“Estudo das Funções de Insulina em Plantas”.

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1 - INTRODUÇÃO
1.1 - INSULINA
As ilhotas de Langerhans foram identificadas, no pâcreas, por volta de 1860,
por Langerhans, daí a sua denominação. A relação entre diabetes e pâncreas foi
sugerida desde 1788 por Cawley, mas só foi comprovada por Frederick Banting &
Charles Best. Eles extraíram um potente fator hipoglicemiante de pâncreas de cães,
usando uma solução ácida de etanol (Banting et al., 1922). Esse fator denominado
insulina devido à sua origem (“islets of Langerhans”), rapidamente teve sua
utilização disseminada no controle do diabetes. A insulina é considerada um
hormônio modelo, uma vez que foi o primeiro a ser purificado, seqüenciado,
cristalizado e sintetizado através de técnicas químicas e de biologia molecular
(Murray et al. 2002).
A insulina é um peptídio formado por duas cadeias, uma de 21 aminoácidos e
a outra de 30 aminoácidos, ligadas por pontes dissulfeto. Ela é sintetizada por
ribossomos no retículo endoplasmático das células β do pâncreas sob a forma de
pré-pró-insulina, um polipeptídeo linear de 110 aminoácidos, com uma seqüência
sinal constituída por 23 aminoácidos hidrofóbicos, que direciona a pré-pró-insulina
para cisternas do retículo endoplasmático rugoso. Nas cisternas da referida organela
ocorre remoção da seqüência líder, formação das pontes dissulfeto e enrolamento
da cadeia. A pró-insulina tem de 77 a 86 aminoácidos sendo constituída pelas
cadeias A e B, conectadas pelo peptídeo C. O peptídeo C possibilita o dobramento
da cadeia permitindo, assim, a correta formação das três pontes dissulfeto. A
molécula de pró-insulina é transportada ao aparelho de Golgi, onde iniciam-se a
proteólise e o empacotamento em grânulos secretores. Nesses grânulos secretores
é convertida em insulina pela ação de uma peptidase específica que cliva ligações
peptídicas envolvendo aminoácidos básicos presentes nas extremidades do
peptídeo C. Quantidades equimolares do peptídeo C e moléculas de insulina estão
presentes no interior desses grânulos. Após estimulação apropriada, os grânulos
maduros se fundem com a membrana plasmática e descarregam seus conteúdos no
fluido extracelular por exocitose. Em vertebrados, as etapas de transcrição e
tradução da insulina são moduladas pela concentração de glicose sanguínea
(Dodson & Steiner, 1998).
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A comparação das seqüências das insulinas de diferentes espécies animais
aponta para conservação da identidade e posição da maioria dos aminoácidos,
exceto para os resíduos 8, 9 e 10, da cadeia A, e o resíduo 30 da cadeia B. Embora
os aminoácidos nessas posições variem muito, as propriedades biológicas
aparentemente não são alteradas. As posições e regiões altamente conservadas
são: a localização das três pontes dissulfeto; os resíduos hidrofóbicos na região
carboxi-terminal da cadeia B e as regiões amino e carboxila-terminais da cadeia A. A
estabilização da estrutura da molécula de insulina ocorre por pontes de hidrogênio e
interações iônicas. Dímeros de insulina são formados pela interação por pontes de
hidrogênio entre os grupamentos peptídicos dos resíduos B24 e B26 de duas
moléculas de insulina. Quando a insulina está em alta concentração, organiza-se
como um hexâmero, cada uma associada a dois átomos de zinco (Baker et al., 1988
citado por Conlon, 2001).
As células β do pâncreas respondem aos diversos estímulos recebidos (na
forma de substratos, hormônios ou neurotransmissores) e liberam insulina em
intensidade proporcional ao balanceamento entre fatores estimulatórios e inibitórios.
A resposta mediada por insulina à concentração de glicose sangüínea é bifásica. A
primeira é rápida, ocorrendo secreção transitória de insulina. A segunda é
proporcional ao nível e duração do pré-estímulo de glicose, e é dependente
parcialmente da síntese continuada de insulina. O aumento dos níveis de glicose é o
regulador fisiológico mais importante da secreção da insulina. A estimulação da
liberação de insulina por aminoácidos depende do tipo de aminoácido e do nível de
glicose presente; lipídeos são também capazes de potencializar a liberação de
insulina (Rorsman et. al., 2000; Lang, 1999; Pagliara et al., 1974).
A degradação da insulina ocorre principalmente no fígado e rins e é
responsável pela remoção e inativação desse hormônio. O primeiro passo para o
catabolismo da insulina é a ligação ao seu receptor e a subseqüente internalização.
Interações intracelulares entre insulina e a protease específica para insulina (sistema
de degradação enzimática da insulina) promovem a clivagem da insulina. Outras
enzimas estão envolvidas na degradação da insulina como a proteína isomerase
dissulfeto que catalisa a redução das pontes dissulfeto após a clivagem iniciada pela
protease específica para insulina e, a catepsina D, localizada nos lisossomos
possivelmente relacionada a degradação ácida da insulina previamente quebrada
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pela protease e proteína isomerase dissulfeto (Mora et al., 2003, Duckworth et al.,
1988).
A insulina liga-se ao seu receptor nas células alvo para exercer suas funções.
O receptor é constituído por duas subunidades α que se projetam para o lado
externo da membrana plasmática e duas subunidades β, transmembranares, cujas
extremidades carboxílicas encontram-se no lado citossólico. Um modelo propõe que
uma molécula de insulina liga-se com alta afinidade às duas subunidades α do
receptor, proporcionando mudança conformacional necessária a estimulação da
atividade tirosina quinase da subunidade β. Conforme esquematizado na figura 1, o
sítio 1 de uma molécula de insulina liga-se ao sítio de ligação 1 em uma das
subunidades α do receptor e o sítio 2 da molécula de insulina associa-se com a
região 2 de outra subunidade α do receptor (Schäffer, L., 1994).
Receptor de insulina
Receptor de insulina ativado
Insulina
Figura 1 - Ligação de Insulina ao Receptor (Schäffer, L., 1994). A região 1 de uma molécula de
insulina interagiria com o sítio de ligação 1 em uma das subunidades α do receptor e a região
2 da molécula de insulina ligaria com a região 2 da outra subunidade α do receptor,
determinando mudança conformacional do receptor de insulina.
Subseqüente à autofosforilação do receptor de insulina, ocorre a fosforilação
dos resíduos de tirosina nos substratos intracelulares. Os substratos para os
receptores de insulina são quatro. Existem 20-22 resíduos de tirosina que podem ser
fosforilados no receptor de insulina. Esses sítios de fosforilação estão localizados no
domínio que interage com proteínas que possuem o domínio homólogo a src (SH)2
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como fosfatidil inositol 3 quinase, proteína de ligação ao receptor do fator de
crescimento e a fosfatase tirosina Syp. A fosforilação dessas proteínas desencadeia
a ativação do sistema Ras-Raf-MAP quinase ou ativação da quinase serina AKT
quinase, resultando nos efeitos biológicos da insulina. Esse modelo de sinalização é
esquematizado na figura 2 (revisado por Baudler et al, 2003).
Receptor de insulina
glicose
Quinase PI 3
Complexo RAS
Quinase
S6
Transporte de Glicose
Síntese de lipídios
Quinase MAP
Proliferação
Expressão Gênica
Expressão gênica
Síntese de proteínas
Figura 2: Esquematização da cascata de sinalização de insulina (Baudler et al, 2003).
AKt – quinase serina/treonina sensível a insulina; ATP – adenosina trifosfato; IRS – substrato
do receptor de insulina; GAB-1 – proteína de ligação associada GBR2; GAP – proteína
ativadora de GTPase; GLUT4 – tranportador de glicose do tipo 4; GRB2 – proteína 2 de ligação
do receptor do fator de crescimento; GTP – guanosina trifosfato; GSK3 – quinase 3 da sintase
do glicogênio; MAP – proteína quinase ativada por mitógeno; p110p85 – subunidade catalítica
(p110) e subunidade regulatória da quinase PI-3; Shc proteína com domínio homólogo ao
colágeno e com domínio homólogo a Src; SHP2 – fosfatases tirosinas com domínio homólogo
a Scr; SOS – fator trocador de nucleotídeo guanidina específica para Ras (oncogene do vírus
sarcoma Harvey); Raf – oncongene viral codificante de uma quinase serina/treonina (retrovírus
de transformação rápida); MEK – quinase da MAP quinase; Rsk – quinase S6 ribosssomal.
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A insulina de vertebrados é conhecida por exercer uma ampla faixa de efeitos
regulatórios na célula. Tradicionalmente, esses efeitos são classificados em dois
tipos: metabólicos e estimuladores de crescimento. Os efeitos metabólicos da
insulina consistem na captação, transporte, armazenamento e metabolismo de
moléculas alimentares (as hexoses, aminoácidos e ácidos graxos). Enquanto os
efeitos metabólicos podem ser de curta e longa duração, os efeitos mitogênicos são
de longa duração e ocorrem no nível gênico. Consistem no aumento da expressão
de genes específicos, estimulação da síntese de DNA, RNA e proteínas específicas,
e, em seu conjunto, resultam no crescimento celular. A insulina, em baixa
concentração, tem ação metabólica e, em alta concentração, ação mitogênica
(Pertseva et al., 2003). Alexander-Bridges et al. (1992) sugerem que os efeitos da
insulina sobre os genes responsáveis pelo crescimento são realizados através de
fosforilação das proteínas, enquanto o efeito sobre os genes relacionados ao
metabolismo é efetuado pela inibição da fosforilação.
Uma entrada de glicose, nas células β do pâncreas, determina aumento de
ATP, via glicólise e ciclo de Krebs. Altos níveis de ATP inibem os canais de K+
sensíveis a ATP, despolarizando a membrana das células β, o que resulta no influxo
de Ca++, através dos canais de Ca++ sensíveis a voltagem. Uma vez elevada a
concentração de Ca++, ocorre o estímulo da exocitose da insulina. Isso resulta num
aumento nos níveis da insulina sangüínea que, por sua vez, mediará uma série de
efeitos descritos a seguir (Deeney et al., 2000).
Um dos efeitos consecutivos ao aumento nos níveis de insulina é o aumento
da transcrição do gene da glicoquinase no fígado, elevando a quantidade desta
enzima no órgão. Tal indução enzimática pode contribuir muito para diminuir os
níveis elevados de glicose no sangue. A glicoquinase é uma isoenzima da
hexoquinase com propriedades cinéticas muito diferentes das outras hexoquinases.
O Km é consideravelmente mais alto do que para outras hexoquinases. A
glicoquinase não está sujeita à inibição pela glicose 6-fosfato, o produto da reação
de fosforilação catalisada por essa enzima (Brady et al., 1999).
A glicose é transportada por oito membros de uma superfamília de proteínas
de membrana, produtos de genes singulares, expressos num padrão tecidoespecífico. Os transportadores de glicose são chamados de GLUT1, GLUT2 e assim
por diante. A maioria dos transportadores está localizada na membrana plasmática e
o movimento do transporte de glicose é no sentido de fora para dentro da célula.
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(Olson & Pessin, 1996). GLUT4 é o transportador sensível à insulina,
predominantemente encontrado, mas não exclusivamente, nos tecidos adiposo,
músculo esquelético e cardíaco. No estado basal, mais de 95 % dos transportadores
GLUT4 localizam-se nos diferentes compartimentos de armazenamento – elementos
túbulo-vesicular intracelular, compartimentos endomembranosos (endossomos de
reciclagem e distribuição) e complexo Trans-Golgi. A insulina estimula a
translocação de GLUT4 para a membrana plasmática através de duas vias de
sinalização: uma dependente de substrato do receptor de insulina/quinase do
fosfatidilinositol 3-fosfato e outra envolvendo CAP/CbI/TC10 (Kanzaki & Pessin,
2003; Brady et al., 1999; Pessin et al., 1999).
A glicose é fosforilada, após sua entrada na célula, por hexoquinases, sendo
dessa forma mantida no interior celular. Dependendo das necessidades metabólicas,
a glicose 6-fosfato poderá ser armazenada como glicogênio ou sofrer glicólise para
subseqüente oxidação do piruvato e produção de ATP. As duas enzimas do
metabolismo do glicogênio, a fosforilase do glicogênio e sintase do glicogênio, bem
como as enzimas chaves da glicólise, estão sujeitas à regulação por modificação
covalente, alostérica e compartimentalização (Brady et al., 1999).
No metabolismo do glicogênio, a sintase do glicogênio catalisa a incorporação
de UDP-glicose ao glicogênio, enquanto a fosforilase libera resíduos de glicose 1fosfato das cadeias do glicogênio (figura 3). A fosforilação de múltiplos sítios da
sintase do glicogênio resulta na sua progressiva inativação, enquanto a fosforilação
de um único sítio da fosforilase do glicogênio promove a sua ativação. A insulina
ativa a proteína fosfatase (PP1) responsável pela desfosforilação tanto da sintase do
glicogênio quanto da fosforilase do glicogênio, promovendo a estimulação máxima
da síntese de glicogênio e inibição da glicogenólise. A proteína fosfatase (PP1)
desfosforila e inativa uma quinase da fosforilase do glicogênio, o imediato ativador
desta enzima. A insulina, também, diminui a atividade da quinase da sintase do
glicogênio-3 (GSK-3) que por sua vez fosforila e inativa a sintase do glicogênio.
(Baudler et al., 2003; Brady et al., 1999).
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Receptor de insulina
+
PPI
+
Glicogênio
sintase
GSK-3
Desfosforilação da
fosforilase do glicogênio
Desfosforilação da
fosforilase quinase
Figura 3: Desfosforilação das enzimas do metabolismo do glicogênio (Brady et al.,
1999).
A insulina promove regulação alostérica das enzimas do metabolismo do
glicogênio, à medida que aumentos nos níveis intracelulares de glicose, glicose 6fosfato e UDP-glicose contribuem para regulação de ambas enzimas. Por fim, a
insulina ativa a síntese do glicogênio por regular a localização subcelular da sintase
do glicogênio. Em hepatócitos, aumentos nos níveis de glicose 6-fosfato resultam na
translocação da sintase do glicogênio do citosol para a membrana plasmática
(Fernandez-Novell, et al., 1997).
A insulina sinaliza a ativação de fosfoproteínas fosfatases por mecanismos
não totalmente compreendidos. Uma fosfoproteína fosfatase remove o fosfato da
enzima bifuncional fosfofrutoquinase-2 e frutose 2,6-bifosfatase. Quando a enzima
bifuncional está desfosforilada, a atividade fosfofrutoquinase-2 está ativa e catalisa a
síntese de frutose 2-6 bifosfato. Quando a enzima bifuncional estiver fosforilada, a
atividade frutose 2,6-bifosfatase é estimulada e passa a catalisar a hidrólise da
frutose 2-6 bifosfato. Desse modo, a insulina converte a enzima bifuncional na forma
fosfrutoquinase 2, o que resulta no acúmulo de frutose 2-6 bifosfato. Frutose 2-6
bifosfato é um regulador positivo da enzima 6-fosfofruto-1-quinase e inibidor da
frutose 1,6 bifosfatase, por conseguinte, a glicólise é estimulada e a gliconeogênese
inibida (Saltiel & Kahn, 2001; Pilkis, 1992).
A insulina estimula a lipogênese por vários mecanismos. Em função de uma
maior captação de glicose para o interior celular, aumenta-se a disponibilidade do
piruvato, necessário à síntese de ácidos graxos e também do glicerol 3-fosfato para
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a esterificação de ácidos graxos recentemente formados. A insulina estimula a
ativação da piruvato-desidrogenase no tecido adiposo, mas não no fígado e
determina a conversão à forma ativa da acetil-CoA carboxilase. Um outro efeito da
insulina é a redução dos níveis de AMPc no tecido adiposo, conseqüentemente
ocorre inibição da lipólise, e portanto, a concentração de ácidos graxos livres reduzse acompanhada pela diminuição de acil-CoAs de cadeias longas o que inibe a
lipogênese. A principal ação da insulina no tecido adiposo é inibir a atividade da
lipase hormônio-sensível tanto pela redução do AMPc quanto pela ativação da
fosfatase da lipase. No fígado, a insulina estimula a síntese de triacilglicerídeos que
são transportados para o tecido adiposo na forma de VLDLs (lipopoproteínas de
densidade muito baixa). Nos adipócitos os ácidos graxos liberados dos triacilgliceróis
provenientes das VLDLs são usados na síntese de triacilglicerídeos (Devlin et al.,
2002; Geelen et al., 1980; Holm, 2003).
