4. Actividade e Estabilidade de Enzimas
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DEQB 4. Actividade e Estabilidade de Enzimas Lição de Biocatálise ESTRUTURA DE ENZIMAS DEQB ENZIMA – Entidade de natureza proteica e de origem biológica que levam a cabo in vivo as inúmeras transformações químicas e bioquímicas necessárias à vida dos seres vivos. Os enzimas, tal como as proteínas, são polímeros complexos constituídos por sequências de aminoácidos, as unidades estruturais básicas, ligadas entre si por uma ligação peptídica. O Cα C Cα O- N Cα C H Cα N+ H O homem procura utilizar os ENZIMAS para levarem a cabo in vitro inúmeras transformações químicas e bioquímicas do qual resultam produtos de alto valor acrescentado. Lição de Biocatálise ESTRUTURA DE ENZIMAS DEQB Os aminoácidos constituintes das proteínas são constituídos por 4 grupos diferentes ligados a um carbono central (Cα): H H3N+ C α COO - R - um grupo amino (NH3+); - um grupo carboxílico (COO-); - um átomo de hidrogénio (H); - um grupo variável (R); - um átomo de carbono (carbono-α, Cα), a que se ligam os quatro grupos anteriores. Lição de Biocatálise As propriedades físico-químicas dos aminoácidos estão associadas ao grupo R variável do amínoácido H DEQB H3N+ C COO - R - Têm propriedades ácidas e básicas semelhantes, à excepção da prolina. - As cadeias laterais têm uma enorme variedade de propriedades funcionais (carga eléctrica, polaridade, hidrofobicidade, reactividade química) e estruturais, conferindo aos aminoácidos a respectiva individualidade. - O grupo α-amino de um aminoácido pode reagir com o grupo β-carboxilo de outro, com formação de cadeias polipeptídicas. - Podem sintetizar-se quimicamente polipéptidos com uma sequência pre-determinada. - A sequência de aminoácidos numa cadeia pode ser determinada por hidrólise da cadeia em fragmentos (péptidos) e análise sequencial da composição dos péptidos a partir de um dos extremos da cadeia. Lição de Biocatálise DEQB Tabela – Classificação, nomenclatura e constante de dissociação das cadeias laterais R dos aminoácidos Classificação Abreviatura Abreviatura de 3 letras de 1 letra Alanina Ala A Valina Val V Leucina Leu L Grupo I Isoleucina Ile I Aminoácidos Metionina Met M Apolares Prolina Pro P Fenilalanina Phe F Triptofano Trp W Glicina Gly G Serina Ser S Grupo II Treonina Tre T Aminoácidos Cisteína Cis C Polares Tirosina Tyr Y Asparagina Asn N Glutamina Gln Q Lisina Lys K Grupo III Arginina Arg R Aminoácidos Histidina His H Com Grupos R Ácido Aspártico Asp D Carregados Ácido Glutâmico Glu E Lição de Biocatálise Nome pKR da cadeia lateral ------------------------~ 13 ~ 13 8.33 10.13 10.79 12.48 6.04 3.90 4.07 Estrutura química da cadeia lateral (R) de aminoácidos Ácido aspártico Glicina O C H2 DEQB H + H3N C COO - R CH 3 CH CH 3 Alanina Leucina O grupo R variável CH Hidrolixados CH C H2 CH 3 pKa ~ 13.0 C H2 C H2 CH 3 CH 3 OH pKa ~ 13.0 CH 3 CH Lição de Biocatálise C NH 2 Ácido glutâmico C H2 O C H2 OH pKa ~ 4.1 C O - O C H2 C NH 2 Lisina C H2 C H2 C H2 C H2 Arginina C H2 pKa ~ 3.9 O C H2 CH 3 Isoleucina Treonina O- Glutamina C H2 Serina C Asparagina CH 3 Básicos Aminoácidos Alifáticos Valina Dicarboxilicos H pKa ~ 10.8 NH 3+ N+H2 C H2 C H2 N H C NH 2 pKa ~ 12.5 