EFEITO DO COBRE NA POPULAÇÃO DE BACTÉRIAS

I CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA AGROPECUÁRIA,
AGRÍCOLA E AMBIENTAL (CBMAAA)
09 a 12 de maio de 2016 - Centro de Convenções da UNESP,
Câmpus de Jaboticabal, SP
EFEITO DO COBRE NA POPULAÇÃO DE BACTÉRIAS
ASSOCIADAS À MACRÓFITA AQUÁTICA Salvinia auriculata
AUBL.
EFFECT OF COPPER IN BACTERIA POPULATION
ASSOCIATED WITH THE MACROPHYTE Salvinia auriculata
AUBL.
Jussara Tamires de Souza Silva (1)
Pollyana Honório Gomes (2)
Aline Chaves Intorne (3)
Resumo
O cobre é um micronutriente essencial para os seres vivos, porém em elevada concentração
torna-se tóxico. No ecossistema aquático, encontra-se a Salvinia auriculata Aubl., uma
macrófita flutuante com potencial para captar contaminantes do ambiente. Associadas a essa
planta, foram previamente isoladas bactérias, que possuem características promotoras do
crescimento vegetal. O objetivo do trabalho foi identificar bactérias associadas a S.
auriculata, que possuam resistência a cobre através da determinação da sua concentração
inibitória mínima (CIM). Para tanto, foram cultivados 18 isolados bacterianos em meio de
cultura DYGS líquido e sólido por 24 horas a 30ºC. Os ensaios de resistência a cobre para
cada um dos gêneros foram realizados utilizando-se o método de CIM. As bactérias foram
cultivadas até atingir em torno de 108, células. ml-1, (D.O600=1,0) e inoculadas 3 gotas (5 µL)
em meio sólido contendo concentrações crescentes de CuSO4 (1, 3, 5, 7 e 9 mM
respectivamente). As placas foram incubadas em estufa a 30ºC por 72 horas. As bactérias que
apresentaram resistência mais elevada, foram cultivadas em meio DYGS líquido com cobre (0,1; 0,5;
1 e 5 mM) sob agitação constante (150 rpm) por 36 horas a 30ºC. Como resultado, no ensaio de
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além da promoção do crescimento vegetal, alguns isolados possuem resistência a cobre,
ressaltando seus potenciais de aplicação em ambientes contaminados por cobre.
Palavras-chave: Ecossistema aquático. Metal pesado. Micro-organismo.
Abstract
Copper is an essential micronutrient for life, but in high concentration becomes toxic. In
aquatic ecosystem is Salvinia auriculata Aubl., a floating macrophyte to capture the potential
environmental contaminants. Associated with this plant, bacteria were previously isolated,
1
Graduanda em Licenciatura em Biologia pela Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro-UENF.
[email protected]
2
Mestranda em Ecologia Recursos Naturais pela Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro-UENF.
[email protected]
3
Dr.ª em Biociências e Biotecnologia pela Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro-UENF. Docente
[email protected]
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having characteristics of promoting plant growth. With the aim of identifying bacteria
associated with S. auriculata, having resistance to copper by determining the minimum
inhibitory concentration (MIC). Therefore, they were grown 18 bacterial isolates in liquid
and solid DYGS culture for 24 h at 30 ° C. The copper resistance tests for each of the genres
were performed using the MIC method. The bacteria were grown until about 10 8 cells. ml-1
(D.O600 = 1.0) and inoculated 3 drops 5 (µL) in solid medium containing increasing
concentrations of CuSO4 (1,3,5,7,9 mM respectively). The plates were incubated at 30 ° C for
72 h. Bacteria that have higher resistance, were grown in liquid DYGS (0.1, 0.5, 1, and 5
mM) under constant stirring (150 rpm) for 36 hours at 30 ° C. As a result, the test MIC four
isolates were resistant. With the assay in liquid medium it reinforces that even under very
stressful cultivation conditions, these bacteria are copper resistant. Thus, addition to
promoting plant growth, some isolates have copper resistance, highlighting its potential
application contaminated copper environments.