Além do transporte de glicose, insulina estimula o transporte de potássio. Dois
mecanismos são propostos para esta ativação: o estímulo do cotransportador de Na+
e K+ e o da Na+K+ATPase. O efeito máximo é observado em 10 minutos (Longo,
1996). Em fibroblastos, insulina aumenta a reciclagem da Na+K+ATPase sem afetar
a quantidade na membrana ou modificar a dependência intracelular de Na+ pela
Na+K+ATPase (Longo et al., 2001).
Insulina desempenha um papel chave na regulação da síntese protéica. Tal
papel tem sido observado em vários tecidos e em sistemas de cultura de células
(Antonetti et al., 1993; Asford & Pain, 1986; DePhilip et al., 1979). Múltiplos
mecanismos estão envolvidos nessa regulação: 1 – aumento da eficiência na
iniciação e/ou elongação na tradução do mRNA (Kimball et al., 1994); 2 – mudança
na transcrição de genes específicos (O’Brien & Granner, 1996); 3 – aumento do
número de ribossomos (Antonetti et al., 1993; Asford et al., 1986; DePhilip et al.,
1979). O grau de contribuição de cada um deles na regulação da síntese protéica
varia conforme os sistemas em estudo. Mudanças dos níveis basais dos ribossomos
podem envolver modulação na síntese ribossomal ou de sua degradação. Hannan et
al. (1998) observaram que insulina estimula a transcrição de rRNA em células de
fibroblastos de camundongos albinos 3T6 e células de hepatomas de rato –II-E.C3,
em parte, pelo aumento do conteúdo celular de componentes requeridos para
formação do complexo ativo de RNA polimerase I. As moléculas que tiveram os
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níveis aumentados foram o UBF (fator de ligação “upstream”) e o fator 53 associado
a RNA polimerase I (Hannan et al., 1998).
1.2 - DISTRIBUIÇÃO DE INSULINA NOS ORGANISMOS
A insulina teve sua origem associada ao pâncreas nos vertebrados primitivos.
Verificou-se, no entanto, recentemente, que ela tem uma distribuição mais ampla,
tanto em termos dos tecidos em que se encontra quanto em relação à sua presença
em outros reinos (Le Roith et al.,1980). Já em 1923, Best & Scott descreveram uma
atividade hipoglicêmica em extratos de diversas glândulas, como a tireóide, o timo, a
submaxilar e o fígado. No sistema nervoso central, a insulina apresenta funções na
estimulação simpática e liberação do fator liberador de corticotropina, além de
possível ação no crescimento do sistema nervoso central (Schulingkamp et al., 2000;
Ferrannini et al., 1999). Há duas teorias para origem da insulina no cérebro de
vertebrados: uma seria através da produção local de insulina e a outra seria pelo
transporte ativo da insulina, contra o gradiente, da circulação para o sistema nervoso
central (Schulingkamp et al., 2000). Em invertebrados, a maioria dos trabalhos
publicados entre 1980 e 1997 sobre insulina, a descrevem no sistema nervoso mais
do que no sistema enteropancreático (Sower et. al., 2000).
1.2.1 – INSULINA EM PROCARIOTOS
Um único trabalho registra insulina em um procarioto. Este trabalho foi
publicado em 1981 por LeRoith et al. (1981b), onde foi descrita insulina em
Escherichia coli detectada por atividade imunológica e biológica.
1.2.2 – INSULINA EM EUCARIOTOS UNICELULARES
Desde 1923, a presença de insulina havia sido descrita por Collip, em
levedura, baseando-se em atividade hipoglicêmica. Mais um indicativo da presença
de insulina, em levedura, seria o caminho de sinalização de insulina, descoberto
posteriormente, quando insulina exógena de humanos foi administrada à levedura
Saccharomyces cerevisae e houve estimulação do metabolismo de glicose e da
quinase Snf1 (Muller et al., 1998).
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Em 1980, LeRoith et al. descreveram insulina em Tetrahymena pyriformis
(protozoário), Aspergillus fumigatus (fungo) e Neurospora crassa (fungo). Estes
peptídeos relacionados à insulina mostraram comportamento semelhante à insulina
de vertebrados em cromatografia de exclusão molecular, de troca iônica e de fase
reversa, além de apresentarem atividade imunológica e biológica (LeRoith et al.,
1980; LeRoith et al., 1985). Tentativas foram feitas para clonar o gene de insulina de
Neurospora crassa, mas Muthukumar e Lenard (1991) obtiveram um pseudogene
semelhante ao gene da preproinsulina humana. Ainda em Neurospora crassa foi
identificado e purificado um receptor de insulina de membrana com 55 kDa, o que
aponta um caminho de sinalização de insulina neste fungo (Dietz et al., 1989; Kole
et al., 1991).
1.2.3 – INSULINA EM INVERTEBRADOS
Em invertebrados, a insulina apresenta-se como um grupo de peptídeos,
estruturalmente muito diversos entre si e codificados por grandes famílias
multigênicas. As estruturas básicas das insulinas de vertebrados são mantidas
nestes peptídeos, tais como organização em duas cadeias e centro hidrofóbico. No
entanto, também apresentam características únicas tais como a incapacidade de
formar dímeros ou hexâmeros como acontece com o MIP (peptídeo de molusco
relacionado à insulina) e com o LIRP (peptídeo de lagosta relacionado à insulina); as
cadeias B são extremamente variáveis, em extensão, quando comparadas às
insulinas de vertebrados (Smit et al., 1998). Entre os filos de invertebrados, a
insulina foi descrita em urocordatos, equinodermes, artrópodes, anelídeos, moluscos
e esponjas (Sower et al., 2000; Robitzki et al., 1989). Em Apis mellifica (abelha),
Drosophila melanogaster e Annelida oligocheta, os peptídeos relacionados à insulina
foram detectados por ensaios imunológicos e biológicos (Maier et al., 1988; LeRoith
et al., 1981a).
A insulina da esponja Geodia cydonium, altamente homóloga à insulina de
vertebrados, não apresenta pontes dissulfeto intracadeia, e possivelmente está
envolvida na sinalização endócrina neste organismo. Várias são as evidências que
confirmam este fato: esta proteína é sintetizada por células sinalizadoras na esponja
e é capaz de estimular a transcrição de RNAm de calelectrina, além do fato de que
membranas citoplasmáticas contêm um receptor para insulina (Robitzki et al., 1989).
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1.2.4 – INSULINA EM PLANTAS
Abordagens científicas no sentido de se investigarem atividades de plantas
eficientes no tratamento do diabetes têm sido feitas, mas pouco se sabe sobre o
mecanismo de ação e os princípios ativos de tais plantas. Foi demonstrado que
extratos aquosos da casca de sementes de Caesalpinia bonducella, administrados
oralmente, têm ação hipoglicêmica em ratos com diabetes induzido por
estreptozotocina e aloxano (Biswas et al., 1997) e que extratos aquosos do fruto de
Momordica charantia têm ação hipoglicêmica em ratos tratados com aloxano
(Srivastava et al., 1993).
Tantos são os tratamentos tradicionais empregados para o diabetes mellitus
que, se contabilizados, ultrapassam o número de 400. Compostos da classe dos
alcalóides, glicosídeos e polissacarídeos são descritos como tendo atividade
hipoglicêmica, embora seus mecanismos de ação não sejam totalmente definidos.
Os possíveis mecanismos de ação são: facilitação da ação da insulina e estimulação
de sua síntese (Bailey & Day, 1989). Um composto extraído de Salacia reticulata, um
açúcar sulfatado denominado salacinol, apresenta atividade hipoglicêmica por inibir
a atividade α- glicosidásica do intestino (Yoshikawa et al., 1997).
Já desde o descobrimento de insulina em vertebrados, sua presença foi
investigada em plantas. Um dos membros do grupo que descobriu a insulina em
cães, J. B. Collip, publicou um artigo em 1923, relatando atividade hipoglicêmica de
extratos de diferentes plantas como alface, cevada, cebola, trigo e feijão. Ele atribuiu
o nome de glucocinina a estes compostos hipoglicemiantes por considerar que o
hormônio deveria ter uma denominação relacionada à sua atividade, ou seja,
metabolismo de glicose e não relativa ao tecido de origem em vertebrados (Collip,
1923). Posteriormente, em 1979, um polipeptídeo extraído de Momordica charantia
(melão-de-São-Caetano), uma Cucurbitaceae, foi denominado p-insulina, dado suas
características semelhantes à insulina bovina quanto ao método de preparação,
cristalização e atividade hipoglicêmica (Khanna & Jain, 1979). Peptídeos
relacionados à insulina também foram detectados por ensaios imunológicos e
biológicos em espinafre, centeio e Lemna gibba (Collier et al.,1987). Embora já
estivesse sido descrita a presença de insulina em plantas, a primeira seqüência de
uma insulina vegetal, foi obtida por Oliveira e colaboradores em 1999, tendo sido
isolada de sementes de Canavalia ensiformis (feijão-de-porco), uma leguminosa.
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As proteínas solúveis do tegumento de Canavalia ensiformis foram
submetidas a cromatografia de troca iônica (DEAE-celulose) e a fração adsorvida foi
separada, posteriormente, em cromatografia de exclusão molecular (Sephadex G50). A fração eluída, em Sephadex G-50, no tempo de retenção das proteínas com
aproximadamente 8 kDa foi separada em gel de poliacrilamida e a banda protéica
com 6 KDa contida nessa fração foi seqüenciada. A principal seqüência foi a que
apresentou homologia com insulina bovina e a seqüência secundária mostrou-se
80% homóloga a uma seqüência interna do receptor do tipo tirosina quinase de
humanos. A fração da Sephadex G50 com 15,3 % de espécies responsivas ao
anticorpo anti-insulina humana, conforme determinado por radioimunoensaio,
reduziu a glicemia de camundongos com diabetes induzida por aloxano, em nível
comparável a solução de insulina bovina controle (Oliveira et al., 1999).
Imunolocalização demonstrou a presença de insulina, receptor do tipo proteína
quinase e proteínas do tipo fosfoserina na camada interna do tegumento de
sementes de Canavalia ensiformis. (Oliveira et al., 2004).
De Vigna unguiculata, também foram isoladas proteínas do tipo insulina com
homologia a insulina bovina. Foi observado que os níveis de proteínas do tipo
insulina aumentam durante o desenvolvimento de frutos de Vigna unguiculata e só
declinam com a fase do amadurecimento (Venâncio et al., 2003). Posteriormente,
esse mesmo grupo purificou uma proteína com afinidade a insulina de frutos de
Vigna unguiculata cuja seqüência primária foi homóloga a receptores do tipo quinase
de Arabidopsis thaliana e ao precursor do receptor de insulina de rato (Venâncio et
al., 2004).
Insulina
foi
detectada
em
cloroplastos
e
em
vacúolos
de
células
parenquimáticas de folha de Bauhinia variegata (pata-de-vaca). No vacúolo, insulina
estava associada a cristais contendo cálcio provavelmente na forma de oxaloacetato
de cálcio. A proteína isolada do cloroplasto de folha de Bauhinia variegata
apresentou atividade hipoglicemiante e seqüência parcial homóloga a insulina
(Azevedo et al., 2003).
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1.3 - EFEITOS DE INSULINA EXÓGENA EM PLANTAS
Um caminho de transdução de sinais envolvendo insulina tem sido
evidenciado, em plantas, pelos resultados de administração exógena desse
hormônio. Em sementes de melancia, pepino e girassol, insulina foi capaz de
estimular a atividade de enzimas do ciclo do glioxalato (Goodman & Davis, 1993). Já
em sementes de milho, a insulina acelerou a germinação e o crescimento das
sementes, além de aumentar a síntese de proteínas ribossomais. Em especial, o
fator de iniciação eIFiso-4E de sementes de milho teve o seu controle transcricional
relacionado à insulina que, ao que tudo indica, modularia a fosforilação de proteína
ribossomal S6 na subunidade 40S. No estado fosforilado da proteína ribossomal S6
há maior eficiência no recrutamento do RNAm da eIFiso-4E para os polissomos
(Sánchez de Jiménez et al., 1999; Dinkova et al., 2000).
Através de ensaio de ligação em membrana, Komatsu & Hirano (1991)
demonstraram que globulinas 7S básicas de Vigna radiata, Vigna anglaris, Vigna
sinensis, Lupinus albus e Glycine max e também uma glicoproteína epidermal de
cenoura são capazes de se ligarem à insulina e ao fator de crescimento do tipo
insulina I e II. As globulinas 7S básicas não têm homologia de seqüência com o
receptor de insulina ou com receptores de fatores de crescimento do tipo insulina.
No entanto, as globulinas 7S básicas apresentam diversas características
semelhantes ao receptor de insulina. As duas proteínas são glicosiladas e têm
domínios ricos em cisteína. Tanto o receptor de insulina quanto as globulinas 7S
básicas são formadas por duas subunidades ligadas por ponte dissulfeto, e são
sintetizadas na forma de um precursor com uma única cadeia. A subunidade de 16
kDa das globulinas 7S básicas tem atividade quinásica semelhante à subunidade β
do receptor. Watanabe e colaboradores (1994) isolaram um peptídeo de radículas
de soja em germinação, denominado leginsulina, capaz de ligar-se às globulinas 7S
básicas e estimular a atividade quinásica destas proteínas, embora leginsulina não
tenha homologia com insulina (Komatsu & Hirano, 1991; Komatsu et al., 1994;
Watanabe et al., 1994).
14
1.4 – EFEITOS DE ANÁLOGOS DA INSULINA E INIBIDORES DO
EFEITO DA INSULINA EM PLANTAS
Alguns compostos têm efeitos miméticos à insulina, entre estes estão o
vanadil sulfato e pinitol. O D-pinitol (3-O-metil-quiroinositol), isolado do Bougainvillea
spectabilis, reduziu a glicemia de camundongos diabéticos e aumentou o transporte
de deoxi-glicose em células musculares (Bates et al., 2000). Os D-quiroinositóis são
estruturalmente relacionados aos fosfatidilinositóis fosfato que participam na cascata
de ativação do transporte de glicose promovida pela insulina (Holman & Kasuga,
1997; White, 1997). Por sua vez, os fosfoglicanos inositóis são rapidamente
produzidos em resposta à insulina e atuam como mediadores da ação da insulina,
provavelmente, após o receptor (Kelly et al., 1987; Larner et al., 1998). Vanadil
reduziu as concentrações de glicose de ratos diabéticos (Thompson et al., 1993) e
estimulou o transporte de glicose e atividade da sintase do glicogênio em
hepatócitos isolados de ratos (Miralpeix et al., 1989). Em plantas, tanto o vanadil
sulfato quanto o pinitol tiveram efeitos similares aos da insulina. Pinitol e vanadil
sulfato quando adicionados ao meio de germinação de sementes de Canavalia
ensiformis promoveram aumentos significativos no comprimento e massa de raízes e
epicótilos com 120 horas após a embebição, semelhantemente à insulina. No
entanto, sementes de Canavalia ensiformis embebidas em solução de tifortin
(inibidor da atividade quinase do receptor de insulina) tiveram epicótilos e radículas
com tamanhos e massas inferiores daquelas sementes embebidas com solução de
insulina (Oliveira et al., 2004). Rapamacina e wortimanina, dois inibidores da
sinalização de insulina, preveniram o aumento da síntese das proteínas ribossomais
e da fosforilação de proteínas ribossomais S6 da subunidade ribossomal 40 S de
eixo embrionário de milho com 24 horas após a embembição, promovido pela
insulina (Sánchez de Jiménez et al., 1999) e também preveniram a ativação da
mobilização de RNAm do fator de inicialização de eucarioto – eIFiso4E,
desencadeada por insulina, nos polissomos de eixo embrionário de milho com 24
horas após embebição (Dinkova et al., 2000).
15
1.5 – METABOLISMO DE AÇÚCARES EM PLANTAS
A fotossíntese constitui a rota pela qual toda a energia solar entra na biosfera
(Raven et al., 1996). Em vegetais, a fotossíntese ocorre em uma organela
intracelular especializada, o cloroplasto. Os produtos da fotossíntese são usados
pelas células fotossintetizantes para processos biossintéticos e são geralmente
exportados na forma de sacarose para suprir as necessidades metabólicas das
células não fotossintetizantes do vegetal. Alternativamente, os produtos podem ser
armazenados na forma de amido, um polissacarídeo osmoticamente inerte (Alberts
et al., 1997).
A síntese de sacarose é restrita ao citosol. Entretanto, é armazenada
principalmente no vacúolo, que é cerca de 10 a 20 vezes maior que o citosol. O
transporte intracelular de sacarose que ocorre entre vacúolo e citosol envolve um
antiporter sacarose-H+ (Winter & Huber, 2000).
