DIVERSIDADE GENÉTICA DE ACESSOS NATIVOS DE

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE
FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA
DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA MESTRADO
EM MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS
DIVERSIDADE GENÉTICA DE ACESSOS NATIVOS DE
MACROPTILIUM SPP E SEU SIMBIONTE BACTERIANO NO
SEMIÁRIDO PERNAMBUCANO
Mestrando: Thiago Prates Fernandes
Orientador: Prof. Mario de Andrade Lira Junior, Ph.D.
Co-orientador: Márcia do Vale Barreto Figueiredo, D.Sc.
Recife – PE
Novembro, 2010
Thiago Prates Fernandes
DIVERSIDADE GENÉTICA DE ACESSOS NATIVOS DE MACROPTILIUM SPP E
SEU SIMBIONTE BACTERIANO NO SEMIÁRIDO PERNAMBUCANO.
Projeto de pesquisa apresentado pelo
aluno Thiago Prates Fernandes ao
Programa de
Pós-Graduação em
Agronomia- Melhoramento Genético de
Plantas da UFRPE, como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Mestre.
Recife – PE
Novembro, 2010
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Dados gerais do projeto
Titulo:
Diversidade genética de acessos nativos de Macroptilium spp e seu simbionte bacteriano no
semiárido Pernambucano.
Linha de pesquisa:
Caracterização genética e agronômica de plantas cultivadas na região tropical.
Equipe técnica:
Autor:
Nome: Thiago Prates Fernandes
Titulação: Engenheiro Agrônomo
Curso: Agronomia
CPF: 071.457.026-57
e-mail: [email protected]
Orientador:
Nome: Mario de Andrade Lira Junior.
Titulação: PhD em Plant Science
Ano da titulação: 2001
Departamento: Agronomia
Área: Fitotecnia
CPF: 794002644-53
e-mail: [email protected]
Co-orientador
Nome: Márcia do Vale Barreto Figueiredo
Titulação: Dra. Em Ciências (Microbiologia), UFRJ
Ano da titulação: 1998
Departamento: Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária
Área: Fitotecnia
CPF: 127.926.674-00
e-mail: [email protected]
Duração: 24 meses
UNIDADE EXECUTORA:
Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE - Campus de Dois Irmãos,
Rua Dom Manuel de Medeiros, s/n - Dois Irmãos
CEP: 52171-900
Caixa Postal 1022
Recife - PE
Fone: (081) 3320-1000
Home page: http://www.ufrpe.br
Laboratório Biologia Molecular do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA).
Rua Av. General San Martin, 1371 - Bongi
CEP: 50761-000
Recife - PE
PABX: (81) 3184-7200
Home page: http://www.ipa.br
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 6
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 8
2.1 Aplicação das leguminosas em pastagens ......................................................................... 8
2.2 Microrganismos diazotróficos simbióticos ....................................................................... 9
2.3 Diversidade dos rizóbios .................................................................................................. 12
2.4 Fixação biológica do nitrogênio (FBN) em leguminosas ............................................... 14
2.5 Nodulação: alterações anatômicas e fisiológicas ............................................................ 15
2.6 Fixação do nitrogênio no Nódulo .................................................................................... 17
2.7 Fatores que afetam a nodulação ...................................................................................... 18
2.8 Marcadores Moleculares .................................................................................................. 21
2.9 Marcadores Moleculares ISSR ........................................................................................ 22
2.10 Utilização da região 16S rDNA na caracterização dos isolados ................................. 23
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 25
3.1 Geral .................................................................................................................................. 25
3.2 Específico ........................................................................................................................... 25
3.3 Metas .................................................................................................................................. 25
4 METODOLOGIA................................................................................................................ 26
4.1 Coleta de germoplasma .................................................................................................... 26
4.2 Avaliação da diversidade genotípica da leguminosa ..................................................... 27
4.3 Isolamento, autenticação e caracterização dos isolados ................................................ 28
5 CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO .................................................................................. 30
6 ORÇAMENTO .................................................................................................................... 31
7 APOIO FINANCEIRO E INSTITUCIONAL .................................................................. 32
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 33
RESUMO DO PROJETO
As leguminosas apresentam uma importante particularidade, pois grande parte das espécies
conhecidas é capaz de formar estruturas especializadas denominadas nódulos, em simbioses
com determinadas bactérias capazes de fixar nitrogênio atmosférico. Dessa forma, estas
bactérias podem ser chamadas de bactérias fixadoras de nitrogênio que nodulam leguminosas
(BFNNL). A fixação biológica de nitrogênio atmosférico (FBN) é um dos mais importantes
processos que ocorrem no solo relacionado à manutenção da vida na Terra, pois é responsável
pela grande contribuição no aporte de nitrogênio (N) nos ecossistemas. O estabelecimento da
simbiose entre leguminosas e BFNNL é mutualística e neste caso implica que exista troca de
benefícios entre os parceiros, no caso o nitrogênio das bactérias para as plantas e carboidratos
das plantas para a bactéria. O Nordeste Brasileiro é considerado o centro de origem de
diversas leguminosas forrageiras como espécies do gênero Stylosanthes, Desmanthus e
Macroptilium. Assim, faz-se necessário um trabalho de coleta, preservação e multiplicação do
germoplasma de leguminosas com potencial forrageiro no semiárido nordestino, para
liberação junto aos produtores. O estudo de plantas nativas de Macroptilium spp pode
proporcionar o isolamento de novas estirpes de rizóbio que apresentam características
importantes de adaptação ecológica e maior eficiência na fixação biológica de nitrogênio. Isto
é essencial para a compreensão da diversidade de espécies e aproveitamento deste recurso
biológico. O conhecimento das características fenotípicas e genéticas vem sendo utilizados na
distinção de estirpes de rizóbio e no processo de identificação dos isolados de espécies nativas
de Maroptilium spp. A diversidade de rizóbios que nodulam o Macroptilium apresenta grande
importância, pois os isolados obtidos podem apresentar potencial para serem utilizados como
inoculantes em leguminosas nativas para fins de recuperação de áreas degradadas, já que este
ecossistema tem sofrido grandes perturbações antrópicas principalmente com a abertura e
pavimentação de estradas e atuação de mineradoras. Além disso, estes novos isolados podem
apresentar potencial para uso em leguminosas cultivadas para a produção de alimentos,
adubações verdes e leguminosas forrageiras. O objetivo com este trabalho será coletar e
avaliar a diversidade genotípica de pares simbióticos ocorrentes em 11 microregiões do
semiárido de Pernambuco. Serão realizadas coletas de solo e planta de em 11 municípios
representativos da caprino-ovinocultura no semiárido pernambucano, para formação do banco
ativo de germoplasma (BAG). Destes acessos serão coletadas folhas jovens para estudos
genéticos, utilizando marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). Os estudos genéticos
serão complementados por amplificação e sequenciamento de regiões ITS (Internal
Transcribed Spacer) do DNA ribossomal. A caracterização morfológica dos isolados será
baseada em aspectos como: tamanho da colônia, forma, cor, entre outros. Para a
caracterização genética dos isolados serão utilizandos os primers fD1 e rD1. Os amplicons
serão enviados para seqüenciamento completo do 16S, e os resultados serão alinhados no
Mega4, seguido da comparação das sequências com o GenBank. Outros trabalhos com a
espécie; serão conduzidos em casa de vegetação para avaliação do potencial de fixação de
nitrogênio.
Palavras-chaves: leguminosa forrageira, siratro; nodulação, rizóbios, fixação biológica de
nitrogênio, 16S rDNA.
6
1 INTRODUÇÃO
As plantas estão constantemente expostas à grande variedade de microrganismos,
no entanto, apenas parte deles especializou-se durante a evolução na interação com as plantas.
Considerando que o fato de haver interação entre espécies não necessariamente significa
contato direto entre organismos envolvidos ou alterações morfológicas ou fisiológicas e podese afirmar que, de maneira geral, se conhece muito pouco quais espécies de microrganismos
interagem com plantas, como se dá a interação e qual sua importância (HOFFMANN &
LUCENA, 2006).
O solo é um reservatório de diversidade de espécies microbianas, que entram em
contato com as plantas via raiz. As raízes das plantas são importantes para grande número de
espécies microbianas, uma vez que, na maior parte do tempo, o solo é escasso em carbono
orgânico, que é fonte de energia para a maioria dos microrganismos. (LIMA, 2009) As raízes
constituem as principais fontes de matéria orgânica e, conseqüentemente, os microrganismos
ploriferam na região da rizosfera, onde há constante aporte de uma variedade de compostos
orgânicos exsudados pelas raízes. Assim, a comunidade microbiana da rizosfera difere
daquelas encontradas em outras regiões do solo (MCCULLY, 1999).
Algumas das bactérias que vivem na rizosfera contribuem para o desenvolvimento
das plantas, a partir de interações microrganismo-planta. As interações mais estudadas e
conhecidas são aquelas em que ocorrem alterações morfofisiológicas nos organismos
envolvidos e que, ao mesmo tempo, têm maior relevância econômica: a simbiose e a
patogênese. As simbioses definem-se como uma relação onde ocorrem alterações
morfológicas e benefício para os organismos envolvidos, isto é, planta e microssimbionte,
enquanto que na patogênese o microrganismo é favorecido em detrimento da planta
(HOFFMANN & LUCENA, 2006).
Apesar da abundância de N2 na atmosfera terrestre, os organismos que pertencem
ao grupo dos eucariotos (plantas e animais) não conseguem utilizar este elemento diretamente.
Apenas uma porção dos organismos do grupo dos procariotos consegue converter ou reduzir
enzimaticamente o nitrogênio da atmosfera em amônia, a qual pode ser incorporada para o
crescimento e manutenção das células. Estes organismos são denominados diazotróficos e o
mecanismo responsável pela incorporação de N à biomassa é chamado de fixação biológica
de nitrogênio (FBN). Portanto, a FBN é o processo pelo qual a maior parte do nitrogênio
atmosférico foi incorporado à matéria viva, ao longo da evolução do nosso planeta.
7
No cultivo das leguminosas, é importante o conhecimento sobre a eficiência e a
diversidade de grupos-chave de bactérias, como os rizóbios noduladores que fixam N2
(BNLFN), uma vez que o nitrogênio é considerado um dos nutrientes mais limitantes para o
crescimento vegetal. Segundo Melloni et al., (2006), a diversidade e a eficiência de tais
bactérias é principalmente estimada a partir da coleta ou cultivo de plantas-iscas, em solos de
determinadas áreas, usadas como fonte de inóculo, das quais são extraídos os nódulos, que
passam pelas etapas de desinfecção e isolamento, realizado em meio de cultura específico
para o crescimento de rizóbios.Obtido os isolados, as colônias de bactérias passam por
caracterizações fenotípicas, genotípicas, bioquímicas e filogenéticas (SILVA et al., 2007;
FREITAS et al., 2007). A eficiência dos rizóbios é verificada através da avaliação da matéria
seca da parte aérea, concentração de nitrogênio, número, matéria fresca e atividade de nódulos
presentes (MELLONI et al., 2006; VIEIRA et al., 2005).
Os estudos sobre a divergência genética, utilizando as técnicas multivariadas,
realizam-se por meio da avaliação simultânea de vários caracteres, que permitem inúmeras
inferências a partir do conjunto de dados existentes (CRUZ et al., 2004). Essas técnicas,
empregadas tanto para caracteres expressos por dados quantitativos quanto qualitativos, têm
facilitado o estudo sobre a diversidade de diferentes grupos de organismos e gerado
informações importantes para o melhoramento, manutenção dos recursos genéticos vegetais
(RIBEIRO et al., 2005; BENIN et al., 2002) e identificação de microrganismos (SILVA et al.,
2007; FREITAS et al., 2007).
Pesquisas referentes às plantas nativas de Macroptilium spp podem proporcionar o
isolamento de novas estirpes de rizóbio que apresentam características importantes de
adaptação ecológica e maior eficiência na fixação biológica de nitrogênio. Isto é essencial
para a compreensão da diversidade de espécies e aproveitamento deste recurso biológico. O
conhecimento das características fenotípicas e genéticas vem sendo utilizados na distinção de
estirpes de rizóbio e no processo de identificação dos isolados de espécies nativas de
Maroptilium spp.
