BIOTECNOLOGIAS DA REPRODUÇÃO ANIMAL PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS Paulo Bayard D. GONÇALVES1, M.H. BARRETA, L.C. SIQUEIRA, A.Q. ANTONIAZZI INTRODUÇÃO A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotécnica de reprodução assistida e uma ferramenta para pesquisa de eventos relacionados à maturação e fecundação de oócitos, capacitação espermática e desenvolvimento embrionário na fase de pré-implantação. Além disso, a PIV é um instrumento de suporte para outras biotécnicas como clonagem, transgênese e transferência nuclear. Sua aplicação em escala comercial se tornou viável após o advento da aspiração folicular in vivo e pelo aprimoramento das condições de cultivo in vitro. Passam-se 25 anos após o nascimento do primeiro bezerro produzido in vitro e os índices de blastocistos obtidos ainda estão aquém do desejado, variando entre 20-50% (média de 35%). Além da baixa eficiência da técnica, os embriões que conseguem se desenvolver in vitro apresentam qualidade inferior àqueles produzidos in vivo. Diversos parâmetros são utilizados para avaliar a qualidade dos embriões PIV como morfologia, criotolerância, transcrição (mRNA), eclosão in vitro e prenhez após a transferência. Entretanto, nenhuma dessas técnicas permite uma seleção eficiente que assegure bons índices de prenhez. O aumento da eficiência da PIV está condicionado ao desenvolvimento de trabalhos que visem aperfeiçoar e simplificar as condições de cultivo durante as várias etapas do processo, principalmente no que se refere à maturação citoplasmática e molecular de oócitos obtida in vitro. Maturação nuclear, citoplasmática e molecular do oócito In vivo, a maturação nuclear do oócito inicia após o pico pré-ovulatório de LH durante o estro e in vitro, a retirada do oócito do ambiente folicular reinicia a meiose. Em bovinos, a maturação nuclear do oócito requer de 18-24h e compreende a progressão do estádio diplóteno da primeira prófase meiótica até metáfase II. A capacitação do oócito, avaliada pelo desenvolvimento embrionário, tem sido positivamente associada com o tamanho do folículo antral do qual foi recuperado (LONERGAN et al., 1994), com o estádio de desenvolvimento folicular (MACHATKOVA et al., 2004) e com o local de maturação (in vivo vs. in vitro; RIZOS et al., 2002). O TCM199 é o meio mais difundido entre os laboratórios de PIV. Seus principais suplementos são o soro fetal bovino, FSH, LH, piruvato, penicilina e estreptomicina. A maturação in vitro varia de 18-24h em 5% de CO2 em ar e umidade saturada. 1 Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil. e-mail: [email protected] Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 11, suplemento 1, p.135-138, abril, 2008 P. B. D. GONÇALVES et al. In vivo, os folículos préovulatórios atingem um diâmetro de 12-20mm, e ovulam um oócito com núcleo e citoplasma maturados adequadamente. Entretanto, os oócitos coletados para PIV são em sua maioria oriundos de pequenos folículos antrais e apesar de competentes para o reinício da meiose, apresentam baixa capacitação para o desenvolvimento embrionário, por apresentarem uma maturação citoplasmática e molecular insuficiente. As condições de cultivo in vitro têm sido constantemente manipuladas para melhorar a capacitação do oócito após sua retirada do ambiente folicular. Fatores de crescimento, gonadotrofinas e esteróides têm sido adicionados aos mais diversos meios de maturação. Porém, apenas modestos incrementos na capacidade de desenvolvimento embrionário puderam ser observados e a produção de blastocistos raramente atingiu 50% (THOMPSON, 2000). Métodos celulares e bioquímicos têm sido usados para inibir o reinício da meiose dos oócitos após sua retirada do ambiente folicular, visando melhorar o desenvolvimento citoplasmático e molecular na ausência de maturação nuclear (SIRARD, 2001). Esses estudos demonstram que é possível manter o reinício da meiose bloqueado por 24-48h sem afetar drasticamente o desenvolvimento embrionário ou fetal. Porém, nenhuma dessas metodologias tem melhorado a capacidade de desenvolvimento embrionário. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a angiotensina II é capaz de reverter o efeito inibitório das células da teca sobre a maturação nuclear de oócitos bovinos (GIOMETTI et al., 2005). Além disso, o cultivo de 136 CCOs em um sistema de maturação com células foliculares, angiotensina II e IGF-I aumentou as taxas de clivagem, blastocisto e eclosão in vitro (STEFANELLO et al., 2006). Fecundação in vitro In vivo, o espermatozóide percorre um longo trajeto para chegar ao infundíbulo e fecundar o oócito. Durante esse percurso, glicosaminoglicanas presentes no trato genital feminino induzem sua capacitação. Para fertilização in vitro, a capacitação espermática é, geralmente, promovida pela heparina. Antes do processo de capacitação, os espermatozóides viáveis contidos em uma palheta de sêmen precisam ser separados do plasma seminal, crioprotetores, extensores e células mortas. Para bovinos, os métodos