O transporte intercelular pode ocorrer por via de duas rotas principais. A
primeira delas envolve o transporte mediado por carreador através da membrana
plasmática e a difusão através da fase aquosa da parede celular (rota apoplástica).
A segunda envolve o transporte direto célula-célula via plasmodesmata (rota
simplástica). O transporte intercelular de sacarose ocorre dentro de uma planta por
ambas as rotas, dependendo do tipo celular e da espécie. Células do mesófilo, por
exemplo, estão conectadas por uma rede extensa de plasmodesmatas. O transporte
da sacarose por via simplástica poderia ocorrer entre os tubos crivados e o
complexo das células companheiras, que estão interconectados via plasmodesmatas
(Winter & Huber, 2000).
Se o transporte da sacarose no floema ocorre por via simplástica ou
apoplástica, é ainda motivo de controvérsia. A figura 4 apresenta um caminho
hipotético do fluxo de solutos dentro e fora do floema. Nas veias menores, o soluto
passaria através do parênquima do floema ou células da bainha do feixe para as
células companheiras através do plasmodesmata (A) ou por via apoplástica (B). Das
células companheiras, os solutos seriam translocados para os tubos crivados
seguindo uma rota simplástica (D) ou apoplástica (C). A perda continuada de soluto
durante o transporte dirigiria o fluxo de líquido para os tubos crivados. No tecido
floemático, o complexo das células companheiras/tubos crivados é simplasticamente
isolado, o que permitiria o equilíbrio do soluto entre os dois tipos celulares. Alguns
16
solutos poderiam sair do caminho floemático, via rota apoplástica, para tecido de
alimentação (F). Nos órgãos drenos, o fluxo ocorreria pela rota simplástica (A) ou
apoplástica (F) (Turgeon, 2000).
Veias menores
Floema
Tubo crivado
Tubo crivado
Tecido “dreno”
Tubo crivado
Célula companheira
Célula companheira
Célula companheira
Células do floema
ou feixe da bainha
Célula do floema
Célula do floema
Figura 4: Caminhos hipotéticos do fluxo de solutos dentro e fora do floema (Turgeon,
2000). Nas veias menores, os solutos seriam transportados das células do parênquima do
floema ou da bainha do feixe para as células companheiras pela via simplástica (A) ou
apoplástica (B). O caminho apoplástico envolve efluxo e influxo através dos transportadores
associados à membrana. Das células companheiras, os solutos seriam transportados para os
elementos de tubo crivados por via apoplástica (C) ou simplástica (D). O controle do
transporte de solutos para os elementos de tubo crivados, nas veias menores, ocorre pela
especificidade dos carreadores (C) ou pela recuperação dos solutos transferidos pelo caminho
simplástico mediada por carreadores (E).
No floema, os solutos dos elementos de tubo
crivados, poderiam seguir para o tecido dreno ou ter fluxo bidirecional com as células
companheiras. Nas células companheiras do tecido floemático, os solutos seguiriam por via
apoplástica (F) para células do parênquima do floema. Nos tecidos drenos, ocorreria o fluxo
birecional dos solutos entre os elementos do tubo crivados e células companheiras (D). Os
solutos das células companheiras poderiam ser transportados por via simplástica (A) ou
apoplástica (F) para células do parênquima do floema.
O caminho apoplástico envolve entrada e saída de solutos via carreadores
associados à membrana. Os açúcares são translocados através da membrana
plasmática, mediante transportadores, direcionados por gradiente de prótons
(Stadler et al., 1995 citado por Yistra et al., 1998). Esses transportadores são de
monossacarídeos
ou
dissacarídeos.
Os
genes
para
transportadores
de
dissacarídeos são transcritos, “a priori”, em folhas maduras, e os transportadores de
17
monossocarídeos em órgãos drenos, ou seja, folhas jovens, órgãos florais e de
armazenamento (Sauer & Stadler, 1993 citado por Yistra et al.,1998). O tubo polínico
de Petunia hibrida, um órgão dreno, capta açúcar na forma de hexoses e para tanto
a sacarose deverá ser clivada por invertases associadas à parede celular. O gene
Pmt1 (transportador de monossacarídeo de Petúnia 1) somente é expresso no grão
de pólen e este transportador só é ativo após a primeira mitose desta célula
reprodutora (Yistra et al., 1998). Diferentemente de outros transportadores de
membrana, o transportador de sacarose isolado de cotilédones de soja, que é
homólogo à vicilina, não depende de um gradiente de próton para promover o
transporte (Overvoorde et al., 1997).
Sacarose tem papel chave no crescimento e desenvolvimento das plantas
podendo atuar como açúcar transportador, nutriente e molécula sinalizadora. Como
resultado dessa importante participação, diversos estudos têm sido desenvolvidos
para identificar os mecanismos que regulam o metabolismo da sacarose. A figura 5
representa um modelo do metabolismo da sacarose nas células das plantas no qual
sacarose seria clivada por uma invertase no apoplasto ou no interior da célula. As
hexoses resultantes (glicose e frutose) seriam convertidas a hexoses-fosfato por
frutoquinases e hexoquinases presentes no citosol. A sacarose poderia também ser
clivada pela sacarose sintase, produzindo UDP-glicose e frutose. Após fosforilações
as hexoses-fosfato resultantes poderiam ser metabolizadas pela glicólise (Pego &
SmeeKens, 2000).
A sacarose é sintetizada nas folhas como um dos produtos finais da
fotossíntese. Durante o dia, o substrato para síntese de sacarose é a triose fosfato,
liberada do cloroplasto através de um sistema antiporte que troca sacarose por Pi. À
noite, o substrato para síntese de sacarose é proveniente da quebra do amido,
provavelmente na forma de glicose (Winter & Huber, 2000).
A biossíntese da sacarose é catalisada pela ação seqüencial da sintase da
sacarose fosfato (SPS) e fosfatase da sacarose 6-fosfato (SPP):
(1) UDP-Glicose + Frutose 6-fostato
SPS
sacarose 6-fosfato + UDP + H+
SPP
(2) Sacarose 6-fosfato + H2O
sacarose + Pi
18
Sacarose
invertase
Frutose + glicose
Transportador
de sacarose
Transportador
de hexoses
apoplasto
citosol
Sacarose
Sacarose sintase
invertase
Frutose + glicose
UDP-glicose + frutose
Frutoquinase
Frutose 6-fosfato
hexoquinase
Glicose 6-fosfato
Glicólise
Figura 5: Metabolismo da sacarose nas células das plantas (Pego & SmeeKens, 2000).
A sacarose seria transferida do apoplasto para o interior celular através do transportador de
sacarose localizado na membrana plasmática, ou seria clivada pela invertase, ainda, no
apoplasto, formando glicose e frutose. As hexoses (glicose e frutose) seriam transferidas para
o interior celular através do transportador de hexoses. A sacarose no interior celular poderia
ser clivada pela invertase formando glicose e frutose ou pela sacarose sintase formando UDP
glicose e frutose. As hexoses, glicose e frutose, poderiam ser fosforiladas, respectivamente,
por hexoquinase e frutoquinase e então serem metabolizadas através da glicólise.
A rápida remoção da sacarose 6-fosfato por uma fosfatase específica conduz
a síntese de sacarose à irreversibilidade, embora a primeira reação, catalisada pela
SPS, seja reversível (Winter & Huber, 2000).
O estado de fosforilação da SPS constitui um importante mecanismo da
regulação da atividade desta enzima e ocorre em resposta a estímulos endógenos e
ambientais. A fosforilação foi, originalmente, descoberta como mecanismo
modulador da atividade claro/escuro. Mais recentemente foi relacionada à ativação
da enzima que ocorre quando o tecido de folhas é submetido a estresse osmótico. A
enzima é fosforilada em vários resíduos de serina, “in vivo”. Em espinafre, a serina
158 quando fosforilada, inativa a enzima no escuro por alterar a afinidade da enzima
19
pelo substrato e efetores (McMichael et al., 1993). Recentes evidências sugerem
que há um segundo sítio de regulação por fosforilação na serina 424, altamente
conservado entre as espécies, assim como a serina 158. A fosforilação da serina
424 ativa a enzima em resposta a estresse osmótico nos tecidos foliares (Toreser &
Huber, 1997).
A clivagem reversível da sacarose é catalisada pela sintase da sacarose
(SuSy). A energia da hidrólise é conservada na ligação glicosídica da UDP-glicose
que constitui substrato para síntese da celulose e da calose ou ainda pode entrar na
via glicolítica pela ação combinada da UGPase e fosfoglicomutase. Em tecidos não
verdes a glicose-1 fosfato e glicose 6-fosfato são as hexoses fosfatos, geralmente
envolvidas na síntese de amido (Winter & Huber, 2000).
(1)
Sacarose + UDP
(2)
UDP-glicose + PPi
SuSy
UGPase
UDP-glicose + frutose
UTP + glicose-1 fosfato
fosfoglicomutase
(3)
glicose-1 fosfato
glicose-6 fosfato
Tanto monocotiledôneas quanto dicotiledôneas possuem pelo menos duas
isoformas da enzima SuSy. No entanto, nas leguminosas, SuSy possui apenas uma
isoforma. As isoenzimas exibem diferente expressão espacial e temporal e sofrem
regulação diferenciada no nível transcricional e traducional, o que pode ser
relacionado com importante papel no metabolismo da planta (Winter & Huber, 2000).
As invertases são grupos de β-frutosidases que diferem quanto à solubilidade,
localização e pH ótimo para sua atividade. As invertases são classificadas em: (1)
invertase ácida solúvel encontrada no vacúolo; (2) invertase ácida insolúvel
associada à parede celular e (3) invertase alcalina/neutra encontrada no citosol. As
invertases ácidas vacuolares clivam sacarose nos eventos que requerem demanda
aumentada da hidrólise da sacarose como expansão celular. As invertases solúveis
alcalinas/neutras são importantes na quebra de sacarose quando as atividades das
invertases ácidas estão baixas. Como as invertases ácidas de parede celular podem
promover gradiente de sacarose nos tecidos fontes e drenos, provavelmente, este
tipo de invertase está envolvido nas relações que definem tecido fonte e tecido
dreno (Winter & Huber, 2000).
20
Plantas são maquinarias fotoautotróficas que coordenam a fixação de
carbono da fotossíntese com sua utilização, mobilização e distribuição em vários
tecidos e em diferentes estágios do desenvolvimento. Assim, os genes que
codificam proteínas envolvidas nestes processos são altamente regulados por
açúcares. Evidências indicam que açúcares afetam a expressão de genes
relacionados a fotossíntese, metabolismo do glioxilato, glicólise, metabolismo de
sacarose, nitrogênio e amido, regulação do ciclo celular e mecanismos de defesa
(Koch, 1996). Altos níveis de açúcares reprimem a expressão de genes
responsáveis por rotas anabólicas de carboidratos e induzem genes envolvidos no
armazenamento e utilização dos mesmos. Conseqüentemente, a depleção de
açúcares exerce o efeito oposto (Jang & Sheen, 1997).
Glicose e sacarose têm sido mostradas como importantes moléculas
sinalizadoras em plantas. Entretanto, genes que são regulados por sacarose são
também regulados por glicose e frutose, levando à hipótese de que estas últimas
podem atuar como moléculas sinalizadoras diretas. É provável que a sacarose seja
convertida a uma hexose, antes de se tornar um sinal (Jang & Sheen, 1997).
Os mecanismos de sensibilidade a açúcares em plantas, ainda, são pouco
entedidos, mas ao que tudo indica, as hexoquinases estão envolvidas (Smeekens,
2000). Estudos com plantas transgênicas de Arabidopsis com alterados níveis de
hexoquinase ou expressando hexoquinase de levedura indicam a existência de três
vias de sinalização envolvendo glicose que seriam: uma via independente de
hexoquinase, uma via dependente de hexoquinase e do metabolismo da glicose
(alteração da taxa de ATP/AMP ou concentrações de fosfato no citosol resultante da
atividade da hexoquinase) e uma terceira via dependente de hexoquinase e
independente do metabolismo de glicose. Interessantemente, a repressão de genes
relacionados à fotossíntese e ativação dos genes relacionados à patogenicidade têm
sido observadas como conseqüência de todas as diferentes vias de sinalização por
glicose (Shen et. al., 1999). As frutoquinases também estão envolvidas na regulação
metabólica sinalizada por açúcares, e apresentam expressão diferencial: a do tipo 1,
por exemplo, é encontrada nos tecidos fontes de açúcares e a do tipo 2, em tecidos
drenos (Pego & Smeekens, 2000).
Análises genéticas e fenotípicas de mutantes de Arabidopsis, na sinalização
por açúcares, têm revelado interações complexas entre sinalização por açúcares e
as cascatas de sinalização por hormônios (Leon & Sheenm 2003). A sinalização por
21
glicose interage com a via do etileno, de maneira antagônica, como tem sido
evidenciado pelos estudos com mutantes gin 1 (insensível à glicose) e mutantes ein1
(insensível ao etileno). Segundo o modelo para interação de açúcares e hormônios
na regulação de crescimento da plântula de Arabidopsis, proposto por Gazzarrini &
McCourt (2001), a plântula no estágio 1 do desenvolvimento seria altamente sensível
a ABA. No estágio 1, o carbono requerido para o desenvolvimento da plântula é
fornecido pelo catabolismo de lipídeos e proteínas armazenados no embrião.
Quando
o
desenvolvimento
está
no
nível
2,
ou
seja,
a
plântula
está
fotossinteticamente independente, a sensibilidade para ABA diminui. Aplicações
exógenas de açúcares, em concentrações elevadas (não fisiológicas), resultam em
um aumento nos níveis endógenos de ABA. Entretanto, o efeito de ABA depende do
estado do desenvolvimento da plântula: no estado 1, ABA inibe o desenvolvimento e
no 2 tem pouco efeito sobre o desenvolvimento. A sinalização para altas
concentrações de açúcar é negativamente regulada por etileno através da
modulação negativa da sinalização por ABA (Gazzarrini & McCourt, 2001).
1.6 – GERMINAÇÃO E DESENVOLVIMENTO DA PLÂNTULA
A germinação é um processo fisiológico que tem seu início com a captação de
água pela semente quiescente e termina quando ocorre o alongamento do eixo
embrionário. Eventos subseqüentes à emersão da radícula, incluindo a mobilização
das reservas, são associados ao desenvolvimento da plântula (Bewley, 1997;
Bewley & Black, 1994).
O início do alongamento da radícula é determinado por três possíveis fatores.
O primeiro seria redução do potencial osmótico que ocorre em função do aumento
da concentração do soluto proveniente da hidrólise de polímeros de reserva. A
redução do potencial osmótico promoveria um aumento da captação da água e
dessa forma o aumento da pressão de turgor (Welbaum & Bradford, 1990). O
relaxamento da parede celular constitui o segundo fator. Possivelmente xiloglicanoendotransglicosilases e expansinas estão envolvidas neste processo de relaxamento
da parede celular. A atuação de xiloglicano-endotransglicosilases possibilitaria a
extensão da parede, já que catalisam a clivagem reversível de moléculas de
xiloglicanos, responsáveis pela ligação das microfibrilas de celulose (Wu et al.,
1994). Expansinas rompem pontes de hidrogênio entre os polímeros da parede
22
celular (McQueen-Mason & Cosgrove, 1995). O último fator seria o enfraquecimento
de estruturas adjacentes à ponta da radícula o que permitiria a sua passagem
(Watkins & Cantliffe,1983).
Sob condições ótimas, a absorção de água pela semente é trifásica. No
primeiro momento, ocorre captação rápida de água devido ao alto potencial mátrico,
isto é, habilidade de ligar a água em função da hidratação da parede celular, amido
e corpos protéicos. Na segunda fase, a absorção de água estabiliza e a massa
fresca da semente permanece constante. A segunda fase é conseqüência do
balanço entre o potencial osmótico e o potencial de pressão (pressão exercida sobre
a parede celular decorrente da entrada da água). A última fase é caracterizada pela
rápida absorção e tem seu início com emersão da radícula, ou seja, com o fim da
germinação. Nesse momento, a absorção de água é dirigida pelo potencial osmótico
(Bewley & Black, 1994).