8
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aplicação das leguminosas em pastagens
O valor das leguminosas em pastagens consorciadas ou de forma exclusiva (banco
de proteína) vem readquirindo interesse no país, tanto com leguminosas de clima temperado
como trevos, alfafa, cornichão e ervilhaca, como as tropicais, como soja perene, siratro,
estilosantes, desmódio e leucena (FREIRE, 1992).
É tradicional o uso de pastagens consorciadas nos países de clima temperado
como Nova Zelândia, Estados Unidos e Inglaterra, entre outros, para aproveitar a
característica que possuem as leguminosas de incorporar N ao sistema da pastagem e atender
as necessidades do capim associado. Entre países de clima tropical, pode-se citar a Austrália
como tradicional nos seus estudos para uso de leguminosas em pastagens consorciadas.
Pastagem consorciada é tecnologia ainda pouco utilizada no Brasil tropical,
devido a limitadas informações sobre seu manejo e espécies mais adaptadas a cada ambiente.
É tecnologia ecologicamente recomendável e economicamente viável, visto ser o nitrogênio
introduzido na pastagem, via fixação biológica, mais barato e muito menos poluente em
comparação à adubação nitrogenada.
O componente leguminosa de uma pastagem, natural ou cultivada, exerce um
papel fundamental na produção agropecuária. Além de fixar o nitrogênio atmosférico,
contribuir com matéria orgânica e melhorar a textura, estrutura e infiltração de água no solo,
aumenta a produção e o valor nutritivo da forragem. Leguminosas forrageiras originárias de
regiões de clima tropical e subtropical têm sido recomendadas para melhorar a qualidade
nutritiva das pastagens, sendo que o Macroptilium spp. vem se destacando em regiões do
semiárido.
Uma das características agronômicas desejáveis para uma leguminosa forrageira,
utilizada tanto em consorciação como em bancos de proteína, além da produção de biomassa,
é a sua persistência e produção de sementes. A quantidade de sementes produzidas é crítica
para a persistência e produtividade, sendo que o desenvolvimento de bancos de sementes no
solo fornece os meios para essas espécies sobreviverem a condições desfavoráveis tanto
ambientais como de manejo, para a sua regeneração e persistência na pastagem (McIVOR et
al., 1993).
9
Cerca de 50% dos 100 milhões de hectares ocupados com pastagens cultivadas no
Brasil encontra-se em algum estágio de degradação (DUBEUX et al., 2006). A não reposição
de nutrientes, dentre eles o nitrogênio, é um dos fatores responsáveis por tal quadro. A
adubação química e a fixação biológica podem adicionar o N ao ecossistema das pastagens.
Porém, limitações econômicas têm reduzido o uso de adubações químicas em pastagens.
Nesse sentido, Martha et al. (2004) relatam que no intervalo de 1999 a 2003, o poder de
compra de fertilizantes nitrogenados baseados na venda de boi ou de bezerro, foi reduzido em
55% e 67%, respectivamente. Desta forma, a fixação biológica de nitrogênio passa a ser uma
alternativa ao uso dos fertilizantes químicos. Lira et al. (2006), por meio de simulação
realizada, sugerem que a manutenção de 25% de leguminosas na composição botânica da
pastagem (peso seco), equivale a uma adubação anual aproximada de 100 kg de N2/ha.
Além da fixação biológica de N2, as leguminosas quando bem manejadas
proporcionam boa cobertura do solo, reduzindo assim a infestação por plantas daninhas
(FERNANDES et al., 1999) e também a erosão do solo (ALVARENGA et al., 1995). Por
fim, as leguminosas podem melhorar a dieta dos animais, já que de maneira geral possuem
elevado teor de proteína bruta e maior digestibilidade quando comparadas às gramíneas
tropicais (SCHUNKE, 2001; GALINDO et al., 1999). Muitos dados experimentais ressaltam
a melhoria da produção animal promovida pela presença da leguminosa seja pela participação
direta deste vegetal na dieta do animal ou pelos efeitos indiretos relacionados com o aumento
do aporte de nitrogênio ao ecossistema da pastagem (PACIULLO et al., 2003; ANDRADE et
al., 2003).
2.2 Microrganismos diazotróficos simbióticos
Dentre estes organismos que fixam nitrogênio (ou diazotrofos) muitos são
heterótrofos, necessitando de um suplemento de carbono reduzido, o que depende
indiretamente da energia da luz e em geral requer uma simbiose com um hospedeiro
eucarioto; ou são de vida livre, competindo com outros microrganismos pela matéria orgânica
disponível no ambiente. Outros são autótrofos, os quais podem reduzir o CO2 em presença da
luz.
Os microrganismos capazes de fixar o nitrogênio atmosférico são caracterizados
em três: diazotrofos de vida livre, que fixam o nitrogênio para seu próprio uso; diazotrofos
10
associativos, que contribuem para o crescimento da planta sem a formação de estruturas
diferenciadas, não estabelecendo uma simbiose e os diazotrofos simbióticos, que estabelecem
uma interação muito estreita entre o macro e microsimbionte, e em alguns casos, são
formadas estruturas diferenciadas denominadas nódulos.
As bactérias fixadoras de nitrogênio em associação com leguminosas, conhecidas
genericamente como rizóbios, pertencem a um grande número de gêneros.
O gênero Rhizobium apresenta células aeróbias, Gram negativas, com forma de
bacilos, que medem 0,5-1,0 x 1,3-3,0 μm, e a motilidade é realizada por flagelos (1-6), que
podem ser perítricos ou subpolares; as colônias geralmente são brancas ou bege, circulares,
concavas, semitranslúcidas ou opacas e mucilaginosas, medindo 2-4 mm de diâmetro aos 3-5
dias de incubação em meio LMA (Levedura Manitol Ágar), (WANG et al., 2010; BÉCQUER,
2004). O crescimento em meio de carboidratos geralmente é rápido, reação ácida e abundante
quantidade de polissacárideo extracelular, assim como os demais gêneros. A temperatura
ótima de crescimento ocorre entre 25-30 ºC e pH 6-7, porém, podem crescer em extremos de
temperatura (4,0-42,5 ºC) e pH (4,5-9,5); são quimiorganotróficas, utilizando uma série de
carboidratos e sais de ácidos orgânicos como fontes de carbono, sem a formação de gás
(MARIN et al., 2010). Segundo Bécquer (2004), dentre as espécies descritas nesse gênero até
o ano de 2001, formando nódulos com Phaseolus vulgaris, encontram-se R. tropici, R. etlii, R.
gallicum e R. giardinii.
O gênero Sinorhizobium, cujas cepas são produtoras de ácido e de crescimento
rápido, como as de Rhizobium, foi segregado das cepas de rizóbios que formam nódulos na
soja (Glicyne max L.), especificamente R. fredii e R. meliloti (MARIN et al., 2010), devido às
diferenças entre as seqüencias do gene 16S rRNA (WANG et al., 2010). As células
bacterianas apresentam a forma de bacilos, que medem 0,5-1,0 x 1,2- 3,0 μm; a temperatura
ótima de crescimento varia entre 25 e 30 ºC, mas muitas estirpes crescem a 35ºC e outras a
10ºC; o pH ótimo está entre 6 e 8, porém algumas estirpes crescem em pH 5 e outras em pH
10,5; são bactérias quimiorganotróficas, utilizando uma série de carboidratos (exceto celulose
e amido) e sais de ácidos orgânicos como fonte de carbono (BÉCQUER, 2004).
Devido a existência de cepas com características intermediárias, às típicas
espécies rápidas de Rhizobium e espécies lentas de Bradyrhizobium, ocorreu a formação do
gênero Mesorhizobium. Nesse gênero, as células bacterianas são bacilos, que medem 0,4-0,9
x 1,2-3,0 μm; as colônias em meio LMA são circulares, convexas, semitranslúcidas e
mucilaginosas, com 2-4 mm de diâmetro, após 5 dias de incubação a 28ºC, contudo, algumas
espécies apresentam menos de 1 mm após 7 dias de incubação (WANG et al., 2010). Todas as
11
cepas produzem ácido em LMA. Todas as espécies assimilam glicose, raminose e sacarose
metabolizando-os em produtos ácidos, sendo que o pH ideal para crescimento está entre 4,0 e
10,0 e a temperatura entre 37 a 40 ºC (MARIN et al., 2010).
O gênero Bradyrhizobium apresenta células bacterianas aeróbias, Gram negativas,
bacilos que medem 0,5-0,9 x 1,2-3,0 μm, com um flagelo polar ou subpolar, e crescimento
pouco e lento, em meio enriquecido com levedura; são pleomórficas e não formam esporos
(WANG et al., 2010; BÉCQUER, 2004). As colônias são circulares, raramente translúcidas,
brancas e convexas, com diâmetro menor que 1 mm após 5-7 dias de incubação. Podem
formar colônias do tipo seco, opacas, freqüentemente puntiformes e produtoras de
álcali.Ormenõ-Orrillo et al. (2006) identificaram a espécie Bradyrhizobium yuanmingense
nodulando o feijão-fava, cujos isolados apresentavam taxa de crescimento lento, atingindo
colônias com tamanho de 1-3 mm, entre 5-6 dias.
Entretanto, um grupo de isolados com taxa de crescimento considerado extralento, atingindo colônias de tamanho maior que 1 mm, entre 7-10 dias, não apresentou
similaridade com nenhuma espécie já descrita no gênero Bradyrhizobium, o que representa
uma grande diversidade desconhecida entre os microrganismos noduladores do feijão-fava.
Segundo Euzéby (2010), existem ainda descritas as espécies B. japonicum, B. elkanii, B.
liaoningense, B. betae e B. canariense, pertencentes a esse gênero.
O gênero Azorhizobium possui uma única espécie descrita, A. caulinodans, que
forma nódulos efetivos em talos e raízes de Sesbania rostrata. Segundo Wang et al. (2010), as
células bacterianas apresentam forma de bacilos que medem 0.5-0.6 x 1.5- 2.5 μm, movendose em meio sólido devido a presença de flagelos peritricos e em meio líquido, com flagelo
lateral. As colônias são circulares, translúcidas, gomosas, cor cremosa e apresentam
crescimento tão rápido como as do gênero Rhizobium (medindo mais de 2 mm de diâmetro,
após 2 dias), produzem álcali em meio LMA. Ao contrário de Rhizobium e Bradyrhizobium,
esse gênero não assimila açúcares (exceto glicose) (MARIN et al., 2010) e segundo Young
(1996), quanto à posição filogenética, encontra-se mais afastado do gênero Rhizobium.
O gênero Allorhizobium também apresenta, até agora, uma única espécie descrita, A. undicola
(LAJUDIE et al., 1998), isolada a partir de nódulos de Neptuna natans, uma planta aquática
africana do Senegal (WANG et al., 2010).
Até recentemente, era geralmente aceito que as leguminosas eram noduladas
exclusivamente por membros das α-proteobactérias, pertencentes a alguns gêneros
relacionados
à
família
Rhizobiacea
que
inclui
Allorhizobium,
Azorhizobium,
Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium e Ensifer (Sinorhizobium). Nos últimos anos,
12
entretanto, outras α-proteobactérias foram mostradas como noduladoras de leguminosas
(MOULLIN, et al., 2002) incluindo estirpes, Blastobacter, Devosia, e Methylobacterium
(RAMÍREZ BAHENA, 2006; SANTOS et al., 2008; SERRATO et al., 2008).
Atualmente membros de β-Protobactérias foram descobertas nos nódulos de
leguminosas tropicais incluindo, Burkholderia sp. estirpes (STM 678 e STM 815), Ralstonia
taiwanesis (LMG 19424) isoladas de Mimosa pudica (CHEN et al. 2001, 2003 e 2007).
A característica mais notável destas bactérias é sua capacidade de estabelecer, em
condições limitantes de nitrogênio, associação simbiótica mutualística com plantas da família
das leguminosas. Uma importante peculiaridade destas interações é o elevado grau de
especificidade, onde geralmente, cada rizóbio é capaz de interagir com uma ou poucas
espécies vegetais, normalmente bem relacionadas filogeneticamente. Entretanto, existem
rizóbios promíscuos, que apresentam um amplo número de hospedeiros (LIMA et al., 2005).
