Comparação dos níveis circulantes de marcadores de estresse
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Instituto de Ensino e Pesquisa do Hospital Santa Casa de Belo Horizonte Comparação dos níveis circulantes de marcadores de estresse oxidativo e óxido nítrico entre gestantes sadias e com doenças hipertensivas da gravidez HÉLVIO FAGUNDES GOMES Belo Horizonte 2011 1 Hélvio Fagundes Gomes Comparação dos níveis circulantes de marcadores de estresse oxidativo e óxido nítrico entre gestantes sadias e com doenças hipertensivas da gravidez Dissertação apresentada ao Núcleo de Pesquisa e PósGraduação do Hospital Santa Casa de Belo Horizonte, como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Ciências da Saúde. Orientadora: Profª Drª Valéria Cristina Sandrim 2 Belo Horizonte Hospital Santa Casa de Misericórdia 2011 FOLHA DE APROVAÇÃO 3 AGRADECIMENTOS “VINCIT QUI SE VINCIT” Agradeço, primeiramente a Deus, presença em cada momento; provedor de grande força para vencer este desafio. À minha querida orientadora, Dra Valeria Cristina Sandrim, pela força, confiança, pelas palavras de sabedoria e estímulo nos momentos difíceis. Dedico a você este trabalho, Obrigado! À minha família querida: meus pais, Edilson e Rosinha e irmãos, Lívia e Cássio, exemplos de vida que me ajudam a manter meus pés no chão e me estimulam a melhorar a cada dia. À Juliana Hollerbach, minha namorada e companheira, exemplo de otimismo e amor, TE AMO! À minha querida primeira orientadora, Dra Cristiane Fernanda Fuzer Grael, quem me fez despertar para a vida acadêmica e busca do conhecimento. Aos meus amigos, primos e “primanos”, pelo apoio nos momentos alegres e difíceis. Ao núcleo de pós-graduação e pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte, pela competência e responsabilidade. Aos professores e colegas por compartilharem conhecimento tão precioso e às secretárias, Shirley e Zélia, pelos serviços prestados. Ao Laboratório multiusuário da Faculdade de Medicina da USP-Ribeirão Preto, Lílian e Ana Carol por me receberem com atenção e prestatividade. À Farmácia, curso que escolhi e que me permite dar minha parcela de colaboração à sociedade. 4 Compartilho com todos vocês esta conquista! SUMÁRIO Introdução Alterações fisiológicas da gestação saudável Revelvância das doenças hipertensivas gestacionais Fisiopatologia da Pré-eclâmpsia Estresse oxidativo e pré-eclâmpsia Avaliando o grau de estresse oxidativo Óxido nítrico e pré-eclâmpsia Avaliando a biodisponibilidade sistêmica de NO Objetivos Objetivos específicos Pacientes, Materiais e Métodos Critérios de diagnóstico Coleta e processamento das amostras Soluções e Reagentes Equipamentos e Softoware utilizados nos protocolos experimentais Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (teste MDATBARS) Determinação da atividade antioxidante total do plasma (teste FRAP) Determinação do potencial anti-oxidante do plasma, método MTT Determinação dos níveis de nitrito plasmático Análise dos resultados ResultadosDiscussão 5 Características clínicas Marcadores de estresse oxidativo e de óxido nítrico Conclusões Referências LISTA DE ABREVIATURAS ADMA-----------------------------------------------------------------------------------------------------dimetilarginina assimétrica ANOVA----------------------------------------------------------------------------------------------------------análise de variância AOPP-----------------------------------------------------------------------------------------Produtos avançados de oxidação protéica BH4---------------------------------------------------------------------------------------------------------------tetrahidrobiopterina CAT-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------catalase DC ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------débito cardíaco eNOS------------------------------------------------------------------------------------------------------sintase endotelial do óxido nítrico FRAP-----------------------------------------------------------------------------------sigla em inglês para habilidade redutora do ferro GS--------------------------------------------------------------------------------------------------------------Gestantes Saudávéis GSH--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Glutationa GSHPx--------------------------------------------------------------------------------------------------------glutationa peroxidase HAG-------------------------------------------------------------------------------------------------------Hipertensão Arterial Gestacional HAS--------------------------------------------------------------------------------------------------------Hipertensão Arterial Sistêmica hCG--------------------------------------------------------------------------------------------------------gonadotrofina coriônica HCMFRP-USP--------------------------------Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP campus Ribeirão Preto HELLP----------------------------------- sigla em inglês para associação entre Hemólise, Plaquetopenia e Disfunção Hepática HPLC------------------------------------------------------------------------------------------------cromatografia líquida de alta performance IMC---------------------------------------------------------------------------------------------------------índice de massa corpórea LDL---------------------------------------------------------------------------------------------------------lipídeos de baixa densidade MDA-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------malondialdeído MTT--------------------------------------------------------------------------- (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) NO-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------óxido nítrico PAD---------------------------------------------------------------------------------------------------------Pressão Arterial Diastólica PA----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Pressão Arterial PAS---------------------------------------------------------------------------------------------------------Pressão Arterial Sistólica PBS-------------------------------------------------------------------------------------Phosphate Buffered Saline (Tampão fosfato salino) PE------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Pré-eclâmpsia ROS---------------------------------------------------------------------------------------------------------espécies reativas de oxigênio 6 RVP--------------------------------------------------------------------------------------------------------- resistência vascular periférica SOD-----------------------------------------------------------------------------------------------------------superóxido dismutase TBA----------------------------------------------------------------------------------------------------------------ácido tiobarbitúrico TBARS--------------------------------------------------sigla em inglês para Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Representação esquemática da fisiopatologia da pré-eclâmpsia......6 Figura 2 - Concentração plasmática de MDA/TBARS para os grupos GS (grávida sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia)..............31 Figura 3 - Potencial antioxidante total do plasma (FRAP) para os grupos GS (grávida sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia)...............32 Figura 4: Valores de MTT para os grupos GS (grávida sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia)...................................................................33 Figura 5: Valores obtidos de Nitrito plasmático em nM para os grupos GS, HAG e PE................................................................................................................34 7 LISTA DE TABELAS e ESQUEMAS Tabela 1 - Estudos envolvendo análises de marcadores de estresse oxidativo em préeclâmpsia..............................................................................................10 Esquema 1- Produtos e vias relacionados à peroxidação lipídica....................15 Tabela 2- Concentrações usadas para a curva de calibração, teste MDA.....23 Tabela 3- Escala