um
computador PC-compatível. Valores de P < 0,05 foram considerados significativos.
52
4 RESULTADOS
4.1. Estudos in vitro
Inicialmente estudamos o efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA), ácido 3hidroxiisovalérico (3-OHIVA) e da isovaleriglicina (IVG) sobre vários parâmetros
de estresse oxidativo. Começamos pelos parâmetros de peroxidação lipídica
verificados pela determinação dos níveis de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBA-RS) e quimiluminescência em preparações mitocondriais
isoladas de cérebro de ratos jovens.
4.1.1 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre as substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS)
em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens
A figura 4.1 mostra que o IVA, mesmo na concentração de 10 mM, não
alterou significativamente os níveis de TBA-RS [F(4,15)= 0,457; P=0,766] em
preparações mitocondriais de cérebro de ratos. O mesmo ocorreu para o 3-OHIVA
em concentrações de até 5 mM [F(4,15) =0,066; P=0,991] (Figura 4.2) e para a IVG
em doses de até 1 mM [F(4,15) =0,066; P=0,991] (Figura 4.3).
53
TBA-RS
(nmol / mg de proteína)
3
2
1
0
CC
o ontrol
ntro le
0.1 m
M IV A
0 ,1
1 m M1 IV A
5 mM
5 IV A
10 m1M0 IV A
IVA (m M)
Figura 4.1 – Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre as substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBA-RS) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os
valores representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por
análise de variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa entre
os grupos.
4 ,0
TBA-RS
(nmol/mg de proteína)
3 ,5
3 ,0
2 ,5
2 ,0
1 ,5
1 ,0
0 ,5
0 ,0
le
C Coonntrtro
o le
11
mM
5m
5M
3 O H IV A (m M )
Figura 4.2 – Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre as substâncias reativas
ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos
jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi
calculada por análise de variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença
significativa entre os grupos.
54
4,0
TBA-RS
(nmol/mg de proteína)
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
ontrole
Co
n tro le
0,1m
0 ,1 M
1m
1M
IVG (m M )
Figura 4.3 – Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre as substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBA-RS) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os
valores representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por
análise de variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em
relação ao controle.
4.1.2. Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a quimiluminescência induzida por íon ferroso (Fe2+) e ácido
ascórbico (ASC) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos
jovens
Os resultados demonstram que o IVA [t(4)= 0,340; P= 0,756] (Figura 4.4) e o
3-OHIVA [t(4)= 0,217; P= 0,842] (Figura 4.5) não modificaram significativamente a
quimiluminescência induzida por Fe2+ e ASC em preparações mitocondriais isoladas
de cérebro de ratos jovens. Contudo, podemos observar que a IVG [F(2,14)=8,202;
P=0,004], na concentração de 1 mM, aumentou significativamente (47%) a
quimiluminescência induzida nestas preparações (Figura 4.6).
55
120
Quimiluminescência
(% do controle)
100
80
60
40
20
0
Controle
Controle
IVA 10
10 mM
Figura 4.4– Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a quimiluminescência em preparações
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão
(n=4) e foram expressos em percentagem dos controles (11655,7±1724,7cpm/min). A diferença
entre as médias foi calculada pelo teste t de Student para amostras pareadas. Não foi detectada
nenhuma diferença significativa em relação ao controle.
140
Quimiluminescência
(% do controle)
120
100
80
60
40
20
0
Controle
Controle
5
3OHIVA 5 mM
Figura 4.5 – Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a quimiluminescência em
preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ±
erro padrão (n=4) e foram expressos em percentual do controle (13112,2±1854,7cpm/min). A
diferença entre as médias foi calculada pelo teste t de Student para amostras pareadas. Não foi
detectada nenhuma diferença significativa em relação ao controle.
56
195
**
180
165
Quimiluminescência
(% do controle)
150
135
120
105
90
75
60
45
30
15
0
Controle
0,1
1
IVG (mM )
Figura 4.6 – Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a quimiluminescência em preparações
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=4)
e foram expressos em percentual do controle (2449 ±151 cpm/min). A diferença entre as médias foi
calculada por análise de variância de uma via (ANOVA) seguida do teste de Duncan (**P<0,01
comparado ao controle).
Estudamos então o efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na
acidemia isovalérica sobre a oxidação de proteínas, medida através da
determinação do conteúdo dos grupamentos sulfidrila e carbonilas em preparações
mitocondriais isoladas de ratos jovens.