A nodulação é um processo de multi-passos que envolvem plantas específicas e
expressão genética bacteriana compatível (GARCIA, 2008). Os resultados de vários trabalhos
têm indicado a participação de mediadores químicos no período inicial do processo de
infecção das raízes das leguminosas. Flavonóides específicos são reconhecidos pelo rizóbio e,
em alguns casos, este é um importante aspecto de reconhecimento do hospedeiro. Se o
flavonóide for reconhecido, ocorrerá a síntese de sacarídeos nas células bacterianas através da
ação de vários produtos de genes e, resultando a produção de uma pequena família de lipooligossacarídeos. A estrutura dos tipos de lipo-oligossacarídeos é o maior determinante da
especificidade do hospedeiro (DIOUF et al., 2000; DAKORA, 2003)
2.3 Diversidade dos rizóbios
A utilização da diversidade dos microrganismos ocorre, principalmente, através
do conhecimento das características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas, fiologenéticas e
genéticas, que são aplicadas de forma conjunta ou individual nos trabalhos sobre rizóbios
(ORMENÕ-ORRILLO et al., 2006; ZRIBI et al., 2005; FENG et al., 2002; ANYANGO et
al., 1995; SOARES et al., 2006; STROSCHEIN, 2007). Atualmente todas essas técnicas são
utilizadas para distinção de estirpes de rizóbios, constituindo a taxonomia polifásica,
mantendo o uso dos métodos fenotípicos clássicos, que nunca entraram em desuso ou tornar-
13
se-ão obsoletos. Segundo Bécquer (2004), a diversidade genética dos microrganismos nunca
poderá ser avaliada por um único critério, ainda que sejam as técnicas moleculares.
A captura dos microrganismos na rizósfera das plantas é feita com a utilização de
planta-isca, cuja principal característica é a promiscuidade, constituindo um dos métodos mais
utilizados para avaliar a diversidade de bactérias noduladoras de leguminosas e fixadoras de
N2 (BNLFN) nos solos. Hungria (1994) recomenda a coleta de nódulos para isolamento ou de
solos que serão utilizados como fonte de inóculos, em um raio de 30 cm da planta-isca, na
profundidade de 0 a 20 cm. O isolamento normalmente é realizado a partir da seleção
aleatória dos maiores nódulos, de coloração intensa avermelhada, firmando a presença de
leghemoglobina e conseqüente fixação ativa de N2.
Melloni et al., (2006), avaliaram a eficiência e a diversidade fenotípica de
populações de BNLFN em solos de áreas de mineração de bauxita, nos ambientes de campo e
serra, baseados nas seguintes características culturais: tempo de crescimento, diâmetro da
colônia, alteração do meio e produção de goma. Os autores construíram dois dendrogramas de
similaridade, um para os isolados de feijão-caupi e outro para feijão-comum utilizados como
plantas-isca. O feijão-caupi mostrou-se com um maior número de grupos de diversidade, em
ambos os ambientes. De acordo com Santos et al., (2007), e Melloni et al., (2006), além do
número de grupos de diversidade, a caracterização fenotípica de isolados também pode
estimar a diversidade das populações de rizóbio através dos índices: Shanon e Weaver,
riqueza de Margalef e outros, aplicados quando populações são obtidas de formas
diferenciadas, como isolamento dos microrganismos coletados sob diferentes áreas,
coberturas vegetais e ou diferentes manejos.
Entre isolados de rizóbio nativos existe eficiente fixação do N2, que pode
contribuir para aumentar a produção de grãos e reduzir os custos com fertilizantes
nitrogenados, entretanto, é necessária a avaliação, de modo a possibilitar a seleção de estirpes
altamente eficientes em condições adversas (SANTOS et al., 2005). Silva et al., (2007),
identificaram entre isolados de rizóbios nativos, estirpes resistentes à temperatura elevada e
resistentes aos antibióticos kanamicina e ácido nalidíxico, com potencial para utilização em
regiões semi-áridas. Segundo Vieira et al., (2005), as estirpes nativas de rizóbio podem ser tão
eficientes quanto as estirpes selecionadas, quando condições adequadas de expressão do seu
alto potencial de fixação de N2 são fornecidas.
Na literatura são encontrados diversos trabalhos sobre fixação biológica de
nitrogênio, em diferentes leguminosas, tais como: amendoin (SANTOS et al., 2005), feijãocaupi (VIEIRA et al., 2005, ZILLI et al., 2006), feijão-caupi e feijão-comum (MELLONI et
14
al., 2006), feijão-comum (MOTASSO et al., 2002), que além de identificar a diversidade dos
rizóbios, também avaliam a eficiência dessas bactérias no processo da FBN.
Considerando-se que a FBN é mediada por uma ampla gama de microrganismos
procariotos, com substancial diversidade morfológica, fisiológica, genética, bioquímica e
filogenética (SILVA et al., 2007), espera-se que estudos envolvendo um simbionte pouco
conhecido como o Macroptilium spp, proporcionem o isolamento de novas estirpes de
rizóbio, com características importantes para adaptação ecológica e maior eficiência na
fixação biológica de nitrogênio.
2.4 Fixação biológica do nitrogênio (FBN) em leguminosas
A simbiose leguminosas-bactérias fixadoras de N2 atmosférico é amplamente
aceita como alternativa à fertilização química. Bactérias do grupo dos rizóbios têm a
capacidade de formar nódulos em raízes e caules de leguminosas e são reconhecidos como os
principais fixadores de nitrogênio atmosférico assumindo um papel importante na agricultura
sustentável (FREITAS et al., 2007). Durante essas interações benéficas, os rizóbios são
capazes de invadir as raízes das plantas e induzir a formação de um novo órgão, o nódulo,
onde uma forma especializada e diferenciada da bactéria, o bacteróide, é capaz de realizar a
fixação biológica de nitrogênio, reduzindo o dinitrogênio em formas assimiláveis pelas
plantas. O processo de fixação acontece através de um complexo enzimático denominado
nitrogenase, que é uma característica comum em todos os microrganismos fixadores de
nitrogênio atmosférico, estes necessitam de um elevado gasto energético, que é obtido a partir
da oxidação dos carboidratos produzidos na parte aérea das plantas hospedeiras (MOREIRA
& SIQUEIRA, 2006; TRAINER & CHARLES, 2006).
O nitrogênio é o elemento mais abundante na atmosfera terrestre (em torno de
79%), estando presente principalmente na forma diatômica (N2) e é um dos principais
macronutrientes dos vegetais.
A habilidade das bactérias para fixar nitrogênio em simbiose com as leguminosas
é de considerável importância agrícola, entretanto, tipo de solo, clima e cultivar podem afetar
a resposta da inoculação, sendo assim, necessário pesquisas para se determinar qual estirpe é
mais eficiente para estas condições (RUMJANEK; & XAVIER, 2007). As leguminosas têm,
ao seu dispor, duas fontes de nitrogênio: o mineral, proveniente do solo e/ou fertilizante, e o
15
nitrogênio fixado biologicamente através da simbiose com rizóbios. Entretanto, o aumento
vertiginoso dos preços dos adubos nitrogenados devido ao consumo de energia fóssil em sua
fabricação, aliada aos graves problemas de poluição causados pelo uso intensivo desses
adubos, têm deixado a agricultura dos países em desenvolvimento e dos desenvolvidos apenas
as alternativas de maximizar a fixação biológica de nitrogênio, otimizar a distribuição e
emprego dos compostos nitrogenados dentro das plantas e tornar mais eficiente a utilização de
carboidratos pelos nódulos (NEVES & RUMJANEK, 1996; JAMES, 2000).
O crescimento e a produção das leguminosas são pelo menos em parte, resultados
da interação entre as cultivares das plantas, as estirpes de rizóbios e as condições ambientais
em que o sistema simbiótico se desenvolve e que afetam a assimilação, distribuição e
utilização do carbono e nitrogênio pelas plantas. A disponibilidade de nitrogênio para as
sementes em desenvolvimento determina a produção e depende de uma fixação de nitrogênio
que se prolongue até o período de enchimento dos grãos (NEVES & RUMJANEK, 1997).
A fixação biológica do nitrogênio dar-se-á mediante a presença de nódulos nas
raízes induzidos pela infecção das raízes pelas bactérias (HUNGRIA et al., 2000). O
desenvolvimento dos nódulos será iniciado pela troca de sinais químicos moleculares entre a
planta e o simbionte (HUNGRIA et al., 1994). Os nódulos e a planta hospedeira são
perfeitamente interligados por meio de vasos xilemáticos e floemáticos e, portanto, totalmente
integrados em termos hormonais e nutricionais. O processo de fixação do nitrogênio também
requer um suprimento contínuo de carboidratos que fornecem tanto a energia para a redução
do nitrogênio, quanto os esqueletos de carbono necessários à assimilação da amônia
produzida. Durante os processos de infecção e desenvolvimento dos nódulos, energia é
necessária às divisões celulares e é obtida da oxidação dos carboidratos produzidos na parte
aérea da planta hospedeira (SILVEIRA et al., 2001).
2.5 Nodulação: alterações anatômicas e fisiológicas
A fixação biológica do N envolve uma sucessão de processos que começam com a
adaptação da bactéria à planta e culminam na fixação do N2 atmosférico. A nodulação ocorre
aproximadamente 2h após o contato da bactéria com as raízes. Os nódulos primários se
desenvolvem em regiões de alongamento e nas zonas de formação de pequenos pêlos
16
radiculares, considerada a região preferencial para a infecção da bactéria fixadora
(BHUVANESWARI et al., 1980).
O processo de infecção pelo rizóbio envolve diferentes agentes sinalizadores entre
a planta e a bactéria (GERAHTY et al., 1992;TIMMERS et al., 1999; TAÍZ & ZIEGER,
2004;). O modelo proposto por TIMMERS et al. (1999) relata que a bactéria noduladora
migra em direção as raízes em função de uma resposta quimiostática. Essa resposta é
decorrente da atração pelos isoflavonóides e betaínas secretadas pelas raízes, esses atrativos
para as bactérias, ativam enzimas, as quais induzem a transcrição de genes nod, estes genes
codificam moléculas sinalizadoras de oligossacarídeos de lipoquitina. A planta hospedeira
apresenta receptores que parecem ser lecitinas especiais produzidas nos pêlos radiculares.
Durante o contato as células dos pêlos liberam fatores de nodulação (Nod) causando seus
enrolamentos. Com a evolução da infecção é formado um canal dentro do pêlo radicular,
enquanto que no periciclo é iniciado o rearranjo do citoesqueleto microtubular,
posteriormente acontece ativação das células na parte interna do córtex, as quais se dividem
formando um primórdio. Logo após, nos pêlos radiculares ocorre à infecção, localizada
distanciadamente da área radicular ativada. A ativação celular se estende progressivamente
para o meio e a parte mais externa do córtex de acordo com dois gradientes de diferenciação
celular, resultando na formação de um primórdio nodular.
Para entender melhor como ocorre o crescimento e desenvolvimento do nódulo
Gerahty et al., (1992) explicam, de forma cronológica, como acontece a alteração anatômica
nas raízes de soja após a infecção, quando são iniciados divisões celulares dentro e fora do
córtex radicular gerando nódulos meristemáticos onde ocorrem sucessivas divisões mitóticas.
Esses processos foram explicados de forma cronológica através de estágios de crescimento e
desenvolvimento nodular. O estágio 0 corresponde à raiz não infectada, estágio I - início da
infecção, estágio II - células corticais externas começam a se dividir, estágio III - a divisão é
evidente no córtex interno e algumas células do córtex externo, estágio IV – as células são
mais isodiamétricas e apresentam algumas divisões oblíquas externamente e internamente no
córtex, formando um meristema nodular, estágio V - o meristema é aumentado e estágio VI emergência do nódulo.
