Lorena Angélica Castaño Ramos

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Mycobacterium tuberculosis, EM TRÊS
TIPOS DE AMOSTRAS CLÍNICAS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA
UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE NO ESTADO DO AMAZONAS
LORENA ANGÉLICA CASTAÑO RAMOS
MANAUS
2011
i
LORENA ANGÉLICA CASTAÑO RAMOS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Mycobacterium tuberculosis, EM TRÊS
TIPOS DE AMOSTRAS CLÍNICAS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA
UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE NO ESTADO DO AMAZONAS
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas em Convênio com a Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado,
para obtenção do título de Mestre em
Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientadora: Profª. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira
Co-Orientadora: Profa. MSc. Rossicléia Lins Monte
MANAUS
2011
Ficha Catalográfica
R175e
Ramos, Lorena Angélica Castano
Caracterização molecular de Mycobacterium tuberculosis,
em três tipos de amostras clínicas de pacientes atendidos em
uma Unidade Terciária de Saúde no Estado do Amazonas. /
Lorena Angélica Castano Ramos -- Manaus: Universidade do
Estado do Amazonas, 2011.
72f. : il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade do Estado
Amazonas - Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical da Universidade do Estado do Amazonas , 2011.
Orientador: Profa. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira .
1. Tuberculose 2. Mycobacterium tuberculosis
I.
Oliveira, Cintia Mara Costa de II. Titulo
CDU:616.92
Ficha catalográfica elaborada por
Maria Eliana N. Silva – CRB- 11/248
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Mycobacterium tuberculosis,
EM TRÊS TIPOS DE AMOSTRAS CLÍNICAS DE PACIENTES
ATENDIDOS EM UMA UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE NO
ESTADO DO AMAZONAS
LORENA ANGÉLICA CASTAÑO RAMOS
“Esta Dissertação foi julgada adequada para a obtenção do Título de Mestre
em Doença Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do
Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr.
Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
__________________________________
Prof ª. Cintia Mara Costa de Oliveira, Dra.
Presidente
____________________________________
Prof a. Regina Maria Pinto de Figueiredo, Dra.
Membro
________________________________
Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr.
Membro
iii
“Ó minha alma, espera somente em
Deus,
porque
dele
vem
a
minha
esperança”.
Salmos 62:5
iv
DEDICATÓRIA
Dedico esta Dissertação a Alex, meu esposo a Alex Filho, Lorena e Angélica, meus
filhos, grandes motivos de vida, por todo o carinho, apoio e compreensão durante
minha presença ausente, necessária para a realização deste trabalho.
v
AGRADECIMENTOS
A DEUS, por iluminar o meu caminho e permitir mais essa dádiva em minha vida, e
me mostrar que mais importante do que ter fé é confiar.
A meus Pais, Roberto e Betty, sempre atentos, primeiros mestres da minha
formação humana, por seu amor, carinho e principalmente pelo incentivo que
sempre me deram em toda minha vida.
Ao meu esposo, Alex, seu Amor, paciência e compreensão. Aos meus Filhos, fontes
de toda força e vontade que carrego comigo ao despertar de cada manhã.
Aos meus queridos irmãos Roberto e Victor e especialmente a minha querida
cunhada Erica pelo exemplo de perseverança, bondade e fé.
Com grande estima, expresso a minha mais profunda gratidão à minha orientadora,
Profa. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira, pela oportunidade de realização deste
trabalho, pelos conhecimentos transmitidos, bem como pela disponibilidade e pela
orientação e incentivo constante.
É bom dar quando solicitado,
melhor, porém, é dar sem ser
solicitado
por
haver
apenas
compreendido. Há pessoas que
quando
deveriam
ser
apenas
professores foram mestres. Que
deveriam
ser
mestres
foram
amigos. Você Cintia é uma delas.
Minha eterna gratidão por toda
confiança em mim depositada.
vi
A Profª. Msc. Rossicléia Lins Monte, pela orientação durante a realização deste
trabalho, que contribuiu muito para minha formação profissional.
À Farmacêutica bioquímica e minha amiga Marly Marques de Melo, que me ensinou
as bases e me salvou em momentos difíceis e principalmente muito obrigada pela
amizade que nos une.
Ao Dr. Marcio Cortez, pela fundamental parceria na realização da coleta de parte
das amostras analisadas neste trabalho e pela amizade.
Às Dra. Márcia e Dra Regina, da Virologia, que sempre me ajudaram em minhas
intermináveis dúvidas...
A Farmacêutica bioquímica Heline, a Bióloga Socorro e a Biomédica Renata, pela
Amizade, disponibilidade e colaboração.
A aluna de iniciação científica Karolina pela amizade e auxilio em muitas etapas
desse trabalho.
A Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor
Vieira Dourado, A coordenação do Programa de Pós- Graduação em Medicina
Tropical pelos auxílios e incentivos oferecidos no decorrer desse trabalho.
Aos pacientes, sem os quais este trabalho seria impossível.
A meus verdadeiros amigos que hoje se alegram com meus logros.
vii
RESUMO
Introdução: A tuberculose (TB) constitui um grave problema de saúde pública, com
preocupação e repercussão mundial. Atualmente cerca de dois bilhões de pessoas
estão infectadas pela M. tuberculosis, 95% desses casos concentram em países em
desenvolvimento. No Brasil, o estado do Amazonas ocupa o segundo lugar em
número de caso de TB com taxa de incidência de 90/100.000 hab. (65,2%). Com
cerca de dois mil novos casos a cada ano, o índice de mortalidade varia de 2% a
3%, entre as principais causas de morte esta a resistência as drogas antituberculose
e a co-infecção entre TB/HIV. Diante da atual situação é fundamental a utilização de
métodos de diagnóstico precoces, sensíveis e específicos para detecção de TB.
Este estudo teve como principal objetivo: Detectar e caracterizar por métodos
moleculares o Mycobacterium tuberculosis, em amostras clínicas, de pacientes
suspeitos de tuberculose portadores ou não do vírus do HIV. Método: Estudo
descritivo retrospectivo realizado no período de janeiro de 2009 a janeiro de 2010. O
DNA do M. tuberculosis foi detectado utilizando a reação em cadeia da polimerase
(PCR/nested-PCR), o fragmento amplificado corresponde a um fragmento de 220 e
123pb da inserção IS6110, respectivamente. A caracterização molecular das
espécies de M. tuberculosis foi obtida através do seqüenciamento direto do produto
da primeira reação de PCR. Resultados: Dos 104 pacientes incluídos no estudo, 74
(71,2%) são homens e 30 (28,8%) mulheres. A média de idade foi 37,11 anos. Das
107 amostras analisadas 4 foram de liquor, 28 de tecidos fixados em parafina e 75
biopsias. Das 107 amostras submetidas a amplificação por PCR, 52/107 (48,6%)
foram PCR positivas, destas, 21/107 (19,6%) foram detectadas na primeira reação e
31/107 (29,0%) após nested-PCR. De 19 sequências nucleotídicas obtidas 18 foram
caracterizadas como M. tuberculosis e uma com M. bovis. Conclusão: A PCR
poderá complementar de forma eficiente as ferramentas convencionais
bacteriológicas para o diagnóstico rápido da tuberculose, mas não pode substitui-las;
a caracterização molecular mostrou que existem pelo menos dois tipos de
micobatérias circulando no estado do Amazonas.
Palavras-Chave: Tuberculose, Mycobacterium tuberculosis, Diagnóstico molecular,
PCR, nested-PCR.
viii
ABSTRACT
Introduction: Tuberculosis (TB) is a serious public health problem, the with concern
and worldwide repercussions. Currently around two billion people are infected with
M. tuberculosis, 95% of these cases are concentrated in developing countries. In
Brazil, the Amazonas state ranks second in number of cases of TB, with incidence
rate of 90/100.000 inhabitants (65.2%). With about two thousand new cases each
year, the mortality rate ranges from 2% to 3%, among the leading causes of death is
the resistance to antituberculosis drugs and co-infection among TB / HIV. Given the
current situation it is essential to use methods of early diagnosis, sensitive and
specific for detection of TB. This study aimed to objective: Detect and characterize
the Mycobacterium tuberculosis molecular methods in clinical samples from patients
suspected of tuberculosis haring or not the HIV virus. Method: Retrospective
descriptive study conducted from January 2009 to January 2010. The DNA of M.
tuberculosis was detected using polymerase chain reaction (PCR/nested-PCR), the
amplified fragment corresponds to a fragment of the insert 220 and 123pb IS6110,
respectively. Molecular characterization of the species of M. tuberculosis was
obtained by direct sequencing of the product of the first PCR reaction. Results: Of
104 patients enrolled, 74 (71.2%) were men and 30 (28.8%) women. The mean age
was 37.11 years. Of the 107 samples analyzed were 4 of liquor, 28 tissues paraffinembedded and 75 biopsies. Of the 107 samples subjected to PCR amplification,
52/107 (48.6%) were PCR positive, these, 21/107 (19.6%) were detected in the first
reaction and 31/107 (29,0%) after nested -PCR. Of 19 nucleotide sequences
obtained were characterized as 18 M. tuberculosis and one with M. bovis.
Conclusion: The PCR can effectively complement conventional bacteriological tools
for the rapid diagnosis of tuberculosis, but can not replace them, the molecular
characterization showed that there are at least two types of mycobacteria circulating
in the state of Amazonas.
Keywords: Tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, molecular diagnostics, PCR,
nested-PCR.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Distribuição da tuberculose no mundo..............................................
Figura 2:
Distribuição da taxa de Incidência de tuberculose no Brasil.............. 06
Figura 3:
Modelo da constituição da parede celular do M. tuberculosis...........
11
Figura 4:
Imagem de coloração de Ziehl Neelsen............................................
17
Figura 5:
Imagem de cultura do M. tuberculosis...............................................
18
Figura 6:
Fluxograma de atividades laboratoriais.............................................
30
Figura 7:
Perfil eletroforético das amostras amplificadas com iniciadores alfa
tubulina............................................................................................... 33
Figura 8:
Perfil eletroforético das amostras amplificadas com iniciadores de
220 pb................................................................................................ 36
04
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1:
Sequência dos iniciadores utilizados para amplificação do
gene alfa tubulina humana........................................................ 32
Tabela 2:
Sequência dos iniciadores utilizados para amplificação da
sequência de inserção IS6110 de M. tuberculosis.................... 34
xi
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDAS:
AIDS
BAAR
BK
DNA
EPI’s
FMT-HVD
HIV
LJ
LPDE
mL
MS
M. tuberculosis
MIRUs
NJ
OMS
PB
PCR
PCR-RT
p/v
RFLP
RNA
SBI
SEMSA
SINAN
SUSAM
TB
TB-HIV
TCH
TS
UBS
UFC
VNTR
ZN
- Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
- Bacilos álcool-ácido resistentes
- Bacilo de Koch
- Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico)
- Equipamentos de Proteção Individuais
- Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado
- Vírus da Imunodeficiência Humana
- Lowenstein-Jensen
- Laboratório de Diagnóstico e Pesquisas em Doença Endêmicas
- Mililitros
- Ministério da Saúde
- Mycobacterium tuberculosis
- Mycobacterial Interspersed Repetitive Units
- Neighbor-Joining
- Organização Mundial da Saúde
- Pares de Bases
- Reação em Cadeia da Polimerase
- Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
- Peso/Volume
- Restriction Fragment Length Polymorphism
- Ribonucleic acid (Ácido ribonucleico)
- Sociedade Brasileira de lnfectologia
- Secretaria Municipal de Saúde
- Sistema de Informações de Agravos de Notificação
- Secretaria Estadual de Saúde do Amazonas
- Tuberculose
- coinfecção por M. tuberculosis e HIV
- Hidrazida do ácido tiofeno-2-carboxílico
- Tratamento supervisionado
- Unidades Básicas de Saúde
- Unidades formadoras de colônias
- Variable Number of Tandem Repeats
- Ziehl-Neelsen
xii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................
1.1 Considerações gerais sobre a Tuberculose...................................................
1.2 Epidemiologia da tuberculose.........................................................................
1.2.1 Tuberculose no Brasil....................................................................................
1.2.2 Tuberculose no Amazonas............................................................................
1.2.3 Tuberculose em Manaus...............................................................................
1.2.4 Tuberculose na FMT-HVD.............................................................................
1.3 A tuberculose – Doença..................................................................................
1.3.1Tuberculose e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS)...................
1.3.2 O Genoma do M. tuberculosis.......................................................................
1.4 Transmissão e Sintomatologia.........................................................................
1.5 Diagnóstico.......................................................................................................
1.5.1 Diagnósticos Convencionais..........................................................................
1.5.1.1 Exame Direto..............................................................................................
1.5.1.2Exame de Cultura........................................................................................
1.5.1.2.1 Identificação do M. tuberculosis..............................................................
1.5.2 Métodos Moleculares.....................................................................................
1.5.2.1 Tipagem Molecular.....................................................................................
1.5.2.2 PCR em Tempo Real (RT-PCR).................................................................
01
01
02
05
06
07
09
10
12
13
14
15
16
16
17
19
19
21
22
2 OBJETIVOS........................................................................................................ 25
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 25
2.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 25
3 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................
3.1 Tipo de Estudo..................................................................................................
3.2 Considerações Éticas.......................................................................................
3.3 Local do Estudo................................................................................................
3.4 Participantes.....................................................................................................
3.5 Amostras Analisadas........................................................................................
3.6 Armazenamento de Amostras e Biossegurança .............................................
3.7 Processamento das Amostras..........................................................................
3.7.1 As amostras de tecido a fresco (biopsias de gânglio)...................................
3.7.2 Amostras de tecido fixadas em bloco de parafina.........................................
3.7.3 Líquor ............................................................................................................
3.7.4 Amostras de Cultura......................................................................................
3.8 Extração de DNA..............................................................................................
3.9 Controle de Qualidade da Extração......................................................................
3.9.1 Eletroforese em Gel de Agarose 1,0%..........................................................
3.10 Amplificação do DNA do M. tuberculosis por PCR.........................................
3.10.1 Eletroforese em gel de Agarose 2,0%.........................................................
3.11 Purificação do Produto da PCR para o Sequenciamento...............................
3.12 Reação de Sequenciamento..........................................................................
3.13 Análise Estatística..........................................................................................
3.14 Análise Filogenética........................................................................................
26
26
26
26
26
27
27
28
28
28
29
29
31
32
33
34
35
36
36
38
38
xiii
4. RESULTADOS FORMATO DE ARTIGO.......................................................... 39
4.1 Artigo 1 ........................................................................................................... 39
5 CONCLUSÕES...................................................................................................
59
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................