4.1.3 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre o conteúdo de grupamentos sulfidrila em membranas
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens
A figura 4.7 mostra que o IVA não alterou significativamente a medida de
grupamentos sulfidrila em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos
jovens [F(3,12)= 0,027; P= 0,994], o mesmo ocorrendo para o 3-OHIVA [F(3,12)= 1,173;
P=0,361] (Figura 4.8) e para a IVG (Figura 4.9) [F(3,12)= 0,697; P= 0,572].
57
50
Conteúdo de Sulfidrilas
(nmol TNB/mg de proteína)
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Controle
Controle
1
1mM
5
5mM
IVA (mM )
10
10mM
Figura 4.7 – Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a medida de grupos sulfidrila em
membranas mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ±
erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de uma via
(ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao controle.
Conteúdo de Sulfidrilas
(nmol TNB/mg de proteína)
30
25
20
15
10
5
0
Controle
Controle
0,1 M
0,1m
1M
1m
3O HIVA (m M)
5m5M
Figura 4.8 – Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a medida de grupos sulfidrila
em membranas mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ±
erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de uma via
(ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao controle.
58
Conteúdo de Sulfidrilas
(nmol TNB/mg de proteína)
30
25
20
15
10
5
0
Controle
Controle
0,01
0,01mM
0,1
0,1mM
1
1mM
IVG (mM )
Figura 4.9– Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a medida de grupos sulfidrila em
membranas mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ±
erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de uma via
(ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao controle.
4.1.4 Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a formação de carbonilas em preparações mitocondriais
isoladas de cérebro de ratos jovens
Na figura 4.10 demonstramos que o IVA, nas concentrações 1, 5 e 10 mM,
aumentou significativamente (41%) a formação de carbonilas em preparações
mitocondriais [F(4,15)= 19.270; P= 0,0001]. Verificamos que também que o 3-OHIVA
aumentou significativamente (52%) a formação de carbonilas nestas preparações
[F(3,12)= 4,932; P= 0,018] (Figura 4.11) de forma dose-dependente [ : 0,637; P=
0,008] e que a IVG não foi capaz de alterar a formação de carbonilas [F(3,12)= 2,311;
P=0,128] em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens (Figura
4.12).
59
5
***
Formação de Carbonilas
(% do controle)
4
***
***
3
2
1
0
Controle
Control
0.1 mM
0,1 IVA
1 mM
1 IVA
5 mM
5 IVA
10 mM
10 IVA
IVA (mM)
Figura 4.10 - Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a formação de carbonilas em membranas
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ± erro padrão (n=4)
e os resultados expressos em percentual do controle (2,07 ± 0,300nmol de carbonila/mg de
proteína).. A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de uma via (ANOVA),
seguida do teste de Duncan (*** P<0,001, comparado ao controle).
180
Formação de Carbonilas
(% do controle)
160
*
140
*
120
100
80
60
40
20
0
Controle
0,1
1
5
3OHIVA (mM)
.
Figura 4.11 - Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-0HIVA) sobre a formação de carbonilas em
membranas mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ± erro
padrão (n=4) e foram expressos em percentual do controle (1,02 ± 0,127nmol de carbonila/mg de
proteína). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de uma via (ANOVA),
seguida do teste de Duncan (**P<0,01 comparado ao controle).
60
120
(% do controle)
Formação de Carbonilas
140
100
80
60
40
20
0
Con trole
0,01
0,1
1
IV G (m M )
Figura 4.12 - Efeito in vitro da isovaleriglicina (IVG) sobre a formação de carbonilas em
membranas mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ±
erro padrão (n=4) e os resultados expressos em percentual do controle (1,02±0,127nmol de
carbonila/mg de proteína). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de
uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa entre os grupos.
O próximo passo de nossa investigação foi estudar o efeito in vitro dos
metabólitos acumulados na acidemia isovalérica sobre as defesas antioxidantes não
enzimáticas, medidas através da determinação do potencial antioxidante total
(TRAP) e glutationa reduzida (GSH) em preparações mitocondriais de córtex
cerebral de ratos jovens.
4.1.5. Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre o potencial antioxidante total (TRAP) em preparações
mitocondriais isoladas de ratos jovens
Verificamos que o IVA [F(3,16)= 0,286; P= 0,848] (Figura 4.13), o 3-OHIVA
[F(3,16)=0,298; P=0,826] (Figura 4.14) e a IVG [F(3,12)=0,640; P=0,604] (Figura 4.15)
não alteraram significativamente o TRAP em preparações mitocondriais isoladas
de cérebro de ratos.