Durante o crescimento do nódulo as bactérias internalizadas são liberadas para
produzir infecções no citoplasma, elas começam a se dividir e a membrana que as envolve
aumenta em superfície para acomodar esse crescimento pela fusão com vesículas menores
(GERAHTY et al., 1992; TIMMERS et al., 1999). No estágio de crescimento V, ocorre
controle na expansão do nódulo, considerado um mecanismo de auto-regulação, situação que
17
conduz a maturidade do nódulo. Nesse momento as bactérias param de se dividir e começam
a aumentar em tamanho e a se diferenciar em organelas endossimbióticas fixadoras de
nitrogênio denominadas de bacteróides, a membrana que o envolve chama-se de
peribacteróide, que desenvolve sistema vascular semelhante ao das plantas, que facilitaria a
troca de N fixado pelos bacteróides por nutrientes disponibilizados pela planta (TAÍZ &
ZIEGER, 2004).
2.6 Fixação do nitrogênio no nódulo
Na fixação biológica, o N2 é transformado em NH3 a custas de energia da planta
(BURRIS, 1999; TAÍZ & ZIEGER, 2004). O complexo enzima nitrogenase formado por duas
unidades protéicas, a Ferro-proteína (Fe-proteína) e a Molibdênio-Ferro-proteína (MoFeproteína) são responsáveis pela fixação de nitrogênio no nódulo (BURRIS, 1999; MYLONA
et al., 1995; TAÍZ & ZIEGER, 2004). Para que ocorra a fixação biológica de nitrogênio é
necessário que a nitrogenase se encontre em condições anaeróbicas.
Os nódulos possuem uma heme proteína chamada de leghemoglobina que se liga
ao oxigênio e que está presente em altas concentrações nos nódulos. A planta produz a porção
globina em resposta a infecção da bactéria, tendo esta proteína uma alta afinidade por O2.
Tanto a leghemoglobina como a barreira de difusão de oxigênio no nódulo são reguladores
importantes na tensão de oxigênio no nódulo protegendo o complexo enzima nitrogenase que
é irreversivelmente inativado pelo oxigênio (MYLONA et al., 1995). De acordo com
DENINSON & HARTER (1995) a leghemoglobina é um importante transportador de
oxigênio para as células bacterianas, sendo capaz de armazenar O2 suficiente para a
manutenção da respiração celular por alguns segundos.
Os autores ainda ressaltam que o suprimento de nitrogênio causa inibição da
nitrogenase devido ao decréscimo da permeabilidade da membrana do nódulo ao oxigênio e
pela redução afinidade da leghemoglobina pelo oxigênio. Na reação de redução do N2, a
nitrogenase é auxiliada por uma enzima transportadora de elétrons, a ferredoxina, originária
do fotossistema I da fase fotoquímica da fotossíntese. Na fixação biológica do nitrogênio a
Ferro-proteína e a Molibidênio-Ferro-Proteína comandam as reações. A Ferro-proteína
freqüentemente é reduzida por um doador de elétrons, a ferredoxina reduzida (Fd). A Ferroproteína reduzida se liga com o magnésio ATP (Mg ATP) que recebe elétrons, estes são
18
passados para outra enzima a molibdênio ATP (Mo ATP) e desta os elétrons são passados
para o nitrogênio, transformando-o em NH3, este é liberado por difusão do bacterióde para o
citosol da célula infectada (BURRIS, 1999; TAIZ & ZIEGER, 2004).
Depois de formado, o NH3 em contato com o substrato aquoso do citoplasma dos
bacteróides é transformado em NH4 (TAIZ & ZIEGER, 2004). O acúmulo de NH4+ inibe a
fixação de nitrogênio dentro dos bacteróides, desta forma ele é transportado para interior da
célula hospedeira, no centro do nódulo. Como o NH4+ também é prejudicial a célula devido a
diminuição na formação do ATP e do transporte de elétrons na cadeia respiratória, ele é
incorporado em moléculas que não possuam efeito tóxico. As enzimas glutamina sintetase
(GS) e a glutamato sintase (GOGAT) convertem o NH4+ em aminoácidos. A atividade destas
enzimas aumenta durante o desenvolvimento dos nódulos e com o aumento na disponibilidade
de energia (ATP) no meio de reação (SILVA, 1998; BURRIS, 1999). O principal meio de
transporte de nitrogênio da soja dos nódulos para a parte aérea é na forma de ureídeos, além
da aspargina (KING & PURCELL, 2005).
2.7 Fatores que afetam a nodulação
Alguns fatores são determinantes na nodulação ou fixação biológica do nitrogênio
(FBN) por leguminosas sendo a tensão da água, teor de oxigênio (O2) no nódulo, temperatura
e pH do solo, salinidade, toxinas e predadores os principais que podem atuar junto à vasta
variedade de estirpes de rizóbio que se encontram no solo.
Como foi relatado, o nódulo consiste de uma região cortical da raiz infectada,
envolvida por células corticais que possuem uma rede vascularizada. A camada vascular
possui uma rede de esclereídeos que serve de sustentação e proteção e que estão associadas
com células parenquimáticas (WALSH, 1995). No entanto esta camada de esclereídeos pode
limitar o movimento de água entre o solo e o nódulo cortical. A fronteira vascular é
apoplasticamente isolada do nódulo cortical via estria de Kaspary. Esta camada possui poucos
plasmodesmos e representa restrição do fluxo via simplasto. Contudo as células corticais
podem secretar glicoproteínas para o apoplasto diminuindo o potencial osmótico e
incrementando a absorção de água (WALSH, 1995).
Também se observa o efeito da disponibilidade hídrica no transporte de sacarose e
compostos nitrogenados. Segundo Walsh (1995), o sistema vascular desenvolve turgor
19
positivo em resposta ao transporte de compostos nitrogenados via fluxo de massa. Isso supõe
que a exportação requer água e esta é indispensável neste fluxo, uma vez que a água que traz
sacarose via floema, é absorvida pelo nódulo seguindo o caminho de volta, carregando os
solutos nitrogenados. Portanto, o balanço de água via transporte simplasto e apoplasto altera a
pressão de turgor das células e provavelmente tem influência na permeabilidade da membrana
do nódulo a gases, principalmente o oxigênio.
Para que o processo de nodulação aconteça de forma efetiva é importante que a
temperatura seja adequada à atividade da nitrogenase. Segundo Zhang et al., (1996), a
temperatura de 25°C é considerada ideal, enquanto temperaturas em torno de 15°C causam
diminuição da atividade ou até inibição em várias raças de bactérias fixadoras.
Algumas pesquisas mostram o efeito do oxigênio na nodulação de plantas como a
realizada por Kuzma et al., (1999). O trabalho mostrou que o oxigênio é fator importante na
nodulação da soja, uma vez que a respiração e a atividade da enzima nitrogenase foram
afetadas pela disponibilidade de O2. De acordo com o estudo, pequenas concentrações de
nitrogênio no bacteróide são importantes, pois concentrações baixas (próximo a 10%) afetam
a atividade da nitrogenase devido a diminuição da respiração e disponibilidade de energia.
A permeabilidade gasosa no bacteróide é afetada por diversos fatores. Entre eles,
a luz, água e nitrato, sendo que de modo geral, o teor de O2 aumenta na luz e decresce em
condições de seca ou exposição ao nitrato (MYLONA, et al., 1995; TAÍZ & ZIEGER, 2004).
O estresse hídrico afeta a atividade da nitrogenase de duas formas. Primeiro,
limita a disponibilidade de oxigênio na zona do bacteróide restringindo a respiração e a
segunda, pela diminuição da síntese de leghemoglobina, acúmulo de ureídeos e aspartato nas
folhas e nódulos devido ao decréscimo no fluxo de água no floema (HUNGRIA & VARGAS,
2000).
King & Purcell (2005) avaliaram a inibição da fixação de nitrogênio em soja
Cultivar Jacson e KS 4895 submetida à déficit hídrico, associados com elevação de ureídeos e
aminoácidos. Com a diminuição na disponibilidade de água, as duas cultivares apresentaram
diminuição da atividade nitrogenase, que foi acompanhado pelo aumento da concentração de
ureídeos, aspartato e vários outros aminoácidos nas folhas, devido ao decréscimo na
exportação destes para as raízes, que segundo os autores, são candidatos potenciais para o
“feedback” de inibição na fixação de nitrogênio.
O manganês tem papel fundamental na catálise de vários processos enzimáticos e
de transferência de elétrons. Valdez et al., (2000) citam que o Mn2+ pode regular a fixação
biológica de nitrogênio (FBN) em condições de seca. Isso porque, a enzima amido hidrolase
20
responsável pela degradação de ureídeos nas folhas é dependente de Mn2+, sendo assim, em
condições de estresse hídrico o suprimento de manganês pode auxiliar na manutenção da
fixação biológica de nitrogênio.
A eficiência de fixação de nitrogênio está relacionada com o pH e a
disponibilidade de alguns nutrientes no solo. Para obter boa eficiência de bactérias fixadoras a
nível de solo, este deve apresentar pH em torno de 6,5. Altos teores de alumínio trocável e
íons H+ prejudicam o desenvolvimento radicular, o crescimento do rizóbio e a infecção
radicular (SILVA et al., 2002). Entretanto, Silva et al., (2002) realizando experimento com
soja sob diferentes doses de calcário (0, 2, 4 e 8 t.ha-1) e com estirpes resistentes a acidez de
solo, sugerem cautela na utilização de elevadas dosagens de calcário sob solos muito ácidos
devido a diminuição na atividade de fixação de nitrogênio. O fósforo tem influência na
iniciação, crescimento e funcionamento dos nódulos (SÁ & ISRAEL, 1991). A atividade da
nitrogenase é dependente de ATP, como já foi citado. Este fator explica porque a cultura da
soja responde mais a adubação fosfatada quando comparada com culturas não noduladas. O
experimento realizado por Sá & Israel, (1991), ressaltou que altos requerimentos de fósforo
são necessários para a FBN, de forma que o aumento do suprimento de fósforo promove
incremento na atividade e no acúmulo de fitomassa seca do nódulo.
Silva (1998) observou que a concentração de Pi nos nódulos das plantas que
apresentaram omissão de fósforo se reduziu e, conseqüentemente, o seu acúmulo de fitomassa
seca. Entretanto o aumento no suprimento de fósforo durante o estágio reprodutivo não
proporcionou recuperação na produção de fitomassa seca de nódulos. O reflexo deste
comportamento foi a redução na produção de ureídeos pela planta, que é a principal forma de
transporte de N pela cultura e da atividade da sintetase glutamina e da glutamato, dependente
de ferredoxina. No trabalho foi observado que a deficiência de Pi no estágio V2 ocasiona
inibição na formação de nódulos e no seu desenvolvimento, o mesmo aconteceu no estágio
reprodutivo R1, com posterior senescência dos mesmos.
O molibdênio é um elemento importante no metabolismo do nitrogênio por fazer
parte do complexo enzima nitrogenase e redutase do nitrato (BURRIS, 1999; TAÍZ &
ZIEGER, 2004). A produção de aminoácidos e, conseqüentemente, de proteínas são afetados
pela deficiência de molibdênio. O Cobalto faz parte de precursores da leghemoglobina (TAÍZ
& ZIEGER, 2004), portanto, também está associado à fixação biológica de nitrogênio.
Santos (1999), trabalhando com adubação nitrogenada e molibdica em soja
observaram que a aplicação de molibdênio nas sementes diminuiu o índice de NO3 - e elevou
o teor de N total nas folhas, entretanto, não interferiu na produtividade de grãos,
21
provavelmente porque o teor de Mo no solo já era suficiente para o desenvolvimento da
planta. Também foi observado incremento no teor de proteína bruta nas sementes, sendo a
aplicação das doses de 80 a 100g.ha-1 via foliar, as mais favoráveis. Meschede et al., (2004),
consideram a adubação com molibdênio e cobalto importantes para a FBN, mostrando que, a
partir do momento que foram adicionados estes micronutrientes na semente a planta
apresentou grãos com maior teor de proteína, entretanto, os autores salientam que se deve ter
cautela na aplicação de molibdênio na semente, principalmente na forma de molibdato (MoO)
o qual tende a reduzir a sobrevivência do rizóbio.