60
7. ANEXOS............................................................................................................. ..69
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais sobre a Tuberculose
A tuberculose (TB) é uma doença crônica causada por microrganismos do
complexo Mycobacterium tuberculosis é transmitida através da inalação de bacilos,
presentes em gotículas no ar eliminadas por indivíduos portadores de TB ativa.
Esses bacilos são patógenos extraordinariamente efetivos em humanos, apresentam
crescimento lento no interior de macrófagos. São organismos aeróbios estritos com
capacidade de persistir nos tecidos1.
A epidemia de tuberculose é hoje uma ameaça crescente nos países
desenvolvidos e constante nos países em desenvolvimento. O empobrecimento da
população, a desestruturação dos serviços de controle da tuberculose e a epidemia
do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) estão entre os principais fatores
associados á expansão da doença no mundo2.
A transmissão é plena enquanto o doente estiver eliminando bacilos e não tiver
iniciado o tratamento. O risco de adoecimento é grande tanto em menores de cinco
anos e idosos, como também em pessoas desnutridas, com silicose, diabetes e
usuários de drogas injetáveis3. A transmissão se dá através da fala, do espirro e,
principalmente, da tosse de um doente bacilífero lançando no ar gotículas
contaminadas que podem atingir os bronquíolos e alvéolos e iniciar a multiplicação
bacteriana4.
A TB pode acometer diferentes sítios do organismo humano, porém o pulmão é
o órgão mais frequentemente envolvido. Antes da pandemia do HIV, 80 a 85% dos
novos casos notificados de TB referiam a doença pulmonar isolada, 4 a 5% dos
casos ao comprometimento pulmonar associado com a doença extrapulmonar e
15% à doença extrapulmonar isolada5. Embora nos pacientes infectados pelo HIV o
acometimento dos sítios extrapulmonares seja mais frequente, a forma pulmonar
continua sendo responsável por 60 a 70% dos casos notificados de co-infecção
TB/HIV5.
2
A TB e o vírus HIV são uma combinação letal, sendo que a AIDS é um potente
fator de risco para TB. O vírus HIV não somente aumenta a chance de reativação da
infecção latente por M. tuberculosis, como também o risco de uma rápida
progressão da TB. A doença é uma das causas mais comuns de morbidade e
mortalidade em adultos HIV-positivos6-7-8.
O Amazonas mantém as mais altas taxas de incidência de TB no país,
ocupando a segunda posição dentre as unidades federadas9. A Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) em Manaus notificou em
2010, 353 casos de todas as formas de tuberculose, sendo 278 (78,8%) destes, HIV
positivo10.
Neste contexto, este estudo propôs a detecção do complexo IS6110 do
genoma de M. tuberculosis utilizando a técnica de reação em cadeia da polimerase
(PCR) e o sequenciamento direto de um fragmento da região IS6110 obtida de
diferentes tipos de amostras clínicas de pacientes com e sem HIV atendidos na
FMT-HVD, no período de janeiro de 2009 a janeiro de 2010.
1.2 Epidemiologia da tuberculose
A Organização Mundial da Saúde (OMS) publica anualmente um relatório
global sobre o controle da TB contendo dados de mais de 200 países, com o
objetivo de monitorar os indicadores epidemiológicos e acompanhar o nível e a
tendência da endemia no mundo. Além disso, esse relatório avalia a implementação
e o impacto da Estratégia Stop TB e os progressos para o alcance das metas dos
objetivos do milênio que visam à redução em 50% da taxa de incidência e
mortalidade até 2015. Segundo estimativas da OMS, aproximadamente 9,27 milhões
de casos novos (139 casos por 100.000 habitantes) ocorreram em 2007 no mundo.
Desses, 14,8% (1,37 milhão) foram co-infectados pelo HIV11.
Em 2008 foram notificados um total de 5,7 milhões de casos de tuberculose,
equivalente a 55-67% dos casos incidentes, com uma estimativa de 61% (10%
3
menos do que o marco Plano Global de uma taxa de detecção de casos de 71% em
2008)12. Entre os pacientes da coorte de 2007, 87% foram tratados com sucesso,
esta foi à primeira vez que a meta de 85% (primeira série em 1991) foi excedida, a
nível global11.
Um grupo de 22 países é responsável por 80% da carga de TB no mundo.
Desses, Índia, China, Indonésia, Nigéria e África do Sul ocupam as cinco primeiras
posições. O Brasil é o 18° país no mundo em número de casos novos de TB e o
108° em incidência da doença. Em 2007, havia 92 mil casos novos; destes, 49 mil
eram de Bacilos Álcool Ácido Resistentes (BAAR+), com taxa de incidência de 48 e
26 casos por 100.000 habitantes, respectivamente. Além disso, estima-se que 14%
dos casos de TB (todas as formas) sejam HIV+. Quanto à mortalidade, cerca de
8.400 óbitos são atribuídos à TB, ou seja, 4,4 mortes por 100.000 habitantes11.
No mundo inteiro, por décadas, até se chegou a ter a perspectiva de
eliminação
da
tuberculose.
Porém,
com
a
epidemia
da
Síndrome
da
Imunodeficiência Adquirida (AIDS) o cenário mudou por completo. Atualmente, a
meta da OMS é reduzir em 50% o número de casos e mortes por tuberculose em
todo o mundo até 2015, utilizando como base os números de 1990. Como parte
dessas metas o Rio de Janeiro recebeu no período de 23 a 25 de março de 2009 um
dos principais eventos de debates sobre iniciativas para acabar com a tuberculose, o
III Fórum de Parceiros Stop TB11.
O III Fórum de Parceiros Stop TB aconteceu em parceria com a OMS e
recebeu 1.300 participantes internacionais. A Sociedade Brasileira de lnfectologia
(SBI) foi uma das entidades que apoiaram o evento, que ocorreu pela primeira vez
em um país da América Latina. Movimento global criado para acelerar as políticas
públicas para a erradicação da tuberculose, o Stop TB planeja investir US$ 56
bilhões nos próximos dez anos. Os investimentos em pesquisa e campanhas para
ampliação do acesso a remédios devem salvar mais de 14 milhões de vidas11.
Cinco sub-regiões epidemiológicas (Europa Central, Europa Oriental, países de
alta renda, a América Latina e Pacífico Ocidental), parecem ter alcançado a Stop TB
Partnership meta de reduzir pela metade a taxa de mortalidade de 1990, antes do
4
ano de 2015. Prevalência e taxas de mortalidade estão caindo em todas as regiões,
com exceção nos países africanos, com alta prevalência do HIV. Onde parece
impossível atingir a meta global11.
O Stop TB prevê ainda ações de controle da relação entre AIDS e a
tuberculose, já que grande parte das pessoas infectadas pelo vírus do HIV acaba
morrendo por causa da tuberculose11. A Figura 1 abaixo mostra a distribuição global
da tuberculose.
Figura 1: Distribuição da tuberculose no mundo.
Fonte: WHO11.
1.2.1 Tuberculose no Brasil
Devido à sua prevalência nas últimas décadas e ao crescente desenvolvimento
de cepas multi-resistentes do bacilo de Koch (BK), a tuberculose tornou-se uma
doença que preocupa as autoridades sanitárias do Brasil e do mundo. Em 2008, 92
5
mil pessoas desenvolveram tuberculose. Destes, 73 mil foram notificados ao
Ministério da Saúde (MS). O Brasil ocupa o 18° lugar no mundo em número absoluto
de casos e o 108° em incidência (número de casos por 100.000 habitantes), sendo
responsável por cerca de 4,5 mil óbitos por ano no país e a primeira causa de morte
entre os pacientes com AIDS. Em 1999 a OMS propôs em nível mundial, a redução
dos casos de TB em 50% até 2015, e desde então o Brasil vem acordando entre as
três esferas de gestão, aumentar os indicadores epidemiológicos equivalentes a
detecção de 70% dos casos BK positivos; curar 85% destes casos; manter os óbitos,
e o abandono do tratamento abaixo de 5% e a cobertura vacinal com a vacina BCG
acima de 95% nos recém nascidos11.
Dados da OMS (2009) apontam no Brasil uma prevalência de 62/100.000
habitantes, com cerca de 50 milhões de infectados, 129 mil novos casos e seis mil
óbitos anualmente. Juntamente com o Peru, totaliza 50% dos casos confirmados na
América Latina11.
O Brasil apresenta diversidade de situações epidemiológicas, sociais e
demográficas com taxas de incidência diferentes da média nacional, maiores
principalmente nas regiões sócio-economicamente mais frágeis, como o Norte e o
Nordeste13.
Nos últimos anos, o país tem apresentado uma redução de 3,3% na notificação
de novos casos a cada ano. Além disso, houve uma redução nos índices de
mortalidade, que hoje representam 4 mil em cada 100 mil habitantes. Os estados do
Rio de Janeiro e Amazonas apresentam os maiores número de casos se comparado
à população local11.
Na distribuição de casos novos por unidade federada, observa-se que os
estados do Rio de Janeiro, Amazonas, Pernambuco, Pará, Rio Grande do Sul,
Bahia, Ceará, Acre, Alagoas e Maranhão possuem taxas de incidência superiores a
38,2 casos por 100.000 habitantes. Sendo que os estados do Rio de Janeiro e
Amazonas têm as maiores incidências com 71,7 e 66,9, respectivamente14 (Figura
2).
6
Figura 2: Distribuição da taxa de incidência de tuberculose no Brasil
Fonte: MS / SVS14.
1.2.2 Tuberculose no Amazonas
Conforme descrito anteriormente, o estado do Amazonas apresenta uma das
maiores incidências de TB no país com 66,9 casos/ 100 mil habitantes14.
Há pelo menos uma década, os estados do Amazonas e Rio de Janeiro
mantêm as mais altas taxas de incidência no país, ocupando um ou outro a primeira
posição dentre as unidades federadas9.
Segundo o Sistema de Informações de Agravos de Notificação (SINAN), o
coeficiente do estado do Amazonas de incidência da doença supera a média
nacional, apresentando uma distribuição geográfica desigual. As taxas mais altas
são encontradas nos municípios de São Gabriel da Cachoeira, Santa Isabel do Rio
7
Negro e Tabatinga, que têm elevados contingentes indígenas. São Gabriel da
Cachoeira chama atenção por apresentar os maiores coeficientes do país (acima
dos 350 casos por 100 mil habitantes)15.
De um modo geral, a tuberculose é mais comum em pessoas com pouca
escolaridade e em classes sociais mais baixas, sendo esta realidade mais dura e
sistemática na região Amazônica brasileira do que em outras áreas16.
1.2.3 Tuberculose em Manaus
O município de Manaus possui uma população estimada em 1.802.525
habitantes. Concentra 50% da população do estado e 68% dos casos notificados de
TB. Em 2006, a doença apresentava elevada morbidade em Manaus, com taxa de
incidência de 81,7 por 100.000 habitantes e taxa de mortalidade de 3,7 por 100.000
habitantes. No mesmo período, no Amazonas a taxa de incidência foi 60,4 por
100.000 habitantes e no Brasil, 41,8 por 100.000 habitantes9.
Durante décadas, o atendimento dos casos de tuberculose esteve centralizado
na Policlínica Cardoso Fontes, Centro de Referência Estadual para o controle da
doença. O processo de descentralização teve início na década de 90, mas, até o fim
de 2002, das 9.628 notificações existentes no banco de dados da Secretaria
Municipal de Saúde (SEMSA), somente 385 (4%) foram notificadas por Unidades
Básicas de Saúde (UBS) do município9.
Em 2003, as ações de controle da tuberculose foram expandidas para a Rede
Básica de Saúde de Manaus. Os casos diagnosticados e notificados pelas Unidades
de Referência (Policlínica Cardoso Fontes, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor
Vieira Dourado e Ambulatório Araújo Lima) passaram a ser encaminhados para as
UBS para continuidade do tratamento. Os registros de 2003 e 2004 foram
comparados nas situações antes e depois da revisão, observando-se um aumento
do percentual de cura de 42,2% para 81,8% no ano de 2003, e de 28,6% para
76,9%, no ano de 2004; diminuição do percentual de transferências de 43,5% para
4,2% em 2003 e de 49,6% para 6,9% em 20049.
8
Manaus apresenta 70% dos casos de tuberculose notificados no Amazonas,
situação favorecida pela grande concentração populacional. Em 2008 foi notificado
um total de 1.626 casos, dos quais 1.261 (77,5%) foram de tuberculose na forma
pulmonar, 299 (18,4%) na forma extrapulmonar e 66 (4,1%) na forma mixta
(extrapulmonar + pulmonar), tendo sido diagnosticados por exame direto através da
pesquisa do bacilo (BAAR+) 769 (47,3%) dos 1.626 casos. Das 1.626 notificações,
994 (61,1%) foram de homens e 632 (38,9%) de mulheres. A faixa etária mais
atingida foi entre 20 a 34 anos de idade, 618 (38,1%) casos17.
Em 2009 foram notificados 1.602 casos dos quais 1.264 (78,9%) na forma
pulmonar, 283 (17,7%) na forma extrapulmonar e 55 (3,4%) na forma mixta, sendo
853 (53,2%)/1.602 diagnosticados por exame direto (BAAR+). Dos 1.602 casos, 986
(61,5%) foram em homens e 616 (38,5%) em mulheres. A faixa etária com maior
prevalência foi também entre 20 a 34 anos de idade com 598 (37,3%) casos18.
Em 2010 foi notificado um total de 1.617 casos dos quais 1.297 (80,2%) na
forma pulmonar, 255 (15,8%) na forma extrapulmonar e 65 (4,0%) na forma mixta.
Dos 1.617 casos, 908 (56,2%) foram diagnosticados por exame de BAAR. Dos 1.617
casos, 964 (59,6%) foram em homens e 653 (40,4%) em mulheres.19.
Nos últimos anos, o índice de cura pós-tratamento foi menor que 85% e taxas
de abandono maiores que 10%. Na coorte de tratamento de 2008, o encerramento
por abandono de tratamento foi de 10,8% para TB todas as formas e de 14% na
forma pulmonar bacilífera9.