de diluições usadas para definir a curva padrão do FRAP................................................................................................................24 Tabela 4- Características clínicas e laboratoriais das participantes..................30 8 teste RESUMO As doenças hipertensivas gestacionais afetam entre 12-22% das gestações em todo o mundo e são responsáveis por 17,6% das mortes maternas. Dentre elas destaca-se a pré-eclampsia, caracterizada por hipertensão associada à proteinúria que inclui em seu processo fisiopatológico estresse oxidativo e disfunção endotelial. O presente estudo avalia a relação entre os níveis dos marcadores de estresse oxidativo MDA-TBARS, FRAP e MTT e de nitrito plasmático, que revela o status de biodisponibilidade do vasodilatador NO (óxido nítrico) em grupos formados por gestantes saudáveis (GS) (n=38), com hipertensão gestacional (HAG) (N=33) e portadoras de pré-eclâmpsia (PE) (n=28). As características clínicas e bioquímicas foram comparadas utilizando-se o teste de análise de variância (ANOVA) de uma via, corrigida por Bonferroni e valores de p<0,05 foram considerados significantes. Ao avaliarmos os marcadores de estresse oxidativo não foram encontradas diferenças entre os grupos para o MDA-TBARS, entretanto, os níveis de FRAP e MTT demonstraram-se elevados nas gestantes dos grupos HAG e PE comparados a GS. Os níveis de nitrito plasmático nos grupos HAG e PE apresentaram-se reduzidos em comparação ao grupo GS. Estes resultados demonstram que mulheres com doenças hipertensivas gestacionais não demonstram alterações no marcador de peroxidação 9 lipídica MDA-TBARS, contudo, marcadores plasmáticos de atividade antioxidante encontram-se aumentados, sugerindo um mecanismo de defesa frente ao aumento de radicais livres produzidos. Além disso, os níveis reduzidos de nitrito plasmático e conseqüentemente de NO, sugerem que fatores adicionais devem contribuir para a disfunção endotelial observada nessas gestantes. Palavras-chave: Doenças hipertensivas gestacionais, estresse oxidativo, nitrito plasmático. 10 ABSTRACT Hypertensives disorders of pregnancy affect 12-22% of all pregnant worldwide and are responsible to 17.6% of maternal death. Preeclampsia is characterized by hypertension associated with proteinuria, and the pathophysiology involves oxidative stress and endothelial dysfunction. The current study evaluated the relation among oxidative stress markers (MDA-TBARS, FRAP and MTT) and plasma nitrite, the marker that indicates the bioavailability of the vasodilator nitrite oxide (NO) in healthy pregnant (HP, n=38), gestational hypertensives (GH, n=33) and preeclampsia (PE, n=28) pregnant. We found no difference of MDA-TBARS levels among groups, in addition higher levels of FRAP and MTT were found in GH and PE compared to HP. Conversely, nitrite levels were lower in GH and PE compared to HP. Our results suggest that pregnant with hypertensives disorders present a defensive mechanism regarding free radicals production. In addition, the lower levels of NO suggest that others factor besides oxidative stress contribute to endothelial dysfunction observed in GH and PE. Key-words: Hypertensives disorders of pregnant, oxidative stress and nitrite 11 Introdução Alterações fisiológicas da gestação saudável Ao processo gestacional estão associadas adaptações fisiológicas, metabólicas e anatômicas que culminam em acentuadas mudanças no organismo materno, incluindo a composição dos elementos figurados e humorais do sangue circulante. Adaptações cardiovasculares na gestante permitem o suprimento constante de nutrientes e metabólitos ao feto, sem comprometer as necessidades maternas. Tais alterações resultam de interações complexas entre hormônios, substâncias vasoativas e vários outros fatores (Gilbert JS 2007; Pridjian and Pruschet 2002; Longo Dola et al. 2003). Durante a gravidez ocorre elevação de cerca de 40 a 50% do volume sanguíneo total em decorrência do aumento, tanto do volume plasmático quanto da massa total de eritrócitos na circulação. O débito cardíaco (DC) eleva-se (30 a 50%) acompanhado por aumento, também, na freqüência cardíaca, hipertrofia ventricular esquerda e resistência moderada à insulina (Rovinsky and Jaffin 1965; Hytten 1985; Gilbert JS 2007). Considerando todas estas alterações hemodinâmicas, poderíamos esperar aumento na pressão sanguínea durante a gravidez. Entretanto, o contrário é observado. Na gravidez saudável são observadas diminuições na pressão arterial (PA) sistólica e diastólica até a 16ª-20ª semana gestacional (MacGillivray et al. 1969; 12 Maynard, Epstein et al. 2008; Gilbert 2007). Tais mudanças são conseqüência da diminuição da resistência vascular periférica (RVP) que ocorre, predominantemente, em resposta à vasodilatação e à diminuição da responsividade aos vasoconstritrores e à angiogênese (Roberts and Gammill 2005; Maynard, Epstein et al. 2008). A gravidez de algumas mulheres não é acompanhada por estas alterações hemodinâmicas que permitem a acomodação do volume corpóreo e conseqüente diminuição da pressão sanguínea, conduzindo a quadros de doenças hipertensivas (Rovinsky and Jaffin 1965). Relevância das doenças hipertensivas gestacionais As doenças hipertensivas gestacionais afetam entre 12-22% das gestações em todo o mundo e são responsáveis por 17,6% das mortes maternas (MacKay 1988, Berg et al. 2001). De modo similar, no Brasil, dados do Ministério da Saúde apontam a hipertensão como a maior causa de morte materna, sendo responsável por cerca de 35% da taxa de 140-160 mortes maternas/100.000 nascidos vivos. Em relação à mortalidade perinatal, a taxa nacional é de 150/1000 partos, assinalando a hipertensão também como a maior causa de óbitos fetais ou de recém-natos (Vasconcelos 2002). A gravidez pode ser complicada por quatro formas distintas de hipertensão: hipertensão crônica de qualquer etiologia, pré-eclâmpsia sobreposta à hipertensão crônica, hipertensão gestacional e pré-eclâmpsia/eclampsia Vasconcelos 2002). 13 (Paschoal 2002, Segundo as diretrizes da Associação Médica Brasileira e do Conselho Federal de Medicina, as manifestações clínicas que caracterizam as diversas classificações para a formas de hipertensão na gravidez são determinadas por: Hipertensão crônica - ocorre em cerca de 3 a 5% das gestações. Caracterizada pela presença da hipertensão arterial sistêmica antes da gravidez, diagnosticada pela primeira vez antes da 20ª semana gestacional ou persistente após 12 semanas pósparto (Vasconcelos 2002; Longo, Dola et al. 2003). Hipertensão arterial gestacional - caracterizada por aumento de pelo menos 30mmHg na pressão arterial sistólica (PAS) e/ou 15mmHg na pressão arterial diastólica (PAD), em relação à média dos valores obtidos antes da 20ª semana. Quando a pressão arterial (PA) prévia for desconhecida, valores >140/90mmHg em duas aferições, com intervalo mínimo de 4h, em repouso, são considerados anormais . Hipertensão Arterial Crônica Superposta por Pré-eclâmpsia caracteriza-se por proteinúria aguda intensa (>300mg/urina 24h), aumento repentino da pressão arterial, trombocitopenia ou níveis elevados das enzimas hepáticas iniciados após a 20ª semana gestacional em gestante com hipertensão arterial preexistente. Ocorre em aproximadamente 20 a 25% das mulheres com HAS crônica (Vasconcelos MJA 2002; Longo, Dola et al. 2003). Pré-eclâmpsia (PE) - síndrome específica da gravidez que ocorre a partir de sua segunda metade. É caracterizada por aumento da pressão arterial (PAS > 140mmHg ou PAD > 90mmHg) e proteinúria (excreção de proteína urinaria ≥ 300mg/24h), com início após a 20ª semana gestacional em gestante previamente normotensa. Para a mãe, as complicações da PE incluem falência renal e hepática, acidentes vasculares e 14 morte. Para o feto, pode resultar em redução do tempo gestacional, prematuridade, danos neurológicos ou morte. A patologia afeta entre 3-5% das mulheres grávidas e é das principais causas de morte entre mães e filhos. Estima-se que aproximadamente 500.000 mulheres morrem no parto a cada ano no mundo e 10- 15% dessas mortes são em decorrência de eclâmpsia. (Maarten T. M et al. 2004; Baumwell