Outro ponto importante a ser ressaltado sobre a nodulação refere-se à aplicação de
produtos químicos na semente ou na cultura em desenvolvimento visando o controle de ervas
daninhas. Esta constatação corrobora os resultados obtidos por Arruda et al., (2001). Os
autores realizaram trabalho que teve por objetivo analisar a nodulação e fixação de nitrogênio
em soja tratada com sulfentrazone (herbicida). Os dados obtidos mostram que a massa seca de
nódulos, os teores de nitratos, aminoácidos e ureídeos decresceram com o incremento na dose
de sulfentrazone, a causa provável deste comportamento foi a menor produção de
fotoassimilados pela planta e desta forma restou menor quantidade para ser alocada para os
nódulos, pois é dos fotoassimilados que vem a energia essencial para a formação e
manutenção da enzima nitrogenase.. Câmara (2001) enfatiza que aplicação de Co, Mo e
fungicidas nas sementes também podem ser fatores com interferência direta na sobrevivência
do rizóbio e conseqüência imediata na nodulação.
Desta forma, fica claro que a fixação de nitrogênio pelas plantas é um processo
que apresenta várias interações entre bactéria e hospedeiro (planta), sendo regulado por sinais
químicos e hormonais, além de fatores externos como disponibilidade hídrica, teor de
oxigênio e adubação nitrogenada. Entretanto, ressalta-se que é um processo dispendioso para
a planta. Assim sugerem-se estudos sobre técnicas de manejo, como a adubação nitrogenada,
com intuito de buscar equilíbrio entre a adição de N e a fixação biológica em vista da
importância do volume financeiro envolvido nestes dois mercados de insumos (adubo
nitrogenado e inoculantes).
2.8 Marcadores Moleculares
Os marcadores genéticos são definidos como elementos capazes de prever,
mapear e caracterizar um fenótipo. Entre as décadas de 20 e 60, os marcadores morfológicos e
22
os marcadores isoenzimáticos, foram os primeiros marcadores genéticos utilizados para
auxiliar estudos de genéticas de populações. Entretanto, estes marcadores eram limitados a
espécies que apresentavam uma maior disponibilidades de informações genéticas, como a
exemplo o tomate (Solanum lycopersicum), (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).
Com o advento das técnicas da biologia molecular na década de 80,surgiram
diversos métodos de detecção de polimorfismo genético diretamente no nível de DNA,
denominados marcadores de DNA ou marcadores moleculares.Os primeiros marcadores
utilizados foram aqueles baseados em enzimas de restrição, como os marcadores RFLP
(Restriction Fragment Lenght Polymorphism). Posteriormente, com o desenvolvimento da
técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction), Surgiram outras classes de marcadores
moleculares (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998), como os marcadores RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA), minisatélites ou locos VNTR (Variable Number of Tandem
Repeats), SSR (Simple Sequence Repeat), dentre outros (FERREIRA & GRATTAPAGLIA,
1998).
Os diversos tipos de marcadores moleculares atualmente disponíveis diferenciamse pela abundância no genoma, nível de polimorfismo detectado, especificidade de locos,
reprodutibilidade, natureza da herança e requerimentos técnicos para a aplicação do marcador.
Marcadores moleculares de origem nuclear são muito úteis para revelar a história de
colonização e as estruturas das população modernas de uma dada espécie invasora. Os
marcadores moleculares podem seu utilizados para estimar as diferenças genéticas entre
indivíduos, dentro ou entre espécies relacionadas de populações. Também são empregados em
estudos de sistemática molecular, entomologia molecular, dinâmica de populações,
diagnósticos e fingerpriting genômico (BEHURA, 2006; FAKRUDIN et al., 2006).
Segundo Fakrudin, et al.(2006), a escolha de um marcador molecular depende de
vários fatores como a disponibilidade, nível de detecção de polimorfismo desejado,
disponibilidade de informações sobre o genoma da espécie alvo, habilidades técncas,
disponibilidades de protocolos, etc. Dessa forma, é impossível impor a superioridade de um
tipo de marcador em relação a outro,uma vez que cada um apresenta sua particularidade.
2.9 Marcadores Moleculares ISSR
Os marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat), representam uma das mais
recentes classes de marcadores moleculares e foram descritos incialmente por Zietkiewicz et
23
al., (1994). Marcadores ISSR são obtidos por amplificação via PCR utilizando primer único,
constituídos de sequências repetidas de di ou trinucleotídeos. O número de repetições do di ou
trinucleotídeo e variável, mas geralmente são longos, produzindo primers de, no mínimo, 14
nucleotídeios. O primer microssatélite pode ser não ancorado (GUPTA et al., 1994) ou
ancorado com um ou dois nucleotídeos, tanto na extremidade 5’ quanto na extremidade 3’ do
oligonucleotídeo (WOLFE, 2005). A ancora garante que o primer se anele somente na
extremidade do microsatélite ou permite que somente um subconjunto do microssatélite sirva
como molde para a amplificação (REDDY et al., 2002).
Uma vantagem desse tipo de marcador é que as amplificações não requerem
informação da sequência do genoma e conduz a altos padrões polimórficos. Cada banda
detectada corresponde a uma sequência de DNA delimitada por dois microssatélites invertidos
e as bandas visíveis são definidas como marcadores dominantes e determinada para locos
genéticos para dois alelos: 1 indica presença e 0 indica ausência (REDDY et al., 2002;
WOLFE, 2005). Em geral para a amplificação dos marcadores ISSR são necessários 10 ng de
molde de DNA por reação de amplificação eos produtos amplificados são geralmente 2002000 pb de comprimento (REDDY et al., 2002). Estima-se que o método apresenta 92 a 95%
de repetibilidade, possivelmente devido ao uso de primers longos quando comparados com
primers de outros tipos de marcadores (BORNET & BRANCHARD, 2001; REDDY et
al.,2002).
O grau de polimorfismo detectado por está técnica depende da natureza do primer
( não ancorado, ancorado 3’ e ancorado 5’), das sequências de repetições (motif), do método
de detecção dos fragmentos e da natureza do primer. Em geral primers com repetições (AG),
(GA) (CT) (TC) (AC) (CA), primers ancorados e detecção e detecção dosa fragmentos
amplificados por gel de poliacrilamida detectam alto polimorfismo quando comparados com
outras condições de análises.
2.10 Utilização da região 16S rDNA na caracterização dos isolados
A maioria das novas tecnologias que estão sendo utilizadas no estudo da ecologia
microbiana é baseada na filogenia molecular do RNA ribossomal (rRNA), particularmente o
rRNA da menor subunidade (SSU ou 16S), uma aproximação para estudar a evolução
microbiana e especificamente resolver seus problemas (RAPPÉ & GIOVANONNI, 2003).
24
O operon do DNA ribossomal, em bactérias, compreende três genes conservados
funcionalmente e evolutivamente, sendo o gene da subunidade menor 16S (rRNA), seguido
por um espaço, o gene da subunidade maior, 23S (rRNA), com um segundo espaço. Estes
espaços entre os genes são as regiões espaçadoras (ITS – Espaço Transcrito Intergênico), nas
quais, também podem estar presentes os genes tRNA (SHMIDT, 1994).
A utilização do gene 16S rRNA revolucionou o campo da ecologia microbiana,
pois com seu uso, foi possível investigar e determinar posições filogenéticas de comunidades
bacterianas de meio ambiente (LUDWIG et al., 1997; KUSKE et al., 1997; HENTSCHEL et
al., 2002).
Um grande número de metodologias moleculares, a partir da década de 80, foi
sendo desenvolvido para analisar a diversidade microbiana (AMANN et al., 1995), e através
dos genes 16S rRNA, 23S rRNA, 5S rRNA e Espaço Transcrito Interno (ITS), tornou-se
possível investigar e determinar posições filogenéticas de comunidades bacterianas
(LUDWIG et al., 1997; RANJARD et al., 2001, PEREIRA et al., 2006, SILVEIRA et al.,
2006) e o entendimento, da ecologia microbiana em especial novas linhagens (HOLMES et
al., 2000).
A extração de DNA, procedimento este que envolve a quebra ou digestão de
paredes e membranas celulares possibilitando a liberação do conteúdo genético da célula, em
geral era demorado e necessitava de grandes quantidades de amostras (VALADARESINGLIS & MELO, 1998).
obteve eficiência na extração dos fragmentos de DNA de diversos organismos, reduzindo o
tempo de extração em 5 vezes em relação aos protocolos comumente praticados.
Através da amplificação da região 16S rRNA com oligonucleotídeos, proposto
por Kuske et al (1997), esses métodos permitiram uma análise molecular do genoma parcial
com alta resolução na classificação bacteriana, principalmente, na diferenciação em nível de
filos, gêneros e espécies, sendo estes, os marcadores mais comumente utilizados para analisar
as mudanças das comunidades microbianas no ambiente (KENT & TRIPLET, 2002).
Combinações de técnicas moleculares podem representar um passo fundamental
para uma correta descrição das análises das comunidades microbianas (AMANN &
LUDWIG, 2000). Estes estudos baseiam-se, principalmente, na comparação de regiões
conservadas dos genes 16S e 18S rRNA e hipervariáveis dos genes do espaço transcrito
intergênico(ITS).
25
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Coletar e avaliar a diversidade genotípica de pares simbióticos ocorrentes em 11
microregiões do semi-árido de Pernambuco.
3.2 Específico
Avaliar a diversidade genotípica de acessos de Macroptilium spp em Santa Cruz
(microregião de Araripina), Parnamirim (microregião de Salgueiro), Serra Talhada (Sertão do
Pajeú), Sertânia (Sertão do Moxotó), Petrolina (microregião de Petrolina), Floresta
(microregião de Itaparica), Tupanatinga (Vale do Ipanema), Jataúba (Vale do Ipojuca), Santa
Cruz do Capibaribe (Alto Capibaribe), Bom Jardim (Médio Capibaribe) e Caetés (microregião
de Garanhuns)
Avaliar a diversidade genotípica de isolados rizobianos que nodulem
Macroptilium spp obtidos nas mesmas áreas de coleta dos genótipos vegetais
3.3 Metas
Obter 100 acessos de Macroptilium spp, bem como avaliar a diversidade
genotípica dos mesmos;
Obter 300 isolados rizobianos utilizando Macroptilium atropurpureum como
planta isca;
Avaliar compatibilidade simbiótica destes isolados com os acessos vegetais;
Avaliar diversidade fenotípica e genotípica dos isolados que nodulem
efetivamente espécies nativas deste gênero;
26
4 METODOLOGIA
4.1 Coleta de germoplasma
Serão realizadas coletas de germoplasma em 11 municípios representativos da
caprino-ovinocultura no semi-árido de Pernambuco: Santa Cruz (microregião de Araripina),
Parnamirim (microregião de Salgueiro), Serra Talhada (Sertão do Pajeú), Sertânia (Sertão do
Moxotó), Petrolina (microregião de Petrolina), Floresta (microregião de Itaparica),
Tupanatinga (Vale do Ipanema), Jataúba (Vale do Ipojuca), Santa Cruz do Capibaribe (Alto
Capibaribe), Bom Jardim (Médio Capibaribe) e Caetés (microregião de Garanhuns) (Figura
1).
Figura 1 - Mapa de Pernambuco, com círculos amarelos representando os locais de coleta.
As coletas serão em áreas de ocorrência de gramíneas, prevendo futuros usos das
leguminosas coletadas em sistemas de produção a pasto, em áreas com aspecto de
superpastoreio. Também serão feitas coletas em áreas mais protegidas de pastejo, como áreas
adjacentes às rodovias. O site de coletas será identificado com coordenadas geográficas e
altitude local, com o auxílio de GPS. Além disso, em cada site serão coletadas amostras de
solo, da planta e de sementes (caso disponíveis), sendo devidamente etiquetados e numerados.
Plantas serão coletadas inteiras, com solo e colocadas em saco plástico com solo local para
27
transplantio para a Unidade Acadêmica de Serra Talhada da Universidade Federal rural de
Pernambuco - UFRPE, para formação de banco ativo de germoplasma (BAG). As amostras de
solo serão encaminhadas para o laboratório de microbiologia do Departamento de Agronomia
da UFRPE para cultura e isolamento de estirpes de bactérias nodulantes – rizóbios, presentes
na amostra. Além disso, parte da amostra de solo será encaminhada ao laboratório de
fertilidade de solo para análise de fertilidade (EMBRAPA, 1999).