Histidina C H2 C H C N NH C H pKa ~ 6.0 Heterocíclicos Histidina C H C H C N NH 2 DEQB H H3N C Prolina COO - NH 2 H C H2C CH 2 + R O C C H2 O- N H Fenilalanina Cisteina pKa ~ 8.3 Sulfurados C HC C H2 O grupo R variável Triptofano Aromáticos + C H C H2 SH C H2 Metionina Tirosina pKa ~ 10.1 Lição de Biocatálise C H2 C H2 S CH 3 C H2 OH Efeito do pH na Reacção Enzimática v DEQB pH óptimo pH Tabela 2-1 - Exemplos de aminoácidos envolvidos no centro activo de enzimas e respectivos valores de pKa. Enzima Lisozima Acetoacetato descarboxilase Quimotripsina Papaína Lição de Biocatálise Resíduo Glu-35 Lys α-NH3 (Ile-16) His-159 pKa 6,5 5,9 10,0 3,4 As modificações químicas mais comuns de alguns resíduos dos aminoácidos durante ou após a sua biossíntese são: DEQB - Acetilação do grupo N-terminal. - Carboxilação (Asp e Glu). - Fosforilação (Ser, Thr, Tyr e His). - Formação de pontes dissulfureto (Cys). - Glicosilação (Asn: pontes N-glicosídicas; Ser e Thr: ligações O-glicosídicas). - Metilação (Lys e Glu). - Ligação covalente: . De grupos prostéticos (grupos de natureza não proteica que se ligam covalentemente (irreversível) ou não-covalentemente (reversível) à proteína na sua forma tridimensional, (p.ex. grupos hemo do citocromo). . Substituição/modificação de grupos funcionais das cadeias laterais (p.ex. –NH2), alterando assim as propriedades de carga, polaridade ou hidrofobia desse aminoácido. A modificação química específica de alguns resíduos (p.ex. lisinas) é um dos métodos possíveis para melhorar a actividade e estabilidade enzimáticas. Lição de Biocatálise Estrutura Primária e Secundária de proteínas A) DEQB B) C H N O N C H N H C O HC-R Folha β Paralela H N HC-R O H N C 14 Å N -H O =C N C O H O H N C HC-R O H N HC-R C R-CH Folha β Antiparalela Figura 2-1 – A) Representação esquemática dos dois tipos de estrutura secundária mais frequentemente encontrados em proteínas e enzimas: hélice a e folha β. B) A folha β paralela e antiparalela, com indicação do avanço por cada dois aminoácidos. Lição de Biocatálise O R-CH R-CH R-CH H N Folha β H N HC-R O =C O =C R-CH Hélice α H N C O HC-R HC-R 13 Å C HC-R R-CH R-CH R-CH O Estrutura Terciária de proteínas DEQB H 188 S 120 Ligações covalentes -S–S- D 175 Interacções electrostáticas Pontes de Hidrogénio Interacções hidrófobas Figura 2-1– Representação esquemática da estrutura terciária da cutinase de Fusarium solani pisi, com indicação de alguns resíduos que limitam o centro activo, e, em particular, da tríade catalítica (Ser120-His188-Asp175). Lição de Biocatálise Estrutura Quaternária de proteínas DEQB Pode-se observar em enzimas multiméricos, i.e., enzimas compostos por duas ou mais cadeias polipeptídicas associadas entre si, por exemplo, penicillin V acylase de B. sphaericus. Domínio α Domínio β Lição de Biocatálise Horseradish peroxidase - HRP DEQB Monomeric enzyme Prosthetic group - heme 2 calcium ions Glycoprotein – 8 specific sites Molecular weight - 44 kDa Isoelectric point - 7.5 Catalyses the oxidation of several compounds by the H2O2, e.g. phenols, aromatic amines such as phenolsulfonic acid (PSA) and 4-aminoantipyrine (4-AAP) FUNÇÃO DOS ENZIMAS DEQB Os enzimas (catalisadores biológicos ou biocatalisadores) catalisam reacções