As estruturas e enzimas necessárias para reiniciar a atividade metabólica
durante a germinação estão presentes na semente seca e foram sintetizadas
durante o processo de maturação da semente. A reintrodução de água é suficiente
para retomada do metabolismo. Inicialmente, observa-se um aumento no consumo
de oxigênio, atribuído em parte à ativação e hidratação das enzimas mitocondriais
envolvidas no ciclo do ácido cítrico e na cadeia transportadora de elétrons. Após a
hidratação da semente, o consumo de oxigênio é estabilizado ou quase não se
eleva, aumentando somente após alongamento da radícula. Nessa fase estacionária
da respiração, provavelmente há pouco aumento das enzimas da respiração e do
número de mitocôndrias. Tecidos de sementes secas contêm mitocôndrias pouco
diferenciadas (Attuci et al., 1991, Ehrenshaft & Brambl, 1990). Dois padrões de
desenvolvimento de mitocôndrias são observados, nos tecidos de armazenamento,
durante a germinação de sementes. No grupo de sementes armazenadoras de
amido há, predominantemente, reparo e ativação de organelas pré-existentes
(Morohashi et al., 1980). Enquanto, nas sementes armazenadoras de gordura,
observam-se síntese de novas mitocôndrias (Morohashi et al., 1981). Em
conseqüência da deficiência interna de oxigênio provocada pelas estruturas ao redor
da semente (testa) e da densidade interna dos tecidos que limitam a difusão dos
gases, sementes em germinação freqüentemente produzem etanol (Morohashi &
Shimokoriyama, 1972 citado por Bewley, 1997).
23
A maquinaria para síntese de proteínas também está presente nas sementes
secas. Após a rehidratação da semente observa-se o recrutamento de ribossomos
isolados para formarem complexos polissomais sintetizadores de proteínas
(Dommes & Van de Walle, 1990). RNAm(s) presentes no embrião seco podem ser
utilizados transitoriamente durante o início da germinação (Lane, 1991). Com o
decorrer do tempo, a síntese de proteínas torna-se mais dependente da síntese de
novos transcritos (Sanchez-Martinez et al., 1986, Bewley & Marcus, 1990). No
decorrer da germinação, ocorre reparo de DNA danificado durante o processo de
desidratação da semente. A síntese de DNA é um evento pós germinativo (Osborne
& Boubriak, 1994).
O primeiro sinal que a germinação se completou é o aumento da massa
fresca e comprimento da radícula. Após a emersão da radícula ocorre um aumento
rápido no consumo de oxigênio em decorrência do aumento de enzimas respiratórias
e mitocôndrias recém sintetizadas durante a proliferação celular. A síntese de DNA
está associada aos eventos de divisão celular durante o crescimento do eixo
embrionário. O desenvolvimento da plântula pode ser dividido em dois tipos segundo
as características dos cotilédones pós-germinação: (1) epigeal – os cotilédones são
suspensos em decorrência da extensão do hipocótilo e torna-se foliado e
fotossintetizante.
(2) hipogeal – o hipocótilo permanece curto e compacto e os
cotilédones permanecem abaixo do solo. O epicótilo se expande para elevar as
primeiras folhas verdadeiras. Plântulas de Phaseolus vulgaris tem desenvolvimento
epigeal (Bewley & Black, 1994).
A mobilização de reservas nos tecidos de armazenamento é um evento pósgerminativo; no entanto, no eixo embrionário, pode ocorrer antes do final da
germinação. As reservas contidas no eixo embrionário são geralmente presentes em
pequenas quantidades, mas são importantíssimas para o desenvolvimento inicial da
plântula. As reservas nos tecidos de armazenamento estão na forma de polímeros
de alto peso molecular que são hidrolisados e convertidos em formas facilmente
transportáveis para os tecidos em crescimento ou com metabolismo acelerado.
Estudos da mobilização de reservas em sementes de ervilha, uma leguminosa não
endospermática, mostraram que carboidratos, proteínas e triacilgliceróis presentes
na radícula, e sacarose, rafinose e estaquiose são os substratos para respiração nos
estágios iniciais do desenvolvimento da plântula. Para o desenvolvimento posterior
da raiz e ramos é necessária a hidrólise de reservas dos cotilédones e transporte
24
dos produtos para o eixo em crescimento. Assim os açúcares livres e dextrinas
liberados da hidrólise do amido são rapidamente translocados para o eixo em
crescimento já que não é observado acúmulo destes açúcares nos cotilédones. A
atividade da fosforilase do amido nos cotilédones produz glicose 1-fosfato que pode
reagir com UTP para formar UDP-glicose e então ser convertida em sacarose pela
sintase da sacarose fosfato e fosfatase da sacarose. Esse açúcar provavelmente é
transportado para o eixo embrionário em desenvolvimento, onde estão presentes
enzimas de hidrólise (Bewley & Black, 1994).
A germinação é um processo complexo que é controlado por fatores externos
(luz, umidade, temperatura) e por reguladores internos (ácido abscíssico e
giberelinas). O ácido abscíssico está envolvido no estabelecimento e manutenção da
dormência enquanto as giberelinas estão relacionadas à indução da germinação. As
giberelinas induzem a expressão de genes cujo produtos são responsáveis pela
mobilização de reservas (Bewley, 1997, Peng & Harberd, 2002).
1.7
–
INSULINA
PODERIA
ATUAR
COMO
HORMÔNIO
EM
PLANTAS?
Por muito tempo, atribuiu-se o papel de sinalização nos processos de
crescimento e desenvolvimento de plantas a seis hormônios não protéicos. Tais
hormônios são identificados como auxina, citocinina, etileno, giberelinas, ácido
abscísico, brassinosteróides.
Auxina é um dos mais importantes hormônios de plantas e a forma primária
presente na maioria das plantas foi caracterizada como o ácido 3-indol acético. Este
hormônio é responsável pelo controle de diversos processos fisiológicos de planta,
entre eles: divisão celular, crescimento celular por expansão, diferenciação da raiz e
resposta da raiz à gravidade (Kulaeva & Prokoptseva, 2004).
Citocininas têm importantes funções nos processos fisiológicos e no
desenvolvimento das plantas, tais como: divisão celular, regulação do crescimento
da raiz e broto, desenvolvimento de cloroplastos, senescência da folha e resistência
a patógeno. As citocininas são percebidas e transmitidas por um sistema com várias
etapas de fosforilação (Kulaeva & Prokoptseva, 2004; Heyl & Schmülling, 2003).
As giberelinas ativas (GA), ácidos carboxílicos diterpenóides, são hormônios
com importantes funções na modulação de diversos processos durante o
25
desenvolvimento da planta. GAs promovem crescimento de folhas e caules. Em
algumas espécies, GAs induzem germinação e regulam o tempo do florescimento e
do desenvolvimento das flores, frutos e sementes. A via de transdução das
giberelinas promove alterações na expressão gênica e morfologia da planta (Sun &
Gubler, 2004, Olszewski et al., 2002).
Ácido abscísico (ABA) tem importante papel em diversos aspectos do
crescimento e desenvolvimento da planta. ABA regula o depósito de reservas
durante o desenvolvimento da semente, controla a fase de desidratação da
embriogênese e maturação da semente. ABA também está envolvido nos processos
de dormência, fechamento dos estômatos e respostas a estresse hídrico, salinidade
e frio. Algumas das respostas mediadas por ABA são rápidas e envolvem
modificações do fluxo de íons, enquanto outras são demoradas e relacionadas à
mudança na expressão gênica (Kulaeva & Prokoptseva, 2004).
A sinalização de ABA interage com diversas vias de sinalização em plantas
através de mediadores. Alguns desses mediadores têm sido determinados
geneticamente e consistem em proteínas quinases e fatores de transcrição que
podem regular a atividade de várias proteínas e genes (Finkelstein & Gibson, 2001).
A tabela 1 apresenta um resumo dos processos fisiológicos de plantas e a forma de
regulação por ABA e outros sinalizadores.
Os brassinosteróides são esteróis de plantas que desempenham diversos
efeitos como expansão das células adaxiais da junta entre a lâmina foliar e bainha
da plântula de arroz, estimulação do alongamento do segundo e terceiro internodo
do caule do feijão, diferenciação vascular e reorientação de microtúbulos (Bishop &
Koncz, 2002, Crozier et al., 2000).
Etileno está relacionado à regulação de vários processos fisiológicos,
variando desde amadurecimento de fruto e senescência de folha à resposta ao
estresse biótico e abiótico. Um efeito do etileno no crescimento da planta, muito
conhecido, é a resposta tripla de plântulas etioladas de dicotiledôneas. A resposta
tripla consiste na inibição do hipocótilo e alongamento celular da raiz, aumento radial
do hipocótilo e curvatura exagerada apical (Gazzarrini & McCourt, 2001; Guo &
Ecker, 2004).
26
Tabela 1: Processos fisiológicos de plantas e a forma de regulação por ABA e outros
sinalizadores (Finkelstein & Gibson, 2001).
Processos
Açúcares e seus Efeitos do ABA
fisiológicos
efeitos
Divisão celular na Glicose promove
fase de embrião
Bloqueia
Sacarose inibe
G/S
a
Outros sinalizadores
fase Giberelinas, auxinas
e
citocinas
promovem divisão.
Armazenamento
Sacarose promove
Promove
Genes reguladores
de reservas em
FUS
e
sementes
(cotilédones
LEC
foliares) promovem
Baixa
Germinação:
emergência
glicose
e Inibe
da sacarose revertem
Giberelinas, etileno,
brassinosteróides e
radícula
inibição por ABA
Germinação:
Glicose e sacarose Acentua a inibição Giberelinas
mobilização
luz promovem.
de inibem a expressão da expressão das promovem
reservas (síntese do
de amilases)
gene
da
a
α- α-amilase de arroz, expressão do gene
amilase 1A e do promovida
pelos da α-amilase 1A e
gene da α-amilase açúcares.
não tem efeito sobre
3D do arroz.
a
expressão
do
gene da α-amilase
3D do arroz.
Desenvolvimento
Altas
da plântula
concentrações
Inibe
de
Etileno
diminui
sensibilidade
glicose e sacarose
açúcares.
inibem.
Tuberização
Sacarose promove
Promove
Giberelinas inibem.
a
a
27
Diversos trabalhos indicam que as poliaminas, em plantas superiores, estão
envolvidas na regulação do crescimento e desenvolvimento e em resposta a
estresse (Evans & Malmberg, 1989; Kumar et al., 1997).
Embora não haja dúvidas sobre a importância das moléculas sinalizadoras
citadas acima, extensivos estudos genéticos e bioquímicos, realizados na década de
90 do século passado, têm demonstrado a importância de alguns peptídeos nos
sistemas de sinalização nos vegetais durante o crescimento e desenvolvimento,
incluindo regulação dos mecanismos de defesa em resposta a pestes, controle de
divisão e expansão celular, determinação de incompatibilidade à auto-polinização.
Atualmente, são reconhecidos cinco principais peptídeos sinalizadores em plantas:
sisteminas; PSK (fitossulfocinas); ENOD40 (fator de nodulação); CLV3 (clavata 3) e
SCR (proteína rica em cisteína do locus S) (Frassen & Bisseling, 2001), os quais
descreveremos resumidamente a seguir.
A sistemina, o primeiro peptídeo sinalizador identificado em plantas, foi
isolada de folhas feridas de tomate e foi capaz de induzir a expressão de genes
codificadores de diversas proteínas de defesa, incluindo inibidores de proteases. O
emprego de sistemina marcada radioativamente mostrou que este peptídeo se move
do sítio de ferida para outro sítio distante e também induz a expressão de inibidores
de proteases, isto é, confere resposta sistêmica à ferida (Pearce et al., 1991).
Scheer & Ryan (1999) purificaram um receptor para sistemina de 160 kDa, SR 160,
da membrana plasmática de tomate, sendo caracterizado como receptor do tipo
quinase rico em leucina.
Recentemente, dois peptídeos do tipo sistemina foram extraídos de folhas de
tabaco, Tob Sys I e Tob Sys II. Embora os dois peptídeos contenham 18
aminoácidos e induzam a expressão de inibidores de tripsina e proteína quinase
ativada por mitógeno de 48 kDa, a seqüência destes dois peptídeos é muito distinta
da sistemina (Pearce et al., 2001a). Durante a purificação de Tob Sys I e Tob Sys II,
RALF (fator de alcalinização rápida) foi identificado como um peptídeo do tipo
sistemina por induzir alcalinização do meio e estimular a atividade da proteína
quinase ativada por mitógeno. Diferente de Tob Sys I e Tob Sys II, RALF não induz a
expressão de inibidores de proteases. RALF é ativo em quantidades que variam de
nano a micromolar e sua aplicação exógena inibiu o crescimento da raiz e formação
de pêlos radiculares (Pearce et al., 2001b).
28
Dois fatores promotores de crescimento celular, denominados fitossulfocinas
(PSK-α e PSK-β) foram isolados de suspensão de Aspargus officinalis. PSK-α e
PSK-β são pequenos peptídeos sulfatados, constituídos, respectivamente, por 5 e 4
aminoácidos. PSK-β provavelmente é um produto de hidrólise do PSK-α, pois
apresentam a mesma seqüência diferindo somente no número de aminoácidos.
Fitossulfocinas foram identificadas em outras espécies de plantas, além do Aspargus
e são funcionalmente semelhantes às PSK-α e PSK-β. As fitossulfocinas estimulam
a proliferação de culturas de células de baixa densidade, em concentrações
nanomolares, e estimularam outros eventos, incluindo, a diferenciação dos
elementos traqueóides. Como as sisteminas, as fitossulfocinas são resultantes do
processamento de polipeptídeos precursores maiores (Matsubayashi & Sakagami,
1996; Yang et al., 2000).
O gene de nodulação recente (ENOD40) é expresso nos nódulos recém
formados no córtex da raiz de leguminosas após infecção por rizóbios simbiônticos.
O gene ENOD40 é encontrado em plantas leguminosas e não leguminosas e
codifica um curto mRNA que não contém ORF (quadro de iniciação de leitura), mas
tem duas regiões conservadas. A região I, próxima ao 5’ terminal codifica 10-13
aminoácidos e a região II, próxima ao 3’ terminal é codificadora de 27 aminoácidos.
O ENOD40 induziu divisão celular no córtex interno da raiz de alfafa (Crespi et al.,
1994; Sousa et al., 2001).
O meristema do caule é conhecido por ter duas regiões: uma zona central
contendo células meristemáticas no estado indiferenciado e uma zona periférica,
onde as células entram em processo de diferenciação. O desenvolvimento do
meristema do caule, em Arabidopsis, está sob regulação dos genes CLAVATA1 e
CLAVATA3. O locus CLAVATA promove diferenciação das células meristemáticas e
restrição à proliferação de células no centro do meristema. CLV1 codifica um
receptor do tipo serina/treonina quinase (RLK). CLV2 codifica uma proteína do tipo
receptor similar à codificada por CLV1, mas faltando o domínio quinase. CLV3
codifica uma proteína de aproximadamente 9kDa. Estudos bioquímicos demonstram
que CLV1 existe na forma de dois complexos, um de 185 kDa e outro de 450 kDa. O
complexo de 185 kDa consiste no heterodímero de CLV1 e CLV2 ligados por ponte
dissulfeto. O complexo de 450 kDa contém, além do dímero CLV1 e CLV2, uma
proteína relacionada a GTPase Rho (Rop) e a uma proteína fosfatase (KAPP). É
postulado que CLV3 seja secretado pelas células apicais e interaja com CLV1 e
29
CLV2 nas células inferiores para induzir a autofosforilação de CLV1 e subseqüente
formação do complexo de 450 kDa. A fosfatase KAPP promove desfosforilação de
CLV1, funcionando como regulador negativo da sinalização promovida por CLV1
(Clark, 2001; Trotochaud et al., 1999; Stone et al., 1998).
O sistema de auto-incompatibilidade de plantas com flores é um mecanismo
que garante a diversidade dentro da espécie, pois possibilita o reconhecimento e
rejeição de pólen de indivíduos próximos. A genética clássica revelou que o SI
(sistema de incompatibilidade) é controlado por um único locus multialélico
denominado
locus
da
esterilidade
(S-locus)
(Bateman,
1955
citado
por
Matsubayashi, 2003). Quando pólen e pistilo têm o mesmo alelo, interações
moleculares entre determinantes masculinos e femininos disparam uma resposta SI
que inibe o metabolismo e crescimento do grão de pólen (Kanno & Hinata, 1969). O
locus S de Brassica contém 03 genes altamente polimórficos: (1) o gene SRK que
codifica um receptor do tipo quinase serina/treonina com domínio extracelular
homólogo a SLG; (2) um gene codificador de uma glicoproteína do locus S (SLG); e
(3) o gene SP11/SCR que codifica um peptídeo de 8 aminoácidos chamado de
proteína 11 do locus S (SP11; também chamada de proteína rica em cisteína do
locus S - SCR). No sistema de incompatibilidade, os determinantes feminino e
masculino são, respectivamente, SRK e SP11/SCR. SLG tem a função de
intensificar o processo de reconhecimento (Schopfer et al., 1999; Shiba et al., 2001;
Takasaki et al., 2000).