and Karumanchi 2007; Pridjian and Puschett 2002, Vasconcelos 2002). A eclâmpsia é o aparecimento de convulsões em paciente com pré-eclâmpsia ou hipertensão gestacional, na ausência de epilepsia e outras doenças convulsivas prévias (Longo, Dola et al. 2003). Pode ocorrer durante a gestação, na evolução do trabalho de parto e no puerpério imediato (Vasconcelos 2002). A PE é mais comum nas primigrávidas do que naquelas que estão a partir da segunda gravidez. Entretanto, com a mudança de parceiro, o risco da mulher desenvolver PE aumenta. É possível de que o pai desempenhe papel importante no processo, podendo aumentar o risco de que a mulher desenvolva uma gravidez préeclâmptica. Histórico de obesidade, múltiplas gravidezes, doenças crônicas como hipertensão, diabetes e trombofilia (uma tendência herdada de coagulação hiperativa) também devem ser levadas em consideração (Walker 2000, Redman 2005; Maynard et al. 2008). A pré-eclâmpsia não pode ser prevenida; a doença é controlada através do monitoramento dos sintomas com a finalidade de minimizar seu agravamento (Maarten et al. 2004). A síndrome HELLP: associação entre hemólise, plaquetopenia e disfunção hepática é uma complicação da PE grave/Eclâmpsia e proteinúria que pode ou não estar presente nessa síndrome (Vasconcelos 2002). 15 Fisiopatologia da pré-eclampsia Enquanto os eventos iniciais desencadeadores da patogênese da pré-eclâmpsia permanecem desconhecidos, vários trabalhos começam a elucidar os mecanismos moleculares por trás da patologia. Em 1939 E.W. Page propôs que a placenta desempenhasse papel central no processo. Exames histológicos em placentas obtidas de pré-eclâmpsia severa demonstravam lesões clássicas de aterose aguda, artérias e arteríolas escleróticas e estreitadas com múltiplos infartos, deposição de fibrina e tromobose. Portanto, uma placenta com desenvolvimento anormal, disfunção endotelial e hipóxia associada é necessária para o início do desenvolvimento da PE (Baumwell and Karumanchi 2007, Maynard et al 2008). Indiscutivelmente, o evento mais importante no início da placentação normal é o estabelecimento da circulação materna efetiva, processo que está ligado à conversão fisiológica das estreitas e tortuosas artérias espiraladas maternas em um flácido ducto sinoidal com baixa resistência que permite o suprimento sanguíneo necessário ao desenvolvimento da placenta (Gotti et al.2002). Em contrapartida, ocorre o processo de invasão trofoblástica de origem fetal que contribui para transformação da circulação útero-placentária em um sistema de alta capacidade, baixa resistência que exibe resistência relativa aos agentes vasopressores (Figura 1). 16 Figura 1. Representação esquemática da fisiopatologia da pré-eclâmpsia. Adaptado de Redman, et al., 2005. Durante a gravidez saudável, os citotrofoblastos, de origem fetal, invadem as arteríolas espiraladas. Seu fenótipo diferencia-se de epitelial para endotelial, permitindo que estes vasos aumentem seu calibre, aumentando, também, a perfusão placentária. Na pré-eclâmpsia, em contrapartida, esta diferenciação não ocorre de maneira adequada. Há conseqüente redução da perfusão placentária e hipóxia associada, gerando um quadro de estresse oxidativo. Este processo ocorre em dois estágios. Inicialmente, os segmentos deciduais das artérias espiraladas são afetados pela primeira onda de invasão trofoblástica 17 seguida por uma segunda onda, a partir do segundo trimestre, na qual a invasão extende-se até o primeiro terço do miométrio (Gotti et al 2002). Na gravidez pré-eclâmptica é percebida uma falha na segunda onda de invasão trofoblástica, resultando em um quadro de vasoconstrição arteriolar, aumentada responsividade aos peptídeos e aminas vasopressoras e reduzido fluxo sanguíneo na unidade uteroplacentária. O remodelamento das artérias espirais fica limitado, e a vasodilatação fica prejudicada (Gotti et al. 2002; Maynard et al 2008). A isquemia placentária progride continuamente durante a gravidez e os vasos estreitados não fornecem a demanda da unidade fetoplacentária em desenvolvimento, um quadro de hipóxia insurge, gerando estresse oxidativo e forte resposta inflamatória de origem materna. Ocorre produção aumentada de fatores antiangiogênicos placentários, especificamente formas solúveis da tirosina quinase 1 (sFLT-1) e a endoglina solúvel. Estes fatores afetam o endotélio causando disfunção endotelial e resultam em hipertensão, proteinúria e outras manifestações da PE. Outros fatores como alterações no eixo renina-angiotensina-aldosterona, mal adaptação imunológica, perda excessiva de fragmentos de trofoblastos e fatores genéticos parecem contribuir para a patogênese da placentação anormal (Maynard S et al.2008; Walker JJ 2000). Na PE o estresse oxidativo resulta em disfunção endotelial, por ação direta na vasculatura ou através da redução na biodisponibilidade de mediadores vasoativos como o óxido nítrico (NO). O estresse oxidativo contribui para a disfunção endotelial e para a fisiopatologia da doença baseando-se na atividade pró-oxidante, podendo resultar, também, de interações entre o componente materno, que inclui condições préexistentes como obesidade, diabetes e hiperlipidemia e/ou do componente placentário que, por sua vez, inclui secreção de peroxidolipídeos (Gilbert et al. 2007). 18 Estresse oxidativo e pré-eclâmpsia O estado de estresse oxidativo é definido pelo desequilíbrio entre as concentrações de espécies reativas de oxigênio (ROS) e os mecanismos antioxidantes de defesa do organismo. Neste processo, a geração de ROS está aumentada ao ponto de superar os mecanismos de defesa antioxidantes. Em outras palavras, ocorre desequilíbrio entre as espécies pró e antioxidantes, sendo que as espécies antioxidantes encontram-se em desvantagem (Dotan et al., 2004; Gilbert et al.2007; Gupta et al.2009). Podem ser considerados ROS os radicais livres e as demais espécies reativas do oxigênio. Radicais livres são moléculas com um ou mais elétrons despareados na órbita mais externa do oxigênio da estrutura, entre eles estão incluídos o radical hidroxila, os radicais do ânion superóxido e do óxido nítrico. As ROS como peróxido de hidrogênio e peroxinitrito não têm elétrons dispareados em sua camada mais externa (Grupta et al. 2005; Dotan et al.2004). As ROS, no entanto, exercem papel duplo. São segundos mensageiros chave para a manutenção das funções fisiológicas, inclusive no trato reprodutivo feminino. Contudo, a sua produção excessiva pode causar diversos danos celulares, ao DNA e às proteínas circulantes (Grupta et al 2009; Grupta et al. 2005; Dotan et al. 2004). Frente a tais fenômenos, nosso organismo dispõe de diversos sistemas antioxidantes para limitar ou inativar a produção das ROS, reparar o dano celular ou até mesmo adaptar o organismo à condição do estresse oxidativo (Grupta et al.2005; Dotan et al. 2004). A gravidez é caracterizada por aumento na geração das ROS, principalmente do radical superóxido que ocorre em função da demanda metabólica aumentada, maior 19 atividade mitocondrial e grande necessidade de oxigenação dos tecidos, principalmente na unidade útero-placentária em desenvolvimento. A origem de sua produção está associada a níveis diminuídos da produção da superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GSHPx), enzimas antioxidantes presentes nos trofoblastos placentários (Gitto et al.2002; Grupta et al 2005). Em contrapartida, o organismo materno parece reagir tentando equilibrar tal situação, com aumento de agentes antioxidantes como vitamina E, ceruloplasmina e os tióis de eritrócitos, lançados na circulação (Gitto et al. 2002). Na pré-eclampsia, a geração das ROS está ainda mais ativa, visto que a placentação anormal leva à isquemia com hipóxia associada e dano endotelial pelo estresse oxidativo placentário. Além disso, níveis de importantes antioxidantes como vitaminas A, E e C, betacaroteno e glutationa, assim como a capacidade ligante do ferro, encontram-se alterados. Alguns estudos sugerem que ocorra diminuição de sua concentração (Mutlu-Torkogiu et al 1998; Yaninik 1999 et al Panburana 2000 El alMadazli 2001 et al), muito embora, outros sugerem elevação de seus níveis durante a PE (Noyan et al. 2006; Uotila et al.1993; Schiff et al. 1996; Zhang et al. 2001). Na Tabela 1 estão apresentados alguns trabalhos avaliando marcadores de estresse oxidativo em PE. 20 Tabela 1: Estudos envolvendo análises de marcadores de estresse oxidativo em préeclâmpsia Estudo Características do estudo Características dos pacientes Parâmetros avaliados Conclusões Takacs et al(2001). Estudo caso-controle Mulheres com PE severa.