Aula de Bioquímica II Ciclo do Ácido Cítrico

Aula de Bioquímica II
Tema:
Ciclo do Ácido Cítrico
Prof. Dr. Júlio César Borges
Depto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: [email protected]
Os destinos do Piruvato
Fermentação
Láctica
Alcoólica
Anaeróbico
Aeróbico
Respiração
Oxidação completa
da glicose
Maioria das células eucarióticas e
bactérias: Combustíveis orgânicos 
CO2 e H2O;
Glicólise é apenas a primeira etapa da
oxidação completa da glicose;
Ocorre em três estágios principais.
Respiração Celular
1º estágio: glicose,
aminoácidos
ácidos
graxos
e
alguns
Fragmentos de 2 C  grupo acetil da Acetil-CoA
2º estágio: oxidação dos grupos acetil
CÍTRICO

CICLO
DO
ÁCIDO
ENERGIA liberada é conservada nos
transportadores de elétrons reduzidos
NADH e FADH2
3º estágio: Oxidação das coenzimas reduzidas;
Transferência de e- para o O2  Cadeia
transportadora
de elétrons
Conservação de energia  fosforilação oxidativa
Ciclo do ácido Cítrico
Ciclo de Krebs
Ciclo do ácido Tricarboxílico
Recebeu o prêmio Nobel de Fisiologia/Medicina em 1953
pela descoberta do Ciclo do Ácido Cítrico
Hans Krebs: Aparato de Warburg utilizado
para medir o consumo de oxigênio no
metabolismo do tecido muscular.
1937  Ciclo do Ácido Cítrico
1945  Coenzima A
1951  Acetil CoA
Ciclo do ácido Cítrico
Ciclo de Krebs
Ciclo do ácido Tricarboxílico
 Tem papel central no metabolismo
 Destino do Piruvato, aminoácidos e ácidos
graxos no metabolismo aeróbico
- Oxidação de Combustíveis à CO2 e H20
- Ocorre na mitocôndria
- Necessita de O2 molecular para ocorrer
- Porta de entrada do Piruvato  Acetil-CoA
O Acetil-CoA
entrada da maioria dos combustíveis do ciclo
convertidos
Esqueletos de C dos açúcares e ácidos graxos
Forma um tioéster com o acetato
para formar a acetil-CoA
Ligação
amida
ao grupo acetil da acetil-CoA
CARREADOR DE ACILAS
Ligação
fosfoéster
Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
- Complexo multienzimático
 Piruvato desidrogenase (E1)
24 cópias
 Dihidrolipoil-desidrogenase (E3)
12-cópias
 Diidrolipoil-transacetilase (E2)
- aumenta a velocidade de reações
24-60 cópias
 evita a difusão do substrato
- minimiza reações secundárias
- permite controle coordenado
Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase bacteriana
 Núcleo da E2
- 24 cópias
Núcleo da
E2
- 60
cópias
 24 cópias de E2  24 cópias de E1
-Verde
-Trímeros nos
vértices do cubo
- Laranja
-Dímeros nas
arestas do cubo
 12 cópias de E3
- Vermelho
-Dímeros nas faces
do cubo
Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase bovina
- 60 cópias de E2
~ 50 nm de
diâmetro
> 5x ribossomo
Domínio lipoil de E2
60 moléculas de E2  trímeros
Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
 necessita de 5 coenzimas:
Pirofosfato de tiamina, CoA, Lipoamida, FAD, NAD+
Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
- Forma Acetil-CoA pela descarboxilação oxidativa do Piruvato  reação irreversível
- Braço da lipoamida canaliza a reação entre os sítios catalíticos do complexo catalítico
1º
REAÇÃO
 descarboxilação do Piruvato  dependente de TPP
2º REAÇÃO  grupo hidroxietil transferido do TPP para Lipoamida  Transacetilase
- envolve a oxidação da carboxila e redução da lipoamida S–S  H–S + S–Acetil
Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
3º REAÇÃO  transesterificação dependente de CoA
- liberação de Acetil-CoA
4º REAÇÃO  regeneração da Lipoamida oxidada  troca dissulfídica  duas Cys
- envolve FAD fortemente ligado a E3
5º REAÇÃO  oxidação do dissulfeto da E3
- envolve FADH como intermediário e NADH como aceptor final da reação
Síntese de Acetil-CoA
-Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