Com relação à distribuição espacial, todos os bairros da cidade apresentam
altas taxas de incidência. Em 2008, dos 56 bairros de Manaus, 57% apresentaram
taxa de incidência de TB em todas as formas, acima de 100/100.000 habitantes e
36% entre 50 a 99/100.000 habitantes17.
9
1.2.4 Tuberculose na FMT-HVD
A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), local
de realização deste estudo, notificou em 2008 um total de 279 casos de todas as
formas de tuberculose, sendo 145 (52,0%) da forma pulmonar da doença, 88
(31,5%) da forma extrapulmonar e 46 (16,5%) da forma mixta, foram diagnosticados
por exame de BAAR 70 (25,1%) dos casos. Dos 279 casos 189 (67,7%) pacientes
eram HIV positivo20.
Em 2009 foram notificados 280 casos de todas as formas de tuberculose,
sendo 165 (58,9%) da forma pulmonar, 83 (29,7%) da forma extrapulmonar e 32
(11,4%) da forma mixta, foram diagnosticados por exame de BAAR 78 (27,9%) dos
casos. Dos 280 casos 199 (71,1%) pacientes eram HIV positivo21.
Em 2010 houve um aumento considerável de casos notificados, 353 de todas
as formas de tuberculose, sendo 217 (61,5%) da forma pulmonar da doença, 77
(21,8%) da forma extrapulmonar e 59 (16,7%) da forma mixta, foram diagnosticados
por exame de BAAR 89 (25,2%). Dos 353 casos 278 (78,8%) pacientes eram HIV
positivo22.
1.3 A tuberculose – Doença
Os microrganismos causadores da tuberculose são bactérias do complexo
Mycobacterium tuberculosis, família Mycobacteriaceae, ordem Actinomycetales,
constituído de várias espécies. Atualmente são conhecidas mais de 120 espécies
dentro do gênero Mycobacterium, sendo que, a grande minoria destas é patogênica
para os seres humanos, podendo causar tuberculose (complexo M. tuberculosis) e
lepra (M. leprae). O M. tuberculosis é um dos elementos do complexo M.
10
tuberculosis, juntamente com o Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG,
Mycobacterium africanum e o Mycobacterium microti. Acredita-se que o complexo M.
tuberculosis,
provavelmente,
derive
de
um
bacilo
ancestral
designado
“Mycobacterium prototuberculosis”23-24. Todos os bacilos pertencentes a este
complexo, sem exceção, são resistentes à ação de agentes químicos e sensíveis
aos agentes físicos, como a radiação ultravioleta e o calor. As espécies são
identificadas e diferenciadas com base nas suas características morfológicas,
fisiológicas e bioquímicas25.
O M. tuberculosis, é o principal agente patogênico responsável pela
tuberculose em seres humanos26. O bacilo da tuberculose é uma bactéria imóvel, de
forma cilíndrica, não capsulada, que não forma esporos, não produz toxinas e não
tem flagelo. Possui cerca de 0,3 a 0,5 µm de largura, 1 a 4 µm de comprimento com
uma parede celular bastante complexa27.
Na parede celular das micobactérias existe um elevado teor de lipídios
complexos de alto peso molecular, os ácidos micólicos, que torna a sua superfície
hidrofóbica. Os ácidos micólicos são ácidos gordos longos, contendo 70 – 90 átomos
de carbono na sua totalidade. Além disso, a parede celular dessas bactérias é
constituída por um polímero rígido, insolúvel em água e quimicamente complexo,
designado de peptidoglicano. Entre o peptidoglicano e os ácidos micólicos existe
uma camada única de polissacarídeos, o arabinogalactano. Os ácidos micólicos e o
arabinogalactano encontram-se covalentemente ligados um ao outro, formando um
complexo, que por sua vez liga-se ao peptidoglicano. Deste modo, a complexidade e
a unicidade da parede celular advêm da sua constituição em ácidos micólicos e
polissacarídeos (Figura 3). O peptidoglicano envolve a bactéria, permitindo o fluxo
de pequenas moléculas e protegendo-a contra o choque osmótico27-28.
Lipídeos
11
Camada externa
Mycolates
Camada interna
AG
Peptidoglicano
Membrana citoplasmática
Figura 3: Modelo da constituição da parede celular do M. tuberculosis29.
Devido ao elevado conteúdo de ácidos micólicos, as micobactérias beneficiamse de uma parede celular espessa, conferindo-lhes proteção e tornando-as
relativamente resistentes a grande parte dos antibióticos e a outras drogas utilizadas
no tratamento. A característica hidrofóbica faz com que a estrutura da parede seja
impermeável a diversos compostos. Estas propriedades são importantes, não só em
termos biológicos, como também na patogenia da infecção25-27-28.
As micobactérias, do ponto de vista de coloração, pertencem ao grupo
chamado álcool-ácido resistente. Esta característica advém da composição da
parede celular rica em ácidos micólicos que é responsável pela coloração. O
elevado teor lipídico da parede celular dificulta a coloração das micobactérias pela
convencional técnica de Gram. Assim, se por um lado, são resistentes à coloração
por vários métodos, como por exemplo, o de Gram, por outro lado, coram quando se
recorre a metodologias mais enérgicas como o Ziehl-Neelsen (ZN). A coloração de
ZN cora os bacilos de vermelho contra um fundo azul. Uma vez coradas, resistem à
descoloração por soluções de álcool-ácidos, sendo-lhes por isso atribuída a
designação de bactérias álcool-ácido resistentes30.
O crescimento do M. tuberculosis em ambiente laboratorial é lento, com
período de divisão de 18 horas, sendo necessárias várias semanas para que as
12
colônias se tornem visíveis, requer 2 a 6 semanas de crescimento em meio sólido,
tornando-se visível na sua superfície25.
O M. tuberculosis é um microorganismo considerado parasita intracelular
facultativo, sendo capaz de sobreviver no interior de células fagocitárias. Em 90%
dos casos, a infecção pelo M. tuberculosis é contida pelo sistema imunológico do
hospedeiro, porém em 10% dos casos pode evoluir para a forma de doença.
Estudos experimentais revelam que a variação existente no potencial de
transmissão pode ser atribuída às propriedades patogênicas do bacilo. Assim,
apesar da variabilidade genética do bacilo, estar relacionada com a susceptibilidade
da doença, torna-se difícil determiná-la. Além disso, populações mais recentemente
expostas ao bacilo da tuberculose, possuem maior propensão ao desenvolvimento
da doença quando comparadas com outras que co-existiram com a tuberculose,
durante décadas25.
1.3.1 Tuberculose e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS)
O surgimento da AIDS na década de 80, juntamente com o surgimento de
cepas resistentes à terapêutica habitual, contribuíram não somente para o aumento
da incidência, como também para as mudanças na apresentação e evolução da
TB31. Os pacientes infectados pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
possuem um risco aumentado em 10 vezes de desenvolver TB ativa devido ao alto
risco de reativação e evolução de infecções latentes nesses indivíduos32-33-34. O
risco de reativação de uma infecção micobacteriana latente nos pacientes HIV
positivos é de 9,7-10,4 casos em 100 pacientes quando comparado aos pacientes
HIV negativos 0,07-0,1 casos em 100 pacientes35.
De acordo com a recente epidemiologia da TB realizada nos países africanos e
Sub-Saáricos, o número de casos de TB triplicou num período de 10 anos11. A
associação TB/AIDS também tem sido observada em todo o mundo, estima-se que
21 milhões de pessoas em todo o mundo estejam co-infectados, sendo que 70%
estão concentrados na África11.
13
Nos pacientes infectados pelo HIV, a TB pulmonar é a forma mais comum da
doença, embora a TB extrapulmonar também seja freqüente e possa ocorrer em
função da acentuada imunossupressão. As formas mais comuns de TB
extrapulmonar em indivíduos HIV+ são a efusão pleural, doença pericárdica e TB
miliar32. Indivíduos soropositivos apresentam um padrão atípico de TB com achados
radiográficos incomuns e em muitos casos o diagnóstico é feito na necropsia36.
1.3.2 O Genoma do M. tuberculosis
A cepa H37Rv é a estirpe de M. tuberculosis mais bem caracterizada. A fim de
compreender a biologia deste patógeno de crescimento lento, seu genoma completo
foi seqüenciado e a sequência analisada26. O genoma do bacilo da tuberculose
compreende 4.411.529 pares de bases (pb), com cerca de 4000 genes e um
elevado conteúdo de guanina e citosina (65,6%), ao longo do genoma. Representa
o segundo maior genoma já determinado, sendo que o primeiro maior genoma
bacteriano pertence à Escherichia coli26.
Os genes existentes no M. tuberculosis na sua grande maioria estão envolvidos
na síntese de enzimas responsáveis pela produção de lipólise e lipogênese,
garantindo assim a sua sobrevivência e a síntese da parede celular. No total,
existem cerca de 250 enzimas envolvidas no metabolismo dos ácidos gordos,
comparados com apenas 50 na Escherichia coli. Cerca de 10% da capacidade de
codificação do genoma dedica-se a duas famílias de proteínas acídicas, ricas em
glicina, cujos genes estão agrupados26. Em outras bactérias patogênicas, estas
proteínas estão relacionadas a mecanismos ligados a variabilidade antigênica26.
Curiosamente, cerca de 59% dos genes são transcritos na mesma direção em
que se realiza a replicação. Esta propriedade pode, provavelmente, estar
relacionada com o crescimento lento do bacilo e com a pouca frequência de ciclos
de replicação25-26.
14
O genoma é rico em sequências de DNA repetitivas, especialmente elementos
de inserção, localizadas em regiões intergénicas ou não-codificantes. Estas
sequências de inserção são elementos genéticos que variam e se repetem em
diferente número e posição no genoma do M. tuberculosis. Esta característica é que
diferencia as várias estirpes do complexo M. tuberculosis25-26. Através da análise do
genoma do M. tuberculosis, torna-se claro que, além das várias funções envolvidas
no metabolismo dos lipídios, as enzimas necessárias para a glicólise e todos os
outros mecanismos presentes, também ajudam a evidenciar a grande dinâmica do
metabolismo dos bacilos25.
1.4 Transmissão e Sintomatologia
A transmissão ocorre pelo ar através de perdigotos, espirro ou tosse de
indivíduos com TB pulmonar. A transmissão geralmente ocorre em locais fechados,
escuros e sem ventilação. O risco do indivíduo se infectar depende do tempo de
exposição e da suscetibilidade do mesmo. Quando um doente com tuberculose
pulmonar respira, fala, tosse ou espirra pode expelir grandes quantidades de bacilos
para o ambiente que o rodeia, estes têm a capacidade de permanecer em
suspensão, podendo ficar assim durante várias horas, as gotículas mais pesadas se
depositam rapidamente e as mais leves permanecem em suspensão no ar, somente
os núcleos secos das gotículas (núcleo de Wells), com diâmetro de até 5μm e com 1
a 2 bacilos em suspensão, podem atingir os bronquíolos e alvéolos e iniciar sua
multiplicação4.
Uma vez infectado, o indivíduo permanece nesse estado por muitos anos.
Porém a maioria (90%) das pessoas HIV negativas infectadas com Mycobacterium
tuberculosis não desenvolvem a doença, entretanto, pessoas infectadas pelo HIV
podem desenvolver TB a qualquer momento30.
Durante a inspiração, partículas de pequeno tamanho, que contêm um ou mais
bacilos, podem ser inaladas por um ou vários indivíduos, depositando-se nos seus
15
pulmões. Estas partículas também podem disseminar-se para outros órgãos através
da corrente sanguínea. As partículas maiores ficam retidas no trato respiratório
superior, particularmente no nariz e na traquéia, e são eliminadas juntamente com a
expectoração. Os doentes com tuberculose no trato respiratório superior e inferior
são mais contagiosos do que aqueles que possuem a doença em outros locais do
organismo30.
Na maioria dos casos, os sintomas não são inicialmente valorizados, pois são
inespecíficos, perpetuando-se e agravando-se ao longo do tempo, de forma
indolente. A doença costuma afetar principalmente os pulmões com índice de até
75% dos casos de doença. Quando ocorre em outros órgãos do corpo, disseminada
através da corrente sanguínea, é designada de tuberculose extra-pulmonar. Na
tuberculose pulmonar os principais sintomas são cansaço fácil, perda de apetite,
fraqueza,
emagrecimento,
suores
noturnos,
febre
habitualmente
baixa
de
predomínio vespertino e tosse persistente, frequentemente acompanhada por
expectoração hemorrágica. Na tuberculose extra-pulmonar existem sintomas muito
variados, dependendo do órgão atingido30.
1.5 Diagnóstico
Ao longo dos anos, contribuições da Ciência e da Medicina permitiram
desenvolver, um conjunto valioso de técnicas e métodos de diagnóstico que nos
permitem investigar a tuberculose com grande margem de certeza. Assim, os
doentes são primeiramente sujeitos a um diagnóstico clínico seguido de um
diagnóstico laboratorial. O diagnóstico clínico compreende: métodos imaginológicos,
como a radiografia pulmonar, a ecografia, a tomografia axial computadorizada, a
ressonância magnética; métodos imunológicos, como a intradermoreacção de
Mantoux e a apresentação clínica dos sintomas. O diagnóstico laboratorial da
tuberculose obriga ao isolamento e identificação do M. tuberculosis a partir de
diferentes tipos de amostras biológicas tais como expectorações, suco gástrico,
líquido pleural, ascítico e pericárdico, líquor, pus, urina, sangue e fezes. Para o
mesmo efeito, também se recorre à análise de biópsias, fragmentos de tecidos ou
16
peças cirúrgicas dos órgãos afetados. De todos os métodos referidos, apenas os
laboratoriais identificam o M. tuberculosis e permitem um diagnóstico conclusivo.
Todas as outras abordagens apenas permitem um diagnóstico presuntivo25-30.
1.5.1 Diagnósticos Convencionais
Embora o diagnóstico inicial da TB seja baseado em evidências clínicas, o
diagnóstico definitivo envolve o isolamento e a identificação laboratorial do bacilo.