( N = 12) ou plasma proveniente de gestantes saudáveis (N = 12) MDA plasmático Elevação significativa nos níveis de peroxilipídeos em mulheres com pré-eclâmpsia. Yanik et al(1999) Estudo transversal de casos de PE e controle de gestantes normotensas Oitenta pacientes com PE e 25 controles normotensos foram recrutados para o estudo MDA, Vitamina E Os valores de MDA apresentaram-se significativamente mais elevados nos casos em que os valores de Vitamina E apresentaram-se significativamente mais baixos. Madazili et al(2002) Estudo transversal de casos de PE e controle de gestantes normotensas Vinte e duas pacientes com PE foram comparadas com controle de 21 gestantes normotensas e saudáveis Vitaminas E, C e MDA no plasma MDA estava significativamente mais alto no grupo PE enquanto níveis de vitaminas E e C estavam significativamente mais altos no grupo controle. Mutlu-Torkogiu et al(1998) Estudo transversal de casos de PE e controle de gestantes normotensas Setenta gestantes com diagnóstico de PE foram comparadas a 10 controles normotensos TBARS, glutationa, GSH-Px, SOD, Vitamina C Níveis de TBARS estavam significativamente mais altos nos casos de PE em comparação aos controles, enquanto os níveis de antioxidantes estavam significativamente mais baixos. Panburana El al (2000) Estudo transversal de casos de PE e controles normotensos O grupo controle era composto por 60 gestantes normotensas. Trinta casos de PE moderada também fora recrutados Vitaminas A,C , E e MDA As mulheres portadoras de PE apresentaram níveis significativamente menores de vitamina C em comparação aos controles. Entretanto, não houve diferença significativa entres os níveis de vitamina A e E depois de ajuste de colesterol. Uoitila et al. (1993) Estudo transversal comparando pacientes com PE a gestantes saudáveis como controle Foram avaliadas 20 gestantes saudáveis, 23 com PE grave, 23 com PE moderada e 13 com hipertensão gestacional. Foram avaliados níveis plasmáticos de MDA, TBARS, cromolipídios fluorescentes, GSHPx selênio, acido úrico e vitamina E O aumento nas concentrações de antioxidantes pode ocorrer em resposta à peroxidação lipídica em PE Noyan et al. (2006) Estudo caso-controle 21 gestantes com PE, 11 gestantes com eclampsia e 19 gestantes saudáveis Níveis séricos de MDA, AOPP (produtos avançados de oxidação protéica), vitamina C e Catalase Níveis significativamente elevados de MDA, Catalase e vitamina C em PE em comparação aos do grupo controle. 21 A placenta é a maior fonte de estresse oxidativo durante a gravidez; é rica em ácidos graxos polinsaturados, que são fonte abundante de peroxilipídios, os quais são secretados na circulação materna. As principais enzimas antioxidantes como SOD, catalase (CAT), GSHPx, gluitationa redutase, glutationa S-transferase e glicose-6fosfato-desidrogenase, que estão presentes na placenta, parecem ter sua atividade diminuída na gravidez pré-eclâmptica (Gitto et al.2002). A peroxidação lipídica desempenha papel importante na fisiopatologia da PE. Os peroxilipídeos seqüestram os antioxidantes não enzimáticos circulantes (vitaminas A, C e E e glutationa) e afetam a funcionalidade dos antioxidantes de origem enzimática (GSHPx e SOD), além de causar dano oxidativo (Gupta et al. 2005). Os peroxilipídeos são então transportados aos mais distantes locais do organismo, resultando em exarcebação da resposta inflamatória e disfunção endotelial sistêmica, contribuindo, assim, para as complicações da pré-eclampsia (Grupta et al 2005, Redman Sacks et al. 2009). O estresse oxidativo com produção de peroxilipídeos e a resposta inflamatória podem ser considerados como processos complementares, visto que a primeira é capaz de desencadear a segunda situação clínica (Redman, Sacks et al. 1999). O dano inerente ao estresse oxidativo pode ser avaliado com a mensuração de seus mais diversos marcadores. Com o resultado dessas mensurações podemos acompanhar a evolução fisiopatológica das doenças nas quais o estresse oxidativo está incluído, bem como saber quais potenciais danos estarão associados aos processos patológicos em estudo. 22 Avaliando o grau de estresse oxidativo Basicamente, existem duas maneiras de mensurar o grau de estresse oxidativo. Através da avaliação das concentrações de subprodutos ou dos promotores do dano oxidativo e através do status ou capacidade antioxidante do meio em questão. A primeira forma avaliativa fornece, de certa maneira, as dimensões do dano oxidativo, enquanto a segunda demonstra a capacidade antioxidante do meio, que pode ocorrer em resposta ao estresse oxidativo ou como forma de adaptação do organismo àquela situação desfavorável (Dotan et al 2004; Nikki 2010). No caso da pré-eclampsia, os principais subprodutos do estresse oxidativo são as formas provenientes da peroxidação lipídica, representadas pelos peroxilipídeos (Dotan et al. 2004). ` Dentre os marcadores mais utilizados para avaliar o dano lipídico por oxidação está o teste MDA (principal metabólito da quebra do peroxilipídeo), que utiliza o ensaio TBARS (Dotan et al 2004). Este teste identifica produtos de oxidação lipídica, pigmentos de bile, aminoácidos e açúcares que podem gerar cromógenos interferentes. Diante disso, é mais apropriado usar o termo substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). No entanto, o MDA é mais reativo ao TBA. Além disso, o fato de o TBA ser calibrado com MDA, leva os autores a, na maioria das vezes, expressar seus resultados com o termo “quantidade de MDA” (Costa et al. 2006). Outra maneira útil de avaliar o estresse oxidativo é mensurar o “status oxidativo”. Representados pelos chamados “testes de potência” que avaliam a capacidade redutora dos fluidos corpóreos, isto é, a capacidade destes fluidos reduzirem a oxidação, testes como o FRAP (habilidade redutora do ferro pelo plasma ou poder antioxidante redutor do ferro) e MTT ( reação de um sal tipo tetrazolium que sofre 23 redução ao reagir com fatores anti-oxidantes do plasma) podem ser utilizados para avaliar a capacidade/poder antioxidante (Dotan et al. 2004; Abreu et al. 2007). Os teste FRAP baseia-se na redução do complexo 2,4,6-tripiridil-s-triazina férrico ([Fe(III)-(TPTZ)2]3+ no complexo ferroso de cor azul intensa [Fe(II)-(TPTZ)2]2 por ação de compostos antioxidantes no plasma sanguíneo, entre eles, principalmente o ácido úrico e as vitaminas C e E (Benzie et al 1996). O teste MTT baseia-se na capacidade dos fatores antioxidantes do plasma como ascorbato, urato, vitamina E, albumina e o grupo das sulfidril proteínas terem de reduzir o composto [-(3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)] a um composto colorimétrico formado pelos os cristais de formazana. (Abreu et al. 2007) 24 No esquema 1 estão apresentados os principais vias e produtos relacionados a peroxidação lipídica. Esquema 1 – Produtos e vias relacionados à peroxidação lipídica. Esse esquema descreve vários produtos, entre eles: Radical peroxil (1), isoprotanos (4) e MDA (5). Extraído de Dotan 2004. 