Um grande número de informações na literatura científica sugere a ocorrência
de proteínas de plantas que são relacionadas à cascata de sinalização de insulina
de vertebrados (tabela 1) (Xavier-Filho et al., 2003). Esses dados associados a
recente descoberta de proteínas com seqüência homóloga a insulina em sementes
de Canavalia ensiformis, fruto de Vigna unguiculata e folhas de Bauhinia variegate
(Oliveira et al., 1999; Venâncio et al., 2003; Azevedo et al., 2003) e a observação
dos efeitos de aplicação exógena de insulina em processos vegetais por diversos
autores (Sánchez de Jiménez et al., 1999; Dinkova et al., 2000; García-Flores et al.,
2001; Goodman & Davis, 1993; Oliveira et al., 2004), nos levam a acreditar no
potencial sinalizador dessa molécula em plantas. Esse trabalho tem por objetivo
contribuir para esclarecimento das funções da insulina e a confirmação do seu papel
hormonal em plantas.
30
Tabela 2: Lista de proteínas associadas à sinalização de insulina encontradas em
vertebrados e plantas (Xavier-Filho et al., 2003).
Proteínas
Animais
Insulina
Plantas
+
+
insulina
+
+
Substrato do receptor de
+
+
Transportador de glicose
+
+
Quinase 3-fosfaditilinositol
+
+
Hexoquinase
+
+
Via da MAPK
+
+
TOR
+
+
Quinase S6 ribossomal
+
+
Receptor
de
(quinase tirosina)
insulina, proteínas IRS-1 e
IRS-2.
31
2 – OBJETIVOS
A insulina tem uma ampla distribuição filogenética e acreditamos que sua
função reguladora no metabolismo e proliferação celular seja conservada também
em plantas. Este trabalho tem a perspectiva de tentar elucidar esta questão e assim
pretendemos:
•
Quantificar o transporte de glicose marcada radioativamente em cultura de
células de fumo na presença e ausência de insulina comercial;
•
Avaliar o efeito da insulina e pinitol (mimetizador da insulina) sobre
desenvolvimento de plântula de Phaseolus vulgaris;
•
Avaliar o efeito da insulina sobre produção de etileno e CO2 por sementes
germinadas na presença e ausência de insulina;
•
Quantificar a concentração de glicose, frutose, sacarose e amido de sementes
de Phaseolus vulgaris germinadas na presença e ausência de insulina;
•
Quantificar atividades de enzimas relacionadas ao metabolismo de açúcares
(invertase, sintase da sacarose fosfato) de sementes de Phaseolus vulgaris
germinadas na presença e ausência de insulina;
•
Caracterizar moléculas do tipo insulina endógena no eixo embrionário de
Phaseolus vulgaris;
•
Testar a capacidade de ligação de moléculas do tipo insulina de Phaseolus
vulgaris a vicilinas.
32
3 – MATERIAIS
3.1 – MATERIAL BOTÂNICO
A planta de Phaseoluls vulgaris é originária das Américas onde foi
domesticada. Suas raízes apresentam crescimento primário e secundário, o caule é
herbáceo apresentando durante fase adulta seção transversal cilíndrica e levemente
angulosa, sendo constituído por nós e internódios intercalados, com números
variáveis e dependentes do hábito alimentar. Suas folhas são de dois tipos, as
simples e compostas. As folhas simples são as primeiras a serem formadas e caem,
antes do completo desenvolvimento da planta. Elas estão localizadas no segundo nó
do caule e são duas com filotaxia oposta. As folhas compostas são formadas por
estípulas, pecíolo, raque, peciólulo, pulvínulas e lâmina foliar composta. Suas flores
são papilionadas e o fruto é um legume, ou seja, é constituído por um carpelo seco,
deiscente, zigomorfo, geralmente alongado e comprimido com as sementes
dispostas em uma fileira central com deiscência na sutura dorsal e ventral (Santos e
Gavilanes , 1998).
As sementes de Phaseolus vulgaris L. cv. Carioca foram cedidas pelo Centro
de Ciências Tecnológicas Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte
Fluminense.
3.2 - REAGENTES
Os reagentes principais utilizados no trabalho são listados a seguir:
[U]14C-glicose
líquido de cintilação (Ready to use, Beckman)
insulina humana - Península
insulina bovina - Sigma
acrilamida – MERCK
bis-acrilamida – Sigma
glicose 6-fosfato - Sigma
Hepes - Sigma
Sacarose - Sigma
33
Acetato de sódio - Sigma
UDP glicose – Sigma
Glicose 6-fosfato desidrogenase – Sigma
NAD+ - Sigma
Frutose 6-fosfato – Sigma
Hexoquinase – Sigma
Fosfoglicoisomerase – Sigma
Invertase – Sigma
Kit de dosagem de amido – Sigma
Os demais reagentes empregados neste trabalho são de grau analítico e
foram adquiridos comercialmente.
3.3 - ANTICORPOS
Os anticorpos empregados neste trabalho foram adquiridos comercialmente,
como se segue:
IgG de “guinea pig” anti-insulina humana – Peninsula Laboratories
Anticorpo anti IgG de “guinea pig” complexado a peroxidase – Sigma
3.4 – EQUIPAMENTOS
Os equipamentos usados neste trabalho são relacionados a seguir:
Balança 2100S – Sartorius Basic
Balança 110S – Sartorius Basic
Agitador Mixer 5432 – Eppendorf
Mini centrífuga 5415C – Eppendorf
Fonte Pac 300 – BioRad
Sistema de Eletroforese – BioRad
Leitor de ELISA – BioRad
Espectrofotômetro UV mini 1240 - Shimadzu
34
4 – MÉTODOS
4.1 – CULTURA DE CÉLULAS DE TABACO
As células de cultura de tabaco em suspensão, fornecidas pela Universidade
Federal de Viçosa, foram mantidas em meio líquido NT-1 [sais MS 0,43% (p/v),
sacarose 3% (p/v), tiamina-HCl 0,0001% (p/v), inositol 0,01% (p/v), 2,4-D 0,2 mgL-1,
KH2PO4 1,32 mmol/L, pH 5,7]. Semanalmente foram feitas repicagens da suspensão
celular.
4.2 – EFEITOS DE INSULINA EXÓGENA NO TRANSPORTE DA
GLICOSE EM SUSPENSÃO DE CÉLULAS DE TABACO.
Insulina humana foi adicionada a uma suspensão de células (55 g), na
concentração de 2,0 μg/mL. Decorridas 12 horas, adicionaram-se 2 μL de [U]14Cglicose (0,8 uCi/mL). Com o objetivo de acompanhar o transporte de glicose para o
interior das células, alíquotas (10 mL) foram coletadas nos tempos 8, 16, 32, 46 e 60
horas e filtradas sob vácuo. As frações foram acrescentadas ao líquido de cintilação
(Ready to use, Beckman), agitadas vigorosamente num vortex e analisadas por
cintilografia. O controle consistia na suspensão de células não incubadas com
insulina.
4.3 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA GERMINAÇÃO DE
Phaseolus vulgaris.
Para este estudo, as sementes de Phaseolus vulgaris foram esterilizadas em
etanol 70% por um minuto, SDS 0,1% e hipoclorito 0,5% por 30 segundos e, em
seguida, lavadas cinco vezes com água destilada estéril (2 minutos cada). Em
seguida foram colocadas para germinar em placas de petri contendo algodão
embebido em solução aquosa de diferentes concentrações de insulina bovina: 0
μg/mL (controle); 0,036 μg/mL; 0,36 μg/mL; 0,9 μg/mL; 1,8 μg/mL; 3,6 μg/mL. As
sementes foram mantidas à temperatura ambiente. Após 72 horas, as sementes
foram dissecadas e as medidas de massa e comprimento de epicótilos e radículas
foram determinadas, assim como os números de raízes secundárias presentes nas
35
radículas. Neste trabalho, optamos por trabalhar com o tempo de 72 horas, pois,
neste estágio as plântulas têm as partes bem definidas e ainda não estão
fotossintetizantes. Cada experimento compreendia 10 sementes e foi repetido por 3
vezes (Sanches de Jiménez et al., 1999, Oliveira et al., 2004).
4.4 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA EMISSÃO DE ETILENO
DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris.
A emissão de etileno por um grupo de 30 sementes de P. vulgaris, embebidas
em água ou solução aquosa de insulina bovina (0,9 μg/mL), foi medida empregandose um espectrômetro fotoacústico. A diferença entre 10P14 (949.479 cm-1) e 10P12
(951.192 cm-1), as duas maiores linhas de absorção de etileno, foi utilizada na
determinação. As medidas foram feitas nos tempos de 0, 24, 48, 72 e 96 horas após
embebição e repetidas por 3 vezes.
4.5 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA EMISSÃO DE CO2
DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris.
O dióxido de carbono (CO2) emitido por um grupo de 30 sementes de P.
vulgaris, embebidas em água ou solução aquosa de insulina bovina (0,9 μg/mL), foi
medido, por um analisador infravermelho PA de gás – Hartmann & Braun URAS 14,
do início da embebição até as 96 horas. O experimento foi feito em triplicata.
4.6 – EXTRAÇÃO DE AÇÚCARES SOLÚVEIS E AMIDO
Os tecidos frescos das sementes (cotilédones, radículas e epicótilos) com 72
horas da embebição tratados (0,9 μg/mL) e não tratados com insulina bovina foram
triturados em nitrogênio líquido. 140 mg destes tecidos foram pesados em tubos
eppendorfs, e a estes foram adicionadas 400 μL de etanol 80 %, sendo o conteúdo
homogeneizado. Em seguida, foram adicionados mais 400 μL de etanol 80 % e a
mistura foi novamente homogeneizada. Os eppendorfs foram pesados antes de
serem incubados em banho-maria a 70 ºC por 90 minutos. Após o aquecimento a
massa foi restituída com etanol 80 % e os eppendorfs contendo a mistura foram
centrifugados a 12.000 x g, 4 ºC, por 15 minutos. O sobrenadante foi usado na
36
determinação de açúcares solúveis. Ao sedimento, acrescentaram-se 800 μL de
etanol 80 % e centrifugou-se a mistura por 10 minutos a 12.000 x g, 4 ºC. O
sobrenadante foi descartado e o sedimento mais uma vez foi lavado com 800 μL de
etanol 80 %. O sedimento foi ressuspenso com 400 μL de hidróxido de potássio 0,2
M, homogeneizado e incubado por 60 minutos a 95 ºC. Após o aquecimento, 70 μL
de ácido acético 1 M foram adicionados. Procedeu-se a última centrigação por 15
minutos a 12.000 x g, 4 ºC. O sobrenadante foi empregado para dosagem de amido
dos referidos tecidos. Três experimentos de germinação independentes foram
usados para o procedimento de extração para posterior dosagem de açúcares.
4.7 - EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA CONCENTRAÇÃO DE
AÇÚCARES
SOLÚVEIS
EM
EPICÓTILOS,
RADÍCULAS
E
COTILÉDONES DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris COM 72
HORAS DA EMBEBIÇÃO
Os teores de açúcares solúveis (glicose, frutose e sacarose) dos tecidos
(cotilédones, radículas e epicótilos) de sementes com 72 horas da embebição não
tratadas e tratadas com insulina bovina (0,9 μg/mL) foram determinados por
métodos enzimáticos, acompanhando aumentos de absorvâncias a 340 nm. A
glicose foi medida como descrito a seguir: 20 μL do material a ser dosado foram
transferidos para placas de cultura e adicionaram-se 260 μL de tampão A (Imidazol
100 mM pH 6,9, MgCl2 5 mM, NAD+ 2 mM, ATP 1mM, glicose 6-fosfato
desidrogenase 2U/mL). A absorvância da mistura foi determinada em leitor de ELISA
até estabilização dos valores. Adicionaram-se 5 μL de hexoquinase (1U/5 μL).
Procedeu-se a leitura das absorvâncias a 340 nm até estabilização dos valores, no
leitor de ELISA. O seguinte controle foi feito: (1) água mais tampão A e hexoquinase;
e (2) uma solução 100 μM de glicose. A diferença entre as leituras de absorvância
antes e após adição da hexoquinase foi usada nos cálculos da concentração de
glicose. Para determinação de frutose adicionaram-se à mistura anterior 5 μL de
fosfoglicoisomerase (10 U/mL) e a leitura foi realizada a 340 nm até estabilização da
mesma. Quando a sacarose foi dosada, adicionaram-se à mistura anterior 5 μL de
invertase (solução saturada em tampão A) e a absorvância a 340 nm foi
acompanhada até estabilização dos valores. As dosagens foram feitas em número
37
de três para cada extrato (três experimentos independentes). Assim foram obtidos
para cada tecido 9 valores.
4.8 - EFEITO DA INSULINA NA CONCENTRAÇÃO DE AMIDO DOS
EPICÓTILOS, RADÍCULAS E COTILÉDONES DE SEMENTES DE
Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO.
As concentrações de amido dos tecidos (cotilédones, radículas e epicótilos)
de sementes com 72 horas da embebição tratadas (0,9 μg/mL) e não tratadas com
insulina bovina foram determinadas por metodologia enzimática, com o emprego do
Kit de dosagem de amido da Sigma. Aos 25 μL do extrato obtido segundo
metodologia do ítem 3,6, foram adicionados 25 μL do reagente de ensaio de amido
que continha amiloglicosidase (50 U/mL) e sais. O primeiro controle consistiu em
misturar 25 μL do reagente de ensaio de amido com 25 μL de água miliQ. No
segundo controle só foram utilizados 50 μL de água miliQ. Para o controle da
amostra, 25 μL de cada extrato foram acrescidos de 25 μL de água miliQ. Soluções
de amido (6 mM e 30 mM) foram usadas para calibração. As misturas foram
incubadas por 15 minutos a 60 ºC. Uma alíquota de 20 μL dessas misturas foi
transferida para placas de cultura e adicionaram-se 100 μL do reagente de ensaio de
glicose que continha NAD+ 1,5 nM; ATP 1 mM; hexoquinase 1 U/mL e glicose 6fosfato desidrogenase 1 U/mL. Após 15 minutos, as absorvâncias foram lidas no
leitor de Elisa a 340 nm. As determinações foram feitas em triplicata para cada
extrato.
4.9 – EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS PARA DETERMINAÇÃO DE
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Os tecidos frescos das sementes com 72 horas a partir da embebição
tratados (0,9 μg/mL) e não tratados com insulina bovina foram macerados em
nitrogênio líquido e extraídos com tampão Hepes 100 mM pH 7,5, DTT 1mM, MgCl2
5mM. A proporção entre massa e volume de tampão foi 1:3 para extração de
cotilédones, epicótilos e radículas, e 1:9 para extração de tegumento. A mistura foi
centrifugada a 12.000 x g, 4 ºC, por 15 min e o sobrenadante utilizado para dosagem
38
da atividade de invertase e sintase da sacarose fosfato. Três experimentos
independentes de germinação foram utilizados para extração obtendo-se 03 extratos
de partidas diferentes. Em cada experimento foram extraídos os tecidos
mencionados acima. Assim os extratos de cada tecido eram em número de três.
4.10 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA ATIVIDADE DE
INVERTASE ÁCIDA EM EPICÓTILOS, RADÍCULAS, TEGUMENTOS E
COTILÉDONES DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris COM 72
HORAS DA EMBEBIÇÃO
A atividade do tipo invertase dos diferentes tecidos das sementes
(cotilédones, tegumentos, epicótilos e radículas) com 72 horas da embebição
tratados (0,9 μg/mL) e não tratados com insulina bovina foi quantificada num meio
reacional contendo 60 μL do extrato protéico em estudo (obtido conforme item 4.9),
20 μL de acetato 100 mM pH 4,7 e 20 μL de sacarose 500 mM. A reação se
processou por 60 minutos a 37 ºC. A glicose foi quantificada segundo método
descrito no ítem 3.7. Foram feitos 02 controles. O primeiro controle consistiu em 60
μL de água miliQ, 20 μL de acetato 0,1 M pH 4,7 e 20 μL de sacarose 500 mM. O
segundo controle continha 60 μL de extrato, 20 μL de água miliQ, 20 μL de acetato
0,1 M pH 4,7. Duas determinações da atividade enzimática foram procedidas para
cada extração que foram em número de 3, assim obtivemos no final 6 valores para
cada tecido (Geigenberger and Stitt, 1993).