Os pacientes que apresentam sinais suspeitos de TB como, tosse com mais de três
meses de duração, produção de escarro e perda de peso, são primeiramente
pesquisados quanto à positividade para BAAR em 3 amostras de escarros, através
da coloração de ZN. Este é um teste rápido e barato, porém possui baixa
sensibilidade, pois para a detecção do bacilo, são necessários 5.000-10.000
microrganismos por mililitro de escarro33-37.
1.5.1.1 Exame Direto
O exame direto consiste na pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes,
através da sua visualização ao microscópio convencional ou de fluorescência,
dependendo da coloração efetuada (coloração de Ziehl-Neelsen e Auraminarodamina respectivamente). As micobactérias não possuem capacidade de corar
pela convencional técnica de Gram, sendo utilizada a técnica de Ziehl-Neelsen.
Após esta coloração os bacilos aparecem fino, reto ou curvado, corados de
vermelho contra um fundo azul (Figura 4). Esta particularidade deve-se ao elevado
conteúdo em lípidios na parede celular das micobactérias, conferindo assim uma
característica álcool-ácido resistente muito própria. Apesar da morfologia tão
característica, o exame microscópico não permite identificar o M. tuberculosis, dando
apenas um diagnóstico presuntivo de tuberculose, sendo necessário proceder à
identificação da espécie do microorganismo presente. É um exame simples, barato,
17
rápido, com especificidade e sensibilidade variáveis, de acordo com a extensão da
doença25-30.
Figura 4: Imagem de coloração de Ziehl Neelsen. Os M. tuberculosis estão
evidenciados na cor vermelha.
Fonte: Tambe38.
1.5.1.2 Exame de Cultura
A par do exame direto, procede-se ao exame cultural, normalmente realizado
em meios de cultura sólidos como o clássico meio de Lowenstein-Jensen (LJ). Estes
meios são solidificados por aquecimento a 85-90ºC durante 45 minutos, resistindo
mais tempo à desidratação durante períodos de incubação prolongados. O M.
tuberculosis não se desenvolve ou muito dificilmente nos meios de cultura
tradicionais utilizados para a maioria das outras bactérias25-30.
Depois de semeados, os meios de cultura são incubados a 36-37ºC durante
cerca de 2 a 6 semanas, devendo ser examinados semanalmente para verificar o
crescimento das micobactérias. Ao observar o crescimento de colônias, para
confirmação da presença do bacilo, realiza-se um esfregaço em lâmina de
microscopia seguido de coloração pela técnica de ZN. As culturas de M. tuberculosis
possuem uma morfologia típica, muito característica, sendo as colônias não
pigmentadas, rugosas e em forma de couve-flor25-30 (Figura 5).
18
Figura 5: Imagem de cultura do M. tuberculosis: a identificação baseia-se no tempo
de crescimento (lento), na morfologia das colônias (rugosas) e na pigmentação (não
cromogêneas).
Fonte: Rodrigues e Pinto39.
O isolamento de M. tuberculosis por cultura em meio sólido continua sendo o
método de referência com o qual todos os novos métodos são comparados. O
principal problema desse método é a morosidade na obtenção do resultado, pois
depende da lentidão de crescimento das micobactérias. No entanto, foram
desenvolvidos meios de cultura líquidos que favorecem o crescimento das
micobactérias e permitem a sua detecção, através da utilização de indicadores de
crescimento30-40.
Dentre estes destacam-se os sistemas semi ou automatizados tais como o
BACTEC 460 TB (Becton Dickinson Instrument System) e o BACTEC/MGIT
(Mycobacteria Growth Indicator Tube) 960, desenvolvidos na década de 70 que
tornaram-se referência contra os quais os novos sistemas são comparados40-41.
Estes sistemas baseiam-se na detecção de micobacterias através da radiometria em
meio líquido de Middlebrook contendo ácido palmítico marcado com Carbono 14 e
na detecção fluorimétrica de consumo de oxigênio respectivamente30-40.
1.5.1.2.1 Identificação do M. tuberculosis
19
O bacilo da tuberculose pode ser identificado através da análise das
características morfológicas das suas colônias em meio sólido, seguida da execução
de provas bioquímicas. Estas provas são a detecção da niacina, o teste da catalase,
teste da redução dos nitratos e a susceptibilidade ao TCH (hidrazida do ácido
tiofeno-2-carboxílico). Esta forma de identificação, além de ser muito elaborada, é
também muito morosa30.
1.5.2 Métodos Moleculares
Enquanto a microscopia e a cultura ainda são de suma importância para o
diagnóstico laboratorial da tuberculose, novos métodos, incluindo o diagnóstico
molecular têm evoluído ao longo das últimas duas décadas. A maioria dos testes
moleculares têm-se centrado na detecção e amplificação de ácidos nucléicos DNA e
ácidos ribonucléicos RNA, específicos do Mycobacterium tuberculosis, como a
reação em cadeia da polimerase (PCR), e na pesquisa de mutações gênicas
associadas à resistência aos medicamentos anti-tuberculose realizada pelo
sequenciamento genético ou hibridação de ácidos nucléicos5.
A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem se destacado como uma das
mais promissoras técnicas moleculares para o diagnóstico rápido do M.
tuberculosis42. Principalmente nos procedimentos que associam duas PCRs (nestedPCR) conciliando maior sensibilidade e especificidade43. Miyazaki et al.43, ao
analisarem a técnica de diagnóstico da tuberculose por nested-PCR, relataram um
limite de detecção para a primeira PCR de 102 unidades formadoras de colônias
(UFC) com aumento de mil vezes após a segunda reação e sensibilidade de até 0,1
UFC. O custo da PCR na rotina é factível, considerando que o diagnóstico rápido em
pacientes
paucibacilares
permite
instituir
o
tratamento
específico
o
mais
precocemente possível, diminuindo assim as fontes bacilíferas e a cadeia de
transmissão44.
20
Vários elementos repetitivos de DNA que contribuem para a variação genética
de cepas foram descobertos em M. tuberculosis. Um deles é a sequência de
inserção IS611045, que é um elemento genético de 1.350 pares de bases, presente
exclusivamente, nas espécies do complexo M. tuberculosis em diferentes números
de cópias e integrado em vários sítios cromossômicos46-47-48. Além da IS6110, outras
sequências alvos têm sido utilizadas no diagnóstico molecular da tuberculose, como
genes que codificam proteínas de 32kDa, 38 kDa (PhoS, CIE Ag78 ou Pab), 65 kDa
(GroEL), a proteína MPB64 (23 kDa) e os genes dnaJ e mtp 4043-49-50-51-52-53.
A reação em cadeia da polimerase PCR é uma técnica molecular cuja escolha
do DNA alvo e definição dos primers dentro da sequência de DNA são fatores
determinantes na sua acuidade. Vem sendo utilizada como alternativa de alta
sensibilidade e especificidade para o diagnóstico rápido de doenças infecciosas.
Entretanto, a sua aplicação na detecção do Mycobacterium tuberculosis tem
apresentado resultados variáveis, principalmente em relação à sensibilidade do
teste44.
A IS6110 é a sequência mais comumente usada por ser repetitiva no genoma
do M. tuberculosis. Essa característica propicia um aumento na sensibilidade da
PCR, quando comparada com a amplificação de sequências únicas no DNA.
Entretanto, a sequência IS6110 já foi relatada como ausente em cepas de M.
tuberculosis isolada na Índia, no Brasil não há relato de cepas de M. tuberculosis
sem a IS611044.
1.5.2.1 Tipagem Molecular
A tipagem molecular de estirpes de M. tuberculosis é essencial em estudos
epidemiológicos. Métodos baseados na análise de sequências repetitivas de DNA,
associados a estudos epidemiológicos convencionais, têm contribuído para melhorar
os conhecimentos sobre a transmissão da tuberculose54-55-56.
21
Das várias sequências de DNA utilizadas como marcadores genéticos, o
elemento de inserção IS6110 é o mais utilizado. Esta inserção varia em número e
posição no genoma da bactéria, sendo o número de cópias entre 1 a 20 por
cromossomo. As diferentes estirpes do complexo M. tuberculosis apresentam grande
variabilidade entre si, quer no número de cópias, quer na sua localização. Existe, no
entanto, a possibilidade de uma ou outra estirpe mais rara não apresentar este
elemento48-54-56.
A grande utilidade do elemento de inserção IS6110 pode ser verificada pela
técnica Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP), atualmente considerada
referência para tipagem de M. tuberculosis54-56. Esta técnica envolve amplificação de
DNA, digestão com enzimas de restrição, separação por eletroforese dos diferentes
fragmentos obtidos e análise utilizando software apropriado. As diferentes estirpes
são agrupadas de acordo com o número e peso molecular das bandas. Este método
apesar de possuir um elevado poder de discriminação apresenta algumas
desvantagens. Além de ser um processo lento e de difícil execução, não consegue
distinguir, muito bem, estirpes com um número de cópias do elemento de inserção
IS6110 igual ou inferior a cinco. Sendo importante associar outro método de tipagem
complementar da região IS6110 por RFLP48-54.
Outro método de tipagem que vem sendo implementado com sucesso na
diferenciação de estirpes de M. tuberculosis, baseia-se na PCR e num número
variável de repetições em tandem (Variable Number of Tandem Repeats – VNTR’s)
de unidades repetitivas de DNA micobacteriano (Mycobacterial Interspersed
Repetitive Units – MIRUs)56.
Esta metodologia tem um poder de resolução muito próximo do método de
RFLP por IS611056. MIRUs são pequenos elementos de DNA (40 – 100 pares de
bases) frequentemente encontrados como repetições em tandem e dispersos em
regiões intergénicas no genoma do M. tuberculosis. A cada estirpe tipada é atribuído
um número correspondente ao número de repetições do loci MIRU, formando a base
de um sistema de codificação que facilita comparações entre diferentes laboratórios.
Esta técnica utiliza um sistema de combinação de 12, 15 ou 24 loci, o que permite
aumentar o seu poder de resolução56.
22
Relativamente à tipagem pelo método de RFLP por IS6110, o método MIRUVNTR é mais rápido e permite fazer comparações de estirpes a nível global, uma
vez que, os resultados são expressos em códigos numéricos56.
1.5.2.2 PCR em Tempo Real (PCR-RT)
A técnica de PCR em tempo real representa grande avanço nos métodos
moleculares de auxílio diagnóstico. Esta técnica pode ser utilizada para avaliação da
carga viral ou bacteriana, determinação da resistência a antibióticos e até mesmo
para o prognóstico de tumores malignos. Utiliza um sistema fluorescente em
plataforma capaz de detectar a luz oriunda da reação de amplificação57.
A PCR em tempo real associa a metodologia de PCR a um sistema de
detecção e quantificação de fluorescência produzida durante os ciclos de
amplificação. Deste modo, a metodologia permite a amplificação, detecção e
quantificação de DNA em uma única etapa, agilizando a obtenção de resultados e
minimizando o risco decorrente de possíveis contaminações58.
Os equipamentos, destinados à realização de PCR em tempo real, associam
um termociclador a um leitor de fluorescência capaz de medir a luz proveniente de
uma reação de amplificação. A metodologia utiliza os mesmos reagentes de uma
PCR convencional acrescidos de fluorocromos, intercalados em cadeias de DNA
(metodologia Sybr Green) ou presentes em sondas de hibridação específicas
(metodologia TaqMan). Na presença de produto amplificado, os fluorocromos,
excitados por uma fonte de luz (laser), emitem um sinal proporcional à quantidade
de produto sintetizado que, por sua vez, será proporcional à quantidade inicial de
sequências-alvo presentes na reação de amplificação58.
23
Os sinais são detectados por um sistema óptico e analisados por software
específico. Os sinais de fluorescências, produzidos à medida que o produto é
amplificado, são expressos graficamente (sinais de fluorescência versus número de
ciclos) permitindo monitorar, em tempo real, a cinética e a eficiência da reação de
amplificação58.
Dentre as vantagens desta técnica podemos citar: redução do risco de
contaminação cruzada, curto tempo necessário para a realização da técnica,
permitindo resultados mais rápidos, além de apresentar execução simples associada
a excelente sensibilidade e especificidade. Cumpre observar que a utilização das
tecnologias de amplificação em tempo real ainda permanece com uso limitado
devido aos elevados custos relacionados aos reagentes e, principalmente, aos
sistemas de detecção empregados. Entretanto, tal viés possui a tendência de
resolução em curto prazo com a ampliação e importância das aplicações
multidisciplinares do uso rotineiro da PCR e PCR-RT57.
As justificativas para este trabalho são diversas; a tuberculose é uma doença
infecto-contagiosa, cujos agentes etiológicos são microrganismos do complexo
Mycobacterium tuberculosis, que tem permanecido até os dias de hoje, como um
sério problema mundial de saúde pública. Depois de ter sido considerada sob
controle, a tuberculose ressurgiu de uma forma bastante preocupante, na medida
em que o número de casos da doença aumentou drasticamente devido à coinfecção com o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). O estado do Amazonas
tem uma incidência de 66,9 casos /100 mil habitantes, mantendo-se entre as mais
altas taxas de incidência no país, ocupando a primeira ou segunda posição dentre
as unidades federadas. O município de Manaus representa 70% dos casos
notificados no Amazonas, sendo em 2008 notificado um total de 1626 casos, em
2009 um total de 1602 casos e em 2010 um total de 1617 casos.
Alguns fatores têm sido apontados como elementos que contribuíram para o
aumento da tuberculose ou sua reemergência: desigualdade social, advento da
24
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), envelhecimento da população,
grandes movimentos migratórios e a emergência de bacilos resistentes às drogas.
Em relação ao diagnóstico laboratorial que tradicionalmente visa a pesquisa
dos bacilos álcool-ácidos resistentes (BAAR), através da coloração de ZN e o
isolamento do M. tuberculosis em cultura. No primeiro caso é um método simples,
barato e rápido, porém possui baixa sensibilidade e especificidade, pois para a
detecção são necessários no mínimo, 5000 bacilos por mL de espécime. Por outro
lado a cultura do M. tuberculosis apesar de ser o padrão ouro para a confirmação
diagnóstica da tuberculose, devido ao crescimento lento da bactéria, requer de 2 a 6
semanas para um diagnóstico definitivo. Com isso na tentativa de reduzir o tempo de
detecção das micobactérias, sem prejudicar a veracidade dos resultados e como
alternativa ou complemento aos métodos tradicionais o presente estudo propôs o
uso das ferramentas da biologia molecular, mais precisamente a reação em cadeia
da polimerase (PCR) e o sequenciamento direto para detecção e caracterização do
M. tuberculosis em diferentes tipos de amostras clínicas de pacientes suspeitos de
tuberculose, esperando desta forma, contribuir para o desenvolvimento diagnóstico
na região e principalmente para a melhoria da qualidade de vida dos pacientes.