bioquímicas, aumentando a sua velocidade, por exemplo: 2H O —> 2H O + O 2 2 2 2 ______________________________________________________________________ CATALISADOR Ea (kJ/mol) Velocidade reacção (Relativa) SEM CATALISADOR 75,4 1,0 PLATINA (INORGÂNICO) 50,2 2x104 CATALASE (ENZIMA) 8,4 3x1011 ______________________________________________________________________ Em termos de propriedades gerais, comuns aos catalisadores químicos, os biocatalisadores caracterizam-se por: i) baixarem a energia de activação para que a reacção que catalisam ocorra; ii) não serem destruídos pelo efeito da reacção; iii) não alterarem o equilíbrio químico das reacções em que participam. Lição de Biocatálise FUNÇÃO DOS ENZIMAS DEQB Por outro lado, os biocatalisadores em relação aos catalisadores químicos são: - Muitíssimo específicos: - tipo de reacção que catalisam, - tipo(s) substrato(s) que reconhecem, - ligação química em que actuam, - bem como à estereo-especificidade dos átomos ou grupo de átomos no substrato. - especificidade absoluta em relação a único substrato Lição de Biocatálise Elevada especificidade em relação ao tipo de reacção que catalisam, DEQB Lição de Biocatálise Elevada especificidade em relação ao tipo de substrato que catalisam, DEQB Sacarose Maltose Lactose Lição de Biocatálise Elevada especificidade em relação ao tipo de substrato que catalisam, DEQB Lactose Maltose Sacarose Trehalose Lição de Biocatálise Elevada especificidade em relação ao tipo de ligação química em que actuam, DEQB Lição de Biocatálise Elevada especificidade em relação ao tipo da estereoespecificidade do substrato em que actuam, DEQB Lição de Biocatálise Elevada especificidade em relação ao comportamento dos compostos do tipo Cx1x2yz nas reacções enzimáticas DEQB Estes compostos Cx1x2yz são do ponto de vista da química orgânica substâncias simétricas em solução (pois possuem um plano de simetria) mas comportam-se assimétricas enquanto substratos de certas reacções enzimáticas (quer dizer que x1 pode ser preferencialmente atacado em relação ao x2 apesar de serem grupos funcionais iguais) Lição de Biocatálise FUNÇÃO DOS ENZIMAS DEQB Por outro lado, os biocatalisadores em relação aos catalisadores químicos são: - A actividade catalítica regulável, - Mas devido à sua natureza proteica são lábeis e inactivados por efeito da temperatura, pH, ou na presença de alguns compostos (designados por agentes desnaturantes). Lição de Biocatálise Características do centro activo DEQB O centro activo corresponde geralmente a uma fenda ou cavidade existente na estrutura da molécula proteica onde se localiza o centro catalítico (centro activo) e locais de reconhecimento do substrato (centro de ligação do substrato) e caracteriza-se por: - Ocupa uma parte relativamente pequena do volume total de um enzima; - É uma entidade tridimensional formada por grupos que pertencem a partes distintas da sequência linear de aminoácidos; - Os substratos ligam-se às enzimas através de atracções fracas múltiplas (electrostáticas, de van der Waals, hidrófobas, ligações de hidrogénio); - A especificidade da ligação do substrato depende do arranjo dos átomos no centro activo (modelo da chave e fechadura - E. Fischer, 1890; modelo do ajuste induzido - D. Koshland, 