Raquel Catarino - Polimorfismo no gene da Ciclina D1 em

UNIVERSIDADE DO MINHO
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM
NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
Orientador: Prof. Doutor Rui Manuel de Medeiros Melo Silva
Co-orientador: Prof. Doutora Margarida Paula Pedra Amorim Casal
RAQUEL JORGE FERREIRA CATARINO
Porto, 2005
DISSERTAÇÃO DE CANDIDATURA AO GRAU DE MESTRE
APRESENTADA À UNIVERSIDADE DO MINHO
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Doutor Rui Medeiros, orientador deste trabalho, pela
paciência, motivação e incentivo, sempre disposto a oferecer estímulos e ouvir
com interesse e ânimo todas as questões, dúvidas e problemas e pela confiança
depositada em mim e no meu trabalho.
À Doutora Margarida Casal, pelos comentários, observações e críticas
construtivas a este trabalho e pelo empenho dedicado ao Mestrado de Genética
Molecular.
Ao Núcleo Regional do Norte da Liga Portuguesa Contra o Cancro, em
particular ao Dr. Cardoso da Silva e ao Dr. Vítor Veloso, por me concederem a
bolsa que permitiu a realização deste trabalho.
Ao Professor Carlos Lopes, pela disponibilização dos meios necessários à
realização deste projecto.
À Dra. Deolinda Pereira e ao Dr. Eduardo Breda, pelo apoio fundamental
na parte clínica deste trabalho.
Aos meus colegas de trabalho, que apesar das dificuldades continuam a
batalhar pela investigação básica. À Paula pelos momentos e desabafos de
confidências, à Gui pelo constante sorriso e boa disposição, à Xaninha pelo
carinho, à Dani e ao Hugo pelo incentivo e prestabilidade e à Ana, pela amizade
e intervalos cúmplices.
V
Aos meus amigos, sempre interessados e solícitos em ajudar-me, por
suportarem e perdoarem as minhas ausências. À Tânia pela amizade franca e
incondicional, à Mafas pela partilha de choros e risos, ao Viet pela fraternidade, à
Joaninha pela amizade para uma vida e à Vaninhas, que apesar de estar longe,
está sempre presente quando é preciso…
Ao Joaquim Paulo, pela disponibilidade e paciência infinitas na elaboração
da parte gráfica desta dissertação.
À minha madrinha, vítima desta doença e desde sempre razão motivadora
para eu estudar Oncologia.
Ao Rui, sempre solícito, por toda a dedicação, paciência, amor e carinho e
pelos pequenos grandes miminhos determinantes para o meu sorriso diário e
fácil…
À minha família, pelo apoio incondicional. Aos meus pais, por terem
suportado todos os meus encargos, pela confiança que me incutem e pela
felicidade que sempre me proporcionam. Foi graças a todo o vosso apoio que
tive oportunidade de estudar o que sempre gostei e de concluir esta dissertação,
podendo retribuir um pouco do orgulho que sinto pelo dois.
Ao meu irmão e à minha mana de sangue e sempre…
Ao meu avô, que sempre acreditou em mim…
VI
INDICE
Índice
RESUMO
IX
ABSTRACT
XV
INTRODUÇÃO
1
BIOLOGIA MOLECULAR DO CANCRO
3
VARIAÇÕES GENÉTICAS: POLIMORFISMOS
8
CANCRO E CICLO CELULAR
10
VÍRUS E CANCRO
13
CICLINA D1 E CANCRO
17
POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1
21
CANCRO DO COLO DO ÚTERO
23
CANCRO DA NASOFARINGE
27
OBJECTIVOS
31
MATERIAL E MÉTODOS
35
POPULAÇÃO
37
Indivíduos Controlo
37
Pacientes com Cancro do Colo do Útero
38
Pacientes com Cancro da Nasofaringe
40
PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
42
AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR PCR
43
Identificação do fragmento do produto de PCR
ANÁLISE DO POLIMORFISMO NO GENE CCND1 POR RFLP
Identificação dos fragmentos obtidos por RFLP
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
VII
44
44
45
INDICE
ANÁLISE ESTATÍSTICA
45
47
RESULTADOS
AMPLIFICAÇÃO DO DNA
49
ANÁLISE DO POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1
49
FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS DO POLIMORFISMO A870G CCND1
51
Indivíduos Controlo
51
Pacientes com Lesões do Colo do Útero
53
Pacientes com Cancro da Nasofaringe
61
DISCUSSÃO
69
SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DO COLO DO ÚTERO
71
SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DA NASOFARINGE
74
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS
79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
85
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
VIII
RESUMO
A carcinogénese é um processo que envolve várias etapas e reflecte
as alterações genéticas que promovem a transformação progressiva de
células humanas normais em células altamente malignas.Nos últimos anos
tem vindo a tornar-se clara a importância do estudo de genes de baixa
penetrância, como os genes envolvidos na reparação de DNA e
manutenção da integridade genómica, no controlo da proliferação e
diferenciação celular ou no metabolismo de carcinogénios.
A variação genética inter-individual pode constituir um factor
importante na caracterização da susceptibilidade para o desenvolvimento
de cancro. Pensa-se que algumas destas variantes genéticas podem ser
definidas como alelos de susceptibilidade de baixa penetrância, conferindo
um risco alterado para desenvolver cancro.
Têm sido descritos muitos estudos relativamente à epidemiologia
do
cancro
e
aos
efeitos
carcinogénicos
de
microrganismos,
nomeadamente os vírus. No caso de vírus que possuem a capacidade de
persistir nas células que infectam, pensa-se que o mecanismo mais
frequente resulta da alteração do controlo do ciclo celular e predisposição
para modificações mais alargadas na expressão genética das células.
A proteína ciclina D1 (CCND1) parece ser muito importante na
regulação do ciclo celular, particularmente no ponto de controlo G1/S do
ciclo celular. O gene CCND1 é um proto-oncogene mapeado no
cromossoma 11q13 muitas vezes alterado em diversos tipos de tumores.
Foi identificado um polimorfismo no nucleótido 870 do gene CCND1, que
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
XI
RESUMO
consiste na transição das bases azotadas adenina e guanina no exão 4 do
gene.
Neste trabalho foi desenvolvido um estudo do tipo caso-controlo,
com os objectivos de analisar a frequência do polimorfismo A870G no
gene da ciclina D1 (CCND1) num grupo de indivíduos sem qualquer
patologia, em mulheres com carcinoma do colo do útero e indivíduos com
carcinoma da nasofaringe e verificar e avaliar a existência de associações
entre a frequência do polimorfismo estudado e susceptibilidade genética
para carcinoma do colo do útero e nasofaringe.
Foram
analisadas
amostras
de
DNA
correspondentes
a
quatrocentos e cinquenta e nove (459) indivíduos. O grupo de indivíduos
controlo consistiu em cento e oitenta e sete (187) indivíduos normais sem
patologia oncológica conhecida, constituído por cento e três (103)
mulheres e oitenta e quatro (84) homens. Foram analisadas amostras de
DNA de 178 mulheres com lesões colo do útero e 94 indivíduos com
cancro da nasofaringe.
A análise do polimorfismo e avaliação dos genótipos foi efectuada
através da técnica PCR-RFLP.
Através da análise dos resultados observou-se que mulheres
portadoras do genótipo GG possuem um risco 3,67 vezes superior para o
desenvolvimento de lesões de alto grau do colo do útero (OR=3,67; 95%
CI 1,45-9,31; p=0,007) e 3,24 vezes superior para o desenvolvimento de
carcinoma espinocelular do colo do útero (OR=3,24; 95% CI 1,41-7,46;
p=0,006). Relativamente ao grupo de indivíduos com carcinoma da
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
XII
RESUMO
nasofaringe, a análise das frequências dos genótipos CCND1 indica que
indivíduos portadores do genótipo GG possuem um risco acrescido no
desenvolvimento de cancro da nasofaringe (OR=2,17; 95% CI 1,19-3,98;
p=0,016) e um risco ainda superior quando analisados os resultados
relativos ao tipo histológico indiferenciado (UCNT) em indivíduos
portadores do genótipo GG (OR=2,32; 95% CI 1,20-4,17; p=0,018).
Estes resultados podem ajudar na compreensão do papel e
influência da ciclina D1 no cancro, dos mecanismos biológicos do cancro
do colo uterino e da nasofaringe e na definição de um perfil genético para
estas neoplasias.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
XIII
ABSTRACT
Tumorigenesis in humans is a multistep process and these steps
reflect genetic alterations that drive the progressive transformation of
normal cells into highly malignant derivatives.
In the last few years low penetrance genes have been intensely
studied, namely genes involved in DNA repair, genomic integrity
maintenance, cell cycle control and metabolism of carcinogens.
The genetic variation between individuals may be important in the
characterization of cancer susceptibility. Some of these genetic variations
can be defined as low penetrance susceptibility alleles, conferring an
altered risk in cancer development.
Many important discoveries relating to cancer epidemiology and to
the carcinogenic effects of micro-organisms, namely virus, have been
reported. The mechanism likely to occur more frequently is the imprinting
of modified cell cycle control and predisposition to more extensive
changes in cellular gene expression in the case of viruses that persist in
the cells they infect.
Cyclin D1 (CCND1) is a protein very important in cell cycle
regulation, particularly in the G1/S checkpoint of the cell cycle. CCND1 is a
proto-oncogene located on human chromosome 11q13 often altered in
many human tumors. A single nucleotide polymorphism at nucleotide 870
has been identified.
We performed a case-control study, in order to analyze the
frequency of the A870G CCND1 polymorphism in healthy individuals,
women with lesions of the uterine cervix
and
individuals
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
XVII
with
ABSTRACT
nasopharyngeal carcinoma, and evaluate the possible associations
between the frequency of the polymorphism and genetic susceptibility to
cervical and nasopharyngeal cancers.
We analysed DNA samples of 459 individuals: 178 women with
cervical lesions and 94 individuals with nasopharyngeal cancer. The
control group consisted of 187 healthy individuals, including 103 women
and 84 men.
The analysis of the A870G polymorphism was performed by PCRRFPL techniques.
The GG genotype was associated with a 3,67 fold higher risk for the
development of high-grade lesions of the cervix (OR=3,67; 95% CI 1,459,31; p=0,007) and a 3.24 fold increased risk for the development of
squamous invasive cervical cancer (OR=3,24; 95% CI 1,41-7,46;
p=0,006). Concerning the nasopharyngeal cancer group, the analysis of
the frequencies of CCND1 genotypes indicates that individuals carrying the
GG genotype have a 2,17 fold increased risk for the development of
nasopharyngeal cancer (OR=2,17; 95% CI 1,19-3,98; p=0,016) and a
slightly higher susceptibility, with a risk of 2,32 fold (OR=2,32; 95% CI
1,20-4,17; p=0,018), when considering the undifferentiated histological
type of nasopharyngeal carcinoma (UCNT).
These results can lead to a better understanding of cyclin D1 influence in
cancer, the biological mechanisms of cervical and nasopharyngeal cancers
and in the definition of a genetic profile for these diseases.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
XVIII
INTRODUÇÃO
Biologia Molecular do Cancro
O cancro constitui um importante problema de saúde pública a nível
mundial, sendo detectados todos os anos cerca de 10 milhões de novos
casos no mundo inteiro (Parkin 2001). Em Portugal, esta doença constitui
a segunda causa de morte (Pinheiro et al. 2003).