Amostras de plantas do BAG serão coletadas com inflorescência para
identificação botânica no herbário da UFRPE e do Instituto Agronômico de Pernambuco IPA. As mesmas serão catalogadas nos herbários para futuras consultas para retorno aos
locais de coleta. O BAG também será utilizado como área de produção de sementes para
experimentação posterior, bem como para a preservação ex-situ das mesmas.
4.2 Avaliação da diversidade genotípica da leguminosa
Folhas jovens serão coletadas e terão o DNA extraído para estudos genéticos
utilizando marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat). As amplificações serão
realizadas utilizando vinte iniciadores de ISSR nas condições a seguir: desnaturação inicial a
94oC por 5 mim, seguida por 35 ciclos de 94oC por 45 s, 72oC por 1 mim e 50 s, seguida por
uma extensão de 72oC por 7 mim. Os amplicons serão analisados em gel de agarose 1,5% em
tampão TBE (90 mM Tris-base, 90 mM ácido bórico e 2 mM EDTA), corados com SYBR
Green e visualizados em transiluminador de ultravioleta. Os fragmentos amplificados serão
estimados por comparação com marcador de 100 pb DNA Ladder (SOUZA et al., 2008).
As sequências da região ITS do DNA ribossomal dos acessos de siratro serão
amplificadas com a utilização dos primers ITS1 e ITS4 (WHITE et al., 1990). As reações de
amplificação serão realizadas em volume final de 25µL, contendo: tampão 1X (50 mM KCl,
10 mM Tris HCl); 1,5 mM de MgCl2; 1 µM de cada primer; 0,2 mM de cada um dos dNTPs;
1,25 U de Taq DNA polimerase e 30-60 ng de DNA. A condição para a PCR constará de uma
desnaturação a 95oC por 2 mim, seguido por 35 ciclos de: 95oC por 1 mim, 55oC por 1 mim e
72oC por 1 mim e 30s, com extensão final a 72oC por 10 mim. As amplificações serão
analisadas seguindo a metodologia descrita por (RASBAND, 2008). Os amplicons serão
purificados e enviados para a Embrapa – CENARGEN, onde será realizado o
sequenciamento.
28
4.3 Isolamento, autenticação e caracterização dos isolados
Devido à falta inicial de sementes das espécies nativas, o siratro (M.
atropurpureum) será utilizado como planta-isca para o isolamento, por ser altamente
promíscua, do mesmo gênero e haver disponibilidade comercial das sementes. Plântulas de M.
atropurpureum serão pré-germinadas em vermiculita esterilizada por três a cinco dias e em
seguida transplantadas para vasos de Leonard de pequeno porte (baseados em garrafas tipo
“long-neck”), com areia na parte superior e solução nutritiva de Hoagland sem nitrogênio a
0,1 de concentração (HOAGLAND & ARNON, 1950) e inoculadas com cinco gramas de solo
das amostras obtidas inicialmente.
Aos 60 dias após inoculação as plantas serão colhidas e os nódulos serão limpos e
conservados em tubos com sílica-gel. Em no máximo três meses após a preservação dos
nódulos, será procedido o isolamento das estirpes presentes nos mesmos. O isolamento
seguirá o procedimento padrão. Os nódulos de cada tubo serão reidratados, e em seguida
imersos em álcool 95% para quebra da tensão capilar superficial, seguido por esterilização por
imersão em hipoclorito de sódio 5% por cinco minutos, e lavados em água destilada
esterilizada. O isolamento será conduzido em placas de Petri com meio 79, com azul de
bromotimol .(VINCENT, 1970).
A caracterização morfológica será baseada na velocidade de aparecimento de
colônias isoladas, forma, cor, brilho, superfície, borda e tamanho da colônia, produção e
consistência de muco, absorção de corantes e modificação do pH do meio de cultura
(HUNGRIA &ARAÚJO, 1994; SOMASEGARAN &HOBEN, 1994; MAÂTALLAH et al.,
2002; LIMA et al., 2005; ALBERTON et al., 2006; SEBBANE et al., 2006; UCHÔAS
&FARIA, 2006; SILVA et al., 2007).
Sementes coletadas no BAG de cada uma das espécies serão utilizadas para
formar uma amostra composta representativa da espécie. Sementes de cada uma das espécies
nativas e de siratro serão escarificadas, esterilizadas superficialmente e colocadas para
germinar sob condições assépticas. As plântulas serão posteriormente transferidas para tubo
de crescimento com solução de Hoagland sem N solidificada com ágar (SOMASEGARAN &
HOBEN, 1994) e inoculadas.
Cada estirpe será colocada para crescer em vaso de penicilina com meio YMA
líquido, a 200 rpm e temperatura ambiente até atingir população estimada em pelo menos 108
células bacterianas/ml, com um ml deste caldo sendo utilizado para a inoculação de cada
29
plântula. Após 45 dias da inoculação será realizada avaliação visual do sistema radicular,
aplicando as notas: 0 – não nodulou; 1 – poucos nódulos, aparentemente ineficientes; 2 –
muitos nódulos, aparentemente ineficientes e 3 – nodulação eficiente. A avaliação será em
triplicata.
A caracterização fenotípica e a avaliação de compatibilidade simbiótica serão
utilizadas conjuntamente para agrupamento dos isolados, através de UPGMA, com os
isolados identificados como diferentes entre si passando a ser considerados como estirpes, que
serão submetidas a fingerprinting genético utilizando o espaço intergênico (ITS), com os
primers fD1 e rD1 (SUZUKI, 2008). Os géis obtidos por este processo serão avaliados
utilizando a metodologia descrita por Rasband (2008).
Cada estirpe será então submetida ao sequenciamento completo do 16S, utilizando
PCR, conforme procedimento padronizado na literatura (TAURIAN et al., 2006). O PCR
consistirá de passo inicial de desnaturação a 95°C por 3 min, 30 ciclos (94 °C por 1 min, 54
°C por 45 s e 72°C por 2 minutos) PCR e alongamento final por 7 min a 72°C. Antes do envio
a empresa especializada em sequenciamento, será realizada eletroforese de gel agarose, para
certificar que a multiplicação ocorreu adequadamente. As sequências recebidas serão
alinhadas utilizando Mega4 (TAMURA et al., 2007), seguido por comparação com o
GenBank para identificação no nível de espécie, quando possível. Estirpes que não possam ser
identificadas positivamente ao nível de espécie serão utilizadas em outras pesquisas, com
grupos de trabalho mais especializados em taxonomia rizobiana.
30
5 CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
Atividades
previstas
Disciplinas
Amostragem
Diversidade
genética das
leguminosas
Isolamento,
caracterização
fenotípica e
autenticação das
bactérias
Diversidade
genética das
estirpes
Revisão de
literatura, escrita
da dissertação,
participação em
eventos, envio de
artigos
científicos
Apresentação e
correção final da
dissertação
2010
2011
2012
Ag. Set. Out. Nov. Dez. Jan. Fev. Mar. Abr. Maio Jun. Jul. Ag. Set. Out. Nov. Dez. Jan. Fev. Mar. Abr. Maio Jun. Jul.
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
31
6 ORÇAMENTO
Há financiamento disponível por outros projetos em execução.
32
7 APOIO FINANCEIRO E INSTITUCIONAL

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco - FACEPE

Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE

Universidade Federal Rural de Pernambuco/Unidade Acadêmica de Serra Talhada UFRPE/UAST

Instituto Agronômico de Pernambuco - IPA
33
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTON, O.; KASCHUK, G.; HUNGRIA, M. Sampling effects on the assessment of
genetic diversity of rhizobia associated with soybean and common bean. Soil Biology and
Biochemistry, v. 38, n. 6, p. 1298-1307, 2006.
ALVARENGA, R.C., COSTA, L.M., MAURO FILHO, W. e REGAZZI, A.J. 1995.
Características de alguns adubos verdes de interesse para a conservação e recuperação de
solos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 30: 175-185.
AMANN, R, & LUDWIG, W.. Ribossomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies
in microbial ecology. FEMS Microbiology Ecology, Rev. v. 24, 555-565,
2000.
AMANN, R.I.; LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K-H. Phylogenetic identification and in situ
detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiology Review,
Washington, v. 59, p 143-169, 1995.
ANDRADE, C.M.S., Garcia, R., Couto, L., Pereira, O.G. e Souza, A.L. 2003. Desempenho
de seis gramíneas solteiras ou consorciadas com o Stylosanhtes guianensis cv. Mineirão e
eucalipto em sistema silvipastoril. Revista Sociedade Brasileira de Zootecnia, 32: 18451850.
ANYANGO, B.; WILSON, K.J.; BEYNON, J.L.; GILLER, K.E. Diversity of rhizobia
nodulating Phaseolus vulgaris L. in two Keny an soils with contrasting pHs. Applied And
Environmental Microbiology, v.61, n.11, p.4016-4021, 1995.
ARRUDA, J.S.; et al. Nodulação e fixação de nitrogênio em soja tratada com sulfentrazone.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 36, n. 2, p. 325-330, fev. 2001.
BÉCQUER, C.J. Descripción y clasificación de rizobios: enfoque histórico, métodos y
tendencias. Revista Biologia, v.18, n.1, p.9-29, 2004.
BENIN, G.; CARVALHO, F.I.F. DE; ASSMANN, I.C.; CIGOLINI, J.; CRUZ, P.J.;
MARCHIORO, V.S.; LORENCETTI, C.; SILVA, J.A.G. Identificação da dissimilaridade
genética entre genótipos de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) do grupo preto. Revista
Brasileira de Agrociência, v.8, n.3, p.179-184, 2002.
BEHURA, S. Molecular Markers sistem in insects: current trends and future avenues.
Molecular Ecology, v.15, p. 3087 – 3113, 2006
34
BORNEMAN, J., SKROCH, P. W., O’SULLIVAN, K. M., PALUS, J. A.,
RUMJANEK, N. G., JANSEN, J. L., NIENHUIS, J. and TRIPLETT, E. W.. Molecular
microbial diversity of an agricultural soil in Wisconsin. Applied and Environmental
Microbiology, v. 62, p. 1935-1943, 1996.
BORNET, B.; BRANCHARD, M. Nonanchored Inter Simple Sequence Repeat (ISSR)
markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant Molecular Biology
Reporter, v.19, p. 209-215, 2001.
BURRIS, R.H. Advances in biological nitrogen fixation. Journal of Industrial of
Microbiology & Biotecnology, v. 22, p.381-393, 1999.
CÂMARA, G.M.S. Soja: tecnologia da produção II. Gil Miguel de Sousa Câmara
(editor).Piracicaba: G.M.S. Câmara, 2000. 450 p.
CHEN, W.M.; JAMES, E.K.; PRESCOTT, A.R.; KIERANS, M.; SPRENT, J.L. Nodulation
of Mimosa spp. by the β-proteobacterium Ralstonia taiwanensis. Molecular Plant-Microbe
Interactions, v.16, p.1051-1061, 2003.
CHEN, W.M.; LAEVENS, S.; LEE, T.M.; COENYE, T.; DE VOS, P.; MERGEAY, M.;
VANDAMME, P. Ralstonia taiwanensis sp. nov., isolated from root nodules of Mimosa
species and sputum of a cystic fibrosis patient. International Journal of Systematics and
Evolutionary Microbiology, v.51, p.1729-1735, 2001.
CHEN, W.M.; DE FARIA, S.M.; JAMES, E.K.B.; ELLIOTT, G.N.; SPRENT, J.L.;
VANDAMME, P. Burkholderia nodosa sp. nov., isolated from root nodules of the woody
Brazilian legumes Mimosa bimucronata and Mimosa scabrella. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology, v.57, p.1055-1059, 2007.
CRUZ, C.D.; REGAZZI, A.J.; CARNEIRO, P.C.S. Modelos biométricos aplicados ao
melhoramento genético. 3. ed. Viçosa: UFV, 2004. 480 p.
DAKORA, F. D. Defining new roles for plant and rhizobial molecules in sole and mixed plant
cultures involving symbiotic legumes. New Phytologist, v. 158, p. 39-49. 2003.