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
25
•
Investigar a detecção e as características filogenéticas de agentes do
complexo Mycobacterium tuberculosis em amostras clínicas de
pacientes suspeitos de tuberculose portadores ou não do vírus do
HIV, atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado (FMT-HVD).
2.2 Objetivos Específicos
• Utilizar a reação em cadeia da polimerase (PCR) amplificação do
complexo de inserção IS6110 do Mycobacterium tuberculosis, em
amostras clínicas de pacientes com diagnóstico sugestivo de
tuberculose;
• Comparar a sensibilidade e especificidade dos métodos convencionais
e moleculares para o diagnóstico da tuberculose em amostras de
biopsias de gânglio, liquor e tecidos parafinados;
• Caracterizar as micobactérias do complexo M. tuberculosis que
circulam no Amazonas;
3
MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Tipo de Estudo
26
Trata-se de um estudo descritivo retrospectivo, para pesquisa de M.
tuberculosis utilizando a PCR, em amostras isoladas de pacientes com diagnóstico
suspeito de tuberculose, portadores ou não do vírus HIV, atendidos na Fundação
de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), no período de janeiro
de 2009 a janeiro de 2010.
3.2 Considerações Éticas
Este estudo é parte do projeto “Caracterização Molecular de Micobactérias e de
Mutações Associadas ao Mecanismo de Resistência às Drogas”, da pesquisadora
Profa. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira, aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) da FMT-HVD, processo número 1534/2008, de acordo com a Resolução CNS
196/96 (Anexo I).
3.3 Local do Estudo
Este estudo foi realizado nas dependências do Laboratório de Diagnóstico e
Pesquisas em Doenças Endêmicas (LPDE) com o apoio da Gerência de
Bacteriologia e Patologia da FMT-HVD, Manaus- Amazonas. No Amazonas, a FMTHVD é uma instituição de referência no atendimento de doenças infectocontagiosas, oferece serviço de atendimento especializado a todo paciente portador
do vírus HIV e pacientes com tuberculose.
3.4 Participantes
Foram incluídas no estudo 03 tipos de amostras biológicas encaminhadas ao
Laboratório de Infectologia Celular e Molecular no LPDE, sendo estas, amostras de
líquor, tecidos fixados em parafina e biopsias de gânglios. As biopsias foram
gentilmente cedidas pelo médico cirurgião Dr. Marcio Cortez, membro da equipe
27
deste projeto e do quadro clínico da FMT-HVD. As amostras de tecidos fixados em
bloco de parafina e liquor foram encaminhadas pelo Laboratório de Patologia e
Centro Cirúrgico da FMT-HVD, respectivamente.
3.5 Amostras Analisadas
Foram analisadas 107 amostras clínicas provenientes de 104 pacientes, sendo:
•
75 amostras de biopsias de gânglio a fresco;
•
28 amostras de tecido fixadas em bloco de parafina e
•
4 amostras de líquor.
Como controle positivo foram usadas duas amostras de cultura previamente
identificadas como M. tuberculosis e gentilmente cedidas pela Dra. Rossicléia Lins
Monte, do Laboratório de Bacteriologia da FMT-HVD. Como controle negativo, foi
usado amostras com diagnóstico de baciloscopia e cultura negativa para TB e uma
alíquota de reagentes sem amostra.
3.6 Armazenamento de Amostras e Biossegurança
As amostras foram armazenadas em freezer -80oC, em microtubos de 1,5 mL
estéreis devidamente identificados. A manipulação dessas amostras foi realizada em
cabine de segurança biológica classe 2, em ambiente com exaustão externa
destinado a manipulação de amostras clínicas de pacientes com suspeita de TB.
Foram utilizados ainda Equipamentos de Proteção Individuais (EPI’s), recomendado
no manual de manipulação de material clínico suspeito de TB da Agência Nacional
de Vigilância Sanitária (ANVISA), tais como, avental manga longa descartável, luvas
cirúrgicas, óculos de proteção, gorro e respirador tipo N95.
Como controle de contaminação dos procedimentos laboratoriais foi incluído
em cada extração de ácido nucléico e nas reações de PCR um controle negativo
28
(reagentes sem amostras) e um positivo (amostra de cultura) que permaneceram até
a reação de sequenciamento.
3.7 Processamento das Amostras
As amostras foram processadas de acordo com o tipo de material biológico
analisado.
3.7.1 As amostras de Tecido a Fresco (Biopsias de Gânglio)
As biopsias foram recebidas no Laboratório de Infectologia Celular e Molecular
em microtubos de 1,5 mL estéreis, sendo algumas sem conservante ou fixador e
outras preservadas em 200 µL de tampão contendo Tris-EDTA (2,5mM). No
laboratório, estas foram armazenadas em freezer -80oC para posterior análise
molecular.
3.7.2 Amostras de Tecido Fixadas em Bloco de Parafina
As amostras fixadas em parafina procedentes do Laboratório de Patologia da
FMT-HVD, foram previamente cortadas na espessura de 20 µm por profissional do
referido laboratório e enviadas ao LPDE em microtubo de 1,5 mL estéril. No
Laboratório de Infectologia Celular e Molecular, estas amostras passaram pelo
seguinte processo de desparafinização com xilol e etanol: Incubação com 1,0 mL de
xilol a 60ºC por 10 minutos, seguido de centrifugação a 13000 rpm por 10 minutos,
este procedimento foi repetido por duas vezes, seguido de lavagem com 1,0 mL de
etanol absoluto, centrifugação a 13000 rpm por 10 minutos e secagem a
temperatura ambiente até completa evaporação do etanol. Após esse procedimento,
29
foi realizada a extração do ácido nucléico utilizando o kit Qiamp DNasy Blood &
Tissue (QIAGEN), conforme as recomendações do fabricante.
3.7.3 Líquor
Estas amostras foram recebidas no LPDE em um volume de 1,0 a 5,0 mL em
tubo estéril sem conservante, mantidas a temperatura ambiente. No Laboratório de
Infectologia Celular e Molecular, 200 uL de cada amostra foram imediatamente
submetidos a extração do ácido nucléico e o restante armazenado em freezer -80oC,
para posterior análise, se necessário.
3.7.4 Amostras de Cultura
Amostras de cultura foram utilizadas somente para obtenção dos controles
positivos. Três colônias de cada tubo foram colocadas em um tubo tipo Falcon
contendo 5,0 mL de Tris-HCL pH 8.0 e inativadas por fervura durante 10 minutos
antes de proceder a extração do DNA genômico bacteriano.
As culturas utilizadas foram previamente identificadas como M. tuberculosis
pela bacteriologista Dra. Rossicléia Lins Monte (FMT-HVD), como parte da rotina do
referido laboratório e gentilmente cedidas para análise molecular neste estudo.
Conhecendo a complexidade das técnicas de biologia molecular, buscou-se
padronizá-las de modo que pudessem ser realizadas de maneira simplificada e
fossem facilmente reproduzidas no laboratório, preservando sempre as boas
práticas laboratoriais a fim de evitar qualquer contaminação.
30
A seguir o fluxograma das atividades laboratoriais desenvolvidas no estudo, a
partir da extração de acido nucléico (Figura 6).
EXTRAÇÃO DNA
Qiamp DNasy Blood & Tissue (QIAGEN)
PCR-ALFATUBULINA
31
GEL DE AGAROSE 1%
PCR-TB (220 pb)
GEL DE AGAROSE 2%
(-)
(+)
Nested-PCR-TB (123 pb)
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO
ANÁLISE DOS DADOS
(-)
(+)
PCR-POSITIVO
PCR-NEGATIVO
LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS
Figura 6. Fluxograma de atividades laboratoriais
3.8 Extração de DNA
A extração do DNA foi realizada utilizando o kit Qiamp DNasy Blood & Tissue
(QIAGEN), de acordo com as recomendações do fabricante, a seguir descritas: em
um microtubo de 2,0mL contendo os diferentes tipos de amostras biológicas
previamente
preparadas,
conforme
protocolos
descritos
anteriormente,
foi
adicionado 20µL Proteinase K e 180µL tampão de lise (ATL), seguido de digestão
32
enzimática em banho-maria a 56ºC overnigth até completa digestão do material
biológico. Posteriormente, adicionou-se 200 μL de buffer (AL) e 200 μL de etanol
96%, respectivamente.
Esta solução foi agitada em vortex e transferida para uma minicoluna de
membrana sobre um microtubo de 2,0 mL e centrifugada a 8.000 rpm por 2 minutos.
Transferiou-se a coluna para um novo microtubo de 2,0mL, adicionando 500 μL de
tampão de lavagem (AW1), seguido de centrifugação a 8000 rpm por 2 minutos.
Após, a minicoluna foi transferida para um novo microtubo de 2,0 mL e sobre
esta adicionado 500 μL tampão de lavagem (AW2), seguido de duas centrifugações
consecutivas de 14000 rpm por 3 minutos e 1 minuto, respectivamente, para eliminar
completamente possível resíduo de etanol.
A minicoluna seca foi transferida para novo microtubo de 1,5 mL e adicionado
100 μL de tampão de eluição (AE). Seguido de incubação a temperatura ambiente
por 3 minutos e centrifugação a 8000 rpm por 2 minutos para eluir o DNA da
membrana.
As amostras assim preparadas foram mantidas à –20o C até a sua utilização na
PCR.
3.9 Controle de Qualidade da Extração
Para verificar a eficiência do método de extração utilizado foi realizada
amplificação do DNA genômico humano utilizando iniciadores descritos por
Markolatos et al.59. Estes iniciadores têm como alvo o gene alfa tubulina e
amplificam um fragmento de 527 pb (Tabela 1).
33
Tabela 1- Sequência dos iniciadores utilizados para amplificação do gene alfa tubulina
humana
Primer
Sequência
Tamanho
Alfa tubulina–F 5’-CACCCGTCTTCAGGGCTTCTTGGTTT-3’
Alfa tubulina–R
5’-CATTTCACCATCTGGTTGGCTGGGTC-3
527 pb
F= Forward, R= Reverse
As reações de PCR foram realizadas em microtubos de 0,2 mL com um volume
final de 25,0 μL, contendo 5,0 μL de Tampão da enzima 10x PCR, 0,5 μL de dNTPs
(10 mM), 0,75 μL de MgCl2 (50 mM), 1,0 μL de cada iniciador Alfa tubulina (F e R)
(10 pMol), 0,2 μL de enzima Taq DNA polimerase (5U/μL), 5,0 μL da amostra e água
ultra-pura para completar o volume final.
As reações de PCR foram realizadas em termociclador Mastercicly EPgradient
S (EPPENDORF), com a seguinte programação:
Pré-desnaturação a 94ºC por 3 minutos, seguido de:
•
Desnaturação a 94ºC por 30 segundos
•
Anelamento a 60ºC por 30 segundos
•
Extensão a 72ºC por 50 segundos
•
Extensão Final a 72ºC por 10 minutos
35 ciclos
O termociclador foi programado para conservar as amostras a temperatura de
4ºC após a extensão final até que fossem retiradas e congeladas em freezer.
3.9.1 Eletroforese em Gel de Agarose 1,0%
Os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose a 1,0%
peso/volume (p/v) em solução Tampão 1x (Tris-EDTA), corado com brometo de
etídeo (1μg/μL).
34
A corrida iniciou-se com 70 volts até a entrada dos produtos amplificados no
gel e em seguida aumentava-se a voltagem para 100 volts até o final da corrida com
duração aproximadamente de 30 minutos. Utilizou-se como marcador de peso
molecular, o “Ladder” múltiplo de 100 pb (INVITROGEN) e depois fotografado no
transluminador com luz ultravioleta. A Figura 7 mostra um perfil eletroforético das
amostras obtido no estudo.
1
2
3
4
5
M
6
7
527 pb
Figura 7: Perfil eletroforético das amostras amplificadas com iniciadores alfa tubulina
visualizadas em gel de agarose 1,0% corado com brometo de etídeo. As colunas de
1–7= amostras e M= Ladder de 100pb.
3.10 Amplificação do DNA do M. tuberculosis por PCR
Segundo estudos a PCR é a mais promissora técnica para o diagnóstico rápido
da tuberculose, pois é capaz de detectar até uma cópia de DNA de qualquer célula.
Além da alta sensibilidade e especificidade, é capaz de produzir resultados em
algumas horas. Vários protocolos com diferentes “primers”, número de ciclos e
tratamento de amostras vêm sendo desenvolvidos para o diagnóstico rápido da
tuberculose42.
35
No presente estudo foram utilizados dois conjuntos de iniciadores descritos por
Marchetti et al.60 sendo usados em reações simples ou em nested-PCR. Estes
iniciadores possibilitam a amplificação de segmentos da sequência de inserção
IS6110 que permite a identificação do complexo M. tuberculosis. Os iniciadores
externos amplificam um segmento de 220pb e os internos um fragmento de 123pb42.
As reações de nested-PCR foram realizadas somente nas amostras negativas na
primeira reação. As sequências dos iniciadores estão descritas na Tabela 2.
Tabela 2: Sequência dos iniciadores utilizados para amplificação da sequência de
inserção IS6110 de M. tuberculosis.
Primer
Sequência
Tamanho
do
Amplicom
Primeira reação
IS6110-F
IS6110-R
5´-CGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGAC-3’
220 pb
5’-CATCGTGGAAGCGACCCGCCAGCCCAGGAT-3’
Segunda reação (nested-PCR)
IS6110-F
IS6110-R
5’- CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-3
123 pb
5’- CCTGCGAGCTAGGCGTCGG-3’
A primeira reação para amplificação do fragmento de 220pb foi realizada em
um volume final de 25 μL, contendo: 5,0μL de DNA, 5,0 μL do Tampão 10x PCR, 1,5
μL de MgCl2 (50 mM), 1,0 μL de dNTPs (10 mM), 2,0 μL de cada iniciador F/R (10
pMol), 0,2 μL de Taq DNA polimerase (5U/μL) e água Milli-Q para completar o
volume final. A segunda reação (nested-PCR), também foi realizada para um volume
final de 25 μL, sendo utilizado 1,0 μL do produto de PCR da primeira reação, 1,0 μL
de cada iniciador IS6110 (123pb) (10 pMol) e 0,125 μL de Taq DNA polimerase
(5U/μL). Os demais reagentes foram usados nas mesmas condições anteriormente
descritas.