O cancro é uma doença que envolve alterações dinâmicas no
genoma, que se encontra alterado em múltiplos locais nas células
cancerígenas. A carcinogénese é um processo que envolve várias etapas e
reflecte as alterações genéticas que promovem a transformação
progressiva de células humanas normais em células altamente malignas
(Hanahan e Weinberg 2000). Danos não letais no material genético são a
base da carcinogénese, podendo ser herdados ou adquiridos ao longo da
vida através da acção de agentes ambientais, nomeadamente compostos
químicos, radiação e agentes infecciosos (Kumar et al. 2003). O número
exacto de alterações necessárias ao desenvolvimento de neoplasias não é
conhecido, variando provavelmente com o tipo de alteração e tipo de
tumor. O objectivo da investigação oncológica consiste na definição destas
alterações moleculares e no desenvolvimento de estratégias de prevenção
e tratamento eficazes (Weber 2002).
Um tumor maligno é então o resultado de uma série de alterações
no DNA de uma única célula, ou clones desta célula, que originam perda
das funções normais, crescimento celular descontrolado e, por vezes,
metástases (dispersão de células malignas e crescimento neoplásico à
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
3
INTRODUÇÃO
distância do tumor primário). A progressão de uma célula normal até uma
célula maligna é um processo lento e envolve a acumulação de mutações
em genes determinantes, nomeadamente em proto-oncogenes (genes
cuja função consiste na indução da proliferação celular), genes
supressores tumorais (genes que codificam geralmente proteínas que
inibem a divisão celular), genes associados à regulação da apoptose e
genes envolvidos na reparação de DNA (Brennan 2002).
Durante a carcinogénese, seis propriedades celulares essenciais são
alteradas e adquiridas pelas células malignas, designadamente a autosuficiência em factores de crescimento, insensibilidade a sinais inibidores
de
crescimento,
potencial
replicativo
ilimitado,
fuga
à
apoptose,
capacidade de invasão tecidular e metastização e angiogénese (figura 1).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
4
INTRODUÇÃO
Figura 1 – Alterações necessárias adquiridas pelas células malignas (adaptado
de Hanahan e Weinberg 2000).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
5
INTRODUÇÃO
Os meios através dos quais estas alterações podem ser adquiridas
variam no seu mecanismo e cronologia. O número de mutações
necessárias para adquirir uma determinada propriedade é também
variável conduzindo, no entanto, ao mesmo resultado (Weber 2002). Por
outro lado, os mecanismos celulares que impedem a carcinogénese
podem diferir entre indivíduos, devido à variabilidade populacional dos
genes polimórficos que regulam estes processos (Brennan 2002).
A variação genética inter-individual pode constituir um factor
importante na caracterização da susceptibilidade para o desenvolvimento
de cancro. Tem sido sugerido que os genes envolvidos na susceptibilidade
para cancro podem ser considerados de acordo com a sua penetrância: o
grupo de genes de susceptibilidade com elevada penetrância, como o caso
dos genes BRCA1 e APC e o grupo de genes de susceptibilidade de baixa
penetrância, que são genes comuns com uma interacção gene-ambiente e
associação geralmente esporádica (Shields e Harris 1991). Nos últimos
anos tem vindo a tornar-se clara a importância do estudo de genes de
baixa penetrância, como os genes envolvidos na reparação de DNA e na
manutenção da integridade genómica, no controlo da proliferação e
diferenciação celular ou no metabolismo de carcinogénios. Embora estes
genes tenham um menor impacto no risco individual para o cancro,
podem ter relevância quando analisados em termos de risco atribuível na
população. Estas descobertas podem ajudar na elaboração de estratégias
de prevenção direccionadas para indivíduos de alto risco (Brennan 2002).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
6
INTRODUÇÃO
As causas de uma determinada neoplasia variam de indivíduo para
indivíduo, tornando-se essencial compreender estas variantes genéticas de
modo a definir grupos de indivíduos que sejam mais susceptíveis a uma
determinada neoplasia.
A epidemiologia molecular surge como a ciência que analisa a
contribuição dos potenciais factores de risco genéticos e ambientais,
identificados a nível molecular, para a etiologia, distribuição e prevenção
da doença ao nível das populações.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
7
INTRODUÇÃO
Variações Genéticas: Polimorfismos
Polimorfismos são variações na sequência de DNA que existem em
indivíduos normais de uma população, estando a variante menos
frequente presente em pelo menos 1% da população (Brookes 1999). As
variações de sequência mais comuns no genoma humano são single
nucleotide polymorphisms (SNPs), isto é, polimorfismos em que a variação
ocorre num único nucleótido (Erichsen e Chanock 2004).
Pensa-se que algumas destas variantes genéticas podem ser
definidas como alelos de susceptibilidade de baixa penetrância, conferindo
um risco alterado para desenvolver cancro. O risco para cancro parece ser
influenciado pelos padrões de SNPs que o indivíduo possui em
determinados genes chave de susceptibilidade (Brookes 1999).
A avaliação do risco relativo (RR) estima a magnitude de uma
associação entre o factor de exposição, como o polimorfismo, e a doença,
constituindo uma indicação sobre a probabilidade de desenvolvimento da
doença no grupo portador de uma das variantes desse polimorfismo
comparativamente às restantes. Grande parte dos estudos realizados é do
tipo caso-controlo, em que o risco relativo pode ser avaliado pela
determinação do quociente OR (Odds Ratio). O Odds Ratio representa a
magnitude desta associação e fornece informação que pode ser
importante no julgamento da causalidade e na definição do risco
atribuível, ou seja, a proporção de todos os casos da doença atribuível ao
factor de risco (Knudsen et al. 2001).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
8
INTRODUÇÃO
A análise de SNPs e haplótipos na pesquisa oncológica pode ajudar
na determinação e elaboração de terapias para a intervenção e prevenção
do cancro.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
9
INTRODUÇÃO
Cancro e Ciclo Celular
O cancro é, na sua essência, uma doença do ciclo celular (Pines
1995). Alterações no controlo de mecanismos e vias chave da regulação
da
proliferação
celular
são
acontecimentos
necessários
para
o
estabelecimento de um tumor.
O ciclo celular é constituído por quatro fases ou processos
estritamente coordenados: fase M, fase G1, fase S e fase G2. Na fase M
ocorre mitose (divisão celular), seguida da fase G1, que corresponde a um
intervalo entre a mitose e o início da replicação do DNA. A fase G1
antecede a fase S, onde ocorre replicação do DNA, que por sua vez é
seguida da fase G2, durante a qual a célula continua a crescer e a
sintetizar proteínas na preparação para a mitose. A progressão das células
através do ciclo celular é estritamente regulada por sinais extracelulares e
internos que monitorizam e coordenam os vários processos que ocorrem
durante as diferentes fases do ciclo celular. Esta coordenação entre fases
é dependente de um sistema de checkpoints (pontos de controlo) e vias
bioquímicas de transdução de sinal, que previnem a entrada numa nova
fase até que os eventos que ocorrem na fase anterior sejam completados
(Nurse 2002).
Esta progressão ordenada é controlada por ciclinas, cinases
dependentes de ciclinas (CDKs) e pelos seus inibidores. As CDKs
promovem o ciclo celular através da fosforilação de proteínas alvo que são
necessárias à progressão das células para uma nova fase do ciclo celular e
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
10
INTRODUÇÃO
são activadas por fosforilação após a ligação das ciclinas (subunidades
reguladoras), formando-se um complexo ciclina-CDK (Kumar et al. 2003).
Embora cada fase do ciclo celular seja estritamente regulada, a transição
da fase G1 para a fase S constitui um ponto de controlo de extrema
importância, pois após esta passagem as células são forçadas a progredir
através da fase S (Sherr 1996). Quando a célula recebe sinais indutores
de crescimento, a síntese de ciclinas D que complexam com as CDK4 e
CDK6 e de ciclina E, que complexa com a CDK2, são estimuladas. Estes
complexos fosforilam a proteína retinoblastoma (RB) e provocam a
libertação dos factores de transcrição que vão activar a expressão de
genes necessários à progressão através da fase S do ciclo celular (Sherr
1995; Sherr 1996) (figura 2).
A ciclina D1 tem sido particularmente estudada, devido ao seu
papel importante na promoção da carcinogénese.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
11
INTRODUÇÃO
Figura 2 – Ilustração esquemática do papel das ciclinas e cinases dependentes
de ciclinas (CDKs) na regulação do ciclo celular (adaptado de Kumar et al. 2003).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
12
INTRODUÇÃO
Vírus e Cancro
Nos últimos anos têm sido descritos muitos estudos relativamente à
epidemiologia do cancro e aos efeitos carcinogénicos de microrganismos.
Agentes infecciosos, especialmente os vírus, contribuem para mais de
20% das neoplasias (quadro I). Aproximadamente um quinto de todos os
carcinomas registados no mundo surgem no estômago (9%), fígado (6%)
e colo do útero (5%) (Talbot e Crawford 2004).
A replicação do genoma de muitos vírus de DNA encontra-se
parcialmente dependente da célula hospedeira. Neste processo, podem
alterar a expressão genética do hospedeiro para promoverem a síntese de
DNA e a proliferação celular. No caso de vírus que possuem a capacidade
de persistir nas células que infectam, pensa-se que o mecanismo mais
frequente resulta da alteração do controlo do ciclo celular e da
predisposição para modificações mais alargadas na expressão genética
das células (Pagano et al. 2004).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
13
INTRODUÇÃO
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
14
INTRODUÇÃO
Papilomavirus Humano - HPV
O HPV (Human Papillomavirus) é um vírus pequeno de DNA de
cadeia dupla, pertencente à família Papovaviridae. Foram já catalogados
mais de 120 tipos de HPVs, estabelecidos por homologia da sequência de
DNA. Os tipos de HPV associados a risco para cancro incluem as variantes
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68 (Duarte-Franco e
Franco 2004). Dados epidemiológicos, moleculares e clínicos sugerem que
os HPVs de alto risco, especialmente o HPV-16 e o HPV-18, desempenham
o papel principal na etiologia do cancro do colo do útero. Mais de 90% dos
carcinomas do colo uterino possuem DNA de HPV de alto risco (Bosch et
al. 2002). As proteínas virais E6 e E7 do HPV possuem propriedades
oncogénicas, importantes para a imortalização celular, desregulação do
ciclo celular e inibição da apoptose (Wolf et al. 2003).
Epstein-Barr vírus - EBV
O EBV (Epstein-Barr Vírus) é um vírus de dupla cadeia de DNA, que
pertence à família Herpesviridae e infecta principalmente linfócitos B
(Kuppers 2003). O vírus foi originalmente isolado a partir de biópsias de
Linfoma de Burkitt. Posteriormente, a infecção por EBV foi associada ao
desenvolvimento do cancro da nasofaringe, linfomas pós-transplante, uma
percentagem de linfomas não-Hodgkin e cancros gástricos e a raros
exemplos de linfomas de células T (Young e Rickinson 2004). O EBV
possui a capacidade de alterar a regulação do crescimento dos linfócitos B
e de induzir a transformação de crescimento permanente. O genoma do
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
15
INTRODUÇÃO
EBV codifica diversas proteínas que alteram profundamente a expressão
celular, nomeadamente o oncogene LMP1 (Latent Membrane Protein 1),
essencial para a transformação dos linfócitos e juntamente com outro
gene viral, o LMP2 (Latent Membrane Protein 2), contribui para a
activação da expressão de genes celulares, principalmente através da
activação do factor de transcrição NFkappaB (Nuclear Factor kappa B)
(Pagano et al. 2004).