Keywords: Aquatic ecosystem. Heavy metal. Microorganism.
1 Introdução
Os ecossistemas de água doce fornecem a maioria dos recursos para a vida no planeta,
incluindo alimentação, meio de transporte e habitat para muitos organismos como peixes e
plantas (RAO et al., 2011). E um dos grandes problemas enfrentados pela humanidade no
século XXI está relacionado à quantidade e qualidade da água prontamente disponível para
abastecimento (ORGAN et al., 2009). Isso se deve em parte ao aumento populacional e ao
uso crescente dos recursos hídricos para suprir as necessidades do ser humano (BRASIL et
al., 2001).
De acordo com o Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA), é estabelecido
que possa ser encontrado até 0,009 mg.L-1 de cobre (Cu) dissolvido em água doce. No
entanto, é no ambiente aquático que encontram-se as maiores concentrações de cobre, devido
à manipulação agrária (pesticidas), industrial (baterias e despejos de efluentes) e urbana
(controle de algas em piscinas e aquários) (SONG et al., 2011). E a entrada excessiva de
cobre na água pode ameaçar a saúde humana através do seu consumo e dos organismos
aquáticos, que s sofrem diretamente com esta contaminação (HU et al., 2007).
A macrófita Salvinia auriculata Aubl. é uma planta muito comum em água doce e
bastante resistente a metais. Sob condições favoráveis, é rapidamente disseminada por
propagação vegetativa, colonizando extensas superfícies de água em tempo reduzido
(HENRY-SILVA et al., 2006). Por isso, S. auriculata vêm sendo considerada uma alternativa
viável de biorremediação para uso na remoção de metais e processo de tratamento de
efluentes (ESPINOZA-QUIÑONES et al., 2009).
Devido a fácil adaptabilidade dos microrganismos, sua sobrevivência é garantida nas
mais variadas condições químicas e físicas (WARREN et al., 2001). Dentre esses, destaca-se
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as bactérias benéficas associadas com plantas, frequentemente referidas como bactérias
promotoras do crescimento vegetal ou PGPB (do inglês, Plant Growth Promoting Bacteria)
(KLOEPPER et al,. 1989). Além de promover o crescimento de plantas, determinados
microrganismos também têm a capacidade de remover, imobilizar, ou desintoxicar metais (JI
et al.,1995). Tais mecanismos responsáveis pela resistência da bactéria podem agir no
ambiente intracelular ou extracelular, de modo específico ou não, e sob uma variedade de
metais (WASI et al,. 2013). Este trabalho teve como objetivo, identificar bactérias com
resistência a cobre associadas a macrófita S. auriculata.
2 Material e Métodos
Microrganismos
As bactérias utilizadas no presente estudo foram previamente isoladas de plantas de S.
auriculata (GOMES et al., 2015). Em trabalho anterior, tais cepas foram classificadas de
acordo com análises moleculares para o gene 16S RNA e também foram identificadas como
bactérias promotoras do crescimento vegetal por ensaios de fixação biológica de nitrogênio e
produção de compostos indólicos. Utilizando-se Escherichia coli, por ser um microrganismo
modelo, a bactéria foi empregada como controle nos ensaios de Concentração Inibitória
Mínima (CIM).
Ensaio de Concentração Inibitória Mínima
As 18 bactérias foram cultivadas até atingir 108 células mL-1 (D.O.600 = 1,0) e
inoculadas 3 gotas (5 µL) em meio DYGS sólido, contendo concentrações crescentes de
CuSO4 (1, 3, 5, 7 e 9 mM). As placas foram incubadas em estufa a 30ºC por 72 horas. As
bactérias que resistiram as concentrações mais elevadas no sólido foram cultivadas em meio
DYGS líquido, com cobre (0,1; 0,5; 1 e 5 mM) sob agitação constante (150 rpm) por 36 horas
a 30ºC. Posteriormente, foi realizada leitura no espectrofotômetro. Em ambos os ensaios, não
foi adicionado cobre na situação controle.