61
120
TRAP
(% do controle)
100
80
60
40
20
0
Controle
1
5
10
IVA (mM)
Figura 4.13– Efeito do ácido isovalérico (IVA) sobre o potencial antioxidante total (TRAP) em
preparações mitocondriais isoladas de cérebros de ratos jovens. Os valores representam média ±
erro padrão (n=4) e estão expressos em percentual do controle (5986±677 nmol de Trolox/mg de
proteína). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de uma via (ANOVA).
Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao controle.
140
120
TRAP
(% do controle)
100
80
60
40
20
0
Controle
Controle
0,1mM
0,1
1mM
1
5mM
5
3OHIVA (mM)
Figura 4.14 – Efeito do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre o potencial antioxidante total
(TRAP) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores
representam média ± erro padrão (n=4) e estão expressos em percentual do controle (7174 ± 757
nmol de Trolox/mg de proteína). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância
de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao controle.
62
140
120
TRAP
(% do controle)
100
80
60
40
20
0
C ontrole
Controle
0,01m M
0,01
0,1m M
0,1
1m
1M
IVG (mM )
Figura 4.15 – Efeito da isovalerilglicina (IVG) sobre o potencial antioxidante total (TRAP) em
preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ±
erro padrão (n=4) e estão expressos em percentual do controle (9190± 1,133 nmol de Trolox/mg
de proteína). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de uma via
(ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao controle.
4.1.6. Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre as concentrações de glutationa reduzida (GSH) em
preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens
A figura 4.16. Demonstra mostra que o IVA não alterou significativamente as
concentrações de GSH [F(3,12)= 1,935; P= 0,178].
Também foi observado que o 3-
OHIVA [F(3,16)=0,268; P=0,847] (Figura 4.17) e a IVG não alteraram as
concentrações de GSH [F(3,12)=0,245; P=0,864] (Figura 4.18) em todas as doses
utilizadas.
63
7
GSH
(nmol/mg de proteína)
6
5
4
3
2
1
0
Controle
C
ontrole
1mM
1
5mM
5
10mM
10
IVA (m M )
Figura 4.16 – Efeito do ácido isovalérico (IVA) sobre as concentrações de glutationa reduzida
(GSH) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam
média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de
uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao controle.
GSH
(nmol/mg de proteína)
4
3
2
1
0
Controle
0,1
0,1mM
1
1mM
5
5mM
3OHIVA (m M )
Figura 4.17 – Efeito do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre as concentrações de glutationa
reduzida (GSH) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores
representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de
variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao
controle.
64
GSH
(nmol/mg de proteína)
4
3
2
1
0
Controle
Controle
0,01
0,01mM
0,1mM
0,1
1
1mM
IVG (mM )
Figura 4.18 – Efeito da isovalerilglicina (IVG) sobre as concentrações de glutationa (GSH) em
preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores representam média ±
erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de variância de uma via
(ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa.
Estudamos também o efeito dos principais metabólitos acumulados na
acidemia isovalérica sobre as defesas antioxidantes enzimáticas glutationa
peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD) em preparações mitocondriais
isoladas de cérebros de ratos jovens.
4.1.7. Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a atividade da enzima glutationa peroxidase (GPx) em
preparações mitocondriais isoladas de cérebros de ratos jovens
Verificamos que o IVA [F(2,9)=2,195; P=0,167] (Figura 4.19), o 3-OHIVA
[F(3,12)=0,307; P=0,820] (Figura 4.20) e a IVG [F(3,12)=0,115; P=0,950) (Figura
4.20) não alteraram significativamente a atividade da glutationa peroxidase (GPx) em
preparações mitocondriais isoladas de cérebros de ratos jovens.
65
5
GPx
(U / mg de proteína)
4
3
2
1
0
Control
Controle
10 mM IVA
pré-incubação
com 10 mM IVA
10 mM IVA com
pré-incubação
IVA 10 mM +
adição de IVA 10 mM
Figura 4.19 – Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da enzima glutationa
peroxidase (GPx) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores
representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de
variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao
controle
14
GPx
(U/mg de proteína)
12
10
8
6
4
2
0
Controle
Control
1M
1m
5m5M
3OHIVA (mM )
Figura 4.20 – Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a atividade da enzima
glutationa peroxidase (GPx) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens.
Os valores representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por
análise de variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em
relação ao controle.
66
10
GPx
(U/mg de proteína)
8
6
4
2
0
Controle
Controle
0,01 M
0,01m
0,1
0,1mM
IVG (mM )
1
1mM
Figura 4.21 – Efeito in vitro da isovalerilglicina (IVG) sobre a atividade da enzima glutationa
peroxidase (GPx) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores
representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de
variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao
controle.