Outras neoplasias epiteliais, nomeadamente cancro do pulmão, do
cólon, da bexiga e da próstata, são promovidas por imunossupressão,
sugerindo que podem existir vírus ainda não identificados com um papel
importante no desenvolvimento destas neoplasias (Talbot e Crawford
2004).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
16
INTRODUÇÃO
Ciclina D1 e Cancro
A ciclina D1 (CCND1) parece funcionar como um sensor chave na
integração dos sinais extracelulares em células que se encontram no início
da fase G1 do ciclo celular, mediando a sua função através da ligação às
CDKs. A abundância de CCND1 é induzida por factores de crescimento,
nomeadamente EGF (Endothelial Growth Factor) (Alisi et al. 2003), FGF2
(Fibroblast Growth Factor-2) (Holnthoner et al. 2002), aminoácidos
(Nelsen et al. 2003), LPA (ácido lisofosfatídico) (Hu et al. 2003) e
hormonas gástricas (Song et al. 2003; Pradeep et al. 2004), cada um
regulando a expressão de CCND1 em tipos celulares específicos. Vários
sinais oncogénicos induzem a expressão de CCND1, incluindo RAS
(Albanese et al. 1995), Src (Lee et al. 1999), Neu (Lee et al. 2000) e βcatenina (Shtutman et al. 1999; Lin et al. 2000).
O gene CCND1 é um proto-oncogene mapeado no cromossoma
11q13 (figura 3), que codifica uma proteína de 33.7 kDa (Bates e Peters
1995), sendo também designado de bcl-1 ou PRAD1. Foi originalmente
isolado como um gene clonado, rearranjado e sobre-expresso em
adenomas da paratiróide (Motokura et al. 1991).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
17
INTRODUÇÃO
A
B
Figura 3 – Localização do gene CCND1 no cromossoma 11 (A) e estrutura do
transcrito (B).
O CCND1 é um proto-oncogene muitas vezes activado durante o
desenvolvimento
de
tumores
através
de
vários
mecanismos,
nomeadamente por translocação e amplificação (figura 4). Em alguns
adenomas da paratiróide ocorre inversão, envolvendo as regiões 11q13 e
11q15, o que resulta na expressão de CCND1 sob o controlo do promotor
do gene da hormona paratiróide (Motokura et al. 1991). Em linfomas de
células B, o gene CCND1 sofre translocação e fica sob o controlo do
elemento regulador do gene da imunoglobulina no cromossoma 14q32 (de
Boer et al. 1993). A activação do gene (devido a amplificação ou rearranjo
cromossómico) e/ou sobre-expressão da proteína têm sido descritos em
vários tipos de tumores, nomeadamente cólon (Palmqvist et al. 1998),
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
18
INTRODUÇÃO
mama (Marsh e Varley 1998), cabeça-pescoço (Callender et al. 1994),
pulmão (Betticher et al. 1996), bexiga (Sgambato et al. 2002), fígado
(Nishida et al. 1994) e próstata (Chen et al. 1998). A sobre-expressão de
CCND1 tem também sido correlacionada com proliferação aumentada,
podendo originar a passagem prematura da célula através do ponto de
controlo G1/S, resultando na propagação de erros não reparados no DNA,
acumulação de erros genéticos e numa vantagem selectiva de crescimento
para as células alteradas (Quelle et al. 1993; Zheng et al. 2001).
Figura 4 – Mecanismos de activação de CCND1 em tumores humanos (adaptado
de Bates e Peters 1995).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
19
INTRODUÇÃO
A amplificação do gene e a expressão desregulada de CCND1 em
células tumorais têm também sido associadas a sobrevida livre de doença
reduzida e mau prognóstico, apesar de haver alguma controvérsia nestas
associações (McIntosh et al. 1995; Michalides et al. 1995; Betticher et al.
1996; Keum et al. 1999; Drobnjak et al. 2000).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
20
INTRODUÇÃO
Polimorfismo A870G no gene CCND1
Betticher e colaboradores identificaram um polimorfismo no
nucleótido 870 do gene CCND1, que consiste na transição das bases
azotadas adenina e guanina no exão 4 do gene. Este polimorfismo não
origina uma mudança de aminoácido, no entanto, o nucleótido variante
interfere com o splicing do exão 4 para o exão 5, dada a sua localização
no splice donor site do exão 4 do gene CCND1. O RNAm pode sofrer
splicing alternativo e originar dois transcritos diferentes (a e b), que
existem simultaneamente em diversos tecidos (figura 5). O transcrito a
sofre splicing normal e o transcrito b é cortado no intrão 4 e não possui o
as sequências existentes no exão 5 do gene.
O alelo G está associado a ambos os transcritos, enquanto que o
alelo A, que está apenas associado ao transcrito b, dá origem ao splicing
alternativo, resultando numa proteína truncada que não possui as
sequências envolvidas na degradação rápida e turnover da proteína
codificadas no exão 5 do gene (Betticher et al. 1995).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
21
INTRODUÇÃO
Isoforma a
Figura 5 – Splicing normal e alternativo do gene CCND1 (adaptado de Fu et al.
2004).
Os diferentes genótipos têm sido significativamente associados à
carcinogénese
e
prognóstico
clínico
em
diversas
neoplasias,
nomeadamente cancro da próstata (Wang et al. 2003), cabeça-pescoço,
(Matthias et al. 1998; Matthias et al. 1999; Holley et al. 2001; Wang et al.
2002; Monteiro et al. 2004), bexiga (Wang et al. 2002) e colorectal
(McKay et al. 2000).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
22
INTRODUÇÃO
Cancro do Colo do Útero
O tipo histológico mais comum de cancro do colo do útero é o
carcinoma
espinocelular,
que
pode
ser
queratinizante
ou
não
queratinizante. Os adenocarcinomas são responsáveis por apenas 14%
dos cancros do colo do útero. Os carcinomas adenoescamosos e de
pequenas células são relativamente raros (Pazdur 1995).
Nos últimos anos as taxas de incidência e mortalidade têm
diminuído consideravelmente nos países desenvolvidos, provavelmente
devido à aplicação de programas de rastreio citológico, nomeadamente o
teste de Papanicolau. O cancro do colo do útero é um problema de saúde
pública, com aproximadamente 500000 mulheres a desenvolverem a
doença por ano, em todo o mundo. Em muitos países menos
desenvolvidos constitui a causa mais comum de morte por cancro. O
cancro do colo uterino ocupa o segundo lugar das neoplasias nas
mulheres em todo o mundo, sendo que aproximadamente 80% dos casos
surgem em países menos desenvolvidos (Waggoner 2003).
Em Portugal, a taxa de incidência ajustada à idade de novos casos
de cancro do colo uterino por ano é de 17,0 por cada 100 000 mulheres e
na União Europeia, de 10,5 por cada 100 000 mulheres. A taxa de
mortalidade anual ajustada à idade por cancro do colo do útero em cada
100 000 indivíduos é de 6,3 em Portugal e de 4,4 na União Europeia
(Pinheiro et al. 2003) (figura 6).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
23
INTRODUÇÃO
Figura 6 – Incidência do cancro do colo do útero no mundo em 2000 (adaptado
de Parkin 2001).
FACTORES DE RISCO
A infecção por tipos de HPV de alto risco é presentemente aceite
como o principal factor causal no desenvolvimento de cancro do colo do
útero, sendo um factor necessário, mas não suficiente, para o
desenvolvimento desta neoplasia. Grande parte das infecções provocadas
pelo HPV é transiente e apenas uma porção se torna persistente. O risco
para o desenvolvimento de lesões intra-epiteliais precursoras de cancro do
colo do útero é substancialmente aumentado em mulheres que
desenvolvem infecções persistentes com tipos de HPV oncogénicos (Bosch
et al. 2002). Outros factores de risco importantes incluem o número de
parceiros sexuais, a idade de coitarca, outras infecções sexualmente
transmissíveis e o fumo de cigarro. O número de partos tem também sido
associado ao desenvolvimento de cancro do colo uterino, sendo que
múltiplas gravidezes provocam um efeito traumático e imunossupressor
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
24
INTRODUÇÃO
cumulativo no colo do útero, podendo facilitar a infecção por HPV. Tem
também sido descrita uma associação entre o uso prolongado de
contraceptivos orais e risco aumentado para cancro do colo do útero.
Relativamente a factores alimentares, a ingestão de frutas e vegetais que
contêm carotenóides e vitaminas C, A e E parece reduzir o risco para
cancro do colo uterino (Franco et al. 2001; Duarte-Franco e Franco 2004).
Factores
genéticos,
como
haplótipos
HLA
específicos
e
polimorfismos em alguns genes envolvidos na regulação do ciclo celular e
reparação do DNA têm sido associados ao desenvolvimento desta
neoplasia (Hildesheim e Wang 2002a; Jee et al. 2004) (figura 7).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
25
INTRODUÇÃO
Figura 7 – Modelo etiológico da infecção por HPV e cancro do colo do útero e
possível papel de outros co-factores na persistência da infecção e mediação da
progressão das lesões (adaptado de Franco et al. 2001).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
26
INTRODUÇÃO
Cancro da Nasofaringe
O cancro da nasofaringe (NPC) constitui um tipo distinto de cancro
da cabeça-pescoço. A classificação segundo a World Health Organization
(WHO) distingue três tipos histológicos de NPC, baseada no grau de
diferenciação. O carcinoma de células escamosas (SCC) queratinizante,
pertence ao tipo I, semelhante a outros cancros da cabeça-pescoço. No
tipo II agrupam-se os carcinomas não queratinizantes e no tipo III, mais
comum,
os
carcinomas
indiferenciados
(UCNT
–
Undifferentiated
Carcinoma of the Nasopharyngeal Type). O carcinoma indiferenciado
possui uma morfologia típica, com um infiltrado linfoplasmocítico
proeminente, também denominado de linfoepitelioma (Pazdur 1995). Os
diferentes tipos histológicos de NPC são encontrados em regiões
endémicas e não endémicas. Em zonas endémicas, o tipo III é
responsável por mais de 97% dos casos, enquanto que o SCC
queratinizante é mais comum em países Ocidentais (75%) (Marks et al.
1998).
O
cancro
da
nasofaringe
é
raro
na
maioria
dos
países,
especialmente na Europa e América do Norte, com incidência anual
inferior a 1/100 000 indivíduos. Nestes países o tipo histológico mais
comum é o indiferenciado, que está associado ao consumo de fumo de
cigarro, com incidência de 0,5-2 em 100 000 indivíduos por ano. No
entanto, a incidência de NPC é elevada em várias regiões no sul da China,
nomeadamente na região de Cantão perto de Guangzhou, onde a
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
27
INTRODUÇÃO
incidência é aproximadamente de 30-80/100 000 indivíduos por ano.
Outras áreas de elevada incidência incluem a Ilha Formosa, o Vietname e
as Filipinas. Nestas áreas, é provável que a dieta desempenhe um papel
importante na carcinogénese, dado que a dieta característica destas
populações consiste em carne e peixe curados que quando cozinhados
podem libertar nitrosaminas voláteis. Os países Arábia Saudita, Caraíbas e
populações de Esquimós do Alasca e Gronelândia possuem uma incidência
intermédia de NPC (Spano et al. 2003) (figura 8).
Esta neoplasia possui uma distribuição diferente entre homens e
mulheres, sendo que a taxa homem/mulher é normalmente de dois ou
três homens para uma mulher (Spano et al. 2003).