de separação espermática mais utilizados são o gradiente de percoll e o swim-up. O co-cultivo de espermatozóides e oócitos é realizado por um período de 18-22h, a 39˚C e 5% de CO2 em ar e umidade saturada. O sistema de fertilização in vitro tenta mimetizar as condições in vivo. Porém, resultados variados são obtidos com espermatozóides oriundos de touros ou partidas diferentes. Desenvolvimento embrionário in vitro O momento crítico para o desenvolvimento embrionário começa após a fecundação, quando a segunda meiose é reiniciada para formar o pró-núcleo feminino, e termina com a ativação do genoma embrionário 8-16 células (BREVINI GANDOLFI & GANDOLFI, 2001). O desenvolvimento nesse período é dependente de mRNA e proteínas acumuladas durante a maturação citoplasmática (BLONDIN & Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 11, suplemento 1, p.135-138, abril, 2008 P. B. D. GONÇALVES et al. SIRARD, 1995). A transcrição deficiente antes da ativação do genoma embrionário não permite o desenvolvimento em várias espécies. Isso foi um dos obstáculos da PIV nas décadas de 60 e 70, fato que contribuiu para melhoria dos sistemas de cultivo. Diversos fatores de crescimento têm sido adicionados aos meios de cultivo in vitro para melhorar os índices de desenvolvimento embrionário (LONERGAN et al., 1996; MATSUI et al., 1997). Porém, apenas em meios definidos esses fatores incrementam as taxas de blastocisto. O cultivo in vivo no oviduto de ovelhas (LONERGAN et al., 2003) e vacas, de embriões bovinos fertilizados in vitro, parece fornecer um ambiente adequado para o desenvolvimento embrionário. A produção de blastocistos em sistemas de cultivo in vivo não é superior a observada in vitro, mas a qualidade dos blastocistos cultivados in vivo é superior (RIZOS et al., 2002). O cultivo embrionário in vitro varia de 7-9 dias a 39ºC, atmosfera controlada (5% de O2, 5% de CO2 e 90% de N2) e umidade saturada. A taxa de blastocisto geralmente é avaliada no 7º dia após a fecundação sendo que, os blastocistos podem permanecer na estufa até o 9º dia para avaliar a taxa de eclosão in vitro. CONSIDERAÇÕES FINAIS A otimização da técnica de PIV visando à produção de embriões de boa qualidade e em número cada vez mais expressivo resultará na diminuição do custo por embrião produzido e possibilitará uma maior difusão da técnica entre os produtores. Ainda, tais melhorias seriam de grande valia para o aprimoramento de outras biotéc- 137 nicas que dependam da PIV. Para isso se faz necessário o desenvolvimento de um sistema de maturação in vitro adequado que permita uma maior capacitação dos oócitos e conseqüentemente uma maior taxa de desenvolvimento embrionário. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BLONDIN, P.; SIRARD,M.A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development, v.41, n.1, p.54-62, 1995. BREVINI GANDOLFI, T.A.L.; GANDOLFI, F. The maternal legacy to the embryo: cytoplasmic components and their effects on early development. Theriogenology, v.55, n.6, p.12551276, 2001. GIOMETTI, I.C. et al. Angiotensin II reverses the inhibitory action produced by theca cells on bovine oocyte nuclear maturation. Theriogenology, v.63, n.4, p.10141025, 2005. LONERGAN, P. et al. Role of epidermal growth factor in bovine oocyte maturation and preimplantation embryo development in vitro. Biology of Reproduction, v.54, n.6, p.14201429, 1996. LONERGAN, P. et al. Effect of follicle size on bovine oocyte quality and developmental competence following maturation, fertilization, and culture in vitro. Molecular Reproduction and Development, v.37, n.1, p.48-53, 1994. LONERGAN, P. et al. Temporal Divergence in the Pattern of Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 11, suplemento 1, p.135-138, abril, 2008 P. B. D. GONÇALVES et al. Messenger RNA Expression in Bovine Embryos Cultured from the Zygote to Blastocyst Stage In Vitro or In Vivo. Biology of Reproduction, v.69, n.4, p.14241431, 2003. MACHATKOVA, M. et al. Developmental competence of bovine oocytes: effects of follicle size and the phase of follicular wave on in vitro embryo production. Theriogenology, v.61, n.2-3, p.329335, 2004. MATSUI, M. et al. Stimulation of the development of bovine embryos by insulin and insulin-like growth factorI (IGF-I) is mediated through the IGF-I receptor. Theriogenology, v.48, n.4, p.605-616, 1997. RIZOS, D. et al. Consequences of bovine oocyte maturation, fertilization or early embryo development in vitro versus in vivo: implications for blastocyst yield and blastocyst quality. Mol.Reprod.Dev., v.61, n.2, p.234248, 2002. SIRARD, M.A. Resumption of meiosis: mechanism involved in meiotic progression and its relation with developmental competence. Theriogenology, v.55, n.6, p.12411254, 2001. STEFANELLO, J.R. et al. Effect of angiotensin II with follicle cells and insulin-like growth factor-I or insulin on bovine oocyte maturation and embryo development. Theriogenology, v.66, n.9, p.20682076, 2006. 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