4.1.8. Efeito in vitro dos principais metabólitos acumulados na acidemia
isovalérica sobre a atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) em
preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens
Os resultados demonstraram que o IVA [F(3,12)=0,016; P=0,997] (Figura 4.22), o 3OHIVA [F(3,12)=0,005; P=0,999] (Figura 4.23) e a IVG [F(3,12)=0,006; P=0,999] (Figura
4.24) não alteraram significativamente a atividade da SOD em preparações
mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens.
.
67
SOD
(U/mg de proteína)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Controle
Controle
1
1mM
5
5mM
10
10mM
IVA (mM)
Figura 4.22 – Efeito in vitro do ácido isovalérico (IVA) sobre a atividade da enzima superóxido
dismutase (SOD) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores
representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de
variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao
controle.
SOD
(U/mg de proteína)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Controle
Controle
0,1mM
0,1
1mM
1
5
5mM
3OHIVA (mM)
Figura 4.23 – Efeito in vitro do ácido 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA) sobre a atividade da enzima
superóxido dismutase (SOD) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens.
Os valores representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por
análise de variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em
relação ao controle.
68
SOD
(U/mg de proteína)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Controle
Controle
0,01
0,01mM
0,1
0,1mM
1
1mM
IVG (mM )
Figura 4.24 – Efeito in vitro da isovalerilgicina (IVG) sobre a atividade da enzima superóxido
dismutase (SOD) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos jovens. Os valores
representam média ± erro padrão (n=4). A diferença entre as médias foi calculada por análise de
variância de uma via (ANOVA). Não foi detectada nenhuma diferença significativa em relação ao
controle.
4.2. Estudos ex vivo
O presente estudo também teve por objetivo verificar o efeito da
administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido isovalérico (IVA) sobre
parâmetros de estresse oxidativo em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos
jovens.
4.2.1. Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico sobre a medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBA-RS) em córtex cerebral, hipocampo e estriado de cérebro de ratos jovens
24 horas após a injeção
Inicialmente, estudamos o efeito da administração I.C.V do IVA sobre a
medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) nestas estruturas
cerebrais 24 horas após a injeção. A figura 4.25A e 4.25B mostra que a injeção I.C.V
do IVA aumentou os níveis de TBA-RS no córtex cerebral (37%) [t(8)=5,005;
P=0,001] e no estriado (53%) [t(7)=4,740; P=0,003], respectivamente. No hipocampo,
69
O IVA não alterou significativamente os níveis de TBA-RS [t(4)= 2,305; P=0,082],
embora houvesse uma tendência de aumento desses (Figura 4.25C).
TBA-RS
(nmol/mg de proteína)
A
10
Córtex Cerebral
5
0
NaCl
TBA-RS
(nmol/mg de proteína)
B
TBA-RS
(nmol/mg de proteína)
C
**
IVA
Estriado
10
**
5
0
NaCl
10
IVA
Hipocampo
5
0
NaCl
IVA
Figura 4.25 – Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) de ácido isovalérico sobre os
níveis das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em córtex cerebral (A), hipocampo
(B) e estriado (C) de cérebro de ratos jovens 24 horas após a injeção. Os valores representam média
± erro padrão (n= 3 – 5). **. P<0,01, teste t de Student para amostras independentes.
70
4.2.2 - Efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico sobre o conteúdo de grupos sulfidrila em córtex cerebral, estriado
e hipocampo de cérebro de ratos jovens 24 horas após a injeção
Podemos observar na figura 4.26 que a administração I.C.V. do IVA diminuiu
(17%) o conteúdo de grupamentos sulfidrila 24 horas após a sua administração no
córtex cerebral (A) [t(8)=2,651; P= 0,029], sem alterar este parâmetro no estriado (B)
[t(6)= 0,355; P= 0,939] e no hipocampo (C) [t(6)=0,511; P= 0,628].
Conteúdo de Sulfidrilas
(nmol TNB/mg de proteína)
A
(nmol TNB/mg de proteína)
Conteúdo de Sulfidrilas
B
(nmol TNB/mg de proteína)
Conteúdo de Sulfidrilas
C
C ó rte x C e re b ra l
50
*
40
30
20
10
0
NaC l
IV A
E s tria d o
50
40
30
20
10
0
N aCl
50
IV A
H ip o c a m p o
40
30
20
10
0
N aC l
IV A
Figura 4.26– Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) sobre a formação de
grupamentos sulfidrila em córtex cerebral (A), hipocampo (B) e estriado (C) de cérebro de ratos
jovens 24 horas após a injeção. Os valores representam média ± erro padrão (n= 6 – 8). **. P<0,01,
teste t de Student para amostras independentes.