A distribuição do NPC de acordo com a idade não é idêntica no
Sudeste Asiático e Norte de África. Na Ásia, a maioria dos casos surge na
quinta ou sexta década de vida. No Norte de Africa, a distribuição parece
ser bimodal, com um pico por volta dos cinquenta anos de idade e outro
mais pequeno em indivíduos entre os 10 e 25 anos. Esta forma juvenil da
doença é responsável por aproximadamente 20% dos pacientes e possui
características clínicas e biológicas distintas (Spano et al. 2003).
As taxas de sobrevida aos 5 anos variam de 30 a 60%, dependendo
do estádio do tumor, da técnica de radiação utilizada e da percentagem
de pacientes com linfoepitelioma.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
28
INTRODUÇÃO
Figura 8 – Incidência do cancro da nasofaringe no mundo em 2000 (adaptado
de Parkin 2001).
FACTORES DE RISCO
Os
factores
etiológicos
que
parecem
ser
importantes
no
desenvolvimento do carcinoma da nasofaringe incluem susceptibilidade
genética e factores ambientais, nomeadamente a dieta e infecção por
Epstein-Barr vírus.
A dieta é um factor de extrema relevância no desenvolvimento de
NPC. Como foi referido anteriormente, a ingestão de peixe curado e
outros alimentos preservados, tradicionais do sul da China, contêm
nitrosaminas voláteis que são factores associados ao desenvolvimento de
cancro da nasofaringe (Lo e Huang 2004).
A infecção por EBV está fortemente associada ao NPC. Pensa-se
que o EBV desempenha um papel crítico na transformação das células
epiteliais na nasofaringe em cancro invasivo (Lo e Huang 2004).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
29
INTRODUÇÃO
Relativamente aos factores genéticos, têm sido observadas perdas
de material genético em alguns cromossomas, nomeadamente 3p, 9, 11q,
13q, 14q e 16q e ganho de material genético no cromossoma 12. Tem
sido sugerido um papel importante dos haplótipos do HLA com o
desenvolvimento de NPC, sendo que alguns antigénios do HLA possuem
uma eficiência reduzida na activação da resposta imunológica à infecção
por EBV (Hildesheim et al. 2002b). Alguns polimorfismos em genes
envolvidos na metabolização de carcinogénios (CYP2E1) e reparação de
DNA (XRCC1 e hOGG1) têm sido associados a risco aumentado para o
desenvolvimento de NPC (Hildesheim et al. 1997; Nazar-Stewart et al.
1999; Cho et al. 2003).
O cancro da nasofaringe envolve a acumulação de diversas
alterações genéticas que resultam na modificação de vários mecanismos
celulares, como a alteração de vias envolvidas na regulação do ciclo
celular, nomeadamente as vias da TP53 e RB (Lo e Huang 2004).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
30
OBJECTIVOS
Neste trabalho foi desenvolvido um estudo do tipo caso-controlo, com os
objectivos de:
- Analisar a frequência do polimorfismo A870G no gene da ciclina
D1 (CCND1) num grupo de indivíduos sem qualquer patologia, em
mulheres com carcinoma do colo do útero e indivíduos com carcinoma da
nasofaringe;
- Verificar e avaliar a existência de associações entre a frequência
do polimorfismo estudado e susceptibilidade genética para carcinoma do
colo do útero e da nasofaringe.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
33
MATERIAL E MÉTODOS
POPULAÇÃO
Neste trabalho foi realizado um estudo do tipo caso-controlo em
quatrocentos e cinquenta e nove (459) indivíduos. Todas as amostras
estudadas foram provenientes de indivíduos da região norte de Portugal.
INDIVÍDUOS CONTROLO
O grupo de indivíduos controlo consistiu em cento e oitenta e sete
(187) indivíduos normais sem patologia oncológica conhecida, constituído
por cento e três (103) mulheres e oitenta e quatro (84) homens, com uma
idade média de 55,0 anos, desvio padrão (dp) de 16,8 e mediana de 55,0
anos.
Relativamente ao sub-grupo controlo constituído pelos 84 homens,
a média das idades foi de 54,5 anos, desvio padrão de 17,4 e mediana de
56,5 anos. O sub-grupo controlo constituído pelas 103 mulheres possui
uma idade média de 46,7 anos, desvio padrão de 12,5 e mediana de 46,0
anos.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
37
MATERIAL E MÉTODOS
PACIENTES COM CANCRO DO COLO DO ÚTERO
Foram analisadas amostras referentes às primeiras amostras de
cento e setenta e oito (178) mulheres com lesões colo do útero
diagnosticado no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil –
Centro Regional de Oncologia do Porto e que deram entrada no
laboratório de Patologia Molecular entre 1997 e 2003. A idade média de
diagnóstico foi de 46,6 anos (dp de 12,7) e a mediana de 46,0 anos.
Aquando do diagnóstico foram analisadas as seguintes características
clínico-patológicas: tipo e grau de lesão, de acordo com o recente sistema
de classificação de Bethesda, tipo histológico do tumor e estádio, de
acordo
a
FIGO
–
Federation
Interantionale
de
Gynecologie
et
d’Obstetrique e AJCC – American Joint Comittee on Cancer. Em alguns
casos não foi possível a obtenção de informação relativamente ao estádio
do tumor. Estes dados estão descritos no quadro II.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
38
MATERIAL E MÉTODOS
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
39
MATERIAL E MÉTODOS
PACIENTES COM CANCRO DA NASOFARINGE
Foram analisadas amostras referentes às primeiras amostras de
noventa e quatro (94) indivíduos com cancro da nasofaringe diagnosticado
no Instituto Português de Oncologia Francisco Gentil – Centro Regional de
Oncologia do Porto e que deram entrada no laboratório de Patologia
Molecular entre 2001 e 2004. A idade média de diagnóstico foi de 47,9
anos (dp de 14,5) e a mediana de 50,0 anos. Foram analisadas as
seguintes características clínico-patológicas na altura do diagnóstico: tipo
e grau histológico e estádio do tumor, de acordo a AJCC – American Joint
Comittee on Cancer. Não foi possível a obtenção de informação
relativamente a estas características em alguns casos. Estes dados estão
descritos no quadro III.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
40
MATERIAL E MÉTODOS
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
41
MATERIAL E MÉTODOS
PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
Foram recolhidos aproximadamente 8 ml de sangue periférico dos
indivíduos atrás referidos, através de uma técnica padronizada de colheita
intravenosa, para tubos contendo uma solução de EDTA.
O isolamento de DNA genómico foi efectuado através da técnica
mista salting-out-clorofórmio a partir de células nucleadas de sangue
periférico (Mullenbach et al. 1989).
Adicionou-se uma solução hipotónica (AKE) às amostras, de forma
a provocar a lise dos eritrócitos e incubou-se a 4ºC durante 30 minutos.
Centrifugou-se a 2000 rpm (rotações por minuto), durante 10 minutos a
4ºC e ressuspendeu-se o sedimento na solução hipotónica. Centrifugou-se
novamente e ressuspendeu-se o sedimento em PBS, seguindo-se outra
centrifugação a 2000 rpm durante 10 minutos a 4ºC.
Após a obtenção do sedimento de células, desprezou-se o
sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento em 4 ml de tampão SE, de
modo a provocar a lise das células nucleadas. Adicionou-se SDS
(dodecilsulfato de sódio, Gibco BRL 5525UA), promovendo a dissociação
do
DNA
de
proteínas.
Adicionou-se
posteriormente
proteinase
K
(Boehringer Mannheim 745723), para uma concentração final de 200
µg/ml e incubou-se a 55ºC durante 12 horas para degradação proteica.
Adicionou-se 1 ml de NaCl 6 M previamente aquecido (concentração
final de 1,5 M), de forma a precipitar as proteínas (salting-out). A
separação das proteínas foi realizada através da adição de igual volume
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
42
MATERIAL E MÉTODOS
de clorofórmio (Merck 1124451000) e agitação suave durante 30 a 60
minutos. De seguida, centrifugou-se a 2500 rpm, durante 10 minutos a
4ºC com o objectivo de separar a fase aquosa que contém o DNA, da fase
orgânica, que contém as proteínas degradadas. Recolheu-se a fase
aquosa e adicionou-se igual volume de isopropanol (Panreac cod131090),
para precipitação do DNA. O DNA foi posteriormente lavado com etanol
(Merck 1009831000) a 70% (p/v). Após evaporação do etanol,
ressuspendeu-se o sedimento em água bidestilada.
Armazenaram-se as amostras a 4ºC ou -20ºC, consoante o tempo
de armazenamento previsto.
AMPLIFICAÇÃO DO DNA POR PCR
A região do gene CCND1 pretendida foi amplificada através da
técnica de Polimerase Chain Reaction (PCR), de forma a obter um
fragmento de 167 pares de base (pb) (Betticher et al. 1995). A reacção foi
efectuada num termociclador programável Biometra T-Gradient, num
volume final de 50 µl, consistindo em aproximadamente 0,2 µg de DNA
genómico, 1 U de Taq DNA polimerase (MBI Fermentas, #EP0402) e
respectivo tampão de reacção 1×, 1,5 mM de MgCl2 (MBI Fermentas), 0,2
mM de desoxinucleosídeos trifosfato (dNTP) (MBI Fermentas, #R0192), e
30 ρmol de primers específicos para a região do gene pretendida (F: 5’
GTG AAG TTC ATT TCC AAT CCG C 3’ e R: 5’ GGG ACA TCA CCC TCA CCC
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
43
MATERIAL E MÉTODOS
TCA CTT AC 3’). As condições da reacção incluíram um passo de prédesnaturação a 95ºC durante 10 minutos para activar a enzima, seguido
de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC durante 1 minuto, annealing a 55ºC
durante 1 minuto e extensão a 72ºC durante 1 minuto, com um passo de
extensão final durante 2 minutos a 72ºC.
IDENTIFICAÇÃO DO FRAGMENTO DO PRODUTO DE PCR
A
identificação
do
fragmento
de
DNA
foi
efectuada
por
electroforese em géis de agarose a 1.5% (p/v), corados com brometo de
etídeo e visualizados sob luz ultravioleta, num equipamento Image Master
VDS (Pharmacia Biotech).
ANÁLISE DO POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1 POR RFLP
O
polimorfismo
estudado
foi
analisado
através
da
técnica
Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP). Cerca de 15 µl de
produtos de PCR foram submetidos a digestão enzimática com 1U da
enzima de restrição ScrF1 (Fermentas #ER1422) e respectivo tampão de
reacção durante 4 horas a 37ºC.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
44
MATERIAL E MÉTODOS
IDENTIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS OBTIDOS POR RFLP
Os fragmentos obtidos por RFLP foram submetidos a electroforese
em géis de agarose a 3% (p/v), corados com brometo de etídeo e
visualizados sob luz ultravioleta. O produto de PCR de 167 pb é cortado
pela enzima, se o alelo G estiver presente, originando dois fragmentos de
145 e 22 pb.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística dos resultados foi efectuada com auxílio do
software estatístico SPSS (Versão 11,5, SPSS Inc., 2002) Epi Info (Versão
3,3, 2004).