As reações de amplificação do DNA do M. tuberculosis foram processadas
em termociclador Mastercicly EPgradient S (EPPENDORF) programado para realizar
a seguinte termociclagem:
36
Pré-desnaturação por 4 minutos a 94ºC;
•
Desnaturação a 94ºC por 1,3 minutos
•
Anelamento a 63ºC por 1 minutos
•
Extensão a 72ºC por 1,3 minutos
•
Extensão Final a 72ºC por 7 minutos
35 ciclos
O termociclador foi programado para ao término dos ciclos, conservar as
amostras a uma temperatura de 4°C.
3.10.1 Eletroforese em Gel de Agarose 2%
Os fragmentos amplificados de ambas as reações de PCR foram analisados
em gel de agarose a 2,0% (p/v) em solução Tampão 1x, nas seguintes condições:
70 volts até a entrada dos produtos amplificados no gel e 100 volts até o final da
corrida. A duração da corrida foi de aproximadamente 1 hora. Foi utilizado como
marcador de peso molecular o “Ladder” múltiplo de 100 pb (INVITROGEN). O gel foi
corado com brometo de etídeo (1μg/μL) e fotografado no transluminador com luz
ultravioleta. As amostras foram consideradas positivas quando apresentavam banda
de 220 pb e 123 pb, respectivamente (Figura 8).
As amostras positivas na nested-PCR, foram submetidas a nova reação de
PCR com os iniciadores IS6110 de 220 pb, ajustando as condições da reação, a fim
de obter produto para o sequenciamento.
37
M 1
2
3
4
5
6
7 8
9 10 11 12 C+ C- a b c+ c- M
220pb
123pb
Figura 8: Perfil eletroforético das amostras amplificadas com iniciadores de 220 pb,
visualizadas em gel de agarose 2,0% corado com brometo de etídeo. As colunas de
1–12= são amostras amplificadas com os iniciadores IS6110 com 220pb e as colunas
a e b foram amplificadas com os iniciadores IS6110 com 123pb, C+= controle positivo,
C- = controle negativo, M= Ladder de 100pb.
3.11 Purificação do Produto da PCR para o Sequenciamento
Os produtos de PCR das amostras positivas foram purificados utilizando o kit
de purificação Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (PROMEGA), conforme
as recomendações do fabricante. Após purificação as amostras foram quantificadas
em gel de agarose a 2,0% (p/v) utilizando o marcador LOW DNA Mass Ladder
(INVITROGEN) 2μL/linha. O gel foi corado com brometo de etídeo (1μg/μL)
e
fotografado no transluminador com luz ultravioleta.
3.12 Reação de Sequenciamento
Somente os produtos 220pb foram sequenciados, sendo a mesma amostra
sequenciada com o iniciador Forward (F) e com o Reverse (R) em reações
separadas. Cada reação foi realizada em um volume final de 20 μL, contendo: de
3,0-5,0 μL do produto de PCR purificado, 2,0 μL do iniciador F ou R (5,0 pMol), 5,0
μL da solução Pré-mix (BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits e 5x
Sequencing Buffer BigDye Terminator) (APPLIED BIOSYSTEMS).
38
As reações de sequenciamento foram realizadas em termociclador (Mastercicly
EPgradient S (EPPENDORF) com a seguinte termociclagem:
• 96ºC por 1 minuto
• 96ºC por 15 segundos
• 50ºC por 15 segundos
25 ciclos
• 60ºC por 4 minutos
• 4ºC Indeterminado
Ao término da reação de sequenciamento, para remover possíveis resíduos de
sais e de dessoxidonucleotídeos, não incorporados durante a reação de
sequenciamento, foi realizada a precipitação dos produtos utilizando o protocolo com
Isopropanol a 75% e etanol a 70%. Onde, em 20 μL da reação foi adicionado 80 μL
de Isopropanol a 75%. Em seguida, essa mistura foi incubada por 15 minutos em
temperatura ambiente, protegido da luz. Após, a placa foi centrifugada a 14000 rpm
por 20 minutos a temperatura de 4ºC. O sobrenadante foi descartado e adicionado
200 μL de etanol 70%. A placa foi novamente centrifugada por 10 minutos a 4ºC.
Descartou-se o sobrenadante com vigor, repetindo o mesmo procedimento por duas
vezes, em seguida a placa foi centrifugada de forma invertida e seca até evaporar o
etanol completamente. O precipitado foi ressuspendido em 10 μL de tampão de
corrida (Formamida HI-Di) (APPLIED BIOSYSTEMS).
Após desnaturação da fita de DNA em termociclador a 95ºC por 2 minutos as
amostras foram submetidas à corrida eletroforética no Analisador Genético de DNA
ABI PRISM 3130 XL (APLLIED BIOSYSTEMS).
3.13 Análise Estatística
39
A análise dos resultados laboratoriais foi realizada avaliando o índice de kappa
(K) na verificação de concordância entre os casos de tuberculose e os métodos de
diagnóstico utilizados. Essa análise foi realizada por meio do programa BioEstat
5.061. A sensibilidade e a especificidade foram calculadas, segundo Fletcher et al.62,
comparando os testes diagnósticos de baciloscopia x PCR e cultura x PCR. Por não
ser solicitado exame de baciloscopia e cultura os resultados de PCR das amostras
de tecidos fixados em bloco de parafina foram comparados com os resultados do
histopatológico.
3.14 Análise Filogenética
O índice de similaridade foi obtido comparando as sequências obtidas no
estudo com sequências representantes das diferentes espécies de micobactérias
depositadas no GenBank (http/www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando o programa BLAST
N63. A edição e alinhamento das sequências nucleotídicas foi realizada utilizando o
programa BioEdit versão 7.0.5.2 (6/5/05)64 e Clustal W65. A análise filogenética foi
conduzida no programa MEGA versão 4.066, aplicando o modelo de NeighborJoining (NJ). A fim de caracterizar as micobactérias circulantes no Amazonas foi
construída uma árvore filogenética utilizando as sequências obtidas no estudo e 12
sequências de M. tuberculosis retiradas do GenBAnk número de Acesso: HM053706
M.tuberculosis, 31619300 M.bovis, 41353667 M.tuberculosis H37Rv, CP001662
M.tuberculosis, GU904010 M.tuberculosis BR (rpoB), HQ324101 M.tuberculosis
H37Rv (gyrB) BR, EU108002 M.africanum ATCC (nat) BR, Y14045 M.tuberculosis
IS6110, CP000611 M.tuberculosis H37Ra, AY462261 M.tuberculosis (plcD) BR,
EU165538 Mycobacterium brasiliensis Rio e 224771496 M. bovis BCG. Os
parâmetros definidos pelo modelo NJ consideram principalmente as substituições da
1ª 2ª e 3ª posições, o número de sítios conservados e variáveis e as substituições
do tipo transversões e transições. O nível de confiança foi obtido usando o método
não paramétrico bootstrap baseado em 500 réplicas (uma réplica é igual a uma
comparação).
40
4. RESULTADOS FORMATO DE ARTIGO
41
Os resultados estão apresentados na forma de Artigo que foi submetido para
publicação na revista Mem Inst Oswaldo Cruz, Online
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Mycobacterium
tuberculosis EM TRÊS TIPOS DE AMOSTRAS CLÍNICAS DE PACIENTES
SUSPEITOS DE TUBERCULOSE COM OU SEM HIV
Lorena Angélica Castano Ramos1, Rossicléia Lins Monte2, Marcio Cortez1,2, Marly
Marquez de Melo2, Alex Panizza Jálkh1,3, Karolina Sabino3, Cintia Mara Costa de
Oliveira1,2,3
1
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, Universidade do Estado do Amazonas. Manaus,
2
Av. Pedro Teixeira, 25, 69040-000 Manaus, AM. Brasil Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor
3
Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil Universidade Federal do Amazonas, Av. Rodrigo Otávio, 3000,
Bloco M, 69067-000, Manaus, AM, Brasil
O objetivo do presente estudo foi detectar e caracterizar o Mycobacterium tuberculosis em
amostras de gânglios, tecidos em bloco de parafina e líquor de pacientes com diagnóstico suspeito de
tuberculose com ou sem HIV, atendidos na Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado
(FMT-HVD). Este foi realizado no período de janeiro de 2009 a janeiro de 2010 onde os casos
suspeitos foram investigados pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e caracterizados por
sequenciamento direto de um fragmento da inserção IS6110. Avaliou-se a sensibilidade da técnica de
PCR (PCR e nested-PCR) utilizando dois conjuntos de iniciadores, que amplificam um segmento de
220pb e 123pb, respectivamente. As reações de nested-PCR foram realizadas somente nas amostras
negativas na primeira reação. Foram investigadas um total de 107 amostras. A PCR foi positiva em
52 amostras, sendo 21 positivas na PCR simples. Das 86 amostras negativas na PCR simples, 31
amostras foram positivas na nested-PCR. A cultura e a baciloscopia foram realizadas em 82/107
amostras, obtendo-se 21/82 amostras positivas na baciloscopia e 19/82 amostras com cultura
positivas, os resultados das culturas foram 17 para M. tuberculosis e 02 para Mycobacterium sp. A
análise filogenética caracterizou 18 sequências nucleotídicas como M. tuberculosis e 1 como M. bovis
BCG. Diante dos resultados obtidos conclui-se que o diagnóstico molecular da tuberculose deve estar
fundamentado na análise conjunta de vários parâmetros, como baciloscopia, cultura, manifestações
clínicas, prova terapêutica e história prévia de tuberculose.
Key words: PCR – nested-PCR - Mycobacterium tuberculosis – HIV – Amazonas
________________________________________________________________________________
Financial Support: Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical – UEA/FMT-HVD.
+ Corresponding author: Lorena Angelica Castano Ramos, e mail: [email protected]; Cintia Mara
Costa de Oliveira, e-mail: [email protected]
A tuberculose (TB) causada por microrganismos do complexo Mycobacterium
tuberculosis, responsáveis anualmente pela mortalidade de aproximadamente 3
milhões de pessoas no mundo inteiro (Pandolfi 2007). Estudos recentes apontam
42
uma estimativa de que um terço da população humana esteja infectado pelo M.
tuberculosis, na sua forma latente (Oelemann et al. 2007, WHO 2008). Em várias
regiões do mundo a tuberculose ainda é a principal causa de morte, pois cerca de
26% dessas mortes são diretamente relacionadas à tuberculose (Macente & Ribeiro
2009), que continua sendo um grave problema de saúde pública sobretudo nos
países em desenvolvimento. O problema agravou-se ainda mais com a
disseminação da infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), na década
de 80. O indivíduo co-infectado TB e HIV têm risco 6 a 100 vezes maior de adoecer
de tuberculose do que o indivíduo infectado apenas com o Mycobacterium
tuberculosis (Santos & Beck 2009).
O avanço da biologia molecular permitiu o desenvolvimento de novas técnicas
para o diagnóstico de infecções por meio da detecção de sequências nucleotídicas
específicas dos microrganismos (Macente & Ribeiro 2009). A reação em cadeia da
polimerase (PCR) tem se destacado como uma das mais promissoras técnicas
moleculares para o diagnóstico rápido de doenças infecciosas. Vários elementos
repetitivos de DNA que contribuem para a variação genética de cepas foram
descobertos em M. tuberculosis. Um deles é a sequência de inserção IS6110, que é
um elemento genético de 1.350 pares de bases que está exclusivamente presente
nas espécies do complexo M. tuberculosis (Ogusku & Salem 2004; Assis et al.
2007).
Embora a PCR simples seja bastante útil para detecção do M. tuberculosis, a
nested-PCR concilia maior sensibilidade e especificidade (Lima et al. 2007).
Miyazaki et al. (1993), ao analisarem a técnica de diagnóstico da tuberculose por
nested-PCR, relataram um limite de detecção para a primeira PCR de 102 UFC com
aumento de mil vezes após a segunda reação e sensibilidade de até 0,1 UFC.
Considerando
a
obtenção
de
um
diagnóstico
rápido
em
pacientes
paucibacilares permitindo instituir o tratamento específico o mais precocemente
possível, diminuindo assim as fontes bacilíferas e, com elas, a infecção pelo M.
tuberculosis, portanto reduzindo a cadeia de transmissão, o custo da PCR na rotina
é factível (Assis et al. 2007).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) considera a tuberculose uma
emergência global incentivando medidas de controle da doença em todo o mundo.
Sem mudanças nas condições socioeconômicas da população o controle da
43
tuberculose reside no diagnóstico precoce e tratamento efetivo, além da vacinação e
quimioprofilaxia para os contactantes (WHO 2009)
O presente trabalho investigou a detecção por métodos moleculares,
caracterizou por análises filogenética e avaliou a sensibilidade e especificidade da
baciloscopia e cultura frente PCR e nested-PCR, em amostras clínicas de biopsias
de gânglio, e líquor e entre o exame patológico e a PCR para amostras em bloco de
parafina. Utilizando como alvos um fragmento da inserção IS6110 do Mycobacterium
tuberculosis (Bollela et al. 1999).
PACIENTES, MATERIAIS E MÉTODOS
Desenho do Estudo - Foi analisado um total de 107 amostras clínicas
provenientes de 104 pacientes com diagnóstico clínico suspeito de tuberculose. As
amostras foram obtidas de pacientes atendidos na Fundação de Medicina Tropical
Dr. Heitor Vieira Dourado, no período de janeiro de 2009 a janeiro de 2010.
Os dados demográficos e epidemiológicos retrospectivos de todos os pacientes
foram coletados através de uma revisão dos prontuários da base de dados da
Fundação. Foram analisadas variáveis como idade, gênero, local de residência na
cidade e status de HIV.
A baciloscopia foi realizada pelo método de Ziehl-Neelsen, enquanto a cultura
foi feita em meio Löwnestein-Jensen, como parte da rotina de diagnóstico de
pacientes com suspeita de TB atendidos na Fundação. Como controle positivo foi
usado duas culturas de Mycobacterium tuberculosis previamente identificadas pelo
laboratório de bacteriologia da Fundação.