4.11 – EFEITO DE INSULINA EXÓGENA NA ATIVIDADE DE SINTASE
DA
SACAROSE
FOSFATO
EM
EPICÓTILOS,
RADÍCULAS,
TEGUMENTOS E COTILÉDONES DE SEMENTES DE Phaseolus
vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO
A atividade da sintase da sacarose fosfato dos diferentes tecidos das
sementes (cotilédones, tegumentos, epicótilos e radículas) com 72 horas da
embebição tratados (0,9 μg/ml) e não tratados com insulina bovina foi medida pelo
método da antrona, conforme descrito por Huber & Huber, 1989. Volumes de 20 μL
de extrato protéico de cotilédones e epicótilos, e 40 μL de extrato protéico de
39
radículas e tegumentos foram ensaiados num volume reacional de 70 μL contendo
Hepes 7,1 mM pH 7,4, MgCl2 171 μM, frutose 6-fosfato 171 μM, glicose 6-fosfato 0,5
mM e UDP glicose 85,7 μM. A reação processou-se por 30 minutos a 25 ºC. Em
seguida, foram adicionados 70 μL de hidróxido de potássio 30 %. As amostras foram
aquecidas em banho a 100 ºC por 10 minutos e, posteriormente, centrifugadas por
18 segundos a 10.000 x g e, em seguida, resfriada em gelo. Adicionou-se 1mL do
reativo de antrona (0,14 % de antrona em ácido sulfúrico 85 %) e incubou-se a 40 ºC
por 20 minutos. A leitura da absorvância foi feita a 620 nm e os valores foram
comparados às absorvâncias da curva padrão de sacarose. Como controle, extratos
protéicos fervidos por 10 minutos foram incubados por 30 minutos a 25 ºC, em
Hepes 7,1 mM pH 7,4, MgCl2 171 μM e UDP glicose 85,7 μM e a seguir foi dosado
sacarose conforme descrito acima. Num segundo controle 70 μL de água miliQ foi
usada para dosar sacarose. Cada extrato foi dosado por duas vezes assim feitas 6
dosagens para cada tecido.
4.12 – EFEITO DE PINITOL NA GERMINAÇÃO DE Phaseolus
vulgaris
As sementes foram esterilizadas como descrito no item 4.3 e foram
germinadas nas seguintes concentrações de pinitol: 0 μg/mL (controle); 0,36 μg/mL;
0,9 μg/mL; 1,8 μg/mL; 3,6 μg/mL e 36 μg/mL. Os parâmetros medidos foram massa
e comprimento de radículas e epicótilos, e número de raízes secundárias das
radículas. Cada placa de Petri continha 10 sementes e cada experimento foi repetido
3 vezes.
4.13 - LIGAÇÃO DE INSULINA A VICILINA POR CROMATOGRAFIA
DE AFINIDADE.
Para preparação da coluna de afinidade, Sepharose 4B ativada com brometo
de cianogênio (2,5 g) foi embebida com bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0, NaCl 0,5
M. Exaustivas lavagens foram realizadas com este mesmo tampão, após as quais, a
resina foi ressuspensa em um volume deste tampão, suficiente para solubilizar 25
mg de vicilina de feijão-de-corda IT81D (preparada segundo Macedo et al., 1993). A
40
suspensão foi mantida a temperatura ambiente, sob agitação lenta, por 4 horas,
seguida de incubação a 4 ºC por 16 horas. Após decantação, o sobrenadante foi
descartado e adicionou-se tampão glicina 0,1 M pH 9,0 ao precipitado. O material foi
agitado lentamente por 3 horas e decantado posteriormente. Logo após o descarte
do segundo sobrenadante, foi adicionado ácido acético 0,1 M pH 3,0. O material foi
novamente decantado e procederam-se exaustivas lavagens com tampão
bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0, NaCl 0,5 M (Cua trecasas, 1970).
A coluna de vicilina acoplada a Sepharose 4B (1 mL) foi utilizada para testar a
capacidade de ligação de insulina à vicilina. Para verificar a eficiência deste
processo aplicamos 670 μg de insulina comercial bovina (Sigma) dissolvida no
tampão em bicarbonado de sódio pH 9,0 em diferentes concentrações de EDTA à
coluna de vicilina acoplada a Sepharose 4B. As condições de eluição também foram
variadas. Três diferentes condições cromatográficas foram testadas. Na primeira, a
insulina foi dissolvida em bicarbonato de sódio 0,1 M e NaCl 0,5 M pH 9,0, esse
mesmo tampão foi empregado para lavar a coluna. A eluição foi feita com ácido
acético 0,1 M pH 3,0. Na segunda condição cromatográfica testada, a insulina foi
dissolvida em bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0 com EDTA 5 mM que também foi
empregado para lavar a coluna. O material retido foi eluído primeiro com bicarbonato
de sódio 0,1 M pH 9,0, EDTA 5mM e NaCl 2 M e depois com ácido acético 0,1 M pH
3,0. No terceiro sistema testado, a insulina foi dissolvida em bicarbonato de sódio 0,1
M pH 9,0 com EDTA 20 mM, este mesmo tampão foi empregado para lavar a
coluna. A eluição foi precedida com bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 20 mM e
NaCl 2 M pH 9,0 e depois ácido acético 0,1 M pH 3,0. Os experimentos foram feitos
em duplicata.
4.14 – EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS DE EIXO EMBRIONÁRIO DE
Phaseolus vulgaris COM 48 HORAS DE GERMINAÇÃO
Os eixos embrionários com 48 horas de embebição em água foram
macerados em nitrogênio líquido e extraídos numa proporção de 1:5 com
bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0, EDTA 0,2 mM, triton X-100 0,1%, glicerol 10 %,
benzamidina 10mM e PMSF 2mM. O homogenato foi centrifugado a 27.000 x g por
30 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi submetido à cromatografia de afinidade em
coluna de vicilina acoplada à Sepharose 4B para isolamento de moléculas.
41
4.15 - SEPARAÇÃO DE MOLÉCULAS DO TIPO INSULINA DE
EXTRATO DE EIXO EMBRIONÁRIO DE Phaseolus vulgaris COM 48
HORAS DA EMBEBIÇÃO
Os extratos dos eixos embrionários de Phaseolus vulgaris com 48 horas de
embebição (65 mL) obtido segundo metodologia descrita no item 4.14 foi aplicado à
coluna de vicilina Sepharose 4B (1 mL) num fluxo de 30 mL/hora. Uma coluna
diferente da que foi usada para testar a ligação de insulina a vicilina foi empregada
para cromatografia de extratos dos eixos embrionários de Phaseolus vulgaris. A
coluna foi lavada com tampão bicarbonato de sódio 0,1 M pH 9,0, NaCl 0,5 M. O
material retido na coluna a partir dos extratos dos eixos embrionários foi eluído com
ácido acético 0,1 M pH 3,0.
4.16 - TESTE DIAGNÓSTICO DE INSULINA POR ELISA
Os picos retidos da insulina, dos extratos de eixos embrionários de Phaseolus
vulgaris foram analisados quanto a sua reatividade ao anticorpo anti-insulina
humana, por técnica de ELISA. Os materiais foram ressuspensos em tampão
carbonato/bicarbonato 0,05 M pH 9,6. A placa de ELISA foi sensibilizada por 16
horas com diferentes amostras. Após este período, descartaram-se os extratos e a
placa foi lavada 03 vezes por 20 minutos com Tween-20 0,05% em tampão fosfato
0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M. Adicionaram-se aos poços 300 μL de tampão bloqueador
(gelatina 1%, Tween-20 0,05 % em tampão fosfato 0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M) por um
período de 1 hora. Lavou-se a placa 3 vezes por 20 minutos com Tween-20 0,05 %
em tampão fosfato 0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M e depois incubou-se com o anticorpo
anti-insulina humana, diluído na proporção de 1: 2.000 no tampão bloqueador, a 37
ºC, por um período de 45 minutos. Fizeram-se 03 lavagens, de 5 minutos cada, da
placa com Tween 0,05% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M. Incubou-se a
placa com o conjugado anti-IgG-peroxidase, diluído 1: 2.000 em tampão bloqueador,
a 37 ºC, por um período de 45 minutos. A placa foi mais uma vez lavada em tampão
fosfato 0,1 M pH 7,6 NaCl 0,5 M Tween-20 0,05 %, por 4 vezes, durante 5 minutos
cada lavagem. Adicionou-se o substrato (10 mg de orto-fenil-diamina dissolvido em
25 mL de tampão citrato 26 mM/fosfato 52 mM pH 5,0
com 10 μL de água
42
oxigenada) e deixou-se a placa no escuro por 10 minutos a temperatura ambiente. A
reação foi interrompida com a adição de 50 μL de ácido sulfúrico 3 N. Procedeu-se,
então a leitura das placas a 410 nm em leitor de ELISA. Uma curva com diferentes
concentrações de insulina bovina comercial foi elaborada para referência.
Considerou-se uma reação positiva a leitura maior do que a do controle, que
consistia do tampão de extração (carbonato/bicarbonato 0,05 M pH 9,6) (CainelliGebara et al, 1995).
4.17 – VISUALIZAÇÃO EM GEL DE POLIACRILAMIDA SOB
CONDIÇÕES DESNATURANTES DE PROTEÍNAS
Os procedimentos eletroforéticos foram realizados segundo o método de
Laemmli (1970). O gel de concentração foi preparado a uma concentração de 3,75
% de acrilamida com SDS 10 % e Tris-HCl 1 M pH 6,8 e o de separação com
concentração de 15 % de acrilamida com SDS 10 % e Tris-HCl 1,5 M pH 8,8.
Amostras protéicas foram dissolvidas em tampão de amostra contendo SDS 4 %,
glicerol 12 %, Tris-HCl 50 mM pH 6,8 e azul de bromofenol 0,01 %. A corrente
utilizada foi de 15 mA. O gel foi revelado por nitrato de prata (Blum et al., 1987).
4.18 – LOCALIZAÇÃO DE INSULINA EM TECIDOS EMBRIONÁRIOS
DE Phaseolus vulgaris por IMUNOCITOQUÍMICA
Radículas e epicótilos de embrião de Phaseolus vulgaris com 48 horas de
embebição
em
água
foram
cortados
e
fixados
em
glutaraldeído
0,1%,
paraformaldeído 4% em tampão cacodilato de sódio 0,05 M pH 7,0. A desidratação
processou-se com metanol 50 % (trinta minutos), 70 % (uma hora) e 90 % (uma
hora). Depois desta etapa, o material foi incluído em resina LR Gold,
seqüencialmente, em 50 % de metanol e 50 % de LR Gold (dezoito horas); 30% de
metanol e 70 % de LR Gold (dezoito horas), 100 % de LR Gold (quatro dias), 100 %
de LR Gold e catalisadores (dez horas). Os catalisadores são benzil e peróxido de
benzoil. A polimerização da resina ocorre sob baixa temperatura e incidência de luz
visível.
Cortes de aproximadamente 60 nm foram obtidos em ultramicrótomo Reichert
Ultracuts e coletados em grades de níquel forradas com filme “formvar”. Os cortes
43
foram incubados com cloreto de amônio 50 mM por duas horas, seguido de bloqueio
com PBS (10 mM de fosfato de sódio pH 7,4, 0,15 M de NaCl) contendo 1% de BSA
(tampão bloqueador) por duas horas. Em seguida, os cortes foram incubados com
anticorpo anti-insulina humana produzido em “guinea pig”, diluído1:100 em tampão
bloqueador, por duas horas. Os cortes foram lavados quatro vezes com tampão de
bloqueio e seis vezes com tampão PBS (com intervalos de cinco minutos entre as
lavagens). A próxima etapa foi incubar as lâminas com anti-IgG de cobaia conjugado
a partículas de ouro coloidal 10 nm, numa diluição 1:200, em tampão bloqueador,
por duas horas. Seguiram-se quatro lavagens com tampão bloqueador e seis vezes
com tampão PBS (com intervalos de cinco minutos entre as lavagens). Os cortes
controle não foram incubados com anticorpo anti-insulina humana. Os cortes foram
contrastados com acetato de uranila e citrato de chumbo, e analisados ao
microscópio de transmissão Omega 900 da Zeiss operado em 80KV.
44
5 – RESULTADOS
5.1 – EFEITOS DE ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NO
TRANSPORTE DA GLICOSE EM CÉLULAS DE TABACO
A insulina comercial humana quando adicionada a células de tabaco em
suspensão aumentou o transporte de glicose para o interior celular. Como podemos
visualizar na figura 6, a partir do tempo de 16 horas a quantidade de glicose
radioativa é bem maior nas células tratadas com insulina do que nas não tratadas. O
efeito máximo da insulina no transporte de glicose para o interior da célula foi
observado no tempo de 16 horas, e a quantidade de glicose nas células tratadas
com insulina foi aproximadamente 17 vezes maior do que nas células não tratadas.
As contagens de cintilações por minuto (cpm) nas células tratadas com insulina nos
tempos de 32, 46 e 60 horas foram respectivamente 11, 9 e 7 vezes maiores do que
as das células controles.
45
25000
CPM
20000
*
*
*
15000
*
10000
5000
0
8
16
32
controle
46
Insulina (2,0 ug/ml)
60
horas
Figura 6 – Efeito da Insulina na absorção de glicose. * Amostras
estatisticamente diferentes (Teste T - P ≤ 0.05). As colunas representam a
média de três experimentos e as barras indicam o desvio padrão.
46
5.2 – EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA
GERMINAÇÃO DE Phaseolus vulgaris
Insulina adicionada ao meio de germinação estimulou o crescimento do eixo
embrionário de Phaseolus vulgaris conforme podemos visualizar na figura 7. A figura
7 A apresenta o tamanho das radículas de eixo embrionário de sementes com 72
horas da embebição, germinadas em presença de diferentes concentrações de
insulina bovina. O maior aumento no tamanho das radículas em torno de 19 % foi
observado quando as sementes germinaram em meio contendo de 0,036 μg/mL a
1,8 μg/mL de insulina. O menor aumento no tamanho das radículas foi de 11 % em
meio contendo uma concentração de 3,6 μg/mL. Os epicótilos de sementes tratadas
com insulina foram significativamente maiores que as não tratadas conforme
podemos observar na figura 7 B. O maior aumento no tamanho dos epicótilos foi
observado na concentração de 0,9 μg/mL, tendo sido na ordem de 41 %. Já o menor
aumento (12%) foi observado na concentração de 3,6 μg/mL. As massas, tanto de
radículas (Figura 7 C) quanto de epicótilos (Figura 7 D), foram estatisticamente
maiores nas sementes germinadas na presença de insulina. As taxas de aumento
nas massas das radículas variaram de 25 % (3,6 μg/mL) a 74 % (0,036 μg/mL).
Insulina na concentração de 0,9 μg/mL aumentou em cerca de duas vezes a massa
dos epicótilos. O aumento nas massas dos epicótilos promovido pela insulina na
concentração 3,6 μg/mL foi menor (1,4 vez) do que nas demais concentrações de
insulina, o que nos indica que este hormônio em concentrações elevadas reduz seu
efeito
promotor
do
crescimento.
A
insulina
nas
diferentes
concentrações
empregadas, aproximadamente dobrou o número de raízes laterais (Figura 7 E).
a
a
b
0.036
0.36
0.9
1.8
3.6
insulina (ug/mL)
A
radícula (mg)
b
2
0
a
100
b
a
b
c
50
0
0
0.036
0.36
0.9
1.8
3.6
insulina (ug/mL)
8
a
ab
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
a
a
bc
b
d
a
b
c
1.8
3.6
b
0
0.036
B
d
C
raízes laterais(nº)
a
4
0
E
a
epicótilo (cm)
c
6
0.36
0.9
insulina (ug/mL)
epicótilo (mg)
radícula (cm)
47
D
15
a
10
a
b
b
c
d
5
0
0
0.036
0.36
0.9
1.8
3.6
insulina (ug/mL)
c
6
d
4
2
0
0
0.036
0.36
0.9
1.8
3.6
insulina (ug/mL)
Figura 7 – Efeito de insulina no comprimento de radículas (A) e epicótilos (B),
na massa de radículas (C) e epicótilos (D) e no número de raízes laterais (E) de
eixos embrionários de Phaseolus vulgaris, com 72 horas de embebição. As
colunas indicam a média de três resultados e as barras representam o desvio
padrão. As médias com mesma letra não são estatisticamente diferentes (Teste
de Duncan - P ≤ 0.05).
48
5.3 – EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA
EMISSÃO DE ETILENO DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES
DE Phaseolus vulgaris.