5º REAÇÃO  oxidação do dissulfeto da
E3
- envolve FADH como intermediário e
NADH como aceptor final da reação
-
Reação não usual devido ao potencial
Redox menor do NADH em relação ao
FADH2
-
- Potencial Redox do FADH2
do depende do ambiente e reação
Síntese de Acetil-CoA
Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
 A canalização do substrato pela E2
Síntese de Acetil-CoA
- Complexo enzimático da Piruvato Desidrogenase
- O longo braço da lipoamida permite o grupo “visitar” diferentes sítios ativos
Ciclo do ácido Cítrico
Ciclo de Krebs ou Ciclo do Ácido Tricarboxílico
 principal sítio de óxido-redução de moléculas
 sítio de oxidação final de carboidratos, aminoácidos e ácidos graxos
 Local: mitocôndria
- o equivalente a 1 grupo Acetil é completamente oxidado a 2 CO2
 entra Acetil CoA (e outros metabólitos) e sai 1 GTP e 8 e’ (3 NADH e 1 FADH2)
1º NADH  isocitrato desidrogenase  sítio de evolução de CO2
2º NADH  α-cetoglutarato desidrogenase  sítio de evolução de CO2
1º FADH2  succinato desidrogenase
3º NADH  Malato desidrogenase
 o oxaloacetato é regenerado no final do ciclo  sistema oxidante de grupos acetil
- 4 pares de elétrons são transportados pela cadeia de transporte de elétrons para a
oxidação de O2
Ciclo do ácido Cítrico
1)
É a fornalha de oxidação
celular
Grande extração de
energia a partir de
1 Acetil-CoA
 8 reações enzimáticas
1: Citrato Sintase
2: Aconitase
3: Isocitrato desidrogenase
4: α-cetoglutarato desidrogenase
5: Succinil-CoA Sintetase
6: Succinato desidrogenase
7: Fumarase
8: Malato desidrogenase
2)
8)
7)
2)
6)
5)
4)
3)
Ciclo do ácido Cítrico
1) CITRATO SINTASE
Alimenta a fornalha
Catalisa a condensação de oxaloacetato com Acetil-CoA
Citrato sintase  Homodímero
• 1 º substrato  Oxaloacetato
 induz mudanças conformacionais no domínio flexível
criando um sítio de ligação para o 2 º substrato  acetil-CoA
• Ocorre formação do intermediário: citroil-CoA  alteração
conformacional
•Leva a hidrólise do tioéster, liberando CoA
Ciclo do ácido Cítrico
1) CITRATO SINTASE
Alimenta a fornalha
Mecanismo de deslocamento sequencial ordenado
- Mecanismo ácido-base forma um intermediário enol
- Enol ataca por SN2 o oxaloacetato  forma o citroil-CoA
- Hidrólise libera a CoA mais Citrato  exergônica
Ciclo do ácido Cítrico
2) ACONITASE
-forma isocitrato via cis-aconitato
- envolve desidratação e hidratação facilitado por um complexo Fe-4S
Ciclo do ácido Cítrico
3) ISOCITRATO-DESIDROGENASE
- descarboxilação oxidativa  produz NADH e CO2
- necessita de Mn2+ ou Mg2+ como cofator
Reação em 3 etapas
1º  Redução de NAD+
2º  Descarboxilação  Intermediário enol
3o  Rearranjo em ceto-enol
Ciclo do ácido Cítrico
4) ALFA-CETOGLUTARATO-DESIDROGENASE
- Forma um complexo multi-enzimático
- Descarboxilação oxidativa  produz NADH e CO2
- Acopla um CoA ao αcetoglutarato
NAD+ é o aceptor de
elétrons
CoA é o transportador do
grupo succinil
- Funciona como a PDH sobre
o α-cetoglutarato
- Possui 3 enzimas similares a
E1, E2 e E3 (idêntica) e os
cofatores descritos para a PDH
- Evolução divergente
Ciclo do ácido Cítrico
5) SUCCINIL-COA-SINTETASE
- acopla a síntese de GTP (ou ATP) com a quebra da ligação de CoA do Succinil-CoA
- envolve a enzima fosforilada para o estado intermediário
1º: formação do Succinil-Pi
2º: enzima fosforilada e
liberação do Succinato
3º: Atividade quinase 
fosforilação ao nível do
substrato
Nucleosídeo-difosfato-quinase
GTP + ADP → GDP + ATP
Ciclo do ácido Cítrico
5) SUCCINIL-COA-SINTETASE
- acopla a síntese de GTP (ou ATP dependendo da isoenzima) com a quebra da ligação de
CoA do Succinil-CoA
 Envolve a enzima
fosforilada para o estado
intermediário