A análise do qui-quadrado foi utilizada para comparar variáveis
categóricas, com um nível de significância de 5%. O valor de p foi obtido
pelo teste de χ2 e considerado estatisticamente significativo quando
inferior a 0,05. O valor Odds Ratio (OR) e o seu Intervalo de Confiança de
95% (95% CI) foram calculados como uma medida da associação entre os
alelos e genótipos do gene CCND1 e o risco para cancro. O equilíbrio de
Hardy-Weinberg foi testado através de um teste goodness of fit de
Pearson, de forma a comparar as frequências observadas e esperadas.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
45
MATERIAL E MÉTODOS
Foi calculada a Proporção Atribuível (PA), fracção de doença
atribuível a um dado factor de risco, através da fórmula: PA = PRF × 11/OR; PRF é a percentagem do factor de risco nos casos e OR é o Odds
Ratio.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
46
RESULTADOS
AMPLIFICAÇÃO DO DNA
A região do gene CCND1 pretendida foi amplificada por PCR, de
forma a obter um fragmento de 167 pares de base (pb). Os produtos de
PCR foram submetidos a electroforese em géis de agarose a 1,5 % (p/v),
corados com brometo de etídeo, utilizando um marcador molecular de
peso conhecido (marcador de 100 pb), de forma a verificar a amplificação
do fragmento de DNA pretendido de 167 pb (figura 9).
Figura 9 – Análise da amplificação dos produtos de PCR em gel de agarose a 1,5 %,
exemplificando o fragmento de 167 pb, correspondente à região de CCND1 amplificada
(M – marcador molecular de 100 pb).
ANÁLISE DO POLIMORFISMO A870G NO GENE CCND1
A técnica RFLP permitiu a visualização dos genótipos possíveis do
polimorfismo A870G no gene CCND1. Após digestão enzimática, a enzima
de restrição ScrF1 origina dois fragmentos de DNA quando o alelo G está
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
49
RESULTADOS
presente (145 e 22 pb) e apenas um, com peso de 167 pb, no caso de
presença do alelo A.
Através da visualização dos géis de agarose a 3% (figura 10),
podemos observar três padrões de fragmentos possíveis: um único
fragmento de 167 pb, correspondente ao genótipo homozigótico AA; um
fragmento de 145 pb e outro de 167 pb, correspondente ao genótipo
heterozigótico AG; ou um único fragmento de 145 pb, no caso de
genótipo homozigótico GG. A banda de 22 pb não é visível nos géis de
agarose, visto que possui um peso molecular muito baixo.
Figura 10 – Análise do polimorfismo A870G no gene CCND1 por RFLP em gel de
agarose a 3%, exemplificando os três padrões de RFLP obtidos. M – marcador molecular
de 100 pb; 1,3 e 7 – heterozigóticos AG; 2,4 e 5 – homozigóticos GG; 6 e 8 –
homozigóticos AA.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
50
RESULTADOS
FREQUÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS DO POLIMORFISMO A870G CCND1
INDIVÍDUOS CONTROLO
As frequências genotípicas do polimorfismo A870G no gene CCND1
nos indivíduos controlo estão descritas no quadro IV.
O grupo de indivíduos controlo total, constituído por 187 indivíduos,
dos quais 103 mulheres e 84 homens, possuiu frequências genotípicas de
28,9%, 56,1% e 15,0% relativamente aos genótipos AA, AG e GG,
respectivamente. Relativamente ao modelo recessivo, as frequências
obtidas foram de 85,0% para os genótipos AA/AG e de 15,0% para o
genótipo homozigótico GG.
O sub-grupo controlo constituído pelas 103 mulheres possuiu uma
distribuição genotípica constituída por 37,9% relativamente ao genótipo
AA, 53,4% relativamente ao genótipo AG e 8,7% relativamente ao
genótipo GG. No modelo recessivo, a frequência dos genótipos AA/AG foi
de 91,3% e 8,7% para o genótipo GG.
Relativamente ao sub-grupo controlo constituído pelos 84 homens,
as
frequências
dos
genótipos
AA,
AG
e
GG
observadas
foram
respectivamente 17,9%, 59,5% e 22,6%. No que respeita ao modelo
recessivo, as frequências obtidas foram de 77,4% para os genótipos
AA/AG e de 22,6% para o genótipo homozigótico GG.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
51
RESULTADOS
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
52
RESULTADOS
PACIENTES COM LESÕES DO COLO DO ÚTERO
A distribuição dos alelos e genótipos do polimorfismo A870G no
gene CCND1 entre o grupo controlo e o grupo de pacientes com lesões do
colo do útero (casos), incluindo lesões de alto grau (HSIL) e carcinoma
espinocelular do colo do útero (ICC) está descrita no quadro V.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
53
RESULTADOS
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
54
RESULTADOS
A frequência do alelo G foi superior no grupo de pacientes com
lesões do colo do útero (46,9%) relativamente ao grupo controlo (35,4%)
e esta diferença é estatisticamente significativa (p=0,011). A frequência
dos genótipos AA, AG e GG foi de 37,9, 53,4 e 8,7%, respectivamente, no
grupo controlo e de 30,8, 44,7 e 24,5%, respectivamente, no grupo dos
casos. A distribuição das frequências genotípicas de ambos os grupos está
de acordo com o esperado segundo os princípios de Hardy-Weinberg para
populações em equilíbrio (P=0,672 no grupo dos casos e P=0,461 no
grupo controlo).
A análise das frequências dos genótipos CCND1 indica que
mulheres portadoras do genótipo GG possuem um risco cerca de 3,4
vezes superior no desenvolvimento de lesões do colo do útero (OR=3,38;
95% CI 1,55-7,41; p=0,001). A estratificação da análise de acordo com a
mediana das idades dos pacientes indicou que o grupo de mulheres com
idade superior a 46 anos portadoras do genótipo GG, possui um risco
aumentado de cerca de 3 vezes no desenvolvimento de lesões do colo do
útero (OR=3,20; 95% CI 1,25-8,16; p=0,017).
No caso dos pacientes com carcinoma do colo do útero, a
proporção de casos de cancro do colo uterino atribuível à influência do
genótipo GG foi de 17,26%.
Na figura 11 estão representadas as distribuições genotípicas do
polimorfismo A870G no gene CCND1 no grupo controlo e grupos de lesões
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
55
RESULTADOS
do colo uterino, incluindo lesões de alto grau (HSIL) e carcinoma
espinocelular do colo do útero (ICC).
As frequências genotípicas no grupo controlo, no grupo de
pacientes com lesões de alto grau e carcinoma espinocelular do colo do
útero e resultados da análise estatística tendo em conta o grau de lesão
estão descritas no quadro VI.
100
GG
GG
90
GG
80
Percentagem
70
60
50
GG
AA/AG
AA/AG
40
AA/AG
AA/AG
30
20
10
0
Controlos
HSIL
ICC
Figura 11 – Representação gráfica da distribuição das frequências do
polimorfismo A870G no gene CCND1 nos grupos controlo, pacientes com lesões
de alto grau do colo uterino (HSIL) e no grupo de pacientes com carcinoma
espinocelular do colo do útero (ICC).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
56
RESULTADOS
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
57
RESULTADOS
Através da análise dos resultados observou-se que mulheres
portadoras do genótipo GG possuem um risco 3,67 vezes superior para o
desenvolvimento de lesões de alto grau do colo do útero (OR=3,67; 95%
CI 1,45-9,31; p=0,007) e de 3,24 vezes superior para o desenvolvimento
de carcinoma espinocelular do colo do útero (OR=3,24; 95% CI 1,417,46; p=0,006).
VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS
Foi analisado o estádio do tumor com o objectivo de avaliar a
influência do polimorfismo A870G no na agressividade e progressão
tumoral.
Foi efectuada uma re-codificação do estádio, de forma a avaliar
diferenciadamente os estádios menos agressivos (I, IIa) e os estádios
mais agressivos com invasão e envolvimento dos paramétrios (IIb, III e
IV).
Na figura 12 está representada a distribuição dos genótipos CCND1
nos diferentes estádios dos casos de carcinoma espinocelular do colo
uterino.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
58
RESULTADOS
100
90
80
Percentagem
70
GG
GG
60
GG
50
AA/AG
40
30
20
AA/AG
AA/AG
10
0
<II b
≥ II b
Figura 12 – Representação gráfica da distribuição das frequências do
polimorfismo A870G no gene CCND1 nos diferentes estádios tumorais.
No quadro VII estão descritos os resultados da análise estatística
referente às frequências dos genótipos CCND1 nos diferentes estádios.
Não
se
verificaram
diferenças
estatisticamente
significativas
frequências genotípicas nestes dois grupos de casos (p=0,49).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
59
nas
RESULTADOS
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
60
RESULTADOS
PACIENTES COM CANCRO DA NASOFARINGE
A distribuição dos alelos e genótipos do polimorfismo A870G no
gene CCND1 entre o grupo controlo e o grupo de pacientes com cancro da
nasofaringe está descrita no quadro VIII.
No grupo de pacientes com carcinoma da nasofaringe, as
frequências de ambos os alelos, A e G, foi de 50,0%. A frequência dos
genótipos AA, AG e GG foi de 28,9, 56,1 e 15,0%, respectivamente no
grupo controlo e 27,7, 44,6 e 27,7%, respectivamente no grupo dos
pacientes com cancro da nasofaringe. A percentagem de indivíduos
portadores do genótipo GG foi superior no grupo dos pacientes,
relativamente ao grupo controlo (figura 13).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
61
RESULTADOS
100
90
GG
GG
Percentagem
80
70
60
GG
50
40
AA/AG
AA/AG
AA/AG
30
20
10
0
NPC
Controlos
Figura 13 - Representação gráfica da distribuição das frequências do
polimorfismo A870G no gene CCND1 nos grupos controlo e pacientes com cancro
da nasofaringe.
A distribuição das frequências genotípicas de ambos os grupos está
de acordo com o esperado segundo os princípios de Hardy-Weinberg para
populações em equilíbrio (P=0,804 no grupo dos casos e P=0,357 no
grupo controlo).
A análise das frequências dos genótipos CCND1 indica que
indivíduos portadores do genótipo GG possuem um risco acrescido no
desenvolvimento de cancro da nasofaringe (OR=2,17; 95% CI 1,19-3,98;
p=0,016).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
62
RESULTADOS
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
63
RESULTADOS
No quadro IX estão descritas as frequências genotípicas no grupo
controlo e no grupo de pacientes com carcinoma indiferenciado da
nasofaringe (UCNT). A análise estatística dos resultados tendo em conta
este
tipo
histológico
demonstra
um
risco
ainda
superior
no
desenvolvimento de UCNT em indivíduos portadores do genótipo GG
(OR=2,32; 95% CI 1,20-4,17; p=0,018).
A proporção de casos de cancro da nasofaringe atribuível à
influência do genótipo GG foi de 14,94%.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
64
RESULTADOS
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
65
RESULTADOS
VARIÁVEIS CLÍNICO-PATOLÓGICAS
O grupo de pacientes com cancro da nasofaringe foi estratificado
de acordo com o estádio do tumor e presença/ausência de metástases
ganglionares, com o intuito de analisar uma possível influência do
polimorfismo A870G na agressividade tumoral.
Na figura 14 estão representadas as distribuições dos genótipos
CCND1 nas diferentes variáveis clínico-patológicas analisadas no grupo de
pacientes com cancro da nasofaringe. Novamente, foi efectuada uma recodificação do estádio do tumor, com o objectivo de comparar os estádios
menos agressivos (I, II e III) e o estádio de maior agressividade (IV).
100
100
GG
GG
90
80
80
70
70
60
GG
50
40
AA/AG
AA/AG
AA/AG
30
Percentagem
Percentagem
90
60
GG
50
40
AA/AG
AA/AG
Não
Sim
AA/AG
30
20
20
10
10
0
GG
GG
0
I/II/III
IV
A
B
Figura 14 – Representação gráfica da distribuição das frequências do
polimorfismo A870G no gene CCND1 nos diferentes estádios tumorais (A) e
referente à presença/ausência de metastização ganglionar (B).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
66
RESULTADOS
No quadro X apresentam-se os resultados da análise estatística
referente às distribuições dos genótipos CCND1 nos diferentes estádios e
referentes à metastização ganglionar. Não foram encontradas diferenças
estatisticamente significativas nas frequências genotípicas dos sub-grupos
definidos tendo em conta as variáveis clínico-patológicas analisadas (para
a
variável
estádio
do
tumor,
p=0,795 e presença/ausência de
metastização ganglionar, p=0,788).