Conforme podemos observar na figura 8 a insulina reduziu a emissão de
etileno na ordem de 8 % (±8), 25% (±10) e 38 % (±4) nos tempos de 48, 72 e 96
horas, respectivamente. Dado o grande desvio no tempo de 48 horas
consideraremos uma redução efetiva na emissão de etileno nos tempos de 72 horas
e 96 horas. O comportamento de redução na emissão de etileno nos tempos de 72
horas e 96 horas foi característico para os três experimentos. No tempo de 72 horas,
as sementes germinadas na presença de insulina produziram menos etileno do que
sementes germinadas na ausência de insulina, tendo sido a redução da ordem de
16, 24 e 37 %, nos três experimentos independes enquanto no tempo de 96 horas
as reduções foram da ordem de 34, 41 e 38 %.
5.4 - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA
EMISSÃO DE CO2 DURANTE A GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE
Phaseolus vulgaris.
Nossos resultados sugerem que insulina aumenta a taxa de respiração das
sementes ao longo do desenvolvimento do eixo epicótilo-radícula. A figura 9
apresenta a taxa de emissão de CO2 de sementes tratadas com insulina e não
tratadas.
49
% de redução da emissão de etileno
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
48
72
96
tempo (horas)
Figura 8 – Efeito da administração de insulina exógena na emissão de etileno
durante a germinação de sementes de
Phaseolus vulgaris. A coluna
representa a média da redução da taxa de emissão de etileno de três
experimentos. As barras indicam o desvio padrão.
50
B
3,0
Água
Water
Aqueous
Insulina (0,9solution
ugmL) of insulin
-1
-1
Respiration Rate ( μL.g .h )
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
20
40
60
( hours
TempoTime
(horas)
80
100
)
Figura 9 – Efeito da administração de insulina exógena na emissão de CO2
durante a germinação de sementes de Phaseolus vulgaris. O experimento foi
feito em triplicata cujos perfis foram similares. O gráfico representa um
experimento.
51
5.5 - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA
CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCARES SOLÚVEIS DE SEMENTES DE
Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO.
Os níveis de glicose, frutose e sacarose de cotilédones, epicótilos e radículas
provenientes de sementes com 72 horas da embebição em presença de insulina
bovina (0,9 μg/mL) ou de água são apresentados na figura 7. Os níveis de glicose e
frutose nos três tecidos analisados das sementes tratadas com insulina não foram
estatisticamente diferentes dos níveis desses açúcares em sementes não tratadas
com insulina. Na presença deste hormõnio, somente a concentração de sacarose foi
alterada; reduções da ordem de 11, 19 e 40 % foram observados em cotilédones,
radículas e epicótilos, respectivamente (Figura 10).
5.6 - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA
CONCENTRAÇÃO DE AMIDO DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris
COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO.
As concentrações de amido nos cotilédones e epicótilos de sementes
embebidas em solução aquosa de insulina bovina (0,9 μg/mL) não foram
estatisticamente diferentes das concentrações de amido nesses mesmos tecidos de
sementes embebidas com água, conforme podemos observar na figura 11. A
insulina, no entanto, reduziu a concentração de amido de radículas, na ordem de 54
% em referência às radículas de sementes não tratadas.
52
umol/MF
400
a
b
300
200
100
a
a
a
a
0
glicose
A
frutose
controle
um ol/gMF
400
sacarose
insulina (0,9 ug/mL)
a
a
a
300
b
200
a
a
100
0
glicose
umol/gMF
B
C
600
500
400
300
200
100
0
controle
frutose
sacarose
insulina (0,9 ug/mL)
a
a
b
a
a
a
glicose
controle
frutose
sacarose
insulina (0,9 ug/mL)
Figura 10 – Concentrações de glicose, frutose e sacarose nos cotilédones (A),
radículas (B) e epicótilos (C) de Phaseolus vulgaris com 72 horas da
embebição. As colunas indicam média de três experimentos independentes e
as barras representam o desvio padrão. As médias com mesma letra não são
estatisticamente diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05).
53
ug de amido/grama de massa fresca
30
a
a
25
a
20
15
b
a
a
10
5
0
Cotilédones
Radícula
controle
Epicótilo
insulina (0,9 ug/ml)
Figura 11 – Concentrações de amido nos cotilédones, radículas e epicótilos de
Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição. Colunas indicam média de
três experimentos independentes. As médias com mesma letra não são
estatisticamente diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05).
54
5.7 - EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA
ATIVIDADE DA INVERTASE DE SEMENTES DE Phaseolus vulgaris
COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO.
A figura 12 apresenta a atividade de invertase em tegumentos, cotilédones,
radículas e epicótilos de sementes germinadas em presença de insulina ou em água.
A insulina não alterou a atividade da invertase nos epicótilos e radículas de
sementes de P. vulgaris com 72 horas da embebição, pois os valores da atividade
não foram estatisticamente diferentes daquelas sementes não tratadas com insulina.
A atividade invertásica não foi detectada em tegumentos e cotilédones de sementes
de P. vulgaris com 72 horas da embebição, nem em sementes tratadas, nem nas
não tratadas com insulina.
5.8 – EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA EXÓGENA NA
ATIVIDADE DA SINTASE DA SACAROSE FOSFATO DE SEMENTES
DE Phaseolus vulgaris COM 72 HORAS DA EMBEBIÇÃO.
A insulina reduziu em 59 % a atividade da sintase da sacarose fosfato de
radículas de sementes de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição (Figura
13). No entanto, a atividade da sintase da sacarose fosfato dos cotilédones e
epicótilos de sementes de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embembição
tratadas e não tratadas com insulina não diferiram nos níveis de atividades (Figura
13). A atividade da sintase da sacarose fosfato não foi detectada em tegumentos de
sementes de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embembição, nem em sementes
tratadas, nem nas não tratadas com insulina.
55
0,3
uMol de glicose gMf-1 min-1
a
a
0,25
0,2
a
a
0,15
0,1
0,05
nd
nd
0
tegumentos
cotilédones
controle
radículas
epicótilos
insulina (0,9 ug/mL)
Figura 12 – Atividade invertásica nos tegumentos, cotilédones, radículas e
epicótilos de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição. As colunas
indicam média de três experimentos independentes e as barras representam o
desvio padrão. As médias com mesma letra não são estatisticamente
diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05). nd – não detectado.
uMol de sacarose gMF-1 min -1
56
a
140
a
120
100
a
80
60
a
a
b
nd
40
20
0
tegumentos
cotilédones
controle (água)
radículas
epicótilos
insulina (0,9 ug/mL)
Figura 13 – Atividade da sintase da sacarose fosfato nos tegumentos,
cotilédones, radículas e epicótilos de Phaseolus vulgaris com 72 horas da
embebição. As colunas indicam média de três experimentos independentes e
as barras representam o desvio padrão. As médias com mesma letra não são
estatisticamente diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05). nd – não
detectado.
57
5.9 - EFEITO DO PINITOL (MIMETIZADOR DA AÇÃO DE INSULINA)
NA GERMINAÇÃO DE Phaseolus vulgaris
Os quiro-inositóis são compostos que atuam como mediadores da ação da
insulina, provavelmente, após ligação ao receptor. No nosso estudo, o efeito do Dpinitol (3-O-metil-quiroinositol) na germinação de sementes de Phaseolus vulgaris
nas concentrações de 0,36, 0,9, 1,8, 3,6, 36 foi testado. As variáveis analisadas
foram: tamanho de epicótilos e radículas, massa de epicótilos e radículas, e número
de raízes laterais de sementes de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição.
Os valores são apresentados na figura 14. O pinitol teve efeito estimulador do
crescimento tanto de epicótilos quanto de radículas. O aumento proporcionado pelo
pinitol no tamanho das radículas variou de 30 % (1,8 μg/mL)
a 77 % (0,9 μg/mL),
enquanto a variação no tamanho dos epicótilos foi de 20 % (3,6 μg/mL) a 41 %
(36 μg/mL). As massas de epicótilos e radículas de sementes embebidas em
solução aquosa de pinitol foram maiores do que das sementes embebidas somente
em água. O maior aumento na massa dos epicótilos e das radículas foi obtido
utilizando-se a concentração de 0,9 μg/mL, sendo da ordem de 83 % e 98 %,
respectivamente (Figuras 14 C e 14 D). Na concentração de 1,8 μg/mL, o pinitol
promoveu as menores taxas de aumento na massa dos epicótilos (33 %) e radículas
(63 %) pinitol aumentou o número de raízes laterais de 3 (1,8 μg/mL) a 5 vezes (36
μg/mL) aproximadamente (Figura 14 E).
b
a
e
c
2
0
0,36
0,9
1,8
3,6
80
60
b
a
c
0
a
b
a
b
0
0
0,36
0,9
C
1,8
3,6
b
a
6
a
a
10
8
6
4
2
0
D
pinitol (ug/mL)
8
0,36
0,9
ab
b
1,8
c
3,6
36
pinitol (ug/mL)
c
a
b
ab
1,8
3,6
a
d
0
36
a
ab
d
B
40
20
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
36
pinitol (ug/mL)
A
radícula (mg)
a
4
0
raízes laterais (no)
d
epicótilo (cm)
6
epicótilo (mg)
radícula (cm)
58
0,36
0,9
36
pinitol (ug/mL)
b
c
4
2
0
E
0
0,36
0,9
1,8
3,6
36
pinitol (ug/m L)
Figura 14 – Efeito do pinitol no comprimento de radículas (A), epicótilos (B), na
massa de radículas (C) e epicótilos (D), e no número de raízes laterais (E) de
eixos embrionários de Phaseolus vulgaris com 72 horas da embebição. As
colunas indicam média de três experimentos independentes e as barras
representam o desvio padrão. As médias com mesma letra não são
estatisticamente diferentes (Teste de Duncan test - P ≤ 0.05).
59
5.10 - LIGAÇÃO DE INSULINA A VICILINAS POR CROMATOGRAFIA
DE AFINIDADE.
Nossos resultados demonstram que insulina bovina liga-se a vicilinas de
Vigna unguiculata (IT81D) acoplada a Sepharose 4 B (figuras 15, 16 e 17). Em
média 63 μg de insulina ficaram retidos em 1 mL da matriz de vicilina acoplada a
Sepharose 4B. O EDTA reduziu a capacidade de ligação de insulina a vicilina
conforme podemos observar nas figuras 15, 16 e 17. Quando comparamos os três
gráficos observamos leituras de absorvâncias menores do pico de insulina retida
quando o EDTA estava presente no tampão do bicarbonato. No entanto, quando
EDTA foi usado na concentração de 20 mM, a insulina ligada só foi eluída com ácido
acético 0,1 M pH 3,0 (figura 17). Quando EDTA estava nos tampões na
concentração de 5 mM, parte da insulina que ficou retida foi eluída com aumento da
força iônica (NaCl 2M) e outra com ácido acético 0,1 M pH 3,0. Todos os picos
retidos foram testados por ELISA e uma reação positiva indicava que a proteína
eluída se tratava de insulina.
60
0,07
Ácido Acético 0,1 M pH 3,0
absorvância (280 nm)
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
volume (mL)
Figura 15 – Perfil cromatográfico de insulina bovina em coluna de vicilinaSepharose 4B. Tampão de equilíbrio e dissolução de amostra – bicarbonato de
sódio 0,1 M NaCl 0,5 M pH 9,0. Tampão de Eluição – Ácido acético 0,1 M pH 3,0.
670 μg de insulina foram aplicados a coluna.
0,08
B
A
0,06
0,04
0,02
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0
absorvância (280 nm)
61
volume (mL)
Figura 16 – Efeito do EDTA (5mM) no perfil cromatográfico de insulina bovina
em coluna de vicilina-Sepharose 4B. Tampão de equilíbrio e dissolução de
amostra – bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 5 mM pH 9,0. Tampão de Eluição –
(A) bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 5 mM NaCl 2 M pH 9,0, (B) Ácido acético
0,1 M pH 3,0. 670 μg de insulina foram aplicados a coluna.
45
41
37
29
25
B
21
17
13
9
5
A
33
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
1
absorvância (280 nm)
62
volume (1 mL)
Figura 17 – Efeito do EDTA (20mM) no perfil cromatográfico de insulina bovina
em coluna de vicilina-Sepharose 4B. Tampão de equilíbrio e dissolução de
amostra – bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 20 mM pH 9,0. Tampão de Eluição
– (A) bicarbonato de sódio 0,1 M, EDTA 20 mM NaCl 2 M pH 9,0, (B) Ácido
acético 0,1 M pH 3,0. 670 μg de insulina foram aplicados a coluna.
63
5.11 - SEPARAÇÃO DE MOLÉCULAS DO TIPO INSULINA DE EIXOS
EMBRIONÁRIOS DE Phaseolus vulgaris COM 48 HORAS DA
EMBEBIÇÃO POR CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE EM VICILINASEPHAROSE
A Figura 18 apresenta o perfil cromatográfico de extrato de eixos
embrionários de Phaseolus vulgaris com 48 horas da embebição em coluna de
Vicilina-Sepharose 4B. Observa-se que houve retenção de material quando este foi
eluído com ácido acético 0,1 M pH 3,0. Quando essa fração foi analisada por ELISA,
mostrou-se reativa ao anticorpo anti-insulina humana. Essa fração também foi
submetida à separação por SDS-PAGE e conforme podemos visualizar na figura 19,
uma proteína com massa molecular próxima a da insulina está presente. Esses
resultados indicam presença de insulina endógena nos eixos embrionários de P.
vulgaris.
5.12
–
IMUNOLOCALIZAÇÃO
DE
INSULINA
NOS
EIXOS
EMBRIONÁRIOS DE Phaseolus vulgaris COM 48 HORAS DE
EMBEBIÇÃO.
Pela microscopia eletrônica de transmissão, foi detectada marcação de
insulina nos vacúolos de epicótilos de Phaseolus vulgaris com 48 horas da
embebição em água (Figura 20) e nos vacúolos e citoplasmas de radículas de
Phaseolus vulgaris com 48 horas da embebição em água (Figura 21). No controle,
os cortes não foram tratados com o anticorpo anti- insulina humana.
64
absorvância (280 nm)
4,5
4
A
3,5
3
2,5
2
1,5
1
114
108
102
96
90
84
78
72
66
60
54
48
42
36
30
24
18
12
6
0
0,5
0
volume (mL)
0,02
0,015
0,01
0,005
11
7
11
5
11
3
11
1
10
9
10
7
10
5
10
3
10
1
99
97
0
95
absorvância (280 nm )
B
volum e (m L)
Figura 18 – A – Perfil cromatográfico do extrato de eixos embrionários com 48
horas da embebição em Sepharose 4B acoplada a vicilina. B - Ácido Acético
0,1 M pH 3,0 (região de eluição ampliada). Tampão de equilíbrio – bicarbonato
de sódio 0,1 M NaCl 0,5 M pH 9,0.
65
I
1
5,7 kDa
Figura 19 – SDS-PAGE em gel 15 % de acrilamida. I – Insulina bovina
comercial, 1 – Pico retido do extrato total de Phaseolus vulgaris em
cromatografia de afinidade em vicilina acoplada a Sepharose 4B.
66
Figura 20 – Detecção de insulina em epicótilos de Phaseolus vulgaris com 48
horas da embebição por microscopia eletrônica de transmissão (MET). Painel:
A – Controle. B – Vacúolo marcado com partículas de ouro coloidal de 10 nm.
Barra = 200 nm.
67
Figura 21 - Detecção de insulina em radículas de Phaseolus vulgaris com 48
horas da embebição por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A –
Controle. B – Vacúolo marcado com partículas de ouro coloidal de 10 nm. C –
Espaço intercelular marcado com partículas de ouro coloidal de 10 nm. D –
Citoplasma marcado com partículas de ouro coloidal de 10 nm. E – Parede
celular. Barra corresponde a 400 nm em A, 250 nm em C e E, 90 nm em B e D.
68
6 – DISCUSSÃO
É sabido que a insulina, em animais, aumenta o transporte de glicose para o
interior celular. Esse processo é mediado pelo aumento da translocação de
transportadores GLUT4 para a membrana plasmática (Kanzaki & Pessin, 2003;
Brady et al., 1999; Pessin et al., 1999). Nossos resultados demonstram efeito similar
da insulina em plantas. As células de tabaco tratadas com insulina apresentam
quantidades de glicose significativamente maiores do que células não tratadas nos
tempos de 16 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas (figura 6). Acreditamos que a
insulina, de forma semelhante em animais, esteja sinalizando o aumento de
transportadores de hexoses na membrana citoplasmática das células de tabaco em
suspensão.