DIOUF, A.; LAJUDIE, P.; NEYRA, M.; KERSTERS, K.; GILLIS, M.;
MARTINEZROMERO, E.; GUEYE, M. Characterization of rhizobia that nodulate Phaseolus
vulgaris in West Africa (Senegal and Gambia). International Journal of Systematic and
Evoluationary Microbiology v. 50, p. 159-170. 2000.
35
DUBEUX, J.C.B., LIRA, M.A., SANTOS, M.V.F. e CUNHA, M.V. 2006 . Fluxo de
nutrientes em ecossistemas de pastagens: impactos no ambiente e na produtividade. Em:
Simpósio sobre manejo da pastagem Piracicaba, 2006, Piracicaba. Anais. FEALQ. Piracicaba.
p. 439-505.
EMBRAPA. Manual de análises químicas de solos. Brasília EMBRAPA, 1999.
EUZÉBY, J.P. List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature. Disponível em:
< http://www.bacterio.cict.fr/b/bradyrhizobium.html>. Acesso em: 05 out. 2010.
FAKRUDIN, B.; VIJAYKUMAR, K.B.K.; PATIL, B.V.; KURUVINASHETTI, M. S. DNA:
DNA-based marker systems and their utility in entomology. Entomologica Fennica, v. 17, p.
21-33, 2006.
FENG, L.; ROUGHLEY, R.J.; COPELAND, L. Morphological changes of Rhizobia in peat
cultures. American Society for Microbiology, v.68, n.3, p.1064-1070, 2002.
FERNANDES, M.F., BARRETO, A.C. e EMÍDIO FILHO, J. 1999. Fitomassa de adubos
verdes e controle de plantas daninhas em diferentes densidades populacionais de leguminosas.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, 34: 1593-1600.
FERREIRA, M.E., GRATTAPAGLIA, D.. Introdução ao uso de marcadores moleculares
em análise genética. 3. ed. , Brasília: EMBRAPA/CENARGEN, 1998 , 220p.
FREIRE, J.R.J. Fixação do nitrogênio pela simbiose rizóbio/leguminosas. In: CARDOSO,
E.J.B.N., TSAI, S.M., NEVES, M.C.P. Microbiologia do Solo. Campinas, Sociedade
Brasileira de Ciência do Solo. 1992. p.121-140.
FREITAS, A.D.S. DE; VIEIRA, C.L.; SANTOS, C.E. DE E.S.; STAMFORD, N.P.; LYRA,
M. DO C.C.P. DE. Caracterização de rizóbios isolados de Jacatupé cultivado em solo salino
do Estado de Pernambuco, Brasil. Bragantia, v.66, n.3, p.497-504, 2007.
GALINDO, I.I.G., AYARZA, M., ALVES, B.J.R., URQUIAGA, S., OLIVEIRA, O.C. e
BODDEY, R.M. 1999. Produção animal em pastagem consorciada de Stylosanthes guianensis
e Brachiaria ruziziensis na região dos cerrados. Em: Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de Zootecnia, 36,1999. Porto Alegre. Anais... SBZ. Porto Alegre.
GARCIA, J. J. O. Mutualismo y Patogénesis:Importancia de genes implicadosen
virulência para El establecimento de La simbiosis rhizobium-Leguminosa. Tesis
Doctoral. Universidad de Granada, 2008.
36
GUPTA, M.; CHYI, Y.S.; ROMERO-SEVERSON, J.; OWEN, J.L. Amplification of DNA
markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence
repeats. Theoritical and Applied Genetics, n. 89, p. 998-1006, 1994.
HENTSCHEL, U. et al. Molecular evidence for a uniform microbial community in sponges
from different oceans. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v.68, n.09,
p. 4431-4440, 2002.
HOFFMANN, L.V. & LUCENA, V.S. Para Entender Micorrizas Arbusculares. Campina
Grande: EMBRAPA ALGODÃO, 2006. 22 p. (EMBRAPA ALGODÃO. Documentos, 156).
HOAGLAND, D. R.; ARNON, D. I. The water-culture method for growing plants without
soil. Berkeley: California Agricultural Experiment Station, 1950.
HOLMES, B., VANDAMME, P., MAHENTHIRALINGAM, E,. Identification and
population structure of Burkholderia stabilis sp nov (formerly Burkholderia cepacia
genomovar IV). Journal Clinical Microbiology. V. 38, p. 1042-1047, 2000.
HUNGRIA, M. Coleta de nódulos e isolamento de rizóbios. In: Hungria, M.; Araujo, R.S.
(Org.). Manual de métodos empregados em estudos de microbiologia agrícola. Brasília,
DF: EMBRAPA-SPI, 1994, p.45-61.
HUNGRIA, M.; ANDRADE, D.S.; CHUEIRE, L.M.O.; PROBANZA, A.;
GUTTIERREZMAÑERO, F.J.; MEGÍAS, M. Isolation and characterization of new efficient
and competitive bean (Phaseolus vulgaris L.) rhizobia from Brazil. Soil Biology
Biochemistry, v. 32, p.1515-1528, 2000.
HUNGRIA. M. & ARAÚJO, R.S. Manual de Métodos Empregados em Estudos de
Microbiologia Agrícola. Brasília: EMBRAPA, 1994. 542 p.
HUNGRIA, M. & VARGAS, M.A.T. Environmental factors affecting N2 fixation in grain
legumes in the tropics, with an emphasis on Brazil. Field Crops Research, v.65, p.151-164,
2000.
JAMES, E.K. Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis. Field Crops
Research, v. 65, p. 197-209, 2000.
KENT, A. D.; TRIPLETT, E. W. Microbial communities and their interactions in soil and
rhizosphere ecosystems. Annual Review Microbiology, Palo Alto, v.56, p. 211-36,
2002.
37
KING, C.A.; PURCELL. Inhibition of N2 fixation in soybean is associated with elevated
ureides and amino acids. Plant Physiology, v.137, p.1389-1396, 2005.
KUSKE, C.R.; BARNS, S.M.; BUSCH, J.D. Diverse uncultivated bacterial groups from
soils of the arid southwestern United States that are present in many geographic regions.
Applied and Environmental Microbiology, v.63,p.3614–3621, 1997.
KUZMA, M.M. et al. The Site of Oxygen Limitation in Soybean Nodules. Plant Physiology,
February 1999, v.119, p.399– 407.
LAJUDIE, P. DE; LAURENT-FULELE, E.; WILLEMS, A.; TORCK, U.; COOPMAN, R.;
COLLINS, M.D.; KERSTERS, K.; DREYFUS, B.; GILLIS, M. Allorhizobium undicola gen.
nov., sp. nov., nitrogen-fixing bacteria that efficiently nodulate Neptunia natans in Senegal.
International Journal of Systematic Bacteriology, v.48, n.1, p.1277-1290, 1998.
LIMA, A. S. T. Maximização da Fixação Biológica do N2 pela Interação BPCPs x
Rizóbios x FMA no Caupi. 2009. 45 p. Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo) –
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 2009.
LIMA, A. S.; PEREIRA, J. P. A. R.; MOREIRA, F. M.S. Diversidade fenotípica e eficiência
simbiótica de espirtes de Bradyrhizobium spp. De solo da Amazônia. Pesq. Agropec. Bras,
v. 40, n. 11, p. 1095-1104, 2005.
LIRA, M.A., SANTOS, M.V.F., DUBEUX, J.C.B. e MELLO, A.C.L. 2006. Sistemas de
produção de forragem: alternativas para sustentabilidade da pecuária. Em: Reunião anual da
sociedade brasileira de zootecnia. João Pessoa, 43, 2006. João Pessoa. Anais... SBZ. João
Pessoa.
LUDWIG, W. BAUER, M., HELD, I., KIRCHHOF, G., SCHULZE, R., HUBER, I.;
SPRING, S., HARTMANN, A., SCHLEIFER, K. H. Detection and in situ identification of
representatives of a widely distributed new bacterial phylum. FEMS Microbiology,
v.153, p. 181-190, 1997.
MARIN, V.A.; BALDANI, V.L.D.; TEIXEIRA, K.R. DOS S., BALDANI, J.I. Fixação
biológica de nitrogênio: bactérias fixadoras de nitrogênio de importância para a
agricultura tropical. Disponível em:
<http://www.cnpab.embrapa.br/publicacoes/download/doc091.pdf>. Acesso em 28. set.
2010
MARTHA, G.B., VILELA, L., BARIONI, L.G., SOUSA, D.M.G. e BARCELLOs, A.O.
2004. Manejo da adubação nitrogenada em pastagens. Em: Pedreira, C.G.S.; Moura, J.C.;
38
Faria, V.P. (Org.). Fertilidade do solo para pastagens produtivas. FEALQ. Piracicaba. p.
155-215.
MAÂTALLAH, J.; BERRAHO, E. B.; MUÑOZ, S.; SANJUAN, J.; LLUCH, C. Phenotypic
and molecular characterization of chickpea rhizobia isolated from different areas of Morocco.
Journal of Applied Microbiology, v. 93, n. 4, p. 531-540, 2002.
McCULLY, M. E. Roots in soil: unearthing the complexities of roots and their rhizospheres.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v. 50, p. 695-718, 1999.
McIVOR, J.G.; JONES, R.M.; TAYLOR, J.A. Tropical pasture establishment. 4. Population
dynamics of sown species in developing pastures. Trop.Grassl..Brisbane, v.27, n.4, p. 302313, 1993.
MELLONI, R.; MOREIRA, F.M. DE S.; NÓBREGA, R.S.A.; SIQUEIRA, J.O. DE.
Eficiência e diversidade fenotípica de bactériasdiazotróficas que nodulam caupi [Vigna
unguiculata(L.) Walp] e feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) em solos de mineração de bauxita
em reabilitação. Revista Brasileira de Ciência do Solo, v.30, n.2, p.235-246, 2006.
MESCHEDE, D.K.; et al. Rendimento, teor de proteínas nas sementes e características
agronômicas de plantas de soja em resposta a adubação foliar e ao tratamento de sementes
com molibdênio e cobalto. Acta Scientiarum Agronomy, v.26, n.2, p.139- 145, 2004.
MOREIRA, F. M. S. & SIQUEIRA, J. O. Microbiologia e Bioquímica do solo. 2. Ed.
Lavras: editora UFLA, 2006.
MOTASSO, L.; MOTASSO, F.L.; DIAS, B.G.; VARGAS M.A.T.; HUNGRIA, H. Selection
of bean (Phaseolus vulgaris L.) rhizobial strains for the Brazilian Cerrados. Field Crops
Research, v.73, n.2-3, p.121-123, 2002.
MOULIN, L., CHEN, W-M., BÉNA, G., DREYFUS, B., BOIVIN-MASSSON, C. Rhizobia:
the family is expanding. in: Nitrogen Fixation: Global Perspectives. T. Finan, M. O’Brian,
D. Layzell, K. Vessey, and W. Newton, eds. CAB International, p. 61-65, 2002.
MYLONA, P. et al. Symbiotic Nitrogen Fixation. The Plant Cell, v.7, p.869-885, July 1995.
NEVES, M.C.P.; RUMJANEK, N.G. Diversity and adaptability of soybean and cowpea
rhizobia in tropical soils. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 29, p. 889-895, 1997.
39
NEVES, M.C.P.; RUMJANEK, N.G. Ecologia do rizóbio nos solos tropicais. Seropédica:
(EMBRAPA-CNPAB. Documentos, Rio de Janeiro); EMBRAPA-CNPAB, 1996, 27p.
ORMENÕ-ORRILLO, E.; VINUESA, P; ZÚÑIGA-DAVILA, D.; MARTINEZ-ROMERO,
E. Molecular diversity of native Bradyrhizobia isolated from (Phaseolus lunatus L.) in Peru.
Systematic and Applied Microbiology, v.29, n.1, p.253-262, 2006.
PACIULLO, D.S.C., GOMIDE, J.A., QUEIROZ, D.S. e SILVA, E.A.M. 2001. Composição
química e digestibilidade in vitro de lâminas foliares e colmos de gramíneas forrageiras, em
função do nível de inserção no perfilho, da idade e da estação de crescimento. Revista
Sociedade Brasileira de Zootecnia., 30: 964-974.