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
67
RESULTADOS
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
68
DISCUSSÃO
Nos últimos anos a investigação oncológica tem demonstrado que o
cancro é uma doença que envolve alterações dinâmicas no genoma.
Alterações no controlo de mecanismos e vias chave da regulação da
proliferação celular são eventos necessários para o estabelecimento de um
tumor.
O gene CCND1 é um proto-oncogene envolvido na regulação do
ciclo celular e alterações neste gene têm sido descritas em vários tumores.
O polimorfismo A870G no gene CCND1 tem sido analisado em alguns tipos
de neoplasias, com resultados controversos.
Os objectivos deste estudo consistiram na análise da frequência do
polimorfismo no codão 870 no gene CCND1 em indivíduos sem qualquer
patologia, em mulheres com lesões do colo uterino e indivíduos com
cancro da nasofaringe e avaliar a existência de associações entre a
frequência do polimorfismo estudado e a susceptibilidade para cancro do
colo do útero e cancro da nasofaringe.
SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DO COLO DO ÚTERO
O cancro do colo do útero permanece um problema de saúde
pública mundial, especialmente em países em vias de desenvolvimento. A
infecção por estirpes de HPV de alto risco constitui o principal factor
etiológico associado à carcinogénese do cancro do colo do uterino. No
entanto, apenas uma percentagem das mulheres infectadas desenvolve
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
71
DISCUSSÃO
esta neoplasia. Pensa-se que factores genéticos individuais, em associação
com a infecção, sejam responsáveis por uma maior susceptibilidade de
determinadas mulheres para o desenvolvimento de cancro do colo uterino
(Bosch et al. 2002).
As oncoproteínas E6 e E7 do HPV são importantes na imortalização
celular e alteram pontos de controlo do ciclo celular. A oncoproteína E7
possui a capacidade de ligação à proteína retinoblastoma (RB) tornando-a
funcionalmente inactiva. Quando as células se aproximam da fase S do
ciclo celular, a RB é fosforilada, originando a libertação dos factores de
transcrição E2F e activando a expressão dos genes necessários à
progressão através da fase S do ciclo celular. A oncoproteína E7 do HPV
ultrapassa este controlo e liga-se directamente à RB, originando a
libertação não fisiológica dos factores E2F. A acumulação de alterações
genéticas como resultado de alterações no controlo de checkpoints do
ciclo celular pode ser um mecanismo importante no processo de
imortalização celular por estirpes de HPV de alto risco (Koromilas et al.
2001; Tindle 2002; Scheffner e Whitaker 2003).
O gene CCND1 codifica a proteína ciclina D1, que é expressa em
resposta a sinais mitogénicos e promove a transição através do ponto de
controlo G1/S do ciclo celular. Southern e Herrington (Southern e
Herrington 1998) descreveram a ausência de expressão de CCND1 na
maioria das lesões de baixo grau do colo uterino infectadas por estirpes
de HPV de alto risco e sobre-expressão de CCND1 na maior parte das
lesões infectadas com estirpes de HPV de baixo risco. Estes resultados são
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
72
DISCUSSÃO
concordantes com as observações in vitro de que a sobre-expressão de
CCND1 não é necessária à progressão através da fase G1 em linhas
celulares de queratinócitos humanos que expressam as oncoproteínas E6
e E7 das estirpes de HPV de alto risco. A ligação da proteína E7 à RB faz
com que a célula não necessite de CCND1 e assegura a libertação dos
factores de transcrição E2F. Consequentemente, as células progridem para
a fase S do ciclo celular e é induzida a expressão dos genes necessários à
síntese celular e viral (Lukas et al. 1994).
A proteína E7 do HPV 16 possui homologia com os locais de ligação
à RB da CCND1, induzindo consequentemente a libertação dos factores de
transcrição E2F (Cho et al. 2002). As ciclinas D ligam-se ao domínio
hipofosforilado da RB através de sequências LXCXE, que são partilhadas
com vários vírus de DNA associados a tumores (Dowdy et al. 1993).
Um artigo publicado recentemente (Bae et al. 2001) indica que a
expressão do RNAm e da proteína CCND1 é baixa em células malignas do
colo uterino e sugere que a expressão da proteína é regulada a nível da
transcrição.
Por
outro
lado,
a
expressão
de
CCND1
tem
sido
correlacionada com os genótipos do polimorfismo A870G no gene,
sugerindo que o genótipo GG está associado a uma baixa expressão de
CCND1 em carcinomas de células escamosas (Holley et al. 2001).
Se a disponibilidade de CCND1 na célula é reduzida, é possível que
os níveis reduzidos da proteína originem uma menor interacção com a RB
de forma quantitativa. Dado que a proteína E7 do HPV possui homologia
com os locais de ligação da CCND1 à RB, isto pode facilitar a interacção da
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
73
DISCUSSÃO
oncoproteína E7 com a RB. Assim, a CCND1 pode não competir com a
oncoproteína E7 pelo mesmo local de ligação à RB, facilitando e
promovendo a ligação da proteína E7 a este regulador celular, com a
consequente libertação dos factores de transcrição E2F e induzindo a
expressão de genes necessários à síntese celular e viral.
Os nossos resultados sugerem que mulheres portadoras do
genótipo GG no gene CCND1 possuem um risco aumentado para o
desenvolvimento de lesões no colo do útero (OR=3,67 para lesões de alto
grau e OR=3,24 para carcinoma espinocelular do colo uterino).
O polimorfismo A870G no gene CCND1 pode então actuar como um
co-factor da infecção por HPV na indução e iniciação da carcinogénese do
colo uterino.
SUSCEPTIBILIDADE PARA CANCRO DA NASOFARINGE
O cancro da nasofaringe é uma neoplasia associada ao vírus
Epstein-Barr. No entanto, a etiologia do NPC é complexa e multi-factorial,
sendo que carcinogénios de origem não viral e predisposição genética
podem constituir outros factores etiológicos de importância relevante.
Vários polimorfismos genéticos relacionados com a susceptibilidade
individual para o cancro têm sido estudados relativamente à sua
associação com o risco para NPC.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
74
DISCUSSÃO
Neste estudo, o polimorfismo A870G no gene CCND1 foi analisado
de forma a avaliar a sua importância no desenvolvimento de NPC.
Os nossos resultados indicam que indivíduos portadores do
genótipo
GG
possuem
um
risco
2,17
vezes
superior
para
o
desenvolvimento de cancro da nasofaringe e uma susceptibilidade ainda
superior, com um risco acrescido de 2,32 vezes, quando considerados
apenas os casos de pacientes com carcinoma indiferenciado da
nasofaringe, associado à infecção por EBV.
Estes resultados são concordantes com os resultados publicados
recentemente por Deng e colaboradores, que demonstram que a proteína
LMP1 do EBV possui a capacidade de regular o crescimento celular pela
expressão de CCND1 através da via NF-kB no NPC e sugerem que o
polimorfismo A870G no gene CCND1 está associado ao desenvolvimento e
susceptibilidade para NPC (Deng et al. 2002).
Os nossos resultados são concordantes com os encontrados por
outros autores, sugerindo que o genótipo GG está associado ao
desenvolvimento de tumores. Matthias e colaboradores (Matthias et al.
1998; Matthias et al. 1999) demonstram que o genótipo GG de CCND1
está associado a tumores pouco diferenciados de cabeça-pescoço e
sobrevida livre de doença reduzida em carcinomas da laringe e faringe,
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
75
DISCUSSÃO
estabelecendo uma ligação entre os alelos A870G de CCND1 com a
expressão da proteína e prognóstico clínico nos carcinomas de células
escamosas da cabeça-pescoço. Um estudo realizado na população
portuguesa refere uma correlação entre o genótipo GG e susceptibilidade
aumentada para o desenvolvimento de tumores na laringe (Monteiro et al.
2004).
No entanto, o papel dos diferentes genótipos do gene CCND1 no
desenvolvimento de neoplasias não é ainda claramente conhecido, tendo
sido publicados resultados controversos (Kong et al. 2000; Zheng et al.
2001; Wang et al. 2002; Wang et al. 2003). Tem sido sugerido que o
transcripto b é originado maioritariamente através do alelo A em vários
tipos de células tumorais. O genótipo AA origina um aumento dos níveis
de transcrito b nas células tumorais, resultando num aumento da
quantidade de uma proteína que não possui sequências envolvidas no
turnover e degradação rápida, a região PEST (destruction box), e possui
um tempo de semi-vida superior (Betticher et al. 1995; Sawa et al. 1998;
Wang et al. 2002).
O mecanismo para esta associação não é ainda conhecido e
embora o alelo G origine uma menor quantidade de transcripto b do que o
alelo A, os indivíduos que possuem o genótipo GG podem possuir níveis
celulares de CCND1 diferentes dos indivíduos que possuem o genótipo AA.
Por outro lado, um estudo recente indica que o transcripto b origina uma
proteína que não é acumulada de forma alterada nas células e possui uma
estabilidade semelhante à proteína originada pelo transcripto a. Este
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
76
DISCUSSÃO
estudo demonstra ainda que o transcripto a constitui um catalisador mais
eficiente da fosforilação/inactivação da RB (Solomon et al. 2003).
Estes
resultados
sugerem
que
o
efeito
do
genótipo
no
comportamento do tumor pode exibir algum grau de especificidade
tecidular. É possível que estes resultados controversos reproduzam os
diferentes mecanismos através dos quais a expressão alterada da ciclina
D1 ocorre no cancro.
Por outro lado, a contribuição de polimorfismos genéticos no risco
para cancro pode ser dependente da população estudada, assim como de
factores ambientais e outros factores que influenciam essa mesma
população.
Têm
sido
descritas
diferenças
étnicas
e
geográficas
relativamente à frequência genotípica de diversos polimorfismos. Os
nossos resultados obtidos na população portuguesa são concordantes com
um estudo recentemente publicado e realizado na nossa população
(Monteiro et al. 2004).
Estes resultados podem ajudar na compreensão do papel da ciclina
D1 no desenvolvimento de cancro do colo uterino e da nasofaringe.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
77
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS
A ciclina D1 é um regulador positivo importante do ponto de
controlo G1/S do ciclo celular que tem sido correlacionado com vários
tipos de tumores humanos. O gene CCND1 é um dos genes mais
frequentemente alterados em neoplasias humanas, dado que a expressão
alterada da proteína pode originar a proliferação celular desregulada.
Vários estudos recentemente publicados indicam que o gene CCND1 pode
constituir um marcador molecular muito útil na determinação do
prognóstico clínico de alguns tumores. O polimorfismo A/G no codão 870
do gene CCND1 tem sido relacionado com o prognóstico clínico e risco
alterados para diversas neoplasias.
Este estudo demonstra que o genótipo GG do polimorfismo A870G
no gene CCND1 parece ter um papel preponderante na susceptibilidade
para cancro do colo do útero e da nasofaringe, conferindo um risco
acrescido no desenvolvimento destes tumores.
A análise de variações genéticas inter-individuais, como os
polimorfismos, pode contribuir para uma melhor caracterização da
susceptibilidade para cancro. A definição de sub-grupos de indivíduos mais
susceptíveis para determinadas neoplasias, de acordo com o seu genoma,
pode ser determinante na elaboração de estratégias de prevenção para
estas doenças.