Extração de DNA – A extração de DNA foi realizada em três tipos de
espécimes clínicos: biopsias de gânglio, tecidos fixados em bloco de parafina e
líquor. O DNA de M. tuberculosis foi extraído utilizando QIAmp DNasy Blood &
Tissue (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as recomendações do
fabricante.
Biopsias de Gânglio - Para facilitar o processo de digestão enzimática as
biopsias de gânglio foram cortadas em pequenos fragmentos e submetidas a
extração do DNA bacteriano com o kit acima descrito.
44
Tecidos Preservados em Bloco de Parafina – Antes de submeter a extração de
DNA as amostras de tecidos fixados em bloco de parafina passaram por um
processo de desparafinização utilizando o seguinte protocolo: em um microtubo de
1,5 mL contendo 10 cortes de tecido com 20 µm de espessura, adicionou-se 1,0 mL
de Xilol seguido de incubação a 60oC e centrifugação a 13000 rpm por 10 min, esse
procedimento foi realizado por duas vezes seguido de uma lavagem com 1,0 mL de
etanol absoluto e secagem a temperatura ambiente (TA) em fluxo laminar até
completa evaporação do etanol.
Amostras de Líquor - Em 200 µL de líquor foi adicionado 280 µL de tampão de
lise AL e 20 µL de proteinase K (QIAmp DNasy Blood & Tissue- QIAGEN). Essa
solução foi incubada a 60oC por 3 horas e posteriormente processadas conforme as
recomendações do fabricante.
Amplificação por PCR - As reações de PCR e nested-PCR teve como alvo a
sequência de inserção IS6110 que permite a identificação do Complexo M.
tuberculosis. Os iniciadores externos amplificam um segmento de 220pb (Marchetti
et al. 1998) e os internos um fragmento de 123pb (Bollela et al. 1999). O DNA
extraído (5.0 μL) foi adicionado a 20 μl da mistura de reagente contendo tampão
PCR 1x, 2,0 mM MgCl2, 1,0 U Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen Life
Technologies, Gaithersburg, MD, EUA), 0,2 mM de cada dNTP (Invitrogen Life
Technologies) e 10 pmol de cada iniciador. A sequência, tamanho do amplicon e
condições de ciclagem estão descritos na Tabela I. Os produtos de PCR foram
analisados por eletroforese em gel de agarose (2% w/v) corados com brometo de
etídeo (1ug/mL) e visualizados em transluminador de luz ultravioleta. As amostras
clínicas também foram amplificadas com iniciadores específicos para o gene alfa
tubulina humana (Markoulatos et al. 2001), a fim de verificar a eficiência da extração.
Tabela I
Sequência dos Iniciadores e Condições da PCR
Primer
Sequência
Produto
Ciclos
45
IS6110
Iniciadores externos (Marchetti et al., 1998)
5´-CGGGACCACCCGCGGCAAAGCCCGCAGGAC-3
220 pb
94ºC-1,3 min
63ºC-1,3 min 35 x
72ºC-1,3 min
5’-CATCGTGGAAGCGACCCGCCAGCCCAGGAT-3’
IS6110
Iniciadores internos (Bollela et al., 1999)
Sense - 5’- CTCGTCCAGCGCCGCTTCGG-3
Anti sense 5’- CCTGCGAGCTAGGCGTCGG-3’
123 pb
94ºC-1,3 min
63ºC-1,3 min 35 x
72ºC-1,3 min
Sequenciamento – Foi sequenciado um fragmento de 220 pares de base da
sequência de inserção IS6110 do genoma M. tuberculosis. As reações de
sequenciamento foram realizadas utilizando BigDye Terminator v3.1 Cycle
Sequencing Kits. A mistura da reação continha 3,0 μL de DNA (produto de PCR), 1
μL de primer 5,0 pmol (TB 220 pb Forward ou Reverse), 2,0 μL de BigDye, 3,0 μL de
5X buffer e H2O (qsp 10 μL). O termociclador foi programado para realizar 25 ciclos,
consistindo dos seguintes estágios: 96ºC por 10 s, 50ºC por 5 s e 60ºC por 4 min. Os
®
dados da sequência foram gerados em um ABI PRISM 3130 XL Genetic Analyzer,
Applied Biosystems.
Analise estatística - A análise dos resultados laboratoriais foi realizada
avaliando o índice de kappa (K) na verificação de concordância entre os casos de
tuberculose e os métodos de diagnóstico utilizados. Essa análise foi realizada por
meio do programa BioEstat 5.0 (Ayres et al. 2007). A sensibilidade e a
especificidade foram calculadas, segundo Fletcher et al. (1996), comparando os
testes diagnósticos de baciloscopia x PCR e cultura x PCR. Por não ser solicitado
exame de baciloscopia e cultura os resultados de PCR das amostras de tecidos
fixados em bloco de parafina foram comparados com os resultados histopatológico.
Analise filogenética - O índice de similaridade foi obtido comparando as
sequências obtidas no estudo com sequências representantes das diferentes
espécies de micobactérias depositadas no GenBank (http/www.ncbi.nlm.nih.gov)
utilizando o programa BLAST N (Altschul et al. 1997). A edição e alinhamento das
sequências nucleotídicas foi realizada no programa BioEdit versão 7.0.5.2 (6/5/05)
(Hall 1999) e Clustal W (Larkin et al. 2007). A análise filogenética foi conduzida no
programa MEGA versão 4.0 (Tamura et al. 2007), aplicando o modelo de NeighborJoining (NJ). A árvore filogenética foi construída utilizando as sequencias obtidas no
estudo e 12 sequencias de M.tuberculosis retiradas do GenBAnk número de Acesso:
46
HM053706 M.tuberculosis, 31619300 M.bovis, 41353667 M.tuberculosis H37Rv,
CP001662 M.tuberculosis, GU904010 M.tuberculosis BR (rpoB), HQ324101
M.tuberculosis H37Rv (gyrB) BR, EU108002 M.africanum ATCC (nat) BR, Y14045
M.tuberculosis IS6110, CP000611 M.tuberculosis H37Ra, AY462261 M.tuberculosis
(plcD) BR, EU165538 Mycobacterium brasiliensis Rio e 224771496 M.bovis BCG. O
nível de confiança foi obtido usando o método não paramétrico bootstrap baseado
em 500 réplicas (uma réplica é igual a uma comparação).
Considerações éticas - O projeto que deu origem a este trabalho foi submetido
e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da FMT-HVD, processo
número 1534/2008, de acordo com a Resolução CNS 196/96.
RESULTADOS
Descrição das características da população - Foram incluídas no estudo um
total de 107 amostras clínicas provenientes de 104 pacientes. Os pacientes tiveram
os dados epidemiológicos investigados em prontuário, e as informações disponíveis
foram incluídas na análise. Foram incluídas informações referentes aos fatores
sócio-demográficos, como gênero, idade, local de residência e soropositividade para
HIV. Dos 104 prontuários 74 (71,2%) foram de homens e 30 (28,8%) de mulheres. A
faixa etária predominante foi entre 30 e 39 anos com 31,7%. A média de idade foi
37,11 anos; Desvio Padrão (DP- Teste de Normalidade de Anderson – Darling)
15,04. Em relação ao local de residência dos pacientes na cidade de Manaus, 23
(22,1%) residiam na zona norte da cidade, seguido das zonas sul e oeste. Dos 104
pacientes analisados, 51 (49,0%) foram HIV positivos e 11 (10,6%) foram negativos.
Em 42 (40,4%) pacientes não foi solicitado exame para HIV (Tabela II).
Tabela II
Faixa etária, procedência segundo a zona de residência em Manaus e no interior do
estado e percentual dos pacientes com e sem HIV incluídos no estudo, em destaque a mais
prevalente.
47
Idade (anos)
N
%
0-09
10-19
20-29
30-39
40-49
50-59
60-69
70-79
80 e +
Ignorado
Zona de Procedência
Norte
Sul
Oeste
Leste
Centro-Oeste
Centro-Sul
Interior do Estado
Ignorado
HIV
Positivo
Negativo
Não Solicitado
Total
1
9
20
33
20
12
3
4
1
1*
1,0
8,7
19,2
31,7
19,2
11,5
2,9
3,8
1,0
1,0
23
20
16
13
6
6
7
13
22,1
19,2
15,4
12,5
5,8
5,8
6,7
12,5
51
49,0
11
10,6
42
40,4
104
100
* Dado excluído da curva de distribuição faixa etária (Teste de Normalidade de
Anderson – Darling).
De acordo com o tipo de material biológico foram analisadas 75/107 (70,1%)
amostras de biopsias de gânglio, 28/107 (26,2%) de tecido fixado em bloco de
parafina e 4/107 (3,7%) amostras de líquor.
A cultura foi realizada em 82/107 (76,6%) amostras. Destas, 17/82 (20,7%)
foram positivas para M. tuberculosis e 02/82 (2,4%) para Mycobacterium sp. A
baciloscopia (BAAR) foi positiva em 21/82 (25,6%) das amostras analisadas.
A análise molecular por PCR amplificou 52/107 (48,6%) amostras. Destas,
21/107 (19,6%) foram detectadas na primeira reação. E 31/107 (29,0%) foram
positivas na nested-PCR.
A relação entre os resultados obtidos na cultura e PCR são mostradas na
Tabela III (n= 82). De 25/28 (89,3%) amostras de tecidos fixados em parafina não foi
solicitado o exame de cultura. O resultado desta analise foi comparado com o
resultado do exame histopatológico e estão mostrados na Tabela IV.
48
Tabela III
Relação entre os casos diagnosticados como tuberculose e os dados obtidos por cultura, e
PCR.
Cultura Positiva
N
PCR*
Positiva
PCR
Negativa
Casos de TB**
Total
Cultura Negativa
n
Total
17***
25
42
2***
19
19
38
7
63
40
26
82
* Incluidos os dados da PCR e a nested-PCR
** Os casos de tuberculose foram definidos usando-se como critérios a baciloscopia positiva
ou isolamento do espécime por cultivo.
*** 1 Cultura positiva para Mycobacterium sp.
Tabela IV
Relação entre os dados obtidos por PCR e
Exame Histopatológico.
PCR*
Positivo
Exame
10
Histopatológico
Positivo
1
Negativo
8
Não Realizado
1
Total
10
* Incluidos os dados da PCR e a nested-PCR
Negativo
18
Total
28
2
12
4
18
3
20
5
28
Os resultados de sensibilidade e especificidade da PCR em relação a
baciloscopia (BAAR), um dos métodos tradicionalmente usados no diagnóstico da
tuberculose, estão apresentados na Tabela V.
Tabela V
Valores de sensibilidade, especificidade, falso positivo e falso negativo, para 82 amostras
analisadas, considerando 26 casos confirmados de tuberculose
49
Sensibilidade*
(n=26)
n
Especificidade** Falso
(n=56)
Positivo
%
n
Falso
Negativo
%
PCR
24/26
89,47
31/56
60,31
25
2
BAAR
21/26
73,68
49/56
88,88
7
5
*A sensibilidade foi calculada segundo a fórmula: A/ (A+C)x100, sendo A o número de infectados
detectados pelo teste e (A+C) o total de doentes.
**A especificidade foi calculada segundo a fórmula: B/ (B+D)x100, sendo B o número de
negativos detectados no teste e (B+D) o total de não doentes.
A análise de concordância entre a PCR e os casos de baciloscopia estão
descritos na Tabela VI.
Tabela VI
Resultados de Concordância e Acuidade entre o PCR e a Baciloscopia.
PCR
BAAR
Valor Preditivo Positivo
40,47
66,66
Valor Preditivo Negativo
95,00
91,80
Prevalência (verdadeira)
23,17
23,17
Prevalência Estimada (Teste)
51,21
25,60
Classificação Correta
67,07
85,36
Classificação incorreta
32,92
14,63
Concordância Observada
0,6707
0,8537
Concordância Esperada
0,4935
0,6309
Índice Kappa (K)
0,3500
0,6035
Z (Kappa)
3,8058
5,4773
Conclusão de Replicabilidade
Fraca
Boa
Análise molecular e filogenética das sequências nucleotidicas – A análise no
BLAST N mostrou índice de similaridade de 98% a 100% entre as sequências obtidas no
estudo e sequências de M. tuberculosis depositadas no GenBank. A análise filogenética
das sequências nucleotídicas, caracterizou 19 sequências como pertencentes ao gênero
Mycobacterium, sendo 18 da espécie M. tuberculosis e 1 da espécie M. bovis BCG
(Figura 5 e Anexo II).
50
AM-VMS
HM053706 M.tuberculosis G4B1.2
AM-131
AM-67
AM-70
AM-CP
AM-78
AM-107
31619300 M.bovis.
AM-76
AM-106
AM-FRL
AM-83
AM-89
AM-74
41353667 M.tuberculosis H37Rv
AM-105
CP001662 M.tuberculosis KZN4207
98
AM-FCS
AM-87
AM-90
AM-116
GU904010 M.tuberculosis BR (rpoB)
HQ324101 M.tuberculosis H37Rv (gyrB) BR
86
EU108002 M.africanum ATCC (nat) BR
99 Y14045 M.tuberculosis IS6110
CP000611 M.tuberculosis H37Ra
AY462261 M.tuberculosis (plcD) BR
EU165538 Mycobacterium brasiliensis Rio
AM-112
99 224771496 M.bovis BCG
0.5
Figura 5: Árvore Neighbor-Joining baseada em 19 sequências nucleotídicas correspondente
a inserção IS6110 do complexo M. tuberculosis. A árvore foi gerada usando sequências
previamente identificadas de acordo com o número de acesso no GenBank.
DISCUSSÃO
Os resultados da análise epidemiológica obtidos neste estudo nos permitem
verificar que a maioria dos pacientes infectados por TB apresentavam faixa etária
51
entre 30 e 39 anos (31,7%). Estes resultados estão de acordo com a literatura, pois
segundo Severo et al. (2007) em países em desenvolvimento como o Brasil, a
tuberculose acomete principalmente a população economicamente ativa, conferindo
uma conotação social à doença. Diferentemente do que ocorre nos países
desenvolvidos, onde a população mais atingida encontra-se em uma faixa etária
mais avançada (Rieder, 2001).