3 Resultados e Discussão
Inicialmente, as bactérias foram cultivadas em meio DYGS e as colônias foram
registradas para identificação da morfologia (Figura 1). Como pode ser observado, os gêneros
bacterianos isolados da macrófita apresentaram uma variedade de cores, o que pode indicar
que estas bactérias desempenham funções ecológicas distintas no ambiente. Segundo
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TORTORA et al. (2012), muitos pigmentos produzidos por bactérias podem proporcionar
proteção contra a luz solar. Esses pigmentos podem ser constituídos de carotenóides, sendo
biossintetizados por microrganismos fotossintetizantes como, por exemplo, algas e
cianobactérias (azuis e verdes), e por microrganismos não fotossintetizantes, como bactérias,
fungos e leveduras (VALDUGA et al,. 2009).
Figura 1. Morfologia das colônias de bactérias isoladas de plantas Salvinia auriculata Aubl. e
cultivadas em meio sólido DYGS
No ensaio de CIM, cada cepa foi exposta a concentrações crescentes de metal. Então,
a mínima concentração testada capaz de inibir o crescimento microbiano, foi assumida como
a CIM para cada bactéria. O resultado pode ser observado na Figura 2, onde as bactérias mais
resistentes foram 2 isolados de Pseudomonas sp (2) e (7), 1 Agrobacterium sp (15) e uma
cepa ainda não identificada, nomeada como NI (22). A bactéria mais sensível foi uma cepa do
gênero Bacillus (1).
Figura 2. Ensaio de Concentração Inibitória Mínima (CIM) em diferentes concentrações de
sulfato de cobre (CuSO4).
Após avaliar a resistência das bactérias em meio sólido, foi realizado ensaio com
adição de cobre em meio líquido (Figura 3). Os resultados mostram uma redução gradual no
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crescimento dos isolados. No entanto, mesmo sob 1 mM de cobre, as cepas testadas
apresentaram concentração alta de células após 36 horas de cultivo.
Figura 3. Cultivo bacteriano em meio DYGS líquido contendo concentrações crescentes de
cobre.
Segundo BAKER-AUSTIN et al., (2006), a resistência ocorre porque a exposição ao
metal selecionou diretamente as bactérias mais resistentes. A estirpe mais tolerante foi aquela
nomeada como NI. Este resultado ressalta o potencial deste isolado com resistência a cobre,
mostrando que seu crescimento foi o menos inibido nas condições avaliadas. Obteve-se ainda
outros três isolados bastante resistentes: dois pertencentes ao gênero Pseudomonas e uma
Agrobacterium sp. Estas cepas podem apresentar esta característica devido à regulação do
ambiente interno das suas células que em geral ocorre por mediação do operon cop.
Neste operon, o gene cop A codifica a proteína que capta cobre e o transporta para o
citoplasma, ao passo que o cop B media a remoção de cobre de dentro das células. O gene cop
Y é repressor e cop Z o ativador que regulam a expressão do operon de acordo com a
concentração de cobre na célula (SOLIOZ et al., 2003). Deste modo, o mecanismo de
proteção das células ao cobre é feito pelo gene cop Y, que reprime as ATPases e cop A e cop
B, que diminuem o transporte deste elemento para o citoplasma, evitando a morte celular pela
exposição a concentrações tóxicas de cobre (SOLIOZ et al,. 2003). Para discernir se este
mecanismo está envolvido, serão necessárias investigações moleculares a fim de identificar os
determinantes de resistência destes isolados.
4 Conclusão
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O presente estudo revelou a existência de bactérias associadas à macrófita S.
auriculata e resistentes ao cobre. Uma vez que os metais podem atuar como agentes seletivos,
a presença de bactérias resistentes a metais e associadas à planta, permite a utilização desses
microrganismos juntamente com S. auriculata em processos de biorremediação.
5 Agradecimentos
As autoras agradecem aos órgãos de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ),
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) e Laboratório de
Fisiologia e Bioquímica de Microrganismos (LFBM).
Referências
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