Estudos realizados em culturas de tecidos demonstram que a
CCND1 possui a capacidade de potenciar a transformação oncogénica de
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
81
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS
outros oncogenes, nomeadamente RAS, Src e E1A. O papel da CCND1
parece ser dependente e específico para o tipo de tecido e oncogene.
Estudos posteriores poderão incluir a análise combinada com outros
polimorfismos que foram já associados a susceptibilidade para cancro e
publicados pelo nosso grupo, incluindo CYP2E1, GST, ecNOS, ARStuI,
VDR, TP53, CCR2 (Medeiros et al. 2002; Ferreira et al. 2003; Medeiros et
al. 2003a; Medeiros et al. 2003b; Medeiros et al. 2004; Coelho et al. 2005;
Santos et al. 2005).
Pretendemos também aumentar a amostragem do estudo, com o
objectivo de alargar os resultados a amostras de grande número e
analisar o papel do polimorfismo na susceptibilidade para outros cancros,
nomeadamente outras neoplasias associadas a vírus.
Estudos recentes sugerem que a CCND1 pode constituir um
potencial alvo terapêutico em alguns carcinomas (Sauter et al. 1999;
Sauter et al. 2002; Fu et al. 2004) e parece alterar a sensibilidade das
células tumorais à radiação ionizante (Coco Martin et al. 1999; Finkielstein
et al. 2002; Jayasurya et al. 2004). É também nosso objectivo alargar este
estudo numa perspectiva farmacogenómica, com o intuito de avaliar o
papel deste polimorfismo na resposta à terapia.
Acreditamos que a continuação deste estudo é então fundamental,
de forma a uma melhor compreensão do papel e influência da ciclina D1
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
82
CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS
no cancro, dos mecanismos biológicos do cancro do colo do útero e da
nasofaringe e na definição de um perfil genético para estas neoplasias.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
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POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
103
ANEXOS
ANEXO I – SOLUÇÕES
PBS
Na2HPO4 1,48g/l (Merck 1065860500)
NaH2PO4 0,495 g/l (Merck 63460500)
NaCl 7,2 g/l (Panreac cod131659)
AKE
NH4Cl 82,9 g/l (Merck 101146)
KHCO2 10 g/l (Merck 48540500)
EDTA 0,37 g/l (Merck 108418)
SE
NaCl 75 mM (Panreac cod131659)
EDTA 25 mM (Merck 108418)
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
ANEXOS
ANEXO II
Provas do artigo intitulado “Increased risk of cervical cancer
associated with cyclin D1 gene A870G polymorphism”, aceite para
publicação na revista Cancer Genetics and Cytogenetics.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
Increased risk of cervical cancer associated with cyclin D1 gene
A870G polymorphism
Raquel Catarinoa, Ana Matosa,b, Daniela Pintoa, Deolinda Pereirac, Rogéria
Craveirod, André Vasconcelosa, Carlos Lopesa, Rui Medeirosa*.
a
Molecular Oncology Unit of Portuguese Institute of Oncology - Porto, Portugal
b
Gynaecology Department of Júlio Dinis Maternity
c
Medical Oncology Department of Portuguese Institute of Oncology - Porto,
Portugal
d
Radiobiology Department of Portuguese Institute of Oncology - Porto, Portugal
*Correspondence should be addressed to:
Rui Medeiros, PhD
Instituto Português de Oncologia, Porto,
Laboratórios - Piso 4, Unit of Molecular Oncology,
R. Dr. Ant. Bernardino Almeida,
4200-072 Porto,
Portugal.
Tel: 351 - 22 5084000 (Ext 5414)
Email: [email protected]
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
ABSTRACT
Human papillomavirus (HPV) play the major role in the etiology of cervical
cancer. However, a complex correlation between viral and cellular genes is
necessary for cell cycle control deregulation in the progression to invasive
cervical cancer (ICC).
Cyclin D1 (CCND1) is an important positive regulator of the G1/S phase of the
cell cycle. The CCND1 gene is located at chromosome 11q13 and is often altered
in human cancers.
We analysed the A870G CCND1 polymorphism by PCR-RFLP in 246 women
including, 50 cases with high-grade squamous intraepithelial lesions of the cervix
(HSIL), 93 with ICC and 103 healthy women. The GG genotype was associated
with a 4.32 fold higher risk for the development of HSIL (aOR=4.32, 95% CI
1.50-12.46, P=0.0067), and a 3.26 fold increased risk for the development of ICC
(aOR=3.26, 95% CI 1.42-7.53, P=0.006).
The proportion of cervical cancer cases attributable to the GG CCND1 genotype
was 17.26%.
This is the first study reporting that A870G CCND1 polymorphism could act as a
cofactor of HPV in the initiation of cervical carcinogenesis, particularly in the
transformation zone of HPV infected women, supporting evidence for a genetic
factor on ICC risk.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
INTRODUCTION
Invasive cervical cancer (ICC) is the most common gynaecologic malignancy
worldwide and one of the most common causes of death in women. In Portugal,
cervical cancer has an age-standardised incidence rate of 17.0 per 100.000 women
and is responsible for 4.2% of malignant deaths [1].
The primary cause in the development of ICC is infection with human
papillomavirus (HPV). More than 90% of squamous cervical cancers contain
HPV DNA [2]. HPV 16 and 18 have two transcriptional units, E6 and E7, which
encode proteins important for cell immortalization [3]. Integration of HPV DNA
into the host genome results in the constitutive expression of the viral
oncoproteins E6 and E7, which deregulate cell cycle control through interaction
with oncogenes and tumor-suppressor gene products, initiating the crucial step for
tumorigenesis [4,5]. The E7 oncoprotein binds to retinoblastoma protein (RB),
and the related pocket proteins p107 and p130, leading to functional inactivation
of these proliferation regulators, which ultimately allows unchecked cell-cycle
progression in cells infected with HPV 16 or 18 [4,6,7].
Epidemiological and clinical data suggest that human papillomavirus, especially
HPV-16 and HPV-18 (high-risk HPV), play the major role in the etiology of
cervical cancer [8]. However, some researchers acknowledge that HPV is a
necessary but not a sufficient factor in the etiology of ICC. The progression from
HPV infection to cancer involves other environmental and host factors. Singlenucleotide polymorphism (SNP) markers should be considered in the
determination of the combinations of genetic factors involved in precancerous
changes to cervical cancer [9]. It is unclear whether the association of these
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
environmental and genetic factors with cervical cancer reflects secondary
associations also attributable to infection, or if they are independent risk factors,
or even if they act as cofactors of HPV infection in induction of cervical
carcinogenesis [10].
A frequent target in transitional cell carcinogenesis is the deregulation of G1/S
phase progression in the cell cycle which is regulated by cyclins, cyclin-dependent
kinases and their inhibitors [11].
Cyclin D1 (CCND1) is a key regulator of cell cycle progression, an important
positive regulator of the G1/S phase and a demonstrated oncogene [12,13,14].
CCND1 is located at chromosome 11q13 and alterations in this gene have been
described in several cancers [15,16-20,21]. CCND1 regulates cell cycle
progression by activating cyclin-dependent kinases 4 and 6 (CDK4 and CDK6),
which in turn phosphorylate RB. This reaction inactivates RB and is postulated to
lead to progression through a G1-S checkpoint, committing the cell to DNA
replication [22,23].
Recently, it has been reported that CCND1 mRNA is alternatively spliced to
produce two transcripts (a and b), which are present simultaneously in a variety of
normal tissues and cancer cells [24,25]. Betticher and colleagues [25] identified a
single base pair polymorphism (A870G) in CCND1, and CCND1 genotypes have
been significantly associated with carcinogenesis and clinical outcome in a variety
of cancers [26-32]. Alterations in this gene, such as gene amplifications and
overexpression have been observed in cervical cancer patients [33-36].
The genetic association between CCND1 A870G polymorphism and genetic
susceptibility to cervical cancer has not yet been investigated. The aim of our
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
study was to determine if the CCND1 genotypes were associated with genetic
susceptibility to cervical cancer.
PATIENTS AND METHODS
PATIENTS
We tested the association between the CCND1 A870G polymorphism and risk of
cervical cancer using a case-control study. 143 patients were selected for this
study; 50 patients with histologically confirmed high-grade intraepithelial
squamous lesions of the cervix (HSIL) and 93 with also histologically confirmed
invasive cervical carcinoma (ICC). Patients were admitted to the Portuguese
Oncology Institute-Porto, Portugal, during the period from 1997 to 2003. The
median age at diagnosis was 46 years (standard deviation 12.5). The control group
consisted of 103 healthy women, with a median age of 55 (standard deviation
16.3), without clinical history of cancer, from the same geographic area as the
case group. All samples were taken after informed consent according to the
declaration of Helsinki.
POLYMERASE
CHAIN REACTION/RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM
(PCR-RFLP) ANALYSIS
DNA was extracted from peripheral blood leukocytes from each study subject
using a salting out protocol [37]. The detection of the A870G polymorphism of
CCND1 was carried out essentially as previously described [25]. The PCR
reactions consisted of nearly 0.2 µg of genomic DNA, 30 ρmol of each primer, 0.2
mM of each dNTP, 1.5 mM MgCl2, 1 × Taq Buffer, and 1 U of Taq DNA
polymerase to a final volume of 50 µl. Primers used in the analysis were CY26
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
(5´GTG AAG TTC ATT TCC AAT CCG C 3´) and CY27 (5´ GGG ACA TCA
CCC TCA CCC TCA CTT AC 3´). Thirty five cycles were performed, consisting
of an initial heating at 95ºC for 10 min to activate the enzyme, followed by 35
cycles of denaturation at 94ºC for 1 min, annealing at 55ºC for 1 min and
extension at 72ºC for 1 min, with a final extension step at 72ºC for 2 min.
PCR products (15 µl) were digested with 1 U ScrF1 at 37ºC for 4 hr, and
visualized by electrophoresis on 3% agarose containing 0.5 µg/ml ethidium
bromide. The 167 bp PCR product generated is not cut by ScrF1 if the A allele is
Figure 1
present, whereas the product from the G allele is cut to produce fragments of 145
and 22 bp (Fig.1).
STATISTICAL ANALYSIS
Analysis of data was performed using the computer software SPSS for Windows
(Version 12.0) and Epi Info (version 6.04). Chi-square analysis was used to
compare categorical variables and a 5% level of significance was used in the
analysis. The odds ratio (OR) and its 95% confidence interval (CI) were
calculated as a measurement of the association between CCND1 genotypes and
cervical cancer risk. The Hardy-Weinberg equilibrium was tested by a Pearson
goodness of fit test to compare the observed versus the expected genotype
frequencies. Logistic regression analysis was used to calculate the adjusted OR
(aOR) and 95% CI for the influence of CCND1 genotypes in the risk of cervical
cancer, with adjustment for age.
We calculated the attributable proportion (AP) using the following formula: AP =
PRF × (1-1/OR), where AP is the fraction of disease attributable to the risk factor
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
and PRF is the percentage of the risk factor in case subjects and OR is the odds
ratio.
RESULTS
The distribution of CCND1 genotypes among cases and controls and the risk of
cervical cancer due to the influence of CCND1 polymorphism are shown in Table
Table1
1.