O próximo passo de nossa investigação foi o de estudar o efeito da injeção
intracerebroventricular do ácido isovalérico sobre as defesas antioxidantes não
71
enzimáticas e enzimáticas do cérebro. Como parâmetro de defesas antiantioxidantes
não enzimáticas utilizamos a determinação de glutationa reduzida (GSH), o mais
importante agente antioxidante do cérebro, e como parâmetros de defesas
enzimáticas medimos a atividade das enzimas glutationa peroxidase, catalase e
superóxido dismutase.
4.2.3 - Efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico (IVA) sobre as concentrações de glutationa reduzida (GSH) em
homogeneizado de córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos jovens 24
horas após a injeção
Na figura 4.27 verificamos que a administração I.C.V do IVA não alterou as
concentrações de GSH em homogeneizado de córtex cerebral (A) [t(7)= 1,230; P=
0,260], de estriado (B) [t(7)= 1,843; P= 0,108]) e de hipocampo (C) [t(7)= 0,946; P=
0,378] 24 horas após sua administração, embora pode se observar que houve uma
tendência para uma diminuição destes níveis no córtex cerebral e estriado.
72
GSH
(nmol/mg de proteína)
A
Córtex Cerebral
20
10
0
N aC l
GSH
(nmol/mg de proteína)
B
Estriado
20
10
0
N aC l
C
GSH
(nmol/mg de proteína)
IVA
IV A
Hipocam po
20
10
0
N aC l
IV A
Figura 4.27 – Efeito da administração I.C.V. do ácido isovalérico sobre os níveis de glutationa
reduzida (GSH) em homogeneizado de córtex cerebral (A), estriado (B) e hipocampo (C) de ratos
jovens 24 horas após a injeção. Os valores representam média ± erro padrão (n= 6-7). Os resultados
foram analisados por teste t de Student para amostras independentes. Não houve diferença
significativa entre os grupos.
4.2.4 - Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico (IVA) sobre a atividade da glutationa peroxidase (GPx) em córtex
cerebral, hipocampo e estriado de cérebro de ratos jovens 24 horas após a
injeção
Podemos observar na figura 4.28 que a injeção I.C.V. do IVA não aumentou
significativamente a atividade da GPx no córtex cerebral (A) [t(6)= 0,118; P= 0,910],
73
estriado (B) [t(6)= 1,146; P= 0,295] e hipocampo (C) [t(6)=0,870; P= 0,418] 24 horas
após sua administração.
Córtex Cerebral
Atividade da
Glutationa Peroxidase
(U/mg de proteína)
30
20
10
0
NaCl
Estriado
Atividade da
Glutationa Peroxidase
(U/mg de proteína)
30
20
10
0
NaCl
30
Atividade da
Glutationa Peroxidase
(U/mg de proteína)
IVA
IVA
Hipocampo
20
10
0
NaCl
IVA
Figura 4.28 – Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) sobre a atividade da enzima
antioxidante glutationa peroxidase (GPx) em homogeneizado de córtex (A), estriado (B) e hipocampo
(C) de cérebro de ratos jovens 24 horas após a injeção. Os valores representam média ± erro padrão
(n=4), (*P < 0,05) teste t de Student para amostras independentes.
4.2.5 - Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico (IVA) sobre a atividade da catalase (CAT) em córtex cerebral,
estriado e hipocampo de cérebro de ratos jovens 24 horas após a injeção
74
Na figura 4.29 observa-se que o IVA não alterou a atividade da CAT em
córtex cerebral (A) [t(8)= 0,090; P= 0,930] e no hipocampo (C) [t(11)= 0,860; P= 0,408]
24 horas após a sua administração. No entanto, o IVA aumentou significativamente
a atividade da CAT (40%) no estriado (B) [t(11)=3,048; P=0,011].
Catalase
(U/mg de proteína)
A
5 ,0
C ó rte x C e re b ra l
2 ,5
0 ,0
N aC l
(U/mg de proteína)
Catalase
B
IV A
E s tria d o
5 ,0
**
2 ,5
0 ,0
N aC l
(U/mg de proteína)
Catalase
C
5 ,0
IV A
H ip o c a m p o
2 ,5
0 ,0
N aC l
IV A
Figura 4.29– Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) sobre a atividade da enzima
antioxidante catalase (CAT) em homogeneizado de córtex (A), estriado (B) e hipocampo (C) de
cérebro de ratos jovens 24 horas após a injeção. Os valores representam média ± erro padrão (n= 5 11). **P<0,01, teste t de Student para amostras independentes.