1958). Lição de Biocatálise Características do centro activo DEQB a) + substrato enzima complexo enzima - substrato enzima complexo enzima - substrato b) + substrato Figura 2-1– a) Modelo chave-fechadura; b) Modelo do ajuste induzido Lição de Biocatálise Características do centro activo DEQB Muitas vezes os enzimas exigem pequenas moléculas ou iões (ex: Zn, Fe, Cu, Ca…) para exercerem uma actividade catalítica; a essas espécies chama-se co-factores. Ao enzima sem cofactor chama-se apoenzima, e ao enzima activo intacto (enzima + cofactor) chama-se holoenzima. - Quando os co-factores são moléculas orgânicas (ex: vitaminas B) ou de natureza nucleotídica (ex: nicotinamida-adenina-dinucleótido - NAD e NAD fosfato - NADP) denominam-se co-enzimas. NAD Lição de Biocatálise NADP Características do centro activo DEQB - Quando são necessários co-factores os enzimas têm que conter centros de ligação adicionais. - A catálise enzimática pode portanto fazer intervir, não só um número limitado de grupos funcionais que se encontram em cadeias laterais de resíduos de aminoácidos (His, Ser, Tyr, Cys, Lys, Glu, Asp), mas também N N co-enzimas e catiões metálicos. III Fe N N N HOOH A + H2O N H 2O HRP AH O N O IV Fe N N N N Compound II IV Fe H+ N A N Lição de Biocatálise N AH N + N N N Compound I PSA + 4-AAP + 2H2O2 → Quinoneimine + H2O + NaHSO4 λ = 490 nm Classificação de Enzimas NOMENCLATURA: DEQB - Nomes empíricos (ex: tripsina, pepsina, quimotripsina). - 1ª designação normalizada: nome do substrato + sufixo ase (ex: urease, amilase). - 2ª designação normalizada: nome do substrato + tipo de reacção que catalisam (ex: malato desidrogenase). - Enzyme Comission EC: nome de acordo com tipo de reacção + substrato + o tipo de aceitador do hidrogénio (ex: malato-NAD-óxido-redutase). 1º dígito Classe da enzima Tipo de reacção catalisada 1 Oxido-redutases Reacções de oxidação-redução 2 Transferases Transferência de 1 átomo ou grupo entre moléculas 3 Hidrolases Reacções de hidrólise 4 Liases Remoção de um grupo de uma molécula (sem ser por hidrólise) 5 Isomerases Reacções de isomerização 6 Ligases ou sintetases Reacções de síntese acoplada à hidrólise de 1 molécula de ATP Lição de Biocatálise • Nomenclatura e Classificação de Enzimas Assim, cada enzima recebeu, DEQB NOME CURTO (NOME RECOMENDADO), NOME SISTEMÁTICO (IDENTIFICA A REACÇÃO QUE O ENZIMA CATALISA) NÚMERO CLASSIFICACÃO EXEMPLO: ATP + CREATINA < ------ > ADP + FOSFOCREATINA NOME CURTO: CREATINA CINASE NOME SISTEMÁTICO: ATP CREATINA FOSFOTRANSFERASE NÚMERO CLASSIFICAÇÃO: E.C. 2.7.3.2 Lição de Biocatálise 2. GRUPO das Transferases 7. TRANSFERE GRUPOS FOSFATOS 3. GRUPO AZOTO COMO ACEITADOR 2. Nº DE ORDEM Nomenclatura e Classificação de Enzimas DEQB k1 H2O E + AX ↔ EAX → E + A + X k−1 k2 Tabela 1-1- Subclassificação das hidrolases Lição de Biocatálise Classificação EC Tipo de ligação 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 Éster Glicosilo Éter Peptidica C-N, não peptidica Ácido anidro C-C Haleto, C-X P-N S-N C-P Quimosina (EC 3.4.23.4) Nomenclatura e Classificação de Enzimas GOx DEQB β-D-glucose + oxygen Lição de Biocatálise D-glucono-1,5-lactone + hydrogen peroxide Óxido-redutases DEQB Lição de Biocatálise • Nomenclatura e Classificação