The frequency of the G allele was higher in cases (46.9%) than in controls
(35.4%), and this difference was statistically significant (P=0.011). The
frequencies of AA, AG and GG genotypes were 37.9, 53.4 and 8.7%, respectively
in normal controls, and 30.8, 44.7 and 24.5%, respectively in the case group. The
genotype distribution of both groups was in the Hardy-Weinberg equilibrium
(P=0.672 in the case group and 0.461 in the control group). The analysis of the
frequencies of CCND1 genotypes indicates that women carrying two G-alleles
have a 3-fold increase in the risk for cervical lesions (aOR=3.48, 95% CI 1.577.70, P=0.0021). The stratification of the analysis according to the patients
median age (women older than 46 versus younger than 46 years) lead to the
observation that, for the group of women older than 46 years carrying two G
alleles, there is a statistically significant threefold increase of cervical cancer risk
(OR=3.20, 95% IC 1.25-8.16, P=0.017).
No significant differences were found in the frequencies of CCND1 genotypes
between different stages of ICC (histological differentiation), as shown in Table 2.
However, women carrying the GG genotype have 4.32 fold higher risk for the
development of HSIL (aOR=4.32, 95% CI 1.50-12.46, P=0.0067), and a 3.26 fold
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
Table 2
increased risk for the development of ICC (aOR=3.26, 95% CI 1.42-7.53,
P=0.006).
For the ICC patients, the proportion of cervical cancer cases attributable to the GG
CCND1 genotype was 17.26%.
DISCUSSION
Cervical cancer remains a major worldwide health problem, especially in
developing countries. During the past decades, the expansion of molecular
biology has been of great importance in understanding the basis of cancer
development and progression. The mechanism of cervical cancer carcinogenesis
is not well understood. Our study is the first report suggesting a role for CCND1
polymorphism in cervical cancer.
It is now known that specific types of human papillomavirus (HPV) are the
principal etiologic agents for both cervical cancer and its precursors. However, the
discrepancy between high rates of HPV infection and low rates of cervical cancer
development among women suggests that additional genetic events are necessary
for progression to a malignant phenotype, namely alterations in oncogenes and
tumor suppressor genes [8].
HPVs encode two proteins, E6 and E7, which are important for cell
immortalization. HPV 16 E6 and E7 disrupt cell cycle checkpoints, particularly
affecting nearly all cyclin-dependent kinase inhibitors linked to the G1 and G2
checkpoints, in each case through a different mechanism [3]. E7 binds to RB
originating its functional inactivation [4,6]. In quiescent cells, RB is complexed to
the transcription factor E2F. Approaching S phase of the cell cycle, RB becomes
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
hyperphosphorylated, causing release of E2F, which then activates expression of
growth-associated genes. E7 bypasses this RB-dependent control by binding to
RB and causing the non-physiological release of active E2F [38,39].
HPV infection may constitute the initial cause of subsequent genetic alterations
leading to the development of cervical tumors, whether the mechanism is due to
direct integration of HPV DNA or subsequent interaction with other cellular
proteins or both [40]. The accumulation of genetic abnormalities as a result of
alterations in cell cycle checkpoint control is likely to be an important mechanism
in the process of cellular immortalization by high-risk HPVs [41].
CCND1 encodes cyclin D1 protein, which is expressed in response to mitogenic
signals promoting transition through the restriction point in the G1 phase of the
cell cycle [23].
Shirley and colleagues [42] reported the absence of CCND1 expression in the
majority of naturally occurring low-grade cervical lesions infected with high-risk
HPVs, in contrast with the overexpression of CCND1 in most lesions containing
low-risk HPVs. These findings are compatible with the in vitro observation that
CCND1 overexpression is not required for G1 phase progression in human
keratinocyte cell lines expressing the E6 and E7 proteins of high-risk HPVs [43].
The binding of the E7 protein of high-risk HPVs to the RB protein obviates the
requirement of the cell for CCND1 and ensures the unrestricted release of E2F
transcriptional factors. This in turn leads to S phase entry, thereby inducing the
expression of genes required for cellular and viral synthesis [43].
HPV 16 E7 shows homology with the RB binding sites of CCND1, consequently
inducing the release of E2F transcriptional factors [44]. D-type cyclins bind to the
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
pocket domain of hypophosphorylated RB through their LXCXE sequences,
which are shared with several DNA tumour viruses [45].
Several genetic polymorphisms contributing to individual’s susceptibility to
cancer have been studied regarding their association with cervical cancer risk
[46,47]. In this study we analysed a single-nucleotide polymorphism in CCND1,
in order to evaluate its importance in the development of cervical cancer. The
A870G polymorphism at codon 242 within the conserved splice donor site of
exon 4 of the gene appears to modulate the splicing of CCND1 mRNA,
originating two transcripts (a and b), which are present in a variety of tissues
[25,48,49]. The transcript a is identical to the reported CCND1 cDNA [12].
However, transcript b fails to splice at the exon 4/intron4 boundary, does not
contain exon 5, and terminates downstream of exon 4. The main difference in the
cyclin D1 proteins encoded by the two transcripts (a and b) is in the C-terminal
PEST-rich region (destruction box) encoded by exon 5 which is responsible for
rapid intracellular degradation and turnover of the G1 cyclins [25,48,50].
It has been suggested that the variant A allele is a major source of variant
transcript b in several types of cancer cells [25,29,49]. The AA genotype increases
the products of transcript b in tumor tissue cells, resulting in an increase of an
altered protein that lacks the PEST-region with increased half-life [25,29].
Duk-Soo Bae and colleagues [33] reported that CCND1 mRNA and protein
expression is decreased in cervical cancer, suggesting that CCND1 expression is
regulated at the level of transcription. Moreover, CCND1 expression has been
correlated with the CCND1 genotypes, suggesting that the GG genotype is
associated with low expression of CCND1 in squamous cell carcinoma [51]. We
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
hypothesize that if the availability of CCND1 in the cell is reduced, there is less
CCND1 to interact with the RB in a quantitative manner. Since high-risk HPV E7
protein shows homology with the RB binding sites of CCND1, the reduced levels
of this cyclin in the cell may facilitate the interaction of the HPV E7 protein with
the RB. Therefore, CCND1 may not compete with HPV protein E7 for the same
binding site in RB, endorsing the binding of E7 to this cell cycle regulator, with
consequent release of the transcriptional factors E2F and inducing the expression
of genes required for cellular and viral synthesis.
Our results suggest that women carrying the CCND1 GG genotype have increased
risk for the development of cervical lesions (aOR=4,32 for HSIL and aOR=3.26
for ICC) and are consistent with previous findings suggesting that CCND1 GG
genotype is associated with cancer development. Matthias and colleagues [27, 52]
reported that CCND1 GG genotype was associated with poorly differentiated
tumors of head and neck and reduced disease-free interval in laryngeal and
pharyngeal carcinomas, independently from tumor differentiation, providing a
link between CCND1 A870G alleles with CCND1 expression and clinical
outcome in SCCHN (Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck). A recent
report [51] found a significant trend between a reduction in the proportion of
CCND1-expressing cells within the tumors of patients with CCND1 GG. Another
recent published study reported a correlation between GG genotype and increased
susceptibility for laryngeal tumor development [53]. However, controversial
results have been reported regarding the role of CCND1 genotypes in cancer
development [26,28,29,30,32]. The mechanism for this association is unknown,
although because the G allele splices less of transcript b than the A allele,
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
individuals with CCND1 GG may have different cellular levels of CCND1 to
subjects with CCND1 AA.
Furthermore, these results suggest that the effect of genotype on tumor behaviour
may exhibit some degree of tissue specificity [27]. It is possible that these
conflicting results in part reflect the many different mechanisms through which
deregulated expression of CCND1 can occur in cancer.
The contribution of genetic polymorphisms to the risk for cervical cancer may be
dependent on the studied population, as well as on several environmental and
other factors that influence that population. Geographical or ethnic differences
have been reported regarding the genotype frequency of several polymorphisms.
Our results within the Portuguese population are consistent with a recently
published study in our population [53].
To the best of our knowledge, this is the first study that demonstrates an
association between A870G CCND1 polymorphism and risk for cervical cancer.
Our results suggest that A870G CCND1 polymorphism could act as a cofactor of
HPV in induction and initiation of cervical carcinogenesis, particularly in the
transformation zone of HPV infected women, supporting evidence for a genetic
factor on ICC risk.
Further studies may include the analysis of other genetic polymorphisms
(CYP2E1, GST, ecNOS, ARStuI, VDR) that have been already associated with
cancer risk [54-58] in order to characterize the genetic profile of cervical cancer
susceptibility. Moreover, in order to assess the gene-viral interaction, additional
studies should include an ideal control group of HPV positive women without
cervical cancer to a more accurate adjustment for this association.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
The determination of a genetic profile may help to explain the observation that not
all high-risk HPV-infected SIL lesions will progress to invasive carcinomas.
Larger scale molecular studies are needed to confirm the role of A870G
polymorphism of CCND1 in cervical cancer. These results can lead to a better
understanding of cyclin D1 influence in cancer, the biological mechanisms of
cervical cancer and in the definition of a genetic profile for this disease.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank the Liga Portuguesa Contra o Cancro (Portuguese League
against Cancer) – Centro Regional do Norte for their support.
We gratefully acknowledge funding of this work by the Ministry of Health of
Portugal (CFICS – 206/2001).
The current affiliation of Ana Matos is Júlio Dinis Maternity.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
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POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
Table 1
Prevalence and odds ratios (OR) of CCND1 genotypes and alleles among control
group and patients with cervical lesions (HSIL and ICC)
Patients
(n=143)
n
%
*
Controls
(n=103)
n
%
OR
95% CI
P
Alleles*
A
G
152
134
53.1
46.9
133
73
64.6
35.4
1.00
1.61
reference
1.09-2.36
0.011
Genotype
AA
AG
GG
44
64
35
30.8
44.7
24.5
39
55
9
37.9
53.4
8.7
1.00
1.03
3.45
reference
0.59-1.81
1.47-7.56
1.000
0.004
Recessive
model
AA/AG
GG
108
35
75.5
24.5
94
9
91.3
8.7
1.00
3.48**
reference
1.57-7.70**
0.0021**
Age
<46 years
AA/AG
GG
52
16
76.5
23.5
28
2
93.3
6.7
1.00
4.31
reference
0.92-20.10
0.052
≥46 years
AA/AG
GG
56
19
74.7
25.3
66
7
90.4
9.6
1.00
3.20
reference
1.25-8.16
0.017
Total allele number in the case group=286 and control group=206.
P, OR and 95% CI using logistic regression analysis adjusting for age.
**
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
Table 2
Distribution of CCND1 genotypes among case and control groups and histological
stage of ICC
CCND1 genotype
N (frequency)
OR
95% CI
P
AA/AG
GG
Controls (n=103)
94 (91.3)
9 (8.7)
1.00
reference
HSIL (n=50)
37 (74.0)
13 (26.0)
4.32*
1.50-12.46*
0.0067*
ICC (n=93)
71 (76.3)
22 (23.7)
3.26*
1.42-7.53*
0.006*
<IIb
3 (16.7)
15 (83.3)
1.00
reference
≥IIb
7 (26.9)
19 (73.1)
0.543
0.12-2.46
Cases
FIGO staging
*
0.49
P, OR and 95% CI using logistic regression analysis adjusting for age.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS
Figure 1. Analysis of the CCND1 genotypes – Restriction Fragment Length
Polymorphism of the PCR products. M – 100 bp ladder; cases 1, 3 and 7 –
CCND1 heterozygous (G/A); cases 2, 4 and 5 – homozygous GG; case 6 and 8 –
homozygous AA.
POLIMORFISMO NO GENE DA CICLINA D1 EM NEOPLASIAS ASSOCIADAS A VÍRUS