25 Óxido Nítrico e Pré-Eclâmpsia Dentre todos os mediadores vasoativos, o NO exerce papel dos mais importantes na regulação da resistência vascular. Sintetizado no endotélio pela sintase endotelial do óxido nítrico (eNOS) através da conversão do aminoácido L-arginina e oxigênio em L-citrulina e NO, o NO contribui para a manutenção da homeostase vascular, promovendo além da vasodilatação, a inibição da agregação e adesão plaquetárias, modificações oxidativas do colesterol LDL, limitando a proliferação das células do músculo liso por ações específicas na célula e diminuindo a expressão de genes pró-inflamatórios que promovem o desenvolvimento da ateroesclerose (Forsterman 2008; Moncada e Higgs 1993). De uma maneira geral, durante a gestação normal, é observado um aumento dos níveis de NO pela atividade da eNOS (Anumba et al. 1999). A causa específica deste aumento é desconhecida, mas sugere-se que o aumento do shear stress- força de fricção na superfície endotelial que resulta em fluxo intraluminal, importante estímulo fisioológico para a vasodilatação mediada por NO - (Sladek et al. 1997; Ranjan et al. 1995) e de certos hormônios, tais como, o 17--estradiol (Wieczorel et al 1995; Hayashi et al. 1997) e hCG (Hishirawa et al. 1995; Voorhis et al. 1995; Jablonka-Shariff e Olson 1997) durante a gravidez estimulem a atividade desta enzima. Para a placenta, especificamente, a atividade da eNOS é importante porque o NO produzido mantém a baixa resistência vascular, além de atenuar a ação dos vasoconstritores (Baylis et al. 1998). Tem sido hipotetizado que a diminuição na produção de NO na placenta poderia acarretar perfusão anormal da placenta, o que é evidenciado nos estados de pré-eclâmpsia. Com relação a produção sistêmica de NO, 26 sugere-se que a vasodilatação dependente do fluxo de NO esteja comprometida em gestantes com pré-eclâmpsia comparadas às grávidas normais (Cockell e Poston 1997). Na presença de estresse oxidativo e do dano endotelial é percebida uma redução da bioatividade do NO. Um dos mecanismos que explicam esta redução ocorre pelo seqüestro e inativação pelo ânion superóxido. Além disso, evidências indicam que o estresse oxidativo persistente causa disfunção da eNOS, que desacoplada, cessa a produção do NO e passa a produzir ROS como o ânion superóxido (Forsterman 2008). Além destas evidências, alguns trabalhos demonstram alterações nos mecanismos regulatórios da atividade da eNOS em mulheres com pré-eclampsia. Por exemplo, os níveis do inibidor endógeno da eNOS (ADMA) e do co-fator BH4, necessário à atividade desta enzima é maior e menor, respectivamente,em gestantes com alta resistência da circulação placentária e, portanto, com risco aumentado para o desenvolvimento de pré-eclâmpsia, comparadas às gestantes saudáveis (Savvidou et al. 2003). Todas estas evidências apontam para uma importância significativa do NO durante a gestação normal, além disso, este sistema parece estar alterado em mulheres com pré-eclâmpsia. De uma maneira geral, acredita-se que combinações diferentes de fatores de predisposição podem levar a mecanismos de disfunção semelhantes que dificultam a investigação desta condição patológica. Avaliando a biodisponibilidade sistêmica do NO Uma maneira de se avaliar a atividade da eNOS se dá pela análise dos produtos de espécies relacionadas ao NO, uma vez que sua curta meia-vida e as suas pequenas 27 concentrações dificultam a avaliação quantitativa da produção in vivo nos tecidos. Entre as espécies citadas, as concentrações plasmáticas dos principais produtos da oxidação do NO (nitritos e nitratos) são mais comumente utilizadas (Ohtoshi etal. 2002; Yoon et al 2000; Tsukada et al. 1998; Nagassaki et al 2005). Os nitritos derivam da reação do NO com oxigênio em solução e são biologicamente ativos. Os nitratos, que são biologicamente inativos, são produzidos através da oxidação dos nitritos pela oxihemoglobina nas hemácias. Entretanto, muitos fatores incluindo etnia, sexo, poluentes ambientais (Noris et al. 2004; Davis et al. 2001; Castillo et. al 1996) e medicamentos podem afetar os níveis plasmáticos de nitrato, limitando, assim, sua utilização clínica para avaliação da produção endógena de NO. Recentemente, a quantificação do nitrito tem se mostrado interessante, uma vez que os níveis plasmáticos deste produto sofrem pouca influência de fatores exógenos. Estima-se que 70% dos níveis encontrados sistemicamente sejam derivados da atividade da eNOS, além de que é sugerido que este composto seja um reservatório de NO na circulação, no qual sua conversão para NO se dá devido pH baixo ou pressões de oxigênio baixas (Noris et al. 2004). Alguns trabalhos vêm demonstrando redução das concentrações plasmáticas de nitrito em condições patológicas, como hipertensão e em indivíduos que apresentam algum fator de risco para doenças cardiovasculares como os tabagistas (Kleinborngard et al. 2006); porém, até o momento pouco se conhece a respeito da relação entre este composto e a pré-eclâmpsia ou HAG. Desta maneira, a quantificação dos nitritos plasmáticos seria mais indicada para análise da atividade da eNOS e portanto da produção endógena de NO. Diante desses aspectos e dos anteriores, é de grande interesse científico a quantificação, tanto dos parâmetros que revelam os índices de marcadores de estresse oxidativo e status anti-oxidante, quanto do nitrito plasmático, que revela a 28 biodisponibilidade de NO, que por sua vez, representa papel importante no tônus vascular e vasodilatação. Bem como a possível relação destes na fisiopatologia da Préeclâmpsia. 29 Objetivos Objetivo Geral Comparar níveis de marcadores de estresse oxidativo e de nitrito plasmático em gestantes com doenças hipertensivas da gravidez. Objetivos específicos 1- Determinar os níveis plasmáticos dos seguintes marcadores de estresse oxidativo: MDA, FRAP E MTT. Em gestantes saudáveis (GS), com Hipertensão Arterial (HAG) e Pré-eclâmpticas (PE). 2- Determinar níveis de nitrito plasmático em gestantes dos grupos PE, HAG e GS. 3- Estabelecer relação fisiológica e bioquímica entre os níveis dos marcadores anteriormente citados. 30 Pacientes, Materiais e Métodos Seleção das participantes e determinação dos grupos de estudo Para o presente trabalho foram selecionadas: 33 gestantes com HAG e 28 gestantes pré-eclâmpticas (PE), acompanhadas pelo atendimento especializado no Ambulatório de Gestação de Alto Risco do HCFMRP-USP. Paralelamente, 38 gestantes saudáveis foram selecionadas no ambulatório de pré-natal normal da MATER em Ribeirão Preto. Gestantes portadoras de co-morbidades como diabetes gestacional, diabetes crônica, doenças inflamatórias e que fossem fumantes foram excluídas dos grupos de estudo. Os grupos foram equilibrados por idade, IMC e semana gestacional. Todas as gestantes selecionadas para este estudo são de raça branca. O estudo em questão é um subprojeto do projeto intitulado “Farmacogenética do tratamento anti-hipertensivo de pacientes com pré-eclâmpsia: relevância do haplótipo da eNOS”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP, de acordo com o processo HCRP n° 4682/2006. Critérios de Diagnóstico O diagnóstico de HAG e PE pré-eclâmpsia foi feito com base nas orientações da Federação Brasileira das Sociedades de Ginecologia e Obstetrícia. Foram diagnosticas como portadoras de HAG, gestantes que apresentaram hipertensão após 20º semana de gestação, caracterizada por pressão arterial sistólica em níveis > 140mmHg e a diastólica >90mmHg, em duas aferições de pressão, com 31 intervalo de 4h, em repouso; Foram consideradas gestantes com pré-eclâmpsia PE aquelas que apresentaram quadro de hipertensão após a 20º semana de gestação e proteinúria (> 0,3 g/L em urina 24 horas). Coleta e processamento das amostras Daquelas voluntárias que aceitaram participar deste estudo, após esclarecimento detalhado sobre o projeto e assinatura do “termo de consentimento informado” (anexo I), foram coletados, seguindo as técnicas de coleta adequadas, 30 ml de sangue venoso, em tubos contendo EDTA ou heparina, e centrifugado a 3000g por 5 minutos, para a obtenção das frações plasma/soro e posteriormente, mantido sob refrigeração em freezer a -70º C até a realização das análises bioquímicas. As amostras de sangue foram coletadas durante o atendimento clínico e utilizadas para os estudos bioquímicos de doseamento de Nitrito plasmático, MDA, MTT e FRAP. 32 Soluções e Tampões Etanol absoluto refrigerado (4ºC) Nitrato de Sódio a 10 mM Água miliQ Solução redutora composta de 3 mL de Vanádio(III) a 0,1M e 3 mL de HCl a 1M Reagente de cor TBA-TCA-HCl (TBA: 0,375%,TCA:15%, HCL: 0,25N). TBA (ácido tiobarbitúrico) TCA (ácido tricloracético) HCl: (ácido clorídrico concentrado) Solução TMP (Tetrametoxipropano, Sigma, no cat 1083833-100ML; PM=164,2g/mol) Tampão Acetato 0,3 M, pH 3,6; Solução de HCl 40 mM (0,04 M); TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine, Sigma, nº cat T1253-5G, PM= 312,34 g/mol) a 10 mM; Cloreto Férrico 20 mM (0,02 M) Sulfato ferroso em tampão acetato (0,0695 g sulfato ferroso (FeSO 4.7H2O) . Isopropanol ácido (0,3 mL de HCl 0,04 M em 90 mL de Álcool isopropílico) 33 Equipamentos e Software utilizados nos protocolos experimentais Centrífuga: fabricante, Hettich Zentrifugen; mod: universal 320R; 220volts Analisador de NO (Sievers Model 280 NO analyser – Boulder, CO, EUA) Vórtex: fabricante, Marconi; mod.: MA162; 110 volts Banho-maria: fabricante, Marconi; mod.: MA156; 220 volts Spectrofotômetro: Marca Spectramax M5; leitor 96 poços; 220 volts Software para análise estatística: GraphPad Prism v. 3 pHmetro de bancada Espectrofotômetro 34 Determinação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (teste MDA-TBARS) (COSTA et al 2006) Este teste consiste na medida de um cromógeno róseo formado pela reação do MDA com duas moléculas de ácido tiobarbitúrico, em meio ácido, em alta temperatura. Essa reação, chamada de “teste de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)”. Em tubos de ensaio marcados, foram pipetados 100µL plasma (homogeneizado em vórtex), branco e padrão. A cada tubo de ensaio foi adicionado 1mL de reagente de cor TBA-TCA-HCl (TBA: 0,375%,TCA:15%, HCL: 0,25N). As amostras foram submetidas a aquecimento em banho-maria, sob temperatura controlada (100º C), durante 30 minutos e, em seguida, submetidas ao resfriamento, em banho de gelo, por 5 minutos e, finalmente, centrifugadas por 10 minutos a 3000rpm (1358,57g). Foram pipetados 200 µL do sobrenadante. A análise foi feita em placa de 96 poços,com leitura em espectrofotômetro a 535nm. Para a curva de calibração, foram pipetados em duplicata 200 µL dos padrões de solução TMP (Tetrametoxipropano), de acordo com a tabela 2 e do branco. Tabela 2: Concentrações usadas para a curva de calibração, teste MDA Ponto da curva Concentração (µM) P1 P2 P3 P4 250,00 125,00 62,50 31,25 35 P5 P6 15,62 7,82 Os resultados foram dispostos em planilha Excel com TMP (µM) no eixo X e as respectivas medidas das absorbâncias no eixo Y. A equação da reta da curva padrão foi calculada e a partir dela, foram calculados os valores de MDA de cada amostra, expressos em µM (ou µmol/L). Determinação da Atividade Antioxidante Total do Plasma (teste FRAP) (BENZIE et al 1996) O ensaio FRAP avalia a capacidade dos antioxidantes da amostra em reduzir o complexo 2,4,6-tripyridyl-s-triazine férrico ([Fe(III)-(TPTZ)2]3+ no complexo ferroso de cor azul intensa [Fe(II)-(TPTZ)2]2+, em meio ácido. Previamente, foram preparadas as soluções: A - Tampão Acetato 0,3 M, pH 3,6; B - Solução de HCl 40 mM (0,04 M); C – de TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine, Sigma, nº cat T1253-5G, PM= 312,34 g/mol) a 10 mM; D de Cloreto Férrico 20 mM (0,02 M) e a solução FRAP, que consiste na mistura das soluções A, C, D na razão 10:1:1, feita, obrigatoriamente, no dia da análise. Para a curva padrão foi feita solução de Sulfato ferroso em tampão acetato (0,0695 g sulfato ferroso (FeSO4.7H2O) em 5 mL de tampão acetato 0,3M). Os pontos da curva padrão seguiram as diluições demonstradas na tabela 3. 36 Tabela 3: Escala de diluições usadas para definir a curva padrão do teste FRAP Ponto da Curva Concentração final ( uM) P1 1000 P2 500 P3 250 P4 125 P5 62,5 Foram pipetados na placa de 96 poços 10 uL de água miliq e 300 µL de solução FRAP para fazer o branco, 10 µL de cada ponto da curva padrão adicionados de 300 µL de solução FRAP, em duplicata e 10 µL de plasma adicionados 300 µL de solução FRAP. A placa foi incubada no espectrofotômetro a 37ºC por 4 minutos e a leitura feita a 593nm. Para o cálculo dos resultados foram dispostas em planilha Excel as concentrações da curva padrão realizada com sulfato ferroso (µM) no eixo X e as respectivas médias da duplicata das absorbâncias no eixo Y para que a equação da reta fosse calculada. A partir da equação da reta da curva padrão, foram calculados os valores de FRAP da amostra expressos em µM. 37 Determinação do potencial anti-oxidante do plasma pelo Método de MTT (Medina et.al 1996) O MTT [-(3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina)] é um tipo de sal tetrazolium que sofre redução metabólica a um produto final colorimétrico, os cristais de formazana. O plasma contém muitos fatores antioxidantes como: ascorbato, urato, α-tocoferol, albumina e o grupo das sulfidril proteínas que são capazes de reduzir o MTT (Medina et al., 2007) e assim transformá-lo em seu produto final no qual sua concentração será detectada pela absorção de luz (espectrofotômetro ou leitor de ELISA). Para esta análise, foram pipetados em tubos de ensaio identificados, 100 µL da amostra em EDTA. Foram adicionados ao conteúdo dos tubos 50 µL de PBS (Tampão fosfato salino) e 12,5 µL de MTT. Feito isto, os tubos foram fechados com papel alumínio e incubados em banho-maria a 37º C por 60min. A cada tubo, foram adicionados 750 µL da solução de isopropanol ácido e feita homogeinizaçao em vortéx por aproximadamente 30 segundos para que fossem submetidos a centrifugação por 10min a 3000rpm Finalmente, foi feita leitura em espectrofotômetro a 570nm. Para o controle negativo foram utilizados 150 µL de PBS e 12,5µL de MTT. Para o Branco PBS. Ambos reagentes seguiram o mesmo processo submetido às amostras. Os valores encontrados foram plotados em planilha do Excel e os dados analisados em pacote estatístico (GraphPad Prism v. 3). Determinação dos níveis de Nitrito plasmático (GLADWIN et al, 2000). Imediatamente após a coleta de 30 ml de sangue das voluntárias, o plasma foi separado da fração celular do sangue por centrifugação a 3000rpm por 5 minutos. O 38 plasma separado foi mantido sob refrigeração em gelo seco até ser armazenado a -70ºC. Para evitar interferências e formação de bolhas que prejudicassem a leitura da concentração de nitritos nessas amostras de plasma, foi realizado um processo de desproteinização do plasma pela técnica da precipitação das proteínas por etanol absoluto gelado. Nesta técnica, 300 L de plasma foram adicionados a 600 L de etanol absoluto refrigerado (4ºC). A mistura foi vigorosamente agitada para que o etanol gelado precipitasse as proteínas presentes no plasma. Após a agitação, o plasma com etanol foi mantido sob refrigeração a 0ºC por 30 minutos e então, as amostras foram centrifugadas a 10000 rpm durante 5 minutos. Com esse procedimento, as proteínas precipitaaram-se e depositaram-se no fundo do tubo. O sobrenadante foi então retirado e armazenado a –70ºC até o momento da quantificação de nitrito plasmático. Para a montagem da curva de calibração para dosagem de nitritos, preparou-se uma solução estoque de Nitrato de Sódio na concentração de 10 mM. A partir dessa, foram feitas diluições sucessivas para obtenção de padrões de nitrito nas seguintes concentrações: 100, 50, 20, 10, 5, 1 e 0,5 M. Com uso do Analisador de NO as leituras de cada um dos padrões foram feitas em triplicata. Também foi feita a dosagem do branco (água miliQ) para verificar se a água utilizada no preparo das soluções continha nitritos, devendo o pico referente ao branco ser o mais próximo possível do ruído. A quantificação de nitrito foi realizada no plasma, sempre em triplicata, pelo método da quimioluminiscência, que é um dos métodos mais simples, sensíveis e 39 precisos. Utilizou-se um analisador de NO (Sievers Model 280 NO analyser – Boulder, CO, EUA), o qual permite medir NO em quantidades tão pequenas quanto 1 pmol (GLADWIN et al, 2000). Amostras previamente desproteinizadas (15 L) foram injetadas num frasco contendo uma solução redutora (solução redutora é aquecida a 90ºC e composta de 3 mL de Vanádio(III) a 0,1M e 3 mL de HCl a 1M). Essa solução reduz os nitritos presentes na amostra a gás NO. O frasco é conectado a um fluxo contínuo do gás inerte (Nitrogênio) que passa através da solução, carreando o NO liberado em direção ao analisador de NO. As quantidades de NO produzidas são medidas após reação do NO com ozônio numa câmara do analisador de NO. Nesta câmara, a reação do NO com ozônio cria moléculas de NO2 (nitrito) que, no seu estado excitado, emitem luz proporcionalmente às quantidades de NO liberadas pela amostra. O analisador contém um detector de luz que transforma o sinal luminoso em sinal elétrico, que é finalmente convertido em sinal analógico e registrado. Análise dos Resultados As características clínicas e bioquímicas foram comparadas entre os grupos estudados com auxílio do Software estatístico GraphPad Prism v. 3. Após realizado teste de distribuição Gaussiana para grupo de características clínicas e bioquímicas, foram aplicados testes paramétricos aos grupos que se enquadravam nas características da distribuição Gaussiana e testes não-paramétricos àqueles grupos que não a apresentaram. Foram utilizadas as ferramentas estatísticas t de Student nãopareado e ANOVA de uma via. Valores de p<0.05 foram considerados estatisticamente significantes. 