A primeira descrição do efeito de insulina sobre os processos germinativos foi
publicada em 1923, por Ellis & Eyster. Neste trabalho, insulina de pâncreas de boi e
de cebola preparadas segundo o método de Collip’s, foram testadas em plântulas de
milho de um genótipo clorótico e outro normal durante a fase de crescimento
dependente do endosperma. Este hormônio, em concentrações inferiores a 0,005 %,
teve efeito estimulador do crescimento da raiz, extremidades e número de raízes
laterais dos genótipos testados, enquanto em altas concentrações a insulina passou
exercer efeito inibitório do crescimento das plântulas. Plantas do genótipo clorótico
tratados com insulina apresentaram cerca de 28,7 % a mais de pigmentos verdes do
que plântulas de milho não tratadas (Ellis & Eyster, 1923).
Relatos do efeito positivo da insulina sobre a germinação e desenvolvimento
da plântulas de milho também foram publicados pelo grupo da Sáchez de Jiménez,
em 1999 (Sánchez de Jiménez et al., 1999). Esse trabalho demonstra que insulina
acelera a incorporação de metionina
35
S em proteínas ribossomais, aumenta a
mobilização de mRNA da proteína ribossomal S6 para os polissomos e também
intensifica a fosforilação da proteína ribossomal S6 na subunidade ribossomal 40S
em eixos embrionários de milho em germinação. Em 2000, esse mesmo grupo
apresentou os resultados referentes aos efeitos da insulina na síntese de novo das
duas principais isoformas dos fatores de iniciação de eucariotos 4E em plantas,
eIF4E e eIFiso4E. Insulina acelerou a síntese de novo do fator eIFiso4E, mas não do
eIF4E (Dinkova et al., 2000). Esses dados, em conjunto, indicam um processo de
regulação da tradução, promovido pela insulina em plantas. De milho, foi isolada
69
uma proteína de 20 kDa com propriedades homólogas a insulina. No processo de
purificação desta proteína empregou-se uma coluna de anticorpo anti-insulina
acoplado a Sepharose 4B (García-Flores et al., 2001).
Insulina, também, tem efeito estimulador no desenvolvimento de plântulas de
cevada, sementes oleaginosas (pepino, girassol e melão) e Canavalia ensiformis
(Csaba & Pál, 1982; Goodman & Davis, 1993; Oliveira et al., 2004). Insulina, quando
presente em concentração de 10-8 M, no meio de germinação de sementes de
cevada, foi capaz de promover aumento no comprimento e massa das raízes, massa
do coleóptilo e atividade mitótica das plântulas (Csaba & Pál, 1982).
Sementes de pepino, girassol e cevada, quando germinadas na presença de
insulina,
apresentaram
atividades
aumentadas
das
enzimas
cotiledonárias
relacionadas à conversão de gorduras em carboidratos. As atividades das enzimas
acil CoA desidrogenase, citrato sintase e malato desidrogenase de cotilédones das
três espécies de sementes citadas foram maiores na presença de insulina do que na
ausência. Somente as atividades das isoformas glioxissomais foram alteradas por
insulina. Tratamento com insulina, também, aumentou a atividade de enzimas
específicas do ciclo do glioxilato, a isocitrato liase e malato sintase. Duas enzimas do
peroxissoma, catalase e oxidase do glicolato, não diretamente envolvidas na
conversão
de
gorduras
armazenadas
em
carboidratos,
tiveram
atividades
aumentadas após tratamento com insulina (Goodman & Davis, 1993).
Nossos dados estão de acordo com trabalhos anteriores, à medida que
insulina estimulou o desenvolvimento de plântulas de Phaseolus vulgaris. Na figura 7
A podemos constatar que as sementes tratadas com insulina em concentrações de
0,036, 0,36, 0,9, 1,8 e 3,6 μg/ml tinham tamanhos de radículas maiores do que em
sementes não tratadas. Um outro parâmetro analisado foi a massa dessas radículas
que foi maior nas sementes tratadas com insulina nas concentrações de 0,036, 0,36,
0,9, 1,8 e 3,6 μg/mL do que as não tratadas (figura 7 C). Tanto o tamanho quanto a
massa dos epicótilos de sementes tratadas com insulina (0,036, 0,36, 0,9, 1,8, e 3,6
μg/mL) foram estatisticamente maiores do que as de sementes não tratadas,
conforme podemos observar entre as figuras 7 B e 7 D, respectivamente. A figura 7
E apresenta o número de raízes secundárias de sementes tratadas com diferentes
concentrações de insulina, notando-se que em todas concentrações empregadas
insulina ativou a formação de raízes secundárias.
70
Em nosso trabalho, observamos que a insulina, por mecanismos ainda não
conhecidos, reduz a síntese de etileno ou aumenta a sua degradação, resultando na
menor taxa de emissão de etileno de sementes germinadas na presença deste
hormônio (figura 8). Se por um lado consideramos difícil a análise do efeito da
insulina na redução da emissão de etileno uma vez que a sinalização de hormônios,
em planta, seja resultante de múltiplas interações, seja dependente do tipo celular,
do estágio do desenvolvimento e da concentração. Por outro lado, constatamos que
no processo de desenvolvimento de plântula, insulina e etileno têm papéis
antagônicos. A insulina estimula o desenvolvimento da plântula enquanto etileno
inibe o crescimento de epicótilo e hipocótilo (Kende, 1993).
Através dos estudos com mutantes ein (insensível a etileno) e ctr (resposta
tripla constitutiva) uma via de sinalização foi delineada, na qual etileno se ligaria aos
receptores para etileno (ETR) e este evento pára a ativação de uma proteína com
alta homologia com MAPKKK (quinase da quinase da quinase ativada por
mitógenos) do tipo Raf, a CTR1. Os receptores de etileno quando estão ligados ao
etileno inativam a quinase serina/treonina do tipo Raf (CTR1). A inativação de CTR1
libera reguladores positivos EIN2 e ativadores transcricionais, EIN3, da regulação
negativa de CTR1, permitindo, assim, a resposta ao etileno. Possivelmente, na
ausência do gás etileno, a via de ETR ativa o crescimento celular. A repressão de
ETR pelo etileno inibe a expansão celular (Gazzarrini & McCourt, 2001; Guo &
Ecker, 2004).
Sugerimos que a insulina possa estar atuando na cascata de sinalização de
etileno e ative a proteína CTR1 (proteína do tipo quinase Raf que ativa cascata de
fosforilações na rota da MAP quinase), ao mesmo tempo iniba a atuação do etileno.
Interessantemente, insulina aumenta a expressão gênica e síntese de DNA, em
vertebrados, atuando na via de sinalização por proteínas MAPK (quinase ativa por
mitógenos). Mas cabe ressaltar que o papel da cascata de MAPK na sinalização de
etileno é controverso e mais evidências genéticas são necessárias (Guo & Ecker,
2004). Existem evidências que etileno ative MAP quinase em epicótilos e em folhas
de Arabidopsis (Novikova et al., 2000) e em células de suspensão de Medicago
(Quaked et al., 2003).
Neste trabalho, também, avaliamos o efeito da insulina sobre a taxa da
respiração de sementes germinadas na presença e ausência de insulina. Era de se
esperar um aumento na taxa respiratória já que insulina acelera o desenvolvimento
71
de eixo embrionário e para tanto há uma maior necessidade energética. Os
resultados apresentados na figura 9 reforçam essas expectativas.
Os açúcares são moléculas importantíssimas durante o crescimento e
desenvolvimento das plantas. Estão envolvidos nos processos de transporte de
fotossintatos bem como em processos metabólicos e de sinalização. Em diversos
processos fisiológicos, os açúcares não só participam, mas também os regulam. Um
exemplo da importância do metabolismo de açúcares encontra-se no evento da
passagem da fase de diferenciação para a fase de armazenamento que ocorre
durante o desenvolvimento de sementes. Em Vicia faba, durante a fase de préarmazenamento, a sacarose é hidrolisada por uma invertase associada à parede
celular. A atividade invertásica é alta nesta fase, resultando em altos níveis de
glicose que promovem crescimento por divisão celular. Nas células parenquimáticas
a sacarose é ressintetizada pela sintase da sacarose fosfato. Quando o embrião
estende-se, ocasiona a destruição da camada de parênquima de parede fina; ocorre,
então, depleção do nível de invertase ocasionando a elevação dos níveis de
sacarose. Os altos níveis de sacarose e os baixos nívies de glicose promovem
diferenciação celular e síntese dos produtos de armazenamento (Weber et al., 1995;
Weber et al., 1996; Weber et al., 1998).
Nesse trabalho procuramos analisar alterações no metabolismo de açúcares
durante o desenvolvimento da plântula de Phaseolus vulgaris, como conseqüência
do tratamento de sementes com insulina. Para tanto dosamos glicose, frutose,
sacarose e amido nas diferentes partes do embrião e atividades das enzimas sintase
da sacarose fosfato e invertase. Os níveis de glicose e frutose dos cotilédones,
epicótilos e radículas alteraram pouco em função do tratamento com insulina (Figura
10). Na presença de insulina, redução significativa do nível de sacarose foi
observada nos cotilédones, radículas e epicótilos tendo sido na ordem de 11 %, 19
% e 40%, respectivamente (Figura 10). A redução da concentração de sacarose nas
radículas de sementes tratadas com insulina pode ser explicada pela redução da
atividade da enzima sintase da sacarose fosfato resultante do tratamento com
insulina (figura 13). Esta enzima é capaz de catalisar tanto a síntese quanto a
hidrólise da sacarose. Entretanto concentrações da SPS são normalmente altas nos
tecidos que sintetizam sacarose, indicando que é uma enzima predominantemente
de biossíntese (Dennis & Blakeley, 2000). Analisando os resultados, acreditamos
que na radícula a insulina estaria interferindo nos processos de síntese da sacarose
72
e não nos processos de hidrólise já que não houve diferença nos níveis de atividade
da enzima invertase entre radículas dissecadas de sementes embebidas com
insulina e radículas dissecadas de sementes embebidas com água (Figura 12). Não
podemos correlacionar a redução de sacarose observada nos epicótilos tratados
com insulina com diferenças entre as atividades das enzimas invertase e sintase da
sacarose fosfato já que estatisticamente as atividades das duas enzimas foram
iguais nos epicótilos de sementes embebidas com insulina e nos epicótilos de
sementes embebidas com água (figura 12 e 13). A insulina nos epicótilos estaria
interferindo em outros processos metabólicos da sacarose que ainda não foram
analisados. Tais processos poderiam ser um aumento da mobilização de sacarose
para outros tecidos (radícula) ou ainda utilização de sacarose na síntese de outros
compostos, tais como proteínas. Nos cotilédones de Phaseolus vulgaris, similar ao
que acontece em sementes de ervilha em germinação (Bewley & Black, 1994), não
detectamos atividade invertásica (figura 12) e a atividade da sintase da sacarose
fosfato não sofreu alteração em função do tratamento com insulina (figura 13). Assim
as atividades destas enzimas não justificam a redução de sacarose também
observada nos cotilédones. Essa redução pode ser atribuída a um aumento na
mobilização de sacarose para os tecidos drenos. No geral, observamos que insulina
reduz as concentrações de sacarose nos tecidos do eixo embrionário e nos
cotilédones. Esse efeito da insulina no metabolismo dos açúcares poderia ser
conseqüência de um maior requerimento metabólico e estrutural resultante das
maiores taxas de crescimento de epicótilos e radículas promovidas por esse
hormônio ou ainda que a insulina estaria sinalizando a redução da sacarose para
evitar
o
efeito
inibitório
de
altas
concentrações
deste
açúcar
sobre
o
desenvolvimento da plântula (Finkelstein & Gibson, 2001).
Um outro efeito da insulina nas concentrações de açúcares foi a redução dos
níveis de amido, um polissacarídeo de reserva, nas radículas de sementes tratadas
com insulina (figura 11). Esse efeito resulta, provavelmente, das maiores taxas
metabólicas requeridas para um crescimento acelerado. Nos demais tecidos
analisados não houve diferença estatística entre as concentrações de amido de
sementes tratadas e não tratadas com insulina.
Conforme podemos visualizar na figura 12 e 13, não detectamos atividade
invertásica e nem da sintase da sacarose fosfato nos tegumentos das sementes que
73
é um tecido de origem materna, mais relacionado a funções de proteção das
sementes do que metabólicas (Bewley & Black, 1994).
Após a confirmação do efeito de insulina sobre o desenvolvimento de plântula
de Phaseolus vulgaris, foi investigado se a cascata de sinalização de insulina seria
conservada em plantas. Então, testamos um composto quiro-inositol, o pinitol,
conhecido por ser mediador, pós-receptor, na cascata de sinalização da insulina
(Bates et al., 2000). O pinitol teve efeito análogo à insulina, conforme observamos na
figura 14, promovendo o crescimento de epicótilos, radículas e aumento no número
de raízes laterais. O pinitol também mimetizou o efeito da insulina no
desenvolvimento de plântulas de Canavalia ensiformis (Oliveira et al., 2004). Esses
resultados nos indicam que, em plantas, existe uma via de sinalização de insulina
similar à encontrada em vertebrados.
Se insulina tem efeito sobre o desenvovimento de eixo embrionário e
possivelmente existe um sistema de sinalização semelhante ao dos vertebrados,
uma pergunta surgiu: Existiria insulina endógena no eixo embrionário de Phaseolus
vulgaris? Partindo da reconhecida capacidade de insulina de ligar-se a globulinas 7S
básicas (Komatsu & Hirano, 1991) em ensaios de ligação de membrana e de dados
obtidos por Ribeiro (2003), demonstrando por ensaios de ELISA, que insulina
também liga-se a globulinas 7S ácidas, do tipo vicilinas, idealizamos um processo de
purificação de insulina baseado em cromatografia de afinidade em coluna de vicilinaSepharose. Assim acoplamos vicilinas de Vigna unguiculata a Sepharose 4B e
testamos sua capacidade de ligação à insulina bovina bem como a forma de eluição.
As figuras 15, 16 e 17 apresentam os perfis cromatográficos de insulina. Os picos
retidos foram testados por Elisa e mostraram-se reativos ao anticorpo anti-insulina
humana, indicando que a proteína eluída se tratava de insulina. Insulina é conhecida
por associar-se a metais divalentes (Howell et al., 1978 citado por Dodson & Steiner,
1998) e esta associação poderia interferir com a ligação de insulina a vicilina, por
isso o EDTA (quelante) foi empregado no tampão bicarbonato. Os resultados
demonstram que insulina, aparentemente, interage mais fortemente com vicilina
quando EDTA está ausente no tampão bicarbonato. O extrato de eixo embrionário
de Phaseolus vulgaris com 48 horas da embebição foi aplicado na coluna de vicilina
acoplada a Sepharose 4B. A figura 18 apresenta o perfil dessa cromatografia e
podemos observar que houve retenção de material que foi eluído com ácido acético
0,1 M pH 3,0. Essa fração foi testada por Elisa e apresentou antigenicidade ao
74
anticorpo anti insulina humana. Quando analisada em SDS PAGE, observamos a
presença de uma banda protéica com massa molecular próxima à da insulina
conforme podemos visualizar na figura 19. Os dados dos experimentos de
imunolocalização confirmam que eixo embrionário contém insulina endógena.
Insulina foi imunolocalizada nos vacúolos de epicótilo (figura 20) e nos vacúolos e
citoplasmas de radículas (figura 21) de Phaseolus vulgaris com 48 horas da
embebição em água.
75
7- CONCLUSÕES
Os dados apresentados neste trabalho sugerem que a insulina aumenta o
transporte de glicose em células de tabaco em suspensão e tem papel ativador do
crescimento de eixo embrionário de Phaseolus vulgaris assim como o pinitol,
conhecido mimetizador da ação de insulina. Insulina também tem efeito inibidor
sobre a emissão do hormônio etileno em sementes de Phaseolus vulgaris em
germinação e apresenta efeito estimulador na emissão do CO2. Insulina afeta o
metabolismo de carboidrato já que reduziu a concentração de sacarose nos
epicótilos, nas radículas e cotilédones de sementes de Phaseolus vulgaris com 72
horas da embebição assim como reduziu a concentração de amido e da atividade da
sintase da sacarose fosfato nas radículas de sementes no mesmo estágio de
desenvolvimento. Insulina está presente em eixo embrionário de semente com 48
horas da embebição. Esses resultados indicam fortemente que insulina tem papel
regulador no metabolismo e crescimento de plantas. Concluímos, também, que
insulina pode ser isolada utilizando a técnica de cromatografia de afinidade de
vicilina acoplada a Sepharose 4B.
76
8- Referências bibliográficas
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