4.2.6 - Efeitos da administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido
isovalérico sobre a atividade da superóxido dismutase (SOD), em córtex
cerebral, estriado e hipocampo de cérebro de ratos jovens 24 horas após a
injeção
75
A figura 4.30 mostra que a injeção I.C.V do IVA não alterou a atividade da
SOD em córtex cerebral (A) [t(5)=0,074; P=0,944], estriado (B) [t(4)= 1,515; P= 0,204]
e hipocampo (C) [t(5)= 0,476; P=0,654] 24 horas após a sua administração.
SOD
(U/mg de proteína)
A
Córtex Cerebral
3,0
1,5
0,0
N aC l
SOD
(U/mg de proteína)
B
IVA
Estriado
3,0
1,5
0,0
N aC l
SOD
(U/mg de proteína)
C
3,0
IVA
Hipocam po
1,5
0,0
N aC l
IVA
Figura 4.30 – Efeito da administração intracerebroventricular (I.C.V.) sobre a atividade da enzima
antioxidante superóxido dismutase (SOD) em homogeneizado de córtex (A), hipocampo (B) e estriado
(C) de cérebro de ratos jovens 24 horas após a injeção. Os valores representam média ± erro padrão
(n=4 - 6). Os resultados foram analisados por teste t de Student para amostras independentes. Não
houve diferença significativa entre os grupos.
76
5 DISCUSSÃO
A acidemia isovalérica é uma doença neurometabólica autossômica recessiva
do catabolismo do aminoácido leucina causada pela deficiência da atividade da
enzima isovaleril-CoA desidrogenase (TANAKA et al., 1966), levando ao acúmulo
preponderante dos ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA), bem
como da isovalerilglicina (IVG). As concentrações de IVA atingem 5 mM no sangue
dos pacientes, principalmente durante episódios agudos, enquanto as do 3-OHVA e
IVG são menores (TANAKA et al., 1966; SWEETMAN & WILLIAMS, 2001; VOCLEY
& ENSENAUER, 2006).
Existem dois fenótipos clínicos da acidemia isovalérica, ambos devidos ao
mesmo defeito bioquímico. São eles a forma neonatal, severa aguda e a forma
crônica, menos grave, com início de apresentação mais tardio (SWEETMAN &
WILLIAMS, 2001; SCRIVER, 2001). Em ambos os variantes, os sintomas
neurológicos, como hipotonia, letargia, coma e convulsões são predominantes. Os
achados
laboratoriais
são
de
acidose
metabólica,
moderada
cetonúria,
acidemia/acidúria láctica e hiperamonemia (FISCHER et al., 1981).
Apesar dos sintomas clínicos serem predominantemente neurológicos nesta
doença, a fisiopatogenia do dano cerebral é pouco conhecida. Porém, o acúmulo de
metabólitos tóxicos na acidemia isovalérica, bem como em outros erros inatos do
metabolismo, tem sido postulado contribuir para a neuropatogênese dessas
patologias. Assim, se faz necessária uma investigação do papel dos metabólitos
acumulados na acidemia isovalérica sobre a função do sistema nervoso central. O
presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos do IVA, 3-OHIVA, e da
IVG sobre alguns parâmetros importantes de estresse oxidativo in vitro e in vivo em
cérebro de ratos jovens. Nos experimentos in vitro, procuramos testar se estes
metabólitos são capazes de alterar vários parâmetros de estresse oxidativo em
77
mitocôndrias de cérebro de ratos jovens, uma vez que essas organelas são
importantes para a geração de radicais livres. Assim, preparações mitocondriais de
cérebro de ratos jovens foram expostas por 30 min ao IVA (1-10 mM), 3OHVA (0,1-5
mM) e IVG (0,01-1 mM), seguidas da medida de lipoperoxidação (TBA-RS e
quimiluminescência), dano oxidativo protéico (carbonilas e sulfidrilas), defesas
antixidantes não enzimáticas (TRAP e GSH) e defesas antioxidantes enzimáticas
(GPx e SOD). A medida da atividade da catalase não foi feita, tendo em vista que
esta atividade não está presente nas mitocôndrias.