PEREIRA, R. M.; SILVEIRA, E. L. ; VAl MORAES, S. P. ; PEDRINHO, E. A. N.;
SCAQUITTO, D. C. ; WICKERT, E. ; ALVES, L. M. C. ; LEMOS, E. G. M . Molecular
Characterization of Bacterial Populations of Different Soils. Brazilian Journal of
Microbiology, v. 37, p. 439-447, 2006.
RAPPÉ, M. S.& GIOVANNONI, S. J. The Uncultured Microbial Majority. Annual
Reviews Microbiology. v. 57, 369-394, 2003.
RAMÍREZ BAHEMA, M. H. Estudio de La biodiversidad de La poblaciones de
Rhizobium que establecen simbiosis com trébol em Espanã. Universidad de Salamanca.
Tesis Doctoral, 2006.
RANJARD, L., POLY, F., LATA, J. C., MOUGEL, C., THIOULOUSE, J., and NAZARET,
S,. Characterization of Bacterial and Fungal Soil Communities by Automated Ribosomal
Intergenic Spacer Analysis Fingerprints: Biological and Methodological Variability. Applied
and Environmental Microbiology, Vol. 67, no. 10, p. 4479-4487, October 2001.
RASBAND, W. ImageJ. Washington: NIH, 2008.
REDDY, M.P; SARLA, N.; REDDY, E.A. Inter Simple Sequence Repeat (ISSR)
polymorphism and its application plant breeding. Euphytica, v 128, p. 9-17, 2002.
RIBEIRO, N.D.; LONDERO, P.M.G.; HOFFMANN JUNIOR, L.; POERSCH, N.L.;
CARGNELUTTI FILHO, A. Dissimilaridade genética para teor de proteína e fibra em grãos
de feijão dos grupos preto e de cor. Revista Brasileira de Agrociência, v.11, n.2, p.167-173,
2005.
40
RUMJANEK, N.G. & XAVIER, G.R. Inoculação do feijão-caupi: uma tecnologia que
garante aumento real na produtividade. Disponível em:
http://www.portaldoagronegocio.com.br/index.php?p=texto&idT=883. Acesso em: 01 out.
2010.
SA, T.M., & ISRAEL, D.W. Energy status and functioning of phosphorus-deficient soybean
nodules. Plant Physiology, v.97, n.4, p.928-935, 1991.
SANTOS, C. E. R. S.; FREITAS, A. D. S.; VIEIRA, I. M. M. B.; COLAÇO, W. Fixação
simbiótica do N2 em leguminosas tropicais. In: FIGUEIREDO, M. V. B.; BURITY, H. A.;
STAMFORD, N. P.; SANTOS, C. E. R. S. Microrganismos e Agrobiodiversidade: o novo
desafio para a agricultura. Guaiba: Agrovilros, p. 568, 2008.
SANTOS, C.E. R. S.; STAMFORD, N.P.; NEVES, M.C.P.; RUNJANEK, N.G.; BORGES,
W.L.; BEZERRA, R.V.; FREITAS, A.D.S. Diversidade de rizóbios capazes de nodular
leguminosas tropicais. Revista Brasileira de Ciências Agrárias, v.2, n.4, 49 p.249-256,
2007.
SANTOS, M.G.; CARVALHO, C.E.M., KELECOM, A.; RIBEIROS, M.L.R. DA C.;
FREITAS, C.V.C.; COSTA, L.M. DA; FERNANDES, L.V. DE G. Cianogênese em
esporófitos de pteridófitas avaliada pelo teste do ácido pícrico. Acta Botânica Brasileira,
n.19, v.4, p.783-788, 2005.
SANTOS, P.L. Adubação nitrogenada e molíbdica na cultura da soja, em Viçosa e Coimbra,
Minas Gerais. Tese (Doutorado em Fitotecnia) UFV (Universidade Federal de Viçosa),
Minas Gerais, 1999, 108p.
SCHUNKE, R.M.. Alternativa de manejo de pastagem para melhor aproveitamento do
nitrogênio do solo. EMBRAPA/CNPGC. Campo Grande. Documentos, 111. 26 p 2001.
SEBBANE, N.; SAHNOUNE, M.; ZAKHIA, F.; WILLEMS, A.; BENALLAOUA, S.;
LAJUDIE, P. Phenotypical and genotypical characteristics of root-nodulating bacteria isolated
from annual Medicago spp. in Soummam Valley (Algeria). Letters in Applied
Microbiology, v. 42, n. 3, p. 235-241, 2006
SERRATO, R. V.; SASSAKI, G. L.; GORIN, P. A. J.; CRUZ, L. M.; PEDROSA, F. O.;
CHOUDHURY, B.; CARLSON, R. W.; IACOMINI M. Structural characterization of an
acidic exoheteropolysaccharide produced by the nitrogen-fixing bacterium Burkholderia
tropica. Carbohydrate Polymers, v. 73, p. 564–572, 2008.
41
SHMIDT, T. Firgerprintng bacterial genomes using ribossomal RNA genes and operons.
Methods in Molecular and Cellular Biology. New York, v.5, p. 3-12, 1994.
SILVA, A. F.; et al. Efeito da inoculação da soja (Cultivar Tropical) com rizóbios de
crescimento rápido e lento em solo ácido submetido à calagem. Acta Scientiarum, v. 24, n. 5,
p.1327-1333, 2002.
SILVA, M.D. Crescimento, fotossíntese e metabolismo do nitrogênio em plantas de soja
noduladas sob omissão e ressuprimento de fósforo. Tese (Doutorado em Fisiologia Vegetal),
Universidade Federal de Viçosa, p.117, 1998.
SILVA, V.N. DA; L.E. DE S.F. DA; FIGUEIREDO, M. DO V.B.; CARVALHO, F.G. DE;
SILVA, M.L. R.B. DA. Caracterização e seleção de populações nativas de rizóbios de solo da
região semi-árida de Pernambuco. Pesquisa Agropecuária Tropical, v.37, n.1, p.16-21,
2007.
SILVEIRA, J.A.G. DA; COSTA, R.C.L. DA; OLIVEIRA, J.T.A. Drought-induced effects
and recovery of nitrate assimilation and nodule activity in cowpea plants inoculated with
Bradyrhizobium spp. under moderate nitrate level. Brazilian Journal of Microbiology, v. 32,
p. 187-194, 2001.
SILVEIRA, E. L.; PEREIRA, R. M. ; SCAQUITTO, D. C. ; PEDRINHO, E. A. N.; VAL
MORAES, S. P. ; LEMOS, E. G. M.; ALVES, L. M. C. . Bacterial diversity of soil under
eucalyptus assessed by 16S rDNA sequencing analysis. Pesquisa Agropecuária Brasileira
(Online), v. 41, p. 1507-1516, 2006.
SOARES, A.L. L.; PEREIRA, J.P.A.R.; FERREIRA, P.A.A.; VALE, H.M.M. DO; LIMA,
A.S.; ANDRADE, M.J.B. DE; MOREIRA, F.M. DE S. Agronomic efficiency of selected
rhizobia strains and diversity of native nodulating populations in Perdões (MG - Brazil): I cowpea. Revista Brasileira de Ciência do Solo, v.30, n.5, p.795 802, 2006.
SOMASEGARAN, P.; HOBEN, H. J. Handbook for Rhizobia. Methods in LegumeRhizobium technology. New York: Springer Verlag, 1994.
SOUZA, G. A.; CARVALHO, M. R. O.; MARTINS, E. R.; GUEDES, R. N. C.; OLIVEIRA,
L. O. Diversidade genética estimada com marcadores ISSR em populações brasileiras de
Zabrotes subfasciatus. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 43, p. 843-849, 2008.
STROSCHEIN, M.R.D. Caracterização de bactéria fixadora de nitrogênio em Lupinus
albescens. 2007. 82f. Dissertação (Mestrado em Ciência do Solo) - UFSM, Santa Maria, PR.
42
SUZUKI, K.; OGURO, H.; YAMAKAWA, T.; YAMAMOTO, A.; AKAO, S.; SAEKI, Y.
Diversity and distribution of indigenous soybean-nodulating rhizobia in the Okinawa islands,
Japan. Soil Science And Plant Nutrition, v. 54, n. 2, p. 237-246, 2008.
TAMURA, K., DUDLEY, J., NEI, M., KUMAR, S. MEGA4: Molecular Evolutionary
Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, v. 24,
p. 1596-1599, 2007.
TAURIAN, T.; IBA¤EZ, F.; FABRA, A.; AGUILAR, O. M. Genetic diversity of rhizobia
nodulating Arachis hypogaea L. in central Argentinean soils. Plant and Soil, v. 282, n. 1-2,
p. 41-52, 2006.
TRAINER, M. A.; CHALES, T.C. The role of PHB metabolism in the symbiosis of rhizobia
with legumes. Appl. Microbiol. Biotechnol, n. 71, p. 377-386, 2006.
VALADARES-INGLIS, M.C.; MELO, I. S. Métodos de extração de DNA e sua aplicação em
estudos genéticos e ecológicos. In: MELO, I. S; AZEVEDO, J.L. Ecologia Microbiana.
Jaguariúna: Embrapa/CNPMA, p. 187-204, 1998.
UCHÔAS, E. S.; FARIA, S. M. Seleção de estirpes de rizóbio para sansão preto (Mimosa sp),
dormideira comprida (Mimosa quadrivalis) e dormideira gigante (Mimosa sp). leguminosas
florestais com potencial uso na recuperação de reas degradadas. n. Comunicado Técnico 89.
Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 2006. p. 6.
VALDEZ, D. et al. Manganese application alleviates the water deficit-induced declined of N2
fixation. Plant Cell and Enviroment, v.23, p.497-505, 2000.
VIEIRA, R.F.; TSAI, S.M.; TEIXEIRA, M.A. Nodulação e fixação simbiótica de nitrogênio
em feijoeiro com estirpes nativas de rizóbio, em solo tratado com lodo de esgoto. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, v.40, n.10, p.1047-1050, 2005.
VINCENT, J. M. A manual for the practical study of root-nodule bacteria. Oxford:
Blackwell, 1970.
WALSH, K.B. Physiology of the legume nodule and its response to stress. Soil Biologic
Biochemical, v.27, n.4/5, p.637- 655, 1995.
WANG, E.T.; MARTÍNEZ-ROMERO, J.; LÓPEZ, I. Rhizobium y su destacada simbiosis
con plantas. Microbios en linea. Disponível em:
<www.biblioweb.dgsca.unam.mx/libros/microbios/Cap8/>. Acesso em: 05 out. 2010.
43
WHITE, T. J.; BRUNS, T.; TAYLOR, J. Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: INNIS, M. A.; GELFAND, D. H.; SHINSKY, J.
J.; WHITE, T. J. (Ed.). PCR Protocols: A guide to methods and applications. New York:
Academic Press, 1990. p. 315-322.
WOLFE, A.D; ISSR techniques for evolutionary biology. Methods in Enzimology, v395, p.
134-144, 2005.
YOUNG, J.P.W.; HAUKKA, K. Diversity and phylogeny of rhizobia”. New Phytol. v.133,
n.1, p.87-94, 1996.
ZHANG, F. et al. Plant growth promoting rhizobacteria and soybean [Glycine max (L.) Merr.]
nodulation and nitrogen fixation at sub optimal root zone temperatures. Annals of Botany,
v.77, p.453 - 459, 1996.
ZIETKIEWICZ, E.; RAFALSKI, A.; LABUDA, D. Genome fingerprinting by simple
sequence repeat (SSR) – anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics, v. 20,
p. 176-183, 1994.
ZILLI, J.E; VALICHESKI, R.R.; RUMJANEK, N.G.; ARAÚJO, J.L.S.; FREIRE FILHO, F.
R.; NEVES, M.C.P. Eficiência simbiótica de estirpes de Bradyrhizobium isoladas do solo de
cerrado em caupi. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.41, n.5, p.811-818, 2006.
ZRIBI, K.; MHAMDI, R.; HUGUET, T; AOUANI, M.E. Diversity of Sinorhizobium Meliloti
and S. medicae nodulating Medicago Truncatula according to host and soil origins. World
Journal of Microbiology and Biotechnology, v.21, n.6-7, p.1009-1015, 2005.