40 Resultados Na primeira etapa deste trabalho comparamos níveis de marcadores bioquímicos de estresse oxidativo (MDA, FRAP, MTT) e o estado clínico das gestantes dos grupos estudados. Na tabela 4 estão sumarizadas as características das gestantes selecionadas para este estudo. Os grupos das gestantes saudáveis (GS), com hipertensão gestacional (HAG) e com Pré-eclâmpsia (PE) foram similares quanto à idade, índice de massa corpórea e idade gestacional da amostragem. Entretanto, houve diferenças significativas quanto à porcentagem de primigestas, pressão sanguínea sistólica e diastólica e proteinúria. Estes parâmetros foram superiores em mulheres com préeclâmpsia comparados aos das gestantes saudáveis. A semana gestacional do parto e o peso do recém-nascido, por sua vez, apresentaram valores inferiores no grupo PE, comparando com os grupos GS e HAG. 41 Tabela 4 – Características clínicas e laboratoriais das participantes GS HAG PE 38 33 28 25.3 ±6.1 26.3 ± 6.7 26.6 ± 6.0 25 43* 41* IMC (kg/m2) 24.5 ± 4.3 26.4 ± 5.1 26.4 ± 5.0 PASis (mmHg) 113.2 ± 8.8 134.0 ± 14.3* 140.8 ± 13.8* PADias (mmHg) 75.0 ± 7.4 84.1 ± 9.7 89.1 ± 9.4* Pr 24h (mg/24h) ND 139.6 ± 75.1 1819 ± 639.3 SG (semanas) 36.2 ± 3.2 35.9 ± 4.5 34.8 ± 3.4 SG parto (semanas) 39.7 ± 1.2 38.8 ± 1.4 36.3 ± 2.5*# 3448 ± 456.8 3183 ± 424.1 2807 ± 887.4* N Idade (anos) Primigrávida (%) Peso RN (g) Abreviações: GS, grávidas saudáveis; HAG, hipertensão gestacional; PE, pré-eclâmpticas; IMC, índice de massa corpórea; PA SIS, Pressão Arterial sistólica; PA DIAS, pressão arterial diastólica; Pr 24h, proteinúria em urina 24 horas ; SG amostragem, semana gestacional da amostragem; SG PARTO, semana gestacional do parto; PESO RN, Peso do recém-nascido; ND, não determinado. Os valores representam as médias ± S.D. * P<0,05 vs. grupo GS e # P<0,05 vs. HAG. 42 A segunda etapa do trabalho foi constituída pela análise das características bioquímicas indicadoras de estresse oxidativo (testes MDA, FRAP e MTT) e dos níveis de nitrito plasmático nas amostras coletadas. Como demonstrado pela Figura 2, não houve diferença estatística entre os grupos estudados para os valores de MDA-TBARS, marcador de estresse oxidativo, indicador de peroxidação lipídica. MDA (nM) 7.5 5.0 2.5 0.0 GS HAG 43 PE Figura 2: Concentração plasmática de MDA/TBARS para os grupos GS (grávida sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia). Na figura 3, estão demonstrados os resultados do teste de atividade antioxidante total do plasma, método FRAP. Neste teste, o grupo PE demonstrou valores superiores aos demais grupos, GS (p<0,05) e HAG, revelando maior concentração de agentes anti-oxidantes no plasma das amostras do grupo PE. FRAP (M) 1000 * 500 0 GS HAG PE Figura 3: Potencial antioxidante total do plasma (FRAP) para os grupos GS (grávida sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia). 44 Na figura 4 estão expressos os valores de MTT para os grupos estudados. O ensaio MTT é um teste não específico que expressa o status anti-oxidante do plasma, e portanto, o teor de agentes anti-oxidantes circulantes. Os grupos HAG (p<0,01) e PE (p<0,001) apresentaram valores superiores no teste MTT comparados aos do grupo GS. Figura 4: Valores de MTT para os grupos GS (grávida sadia), HAG (hipertensa gestacional) e PE (pré-eclâmpsia). 45 A figura 5 expressa as concentrações de nitrito plasmático obtidas nas amostras dos três grupos estudados. Os valores de nitrito plasmático do grupo GS apresentaram valores superiores aos dos demais grupos estudados HAG (P<0,01) Nitrito plasmático (nM) e PE (P<0,05). 300 200 * * 100 0 GS HAG PE Figura 5: Valores obtidos de Nitrito plasmático em nM para os grupos GS, HAG e PE. 46 Discussão Características clínicas É sabido que fatores étnicos/genéticos (Tanaka et al. 2007, Sandrim 2008), tabagismo (Pryor 1993), obesidade e diabetes (Sibai et al. 2000; Rosenberg et al. 2005), doenças inflamatórias (Greer, Lyall et al. 1994) e até mesmo a idade (Horta 2007) são considerados interferentes nos processos patológicos em estudo (estresse oxidativo e disfunção endotelial). Todos estes potenciais interferentes foram considerados para definirmos os critérios de inclusão/exclusão das pacientes. Nenhuma das características clínicas observadas para os grupos (tabela1) diverge das que já estão estabelecidas para as doenças hipertensivas gestacionais (Vasconcelos 2002). Marcadores de estresse oxidativo Várias evidências apontam o estresse oxidativo como fator presente nos eventos fisiopatológicos da pré-eclâmpsia (Raijmarkers 2004; Redman 2005; Baumwell and Karumanchi 2007). Neste contexto, inúmeros estudos avaliam os marcadores que refletem, com suas devidas limitações, estes processos, dentre os quais está o teste MDA-TBARS, cuja simplicidade de execução, reduzido custo e confiabilidade contribuem para a difusão e freqüência de sua utilização (Grupta et al 2004, 2005). 47 Os resultados obtidos no nosso trabalho demonstraram não haver diferenças entre os grupos para o teste MDA-TBARS, assim como demonstrado anteriormente por Llurba 2004, Morris 1998, Diedrich et al. 2001 e Raijmaker et a 2001, Yaninik et AL 1999). Em contra-partida outros trabalhos encontraram diferenças significativas entre os grupos: Orhan et al 2001 e Uoitila et al. 1993 encontraram, respectivamente, valores de MDA 34% e 70% superiores em PE em relação ao grupo controle de gestantes normotensas, enquanto Mistry et al 2008 encontrou valores 2,6 vezes maiores comparando grupos similares. Entretanto, a metodologia utilizada na avaliação do MDA pode sofrer variações. O teste MDA-TBARS, por exemplo, pode ser executado com a utilização de métodos espectrofotométricos ou por HPLC, este último, por ser mais preciso, minimiza a o impacto dos interferentes (Costa et al 2006). O MDA também pode ser avaliado independentemente do teste TBARS e geralmente, sua mensuração também é feita mediante uso da técnica HPLC. Ao revisarmos a literatura percebemos que a maioria dos resultados nos quais os valores de MDA não diferiam entre os grupos foi feita através da técnica MDATBARS. O teste MDA-TBARS, entretanto, é de certo modo inespecífico, uma vez que o ácido tiobarbitúrico, seu principal reagente, reage não somente com o MDA, mas também com pigmentos da bile, aminoácidos e açúcares e outros fatores interferentes (Costa et al 2006). Possivelmente, o efeito destes interferentes pode ter levado aos resultados inconclusivos. Outro fator sempre levado em consideração é a possibilidade de diferença entre os resultados de cada laboratório, a acurácia técnica da equipes laboratoriais e as diferenças entre materiais e equipamentos utilizados na execução das mesmas. 