Verificamos que de uma forma geral os três metabólitos examinados tiveram
efeitos moderados sobre estes parâmetros em preparações mitocondriais. As únicas
alterações destas medidas detectadas foram a quimiluminescência que foi
significativamente aumentada pela IVG na concentração mais alta (1 mM) e a
formação de carbonilas que foi estimulada pelo IVA nas concentrações de 1, 5 e 10
mM de forma dose-dependente e pelo 3-OHIVA nas concentrações de 1 e 5 mM,
também de forma dose-dependente. Estes achados sugerem que o IVG possa ativar
a lipoperoxidação em preparações mitocondriais e que o IVA e o 30HIVA causam
dano oxidativo protéico. Tendo em vista que o conteúdo de grupos tióis (sulfidrilas)
que também sinaliza oxidação de proteínas não foi afetado por estes metabólitos e
que o mesmo ocorreu com a medida de TBA-RS (lipoperoxidação), podemos sugerir
que estas medidas foram menos sensíveis à ação do IVA, 3-OHIVA e IVG. Por outro
lado, as defesas antioxidantes não enzimáticas e enzimáticas também não se
alteraram na presença das várias concentrações destes metabólitos, indicando que
seu efeito foi leve. Também se poderia concluir que essas substâncias acumuladas
na acidemia isovalérica não estimulam substancialmente a produção de radicais
livres na mitocôndria, pois, caso contrário, teríamos encontrado alterações nos
diversos parâmetros analisados nas preparações mitocondriais. Por outro lado, não
se pode excluir a possibilidade de que no citoplasma celular ou em células intactas
efeitos mais significativos desses metabólitos fossem encontrados nas medidas
analisadas no presente trabalho.
As doses do IVA utilizadas nos ensaios in vitro foram similares às
encontradas no sangue dos pacientes afetados por acidemia isovalérica que se
78
aproximam de 5 mM durante as crises. Já o 3-OHIVA e a IVG foram utilizadas na
dose máxima de 1 mM, visto que estas substâncias se acumulam em menores
concentrações nesta doença.
Resultados anteriores mostraram que o IVA, mas não o 3-OHIVA e o IVG,
inibe marcadamente a atividade da Na+,K+-ATPase em cérebro de ratos jovens e
que tal efeito deveu-se à produção de espécies ativas pelo IVA, uma vez que o uso
de antioxidantes preveniu totalmente a ação provocada pelo mesmo (RIBEIRO et al.,
2007).
Desta forma, resolvemos investigar o efeito da injeção intracerebroventricular
de IVA (5 µmol em cada ventrículo lateral) sobre alguns parâmetros de estresse
oxidativo em homogeneizados totais de várias estruturas cerebrais (córtex, estriado
e hipocampo) após 24 horas de sua administração. Observamos um aumento
significativo na medida de TBA-RS no córtex cerebral e estriado dos animais
causada pelo IVA, enquanto nenhuma alteração desta medida foi verificada no
hipocampo. Demonstramos também um incremento da atividade da catalase no
estriado e uma oxidação (diminuição do conteúdo) dos grupamentos sulfidrilas no
córtex cerebral 24 horas após a injeção de IVA. Tais resultados sugerem que este
ácido provoque um aumento da produção de radicais livres, provavelmente radicais
peróxido (que ativam a produção e/ou atividade da catalase) e derivados que
presumidamente poderiam induzir lipoperoxidação (TBA-RS elevado). O aumento
da atividade da catalase poderia ter sido devido ao aumento da sua expressão para
converter a produção acelerada de H2O2, em H2O e, portanto, proteger as células de
dano mediado por radicais livres. Enfatize-se que o H2O2 pode, na presença de ferro,
se converter no radical hidroxila que é o radical com maior toxicidade in vivo e que o
estriado é a estrutura cerebral que possui o maior conteúdo deste metal no cérebro.
Não podemos no momento interpretar com exatidão as causas da resposta
diferencial da administração de IVA sobre as estruturas cerebrais cujas medidas de
estresse oxidativo foram quantificadas. Por outro lado, é possível que o estriado e o
córtex cerebral foram mais vulneráveis à ação deste ácido por serem mais
vascularizados, permitindo, portanto, maior influxo do IVA com aumento de suas
79
concentrações nestas estruturas cerebrais. No entanto, devemos também considerar
que a pequena quantidade de IVA administrada (10 µmol no total) poderia não ter
sido suficiente para provocar um aumento significativo das concentrações deste
ácido nos tecidos cerebrais examinados, assim deixando de causar efeitos
significativos. De qualquer modo, a administração de doses semelhantes de outros
ácidos orgânicos que se acumulam em algumas acidemias provocou efeitos próoxidantes significativos nos mesmos parâmetros analisados (LEIPINITZ et al., 2007).