de Enzimas DEQB Aminotransferase L-aspartate + 2-oxoglutarate Lição de Biocatálise oxaloacetate + L-glutamate Transferases DEQB Lição de Biocatálise • Nomenclatura e Classificação de Enzimas DEQB Hidrolase (quimosina ou renina) κ-casein + water Lição de Biocatálise para-κ-casein + caseino macropeptide Hidrolases DEQB Lição de Biocatálise • Nomenclatura e Classificação de Enzimas DEQB Liase (L-histidina amónia-liase ou histidase) L-histidine Lição de Biocatálise urocanate + ammonia Liases DEQB Lição de Biocatálise • Nomenclatura e Classificação de Enzimas glucose isomerase DEQB α-D-glucopyranose Lição de Biocatálise α-D-fructofuranose Isomerases DEQB Lição de Biocatálise • Nomenclatura e Classificação de Enzimas Ligase (glutathione sintetase) DEQB γ-L-glutamyl-L-cysteine + ATP + glycine Lição de Biocatálise glutathione + ADP + phosphate Ligases ou sintetases DEQB Lição de Biocatálise Medição da actividade enzimática DEQB Os enzimas como catalisadores são testados em condições reaccionais padrão correspondentes, em geral, aos óptimos de pH e concentração do substrato e co-factores (não limitante), de forma que a velocidade da reacção medida seja máxima, isto é, de ordem zero em relação ao substrato. Por exemplo, o método mais simples de medir a velocidade da reacção efectuada pelo enzima ou determinar a sua actividade é medir ao longo do tempo o aparecimento de um produto da reacção ou desaparecimento de um substrato. Lição de Biocatálise Hidrólise da ureia pela urease DEQB Lição de Biocatálise Medição da actividade enzimática DEQB Unidade de actividade enzimática (U): é definida pela quantidade de enzima que a transformação do substrato em produto e produz 1 µmole de produto por minuto nas condições óptimas da reacção. U = 1 µmole/min (T=25°C) KATAL- Quantidade de actividade enzimática que transforma 1 mole de substrato por segundo. KAT = l mole/s Lição de Biocatálise U = l µmole/min 1U=16,67x10-3 KAT Pureza da preparação enzimática DEQB (ACTesp) Actividade específica (U/mg) exprime o número de unidades de actividade enzimática expresso por miligrama de proteína da preparação enzimática. Esta grandeza permite medir a pureza da preparação enzimática quando se compara o seu valor com o do enzima puro e assim permite avaliar o grau de pureza obtido num passo de isolamento ou purificação durante a produção do enzima. Lição de Biocatálise Medir concentrações por espectrofotometria DEQB Lição de Biocatálise Medição da actividade de desidrogenases β-D-galactose dehidrogenase DEQB α-D-galactose + NAD+ Lição de Biocatálise D -galactono-1,4-lactona + NADH + H+ Desidrogenases + Co-factor DEQB Analito 1st Enzima Alcoóis - Formaldeído - D-Fructose D-Glucose / ATP 2 nd Enzima Co-factor e detecção Alcool dehidrogenase + NAD - λ340nm + Formaldeído dehidrogenase NAD - λ340nm Fructose dehidrogenase Azul Prússia λ- 660nm + Glucose quinase Glucose fosfat NAD - λ340nm dehidrogenase + D-Glucose Glucose dehidrogenase NAD - λ 340nm + Glicerol / ATP Glicerol quinase Glicerol fosfato NAD - λ340nm dehidrogenase + Glicerol Glycerol dehydrogenase NAD - λ340nm Glutamate Glutamato NADPH λ - 340nm dehidrogenase + D-hidróxiibutirato D-hidroxibutirato NAD - λ340nm dehidrogenase + Malato Malato dehidrogenase NAD - λ 340nm + Lactato / Piruvato Lactato dehidrogenase NAD - λ340nm + Sarcosina/ creatinina / creatina Sarcosina dehidrogenase NAD - λ340nm Lição de Biocatálise Reacções com desidrogenases DEQB Lição de Biocatálise Eléctrodos enzimáticos DEQB Clark electrode Reacções electroquímicas - + Cátodo Pt (-600mV) O2 + 4H+ + 4eÁnodo 4Ag + 4Cl- 4AgCl + 4e- Reacções enzimáticas e- Glucose + FAD + H2O P t e- FADH2 + O2 A g- Cl GOx Ácido Glucónico + H2O2 Glucose + O 2 Lição de Biocatálise 2H2O Membrana de teflon, permeável à glucose e ao O2, Ácido glucónico + FADH2 FAD + H2O2 DEQB Actividade da Glucose Oxidase (GOx) pelo consumo de O2 Act = - d[% O2]dis / dt Lição de Biocatálise Actividade da Glucose Oxidase (GOx) pela formação de H2O2 DEQB Os ensaios de determinação da actividade da GOx pela formação de H2O2. Glucose + FAD + H O Ácido glucónico + FADH 2 FADH2 + O2 2 FAD + H2O2 Pela combinação com a HRP que oxida por sua vez compostos fenólicos e percursores de um corante (quinoneimine λmax = 490-520nm) com ε490nm = 5,56 mM-1 cm-1. Lição de Biocatálise Actividade da Glucose Oxidase (GOx) pela formação de H2O2 DEQB Neste caso, a actividade de glucose oxidase é definida como número de micromole de H2O2 formados por minuto determinado indirectamente pela medição do aparecimento da cor a 490nm devido á formação do corante (quinoneimine). Neste caso, a mistura reaccional contêm 0,4mM de 4-AAP, 25mM de PSA e 2 U/ml de HRP em tampão fosfato 0,1M pH 7,0. Caso típico é medir a actividade da GOx pela adição de 25µl da amostra da preparação enzimática a 950 µl da mistura reaccional ao qual foi adicionado previamente 25µl de uma solução de glucose a 10% em água. Lição de Biocatálise Actividade de esterases pela hidrólise de substratos sintéticos DEQB O p-nitrofenol absorve a 400 nm (cor intensa amarela), o que permite quantificar a quantidade de produto presente na mistura reaccional. Lição de Biocatálise Actividade da cutinase pela hidrólise de substratos sintéticos DEQB Os ensaios de determinação da actividade da cutinase são efectuados a partir da hidrólise do p-nitrofenilbutirato (pNPB) em pnitrofenol (pNP). pNPB + H2O Cutinase pNP + ácido butírico Quando efectuado em descontínuo, numa cuvette de 1 ml, o ensaio caracteriza-se pela adição de 20µl de amostra da preparação de enzima a 980µl de mistura reaccional e a reacção enzimática deve ocorrer à temperatura ~ 22ºC. Lição de Biocatálise Actividade da cutinase pela hidrólise de substratos sintéticos DEQB A actividade enzimática na mistura reaccional é calculada a partir da derivação da lei de Beer-Lambert em ordem ao tempo, de acordo com a seguinte equação: = d [ pNP ] × V = dAbs(400nm ) × 1 × V ×103 Act (U ) = U µmol ml ml ml. min dt Ve dt ε × l Ve Em que: - U é a unidade de actividade enzimática definida como a concentração de enzima necessário para produzir um µmole de pNP por minuto; - [pNP] é a concentração milimolar de p-nitrofenol; - V é o volume reaccional em ml; - Ve é o volume do extracto enzimático em ml; - Abs(400nm) é a absorvância a 400 nm; - ε é o coeficiente de extinção molar (ε=1,84x104 M.cm-1); - l é a espessura da célula (l=1cm). Este método é válido para variações de absorvância (dAbs/dt) entre 0.1 e 0.9 min-1. Lição de Biocatálise