1º: formação do Succinil-Pi
2º: enzima fosforilada e
liberação do Succinato
3º: Atividade quinase 
fosforilação ao nível do
substrato
Nucleosídeo-difosfato-quinase
GTP + ADP → GDP + ATP
Ciclo do ácido Cítrico
6) SUCCINATO-DESIDROGENASE
- conta com um FAD covalentemente ligado à enzima
- faz parte do complexo II da cadeia transportadora de elétrons  sítio de oxidação do
próprio FADH2 formado
- forma fumarato  alcano a alceno
 Em eucariotos: ligada a MMI da mitocôndria
 Bactérias: ligada a membrana plasmática
 Contém grupos Fe-S e conta com um FAD
covalentemente ligado à enzima
Ciclo do ácido Cítrico
7) FUMARASE
- hidratação da ligação dupla do fumarato  forma malato
- envolve um íon OH- para atacar a ligação dupla do fumarato
Ciclo do ácido Cítrico
8) MALATO-DESIDROGENASE
- oxidação da OH do Malato  regenera oxaloacetato
- dependente de NAD+  similar à lactato desidrogenase
- reação endergônica  reação dirigida pela retirado do produto
- [oxaloacetato] é mínima  retirado pela citrato sintase e outros  ΔG < 0  exergônica
Ciclo do ácido Cítrico
Produção de energia do ciclo
1: Isocitrato desidrogenase
2: -cetoglutarato desidrogenase
3: Succinato desidrogenase
4: Malato desidrogenase
1
4
2
3
Ciclo do ácido Cítrico
Produção de energia do ciclo
Ciclo do ácido Cítrico
Produção de energia do ciclo
Controle do Ciclo do ácido Cítrico
A entrada é regulada:
 Piruvato desidrogenase
 Citrato sintase
O Ciclo de Krebs também é regulado:
Reação da isocitrato-desidrogenase
 Reação da α-cetoglutarato-desidrogenase
Pontos de controle
Relacionados aos principais metabólitos
 Acetil-CoA, oxaloacetato e NADH
3 fatores controlam a velocidade do ciclo:
 Disponibilidade de substrato
 Inibição pelos produtos acumulados
 Inibição alostérica por
retroalimentação das enzimas de catalisam as
etapas iniciais do ciclo
Controle do Ciclo do ácido Cítrico
Vários pontos de controle
- Acetil-CoA e oxaloacetato não saturam a Citrato
sintase
- Falta de NADH aumenta a formação de oxaloacetato
e Acetil-CoA
- NADH e FADH2 são oxidados somente se ADP é
simultaneamente fosforilado a ATP
ATP  inibe a Citrato sintase, isocitrato
desidrogenase e α-cetoglutarato desidrogenase
- Resulta em acumulo de Citrato
- Logo, a necessidade/disponibilidade de ATP
garantem o funcionamento do ciclo de Krebs
NADH  inibe a Piruvato-desidrogenase, citrato
sintase, isocitrato desidrogenase e αcetoglutarato desidrogenase
Succinil CoA  inibe a citrato sintase  ocupa
sítio da Acetil-CoA
- ADP e Ca2+ ativam a isocitrato desidrogenase
- Ca2+ ativa a fosfatase da Piruvato-desidrogenase
ativando-a
Ciclo do ácido Cítrico
O papel em outras vias
- é uma via anabólica ou anfibólica  oxaloacetato para a gliconeogênese e esqueletos de
carbono para aminoácidos
Ciclo do ácido Cítrico
O papel em outras vias 
Fornece blocos de construção para outras vias  bactérias anaeróbicas
Inversão do
sentido
oxidativo
(normal) da via
Não possuem a αcetoglutarato-desidrogenase 
não conseguem realizar a via
completa das reações do Ciclo
de Krebs
Reciclado a
NAD+ pela
redução do
oxaloacetato a
succinato
NADH produzido
pela oxidação do
isocitrato
Ciclo do ácido Cítrico
REAÇÕES ANAPLERÓTICAS
Produção de intermediários do ciclo de Krebs por outras vias com compostos comuns
 reações anapleróticas
 Contribuem para manter a concentração dos intermediários em níveis adequados
REAÇÃO ANAPLERÓTICAS MAIS IMPORTANTE
Fígado e rins de mamíferos: carboxilação reversível do piruvato pelo CO2 para a
formação de oxaloacetato
Piruvato-carboxilase
Acetil-CoA  modulador alostérico positivo
Ciclo do ácido Cítrico
Metabolons
Complexos proteicos de canalização de substratos em vias reacionais