Concluindo, tomados em seu conjunto os resultados in vitro e ex vivo de
nossa presente investigação, podemos concluir que os metabólitos IVA, 3-OHIVA e
IVG não parecem provocar dano oxidativo relevante sobre o cérebro de ratos jovens.
Seria interessante, no entanto, também avaliar os efeitos da administração
intracerebroventricular dos outros metabólitos (3-OHIVA e IVG) acumulados na
acidemia isovalérica sobre os mesmos e sobre outros parâmetros de estresse
oxidativo para melhor esclarecer a fisiopatogenia do dano cerebral da acidemia
isovalérica. Além disso, é também possível que as pequenas alterações encontradas
nos parâmetros de estresse oxidativo analisados no presente trabalho possam agir
sinergicamente com outros mecanismos, como por exemplo, uma disfunção
energética (RIBEIRO et al., 2007) para explicar a disfunção neurológica causada
pelos pacientes afetados pela acidemia isovalérica.
Tendo em vista que estes pacientes apresentam freqüentemente crises
convulsivas, a exicitotoxicidade causada por estes metabólitos também é uma
possibilidade e deveria ser avaliada com experimentos in vitro e ex vivo. Finalmente,
enfatizamos que nossos resultados devam ser interpretados cautelosamente, se
fazendo necessária uma investigação de se o dano oxidativo atua na acidemia
isovalérica, examinando parâmetros de estresse oxidativo em tecidos (sangue,
eritrócitos e fibroblastos) de pacientes afetados. O entendimento dos possíveis
efeitos de espécies ativas sobre o dano neurológico nesta doença pode levar ao
desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para a prevenção e tratamento
da mesma.
80
6 CONCLUSÕES
1) Os ácidos isovalérico (IVA) e 3-hidroxiisovalérico (3-OHIVA), bem como a
isovalerilglicina (IVG) não afetaram in vitro a medida das substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBA-RS) em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de
ratos de 30 dias de vida.
2) Os ácidos IVA e o 3-OHIVA também não alteram in vitro a
quimiluminescência, enquanto a IVG na concentração de 1mM aumentou
significativamente a quimiluminescência em preparações mitocondriais isoladas de
cérebro de ratos de 30 dias de vida.
3) O IVA e o 3-OHIVA aumentaram significativamente e de maneira dosedependente a formação de carbonilas, sendo que a IVG não foi capaz de alterar
significativamente este parâmetro em preparações mitocondriais isoladas de cérebro
de ratos de 30 dias de vida.
4) O IVA e o 3-OHIVA bem como a IVG não alteraram a medida de
grupamentos sulfidrila em mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos de 30 dias de
vida.
5) O IVA e o 3-OHIVA, bem com a isovaleriglicina (IVG) não alteraram as
defesas antioxidantes não enzimáticas medidas pelo potencial antioxidante total e
pela glutationa reduzida em preparações mitocondriais isoladas de cérebro de ratos
de 30 dias de vida.
6) O IVA e o 3-OHIVA, bem como a IVG não alteraram a atividade das
enzimas
antioxidantes
glutationa
peroxidase
e
superóxido
mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos de 30 dias de vida.
dismutase
em
81
7) A administração intracerebroventricular (I.C.V.) do ácido IVA aumentou
significativamente a peroxidação lipídica medida através dos níveis de TBA-RS em
homogeneizado de córtex e estriado, mas não em hipocampo de cérebro de ratos de
30 dias de vida.
8) A I.C.V. do ácido isovalérico (IVA) aumentou significativamente a medida
de grupamentos sulfidrila em homogeneizado de córtex cerebral, sem alterar esse
parâmetro em hipocampo e estriado de ratos de 30 dias de vida.
9) A I.C.V. do IVA não alterou os níveis de glutationa reduzida em
homogeneizado de córtex, hipocampo e estriado de ratos de 30 dias de vida.
10) A I.C.V. do IVA não alterou as atividades das enzimas antioxidante
glutationa peroxidase e superóxido dismutase em homogeneizado de córtex,
hipocampo e estriado de ratos de 30 dias de vida.
11) A I.C.V. do IVA não alterou a atividade da enzima antioxidante catalase
em homogeneizado de córtex e hipocampo, mas aumentou significativamente a
atividade desta enzima no estriado de ratos de 30 dias de vida.
12) A análise conjunta dos resultados in vitro e ex vivo indica que os principais
metabólitos acumulados na acidemia isovalérica não provocam um dano oxidativo
extenso em cérebro de ratos jovens.
82
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