Com relação à co-infecção TB/HIV, os resultados obtidos no presente estudo
demonstram que o aumento da incidência de tuberculose está fortemente
relacionado com a infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV). Estudos
atuais mostram que cerca de 11 milhões de pessoas no mundo estão co-infectadas
pelo M. tuberculosis e HIV. No Brasil, cerca de 8% dos pacientes com tuberculose
também têm AIDS (Santos & Beck, 2009).
No presente estudo verificou-se um índice de 49,0% de positividade para
HIV entre os 104 pacientes incluídos no estudo. Salientando que essa positividade
poderia ser maior do que a encontrada, pois por motivos adversos, em 40,4% dos
pacientes não foi realizado exame para HIV. Estes dados reforçam a atual política
da Coordenação Nacional do Programa de Controle da TB no Brasil que recomenda
que seja oferecida a sorologia anti-HIV para os pacientes com diagnóstico de TB e a
atual diretriz do Plano Nacional de Controle da TB prevê que 100% dos pacientes
com diagnóstico de TB realizem a investigação sorológica para o HIV. Estudos
demonstram que o risco anual estimado de reativação entre os indivíduos com
HIV/TB é de aproximadamente 5% a 8 %, com um risco cumulativo durante a vida
de 30%, comparado ao risco cumulativo de 5 a 10% entre os indivíduos HIV
negativos (Corbett et al. 2003).
Com relação a análise molecular, os resultados obtidos demonstraram que a
nested-PCR com o iniciador IS6110 de 123 pb apresentou positividade de 48,6%
contra 19,6% da PCR simples com o iniciador de 220 pb. Um total, portanto, de 31
amostras seriam consideradas negativas caso não fosse adotado o sistema de
nested-PCR. Silva (2006), utilizando esse mesmo conjunto de iniciadores em 20
amostras de pacientes, sendo 10 com TB e 10 TB/HIV fixados em parafina obteve
positividade em 4/10 e 6/10 amostras, respectivamente, na primeira reação e 8/10 e
9/10, respectivamente na nested-PCR. A autora atribui a baixa positividade do teste
na primeira reação, a fixação do tecido em formol e emblocado em parafina do
52
material utilizado. Assis et al. 2007, utilizando o sistema nested-PCR tendo como
alvo o antígeno b obteve positividade em 111 de 136 amostras de escarro. Por outro
lado, obteve 131/136 positivos quando usou o iniciador IS6110. No Amazonas,
Ogusku e Salem 2004, utilizando apenas o iniciador IS6110 (123pb) no diagnóstico
de tuberculose pulmonar em 81 amostras clínicas, obtiveram positividade de 92%.
Segundo esses autores, devido à seqüência IS6110 estar presente em múltiplas
cópias no genoma do M. tuberculosis, há uma maior sensibilidade da PCR em
comparação com amplificações de sequências de cópias únicas (38kDa, 65kDa,
MPB64), mesmo quando essas são submetidas a nested-PCR. Fujimoto e
colaboradores (2007), utilizando esse mesmo iniciador em 83 amostras clínicas
fixadas em parafina encontraram positividade para M. tuberculosis em 50,6% das
amostras analisadas.
O presente estudo avaliou também a sensibilidade e especificidade da técnica
de PCR e nested-PCR na detecção do DNA de M. tuberculosis em amostras de
biopsias de gânglio, tecido parafinado e líquor frente as técnicas tradicionais de
diagnóstico da tuberculose como a baciloscopia, cultura e histopatologia. Mediante
os resultados obtidos verificou-se que das 21 amostras positivas na PCR simples, 17
foram confirmadas pelo BAAR e cultura e das 31 amostras positivas após nestedPCR, 21 foram BAAR e culturas negativas e 10 com BAAR e cultura não realizadas,
as quais não foram incluídas na análise estatística. A junção dos resultados da PCR
simples e nested-PCR quando comparados com o resultado da baciloscopia
demonstrou que a PCR apresentou maior sensibilidade e menor especificidade.
Quanto ao tipo de amostra, a PCR mostrou melhor performace em biopsias frescas
do que em tecido parafinado (Tabela V).
Com referencia aos métodos tradicionais, vale ressaltar apesar do diagnóstico
pelo método de Ziehl-Neelsen ser rápido e de baixo custo, apresenta como principal
problema baixa sensibilidade a menos que os organismos sejam suficientemente
numerosos, no mínimo, 5.000 bacilos para que o teste seja positivo (Macente &
Ribeiro, 2009). A cultura considerada padrão ouro para o diagnóstico de M.
tuberculosis, por ter especificidade de 100% e sensibilidade de aproximadamente
90%, normalmente, leva várias semanas para o crescimento, pela própria
característica de replicação do M. tuberculosis e consequente identificação, esse
tempo geralmente não é disponível frente a casos graves, como os de
53
imunodeficientes (Macente & Ribeiro, 2009). A letalidade da tuberculose em
indivíduos infectados pelo HIV pode ser 2,4 a 19 vezes maior que nos indivíduos não
infectados (Santos & Beck, 2009). Para que a cultura de um espécime clínico seja
positiva são necessárias entre 10 e 100 células de M. tuberculosis na amostra.
Enquanto que a PCR é capaz de detectar até uma cópia de DNA de M. tuberculosis,
como já foi demonstrado por Eisenach, et al. (1990).
Ainda com relação aos resultados de PCR positivos com baciloscopia e cultura
negativas, podem ser atribuídos a casos de tuberculose paucibacilar; contaminação
da reação de PCR por amplicons; presença de organismos não-viáveis em
pacientes tratados ou pacientes com recidiva de tuberculose (Assis et al. 2007).
Como o alvo da PCR não é o microrganismo vivo, resultados positivos na PCR
podem refletir uma infecção ativa por M. tuberculosis ou passado de tuberculose.
Nesse caso, esses pacientes deveriam ser acompanhados para verificar o
diagnóstico de tuberculose nos anos seguintes (Assis et al. 2007).
A análise também mostrou que 05 entre as 107 amostras foram PCR
negativos, sendo 01 com Baciloscopia e Cultura positivas, 03 com Baciloscopia
positiva e Cultura negativa e 01 com Cultura positiva para Mycobacterium sp. Sabese que o sucesso da técnica de PCR depende da qualidade da extração de DNA,
podendo gerar resultados falsos-negativos. Além disso, a presença de inibidores da
PCR procedentes dos espécimes clínicos ou ainda presença de substâncias
inibidoras da enzima Taq DNA polimerase podem comprometer a sensibilidade do
teste (Bazzo et al. 2004). Neste estudo foram adotadas rigorosas medidas de
prevenção contra contaminação dos procedimentos. O laboratório conta com
ambientes específicos para extração, preparo das reações de PCR e eletroforese.
Estabeleceu-se também um rigoroso controle dos reagentes utilizados nas reações
de PCR, aliquotando e estocando-os em área livre de produtos de PCR. As
amostras de DNA e produtos de PCR foram estocados em ambiente distintos e
distante do local de preparação da reação. Foram incluídos a cada 10 amostras
trabalhadas, controles negativos manipulados desde a extração de DNA até o
sequenciamento.
A partir do seqüenciamento do produto de PCR de 220 pb foi possível obter 19
sequências de boa qualidade, incluindo a do controle positivo. Com relação aos
iniciadores usados na primeira PCR, estes detectam um segmento genômico do
54
complexo M. tuberculosis ideais para caracterização de espécies. Porém, devido ao
alto índice de amostras não amplificadas com esses iniciadores, não são indicados
para realização da PCR como diagnóstico molecular de M. tuberculosis em amostras
clínicas no Amazonas.
Por outro lado, a análise de similaridade no programa
BLAST N mostrou um índice de 98 a 100% de similaridade entre as sequências
obtidas no estudo e sequências de M. tuberculosis do GenBank. Para caracterização
molecular das sequências obtidas foi construída uma árvore filogenética incluindo 12
sequências de M. tuberculosis de diferentes regiões obtidas no GeneBank. De
acordo com a árvore obtida, uma sequência AM112, agrupou-se no mesmo braço da
sequência de M. bovis BCG acesso 224771496, com bootstrap de 99%. As demais
18 sequências agruparam-se com três sequências de M. tuberculosis, não
procedentes do Brasil. Com relação a sequência identificada como M. bovis,
segundo análise dos prontuários, essa foi procedente de um paciente HIV positivo e
identificado na cultura como Micobacteryum sp corroborando portanto o resultado
do sequenciamento. Análise de sequências nucleotídicas tem sido uma poderosa
ferramenta atualmente usada tanto para identificar presença de mutações como
para caracterização molecular de micobactérias. Os resultados apresentados neste
estudo mostram que apesar da pequena casuística de sequencias nucleotídicas
analisadas houve predomínio da espécie M. tuberculosis entre a população
analisada e que pode também ocorrer outras micobactérias como M. bovis. Este é
um trabalho pioneiro na caracterização de M. tuberculosis no Amazonas, espera-se
que os resultados obtidos neste estudo venham contribuir para o conhecimento
desses agentes na região e outros estudos venham ampliar o conhecimento das
cepas de M. tuberculosis que circulam no estado do Amazonas.
Diante dos achados neste estudo, o diagnóstico por PCR deve estar
fundamentado na análise conjunta de vários parâmetros, como baciloscopia, cultura,
manifestações clínicas e a prova terapêutica. A PCR, é mais uma metodologia à
disposição do diagnóstico rápido, desde que utilizada com rigoroso controle de
qualidade podendo complementar de forma eficiente as ferramentas convencionais
bacteriológicas para o diagnóstico.
AGRADECIMENTOS
55
Aos funcionários e colaboradores do Laboratório de Diagnóstico e Pesquisas
em Doenças Endêmicas (LPDE) e da Gerência de Bacteriologia e Patologia da FMTHVD.
CONFLITOS DE INTERESSE
Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no
desenvolvimento da pesquisa.
REFERÊNCIAS
56
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1997. Gapped BLAST and PSI‑BLAST: a new generation of protein database
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áreas das ciências bio-médicas. Versão 5.0. 2007. Belém-Pará-Brasil.
http://biocistron.blogspot.com/2008/07/programa-bioestat-50_7617.html;
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Brasileiro de Patologia Clínica e Medicina Laboratorial, Florianópolis. Disponível
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Bollela VR, Sato DN, Fonseca BAL 1999. Problemas na padronização da reação em
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5. CONCLUSÃO
59
Diante dos objetivos propostos neste estudo e os resultados alcançados
conclui-se que:
•
A população analisada é composta em sua maioria por pessoas do
gênero masculino na faixa etária economicamente ativa;
•
Dos 104 pacientes do estudo, 16,3% eram pacientes co-infectados
TB/HIV;
•
Ao co-relacionar os resultados obtidos na PCR com os resultados
laboratoriais da baciloscopia e cultura, observou-se um alto índice de
positividade na PCR nos casos de pacientes paucibacilar, negativos nas
provas bacteriológicas de rotina;
•
A caracterização molecular por seqüenciamento da região repetitiva do
genoma de M. tuberculosis (IS6110), permitiu a identificação de 18
amostras como M. tuberculosis e uma como M. bovis;
•
Este estudo mostrou, por tanto que a PCR in house é uma poderosa
ferramenta para diagnosticar os casos suspeitos de TB em unidade de
saúde com alta prevalência de TB e HIV.
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7. ANEXOS
ANEXO I
Registro de aprovação, emitido pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos
(CEP) da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.
69
85
ANEXO II
Alinhamento Clustal W das sequencias nucleotidicas de M.tuberculosis obtidas no estudo e
sequencias obtidas no GenBank
AM-67
AM-70
AM-74
AM-76
AM-78
AM-83
AM-87
AM-89
AM-90
AM-105
AM-106
AM-107
AM-116
AM-131
AM-FCS
AM-FRL
AM-VMS
AM-CP
gb|CP00166
gi|4135366
gi|3161930
gi|HM05370
Clustal Co
AM-67
AM-70
AM-74
AM-76
AM-78
AM-83
AM-87
AM-89
AM-90
AM-105
AM-106
AM-107
AM-116
AM-131
AM-FCS
AM-FRL
AM-VMS
AM-CP
gb|CP00166
gi|4135366
gi|3161930
gi|HM05370
Clustal Co
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10
20
30
40
50
---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- TCGCGTCGAG GACCATGGAC CTGGCCATCG TGGAAGCGAC
---------- TCGCGTCGAG GACCATGGAG GTGGCCATCG TGGAAGCGAC
---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ----GTCGAG GACCATGGAG GTGGCCATCG TGGAAGCGAC
---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- --CACCATCG TGGAAGCGAC
---------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ------------------- ---------- ---------- ---------- ----------
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60
70
80
90
100
---------- ---------- ---------- -------ACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- ------GACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- -TCGGTGACA AAGGCCACGT
CCGCCAGCCC AGGATCCTGC GAGCGTAGGC GTCGGTGACA AAGGCCACGT
CCGCCAGCCC AGGATCCTGC GAGCGTAGGC GTCGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- -------GCC ACAGCCACGT
---------- ---------- ---------C GTCGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- ---------- AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------C GTCGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- ------GACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- -------ACA AAGGCCACGT
CCGCCAGCCC AGGATCCTGC GAGCGTAGGC GTCGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- -TCGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------C CGCGGTGACA AAGGCCACGT
CCGCCAGCCC AGGATCCTGC GAGCGTAGGC GTCGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- --CGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- --------CA AAGGCCACGT
---------- ---------- ---------- --CGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ------CTGC GAGCGTAGGC GTCGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ------CTGC GAGCGTAGGC GTCGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ------CTGC GAGCGTAGGC GTCGGTGACA AAGGCCACGT
---------- ------CTGC GAGCGTAGGC GTCGGTGACA AAGGCCACGT
* *******
86
AM-67
AM-70
AM-74
AM-76
AM-78
AM-83
AM-87
AM-89
AM-90
AM-105
AM-106
AM-107
AM-116
AM-131
AM-FCS
AM-FRL
AM-VMS
AM-CP
gb|CP00166
gi|4135366
gi|3161930
gi|HM05370
Clustal Co
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110
120
130
140
150
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACTCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCAGGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
AGGCGAACCC TGCCCATGTC GACACATAGG TGAGGTCTGC TACCCACAGC
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