48 O tempo de armazenamento das amostras e o cuidado ao manuseá-las também são fatores importantes para a confiabilidade do teste em questão. Minimizam, inclusive, que ocorra a auto-oxidação do plasma. Morris et al, utilizou por exemplo plasma citrado tratado com hidroxitolueno para evitar que a auto oxidação ocorresse. Em nosso estudo, as amostras, após coletadas, foram cuidadosamente armazenadas de modo que fosse minimizada ao máximo sua degradação. Ao considerarmos a heterogeneidade dos sujeitos e desenho dos estudos, podemos perceber que cada um avalia populações distintas. Grupos formados por sulafricanas (Raijmaker et al 2004), espanholas (Llurba 2004) e holandesas(Diedrich et al 2001) e inglesas (Morris et al 1998) não demonstraram diferenças nos valores de MDA, enquanto outros grupos formados por mulheres turcas, por exemplo, apresentarem (Yanik et al, 1999; Noyan et al 2006). Devemos, portanto, considerar diversos fatores potenciais interferentes como alimentação, genéticos, de idade e até mesmo metodológicos. Outro marcador de dano lipídico, os isoprostanos (8,12-iso-iPF(2alpha)VI), considerado mais preciso por ser produzido mais prontamente durante a peroxidação lipídica e mais estável (ver esquema 1) também apresenta contradições com relação a dosagens em doenças hipertensivas da gravidez, sendo que Regan 2001 e Morris 1998 não observam diferenças entre os grupos, enquanto recentemente Bazavilvaso-Rodríguez (2011) demonstra aumento deste biomarcador em PE. Este cenário contribui para indefinições com relação ao aumento ou não de síntese de componente oxidantes na PE. Entretanto, outro marcador formado em etapa anterior da quebra lipídica (ver esquema 1) os hidroperóxidos de lipídeos, apresenta-se concentrações elevadas na maioria dos estudos que avaliam dano lipídico em PE. Foi sugerido por Llurba 2004, inclusive, que ao serem formados, os hidroperóxidos de lipídios podem atuar como 49 gatilho para o estímulo da atividade de agentes antioxidantes de origem enzimática ou não na circulação sanguínea resultando numa reação do organismo materno frente ao dano oxidativo. Nosso trabalho demonstra haver aumento significativo dos dois marcadores de atividade antioxidante do plasma MTT e FRAP no grupo PE em relação ao grupo GS sugerindo haver forte resposta antioxidante do plasma materno, além de indicar provável produção excessiva de radicais livres. Com relação às enzimas antioxidantes do plasma, a maioria dos estudos avaliam enzimas (SOD, glutationa, etc) ou antioxidantes (vit C, vit E, etc) de maneira isolada (Mutlu-Torkogiu et al 1998; Yaninik et al 1999, Panburana El alMadazli et al 2001 ) e poucos trabalhos avaliaram a atividade antioxidante total do plasma (Harma 2005, Harsem et al 2006), sendo apenas um utilizando a técnica de FRAP (Harsem et al 2006) e nenhum trabalho na literatura apresenta dados utilizando MTT. Com relação ao FRAP, os dados corroboram com os nossos achados, demonstrando aumento da atividade em PE comparada a GS. Nenhum trabalho investigou esses biomarcadores em HAG. De maneira interessante os dois marcadores de atividade antioxidante apresentaram resultados semelhantes, dando suporte a sugestão do aumento dessa atividade em PE e HAG. Apesar do aumento da atividade antioxidante do plasma e balanceamento da produção de marcadores de estresse oxidativo, os níveis de nitrito plasmático nessas gestantes apresentam valores significativamente mais baixos comparados às gestantes saudáveis, demonstrando a disfunção endotelial característica dessas doenças o que contribui para o aumento da pressão sanguínea observada nesses grupos, uma vez que o NO é o principal fator responsável pela manutenção do sistema vascular (Forsterman 2008; Moncada e Higgs 1993). Os níveis reduzidos de nitrito, apesar de um possível equilíbrio da produção e captura de radicais livres, indica que outros 50 fatores, além do estresse oxidativo poderiam estar contribuindo para reduções da biodisponibilidade de NO. Entre estes fatores podemos citar a presença de altos níveis circulantes de hemoglobina plasmática que capturam o NO, como já demonstrado por nosso grupo (Sandrim et al 2010a) e a presença de altos níveis de ADMA plasmático em PE que podem competir com seu inibidor endógeno (L-arginina) reduzindo o acoplamento da eNOS e conseqüentemente sua atividade produzindo menos NO (Sandrim et al 2010b e Savvidou et al 2003). Resumo dos Resultados Com os dados apresentados nesse trabalho podemos fazer as seguintes conclusões e implicações: - Gestantes com doenças hipertensivas da gravidez não apresentam aumentos significativos de MDA-TBARS, um marcador de peroxidação lipídica; - Gestantes com doenças hipertensivas da gravidez apresentam aumentos significativos da atividade antioxidante do plasma, sugerindo um mecanismo de defesa em contrapartida a aumentos de radicais livres produzidos; - Gestantes com doenças hipertensivas da gravidez apresentam níveis reduzidos de nitrito, um marcador clinicamente relevante para avaliar a biodisponibilidade de NO, um potente vasodilatador. Esses dados sugerem que outros mecanismos devem contribuir para disfunção endotelial e redução de NO observada nessas gestantes. 51 CONCLUSÕES Neste trabalho não encontramos indícios de alterações para o marcador de dano lipídico MDA-TBARS. No entanto, marcadores de resposta anti-oxidante do plasma MTT e FRAP demonstram haver forte resposta fisiológica antioxidante frente ao dano oxidativo iminente para os grupos representantes das doenças hipertensivas da gravidez. Além disto, o marcador de biodisponibinidade de NO, nitrito plasmático, encontra-se reduzido nos grupos citados. Isto demontra que, apesar de o NO poder ser sequestrado pelo estresse oxidante, outros mecanismos estão envolvidos em sua depleção. Referências Abreu D, Medina LO, Veloso CA, Isoni CA, Calsolari MR, Chaves MM. “Determination of the antioxidant status of plasma from type 2 diabetic patients”. Evaluation. 77193-197 (2007) Anumba, D. O., S. C. Robson, R. J. Boys, and G. A. Ford. Nitric oxide activity in the peripheral vasculature during normotensive and preeclamptic pregnancy. Am J Physiol. 277(2 Pt 2):H848-54. (1999). Baumwell S and S. A Karumanchi (2007). “Pre-Eclampsia: Clinical Manifestations and Molecular Mechanisms”. 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ANEXO 1 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO - ESTUDO Projeto: “Farmacogenética do tratamento anti-hipertensivo de pacientes com préeclâmpsia: relevância do haplótipo da eNOS 58 Responsáveis: - Prof. Dr. José Eduardo Tanus dos Santos (FMRP-USP) – CREMESP 84.966 Prof. Dr. Ricardo de Carvalho Cavalli – CREMESP 91.680 Dra. Valéria Cristina Sandrim Você está sendo convidada a participar de um estudo cujos detalhes são: 1) Este projeto pretende estudar se a Sra/Srta apresenta algumas diferenças em alguns dos seus genes (que são responsáveis pela transmissão de suas características hereditárias, que passam de pais para filhos) que poderiam contribuir para o desenvolvimento da pré-eclâmpsia (pressão alta na gravidez) e na resposta aos medicamentos utilizados no tratamento desta doença. Além disso, pretendemos estudar como estas diferenças nos genes podem modificar as concentrações de substâncias importantes no controle da sua pressão sanguínea. Estes dados poderão nos auxiliar no entendimento das alterações cardiovasculares que acontecem durante a gravidez e na obtenção de marcadores genéticos de desenvolvimento da préeclâmpsia. 2) Sua participação neste estudo será: Serão retirados, no máximo, 30 mL do seu sangue, coletados por punção venosa utilizando técnica adequada. Este volume de sangue é cerca de 20 (vinte) vezes menor do que o volume de sangue habitualmente doado quando um indivíduo doa sangue para bancos de sangue. Este sangue será utilizado para realizar todas os estudos bioquímicos e genéticos mencionados acima. Uma segunda coleta de sangue (10 mL de sangue venoso) será realizada caso o seu médico prescreva para o tratamento da pressão alta o medicamento -metildopa. Além disso, caso permita tal procedimento, coletaremos da Sr(a) uma amostra de saliva com o objetivo de avaliaremos a atividade de enzimas importantes na gestação. Com isto, encerra-se a sua participação neste estudo. 3) Você terá direito a ressarcimento financeiro caso haja gastos gerados exclusivamente pela sua participação como voluntário desta pesquisa. 4) Caso haja dano comprovadamente decorrente da pesquisa você terá direito à indenização. 5) NÓS NÃO PODEMOS E NÃO GARANTIREMOS QUE VOCÊ RECEBERÁ QUALQUER BENEFÍCIO DIRETO DESTE ESTUDO. 6) Indiretamente, acreditamos que este estudo trará como benefício um entendimento da fisiopatologia da pré-eclâmpsia, bem como na obtenção de marcadores genéticos de susceptibilidade a pré-eclâmpsia e de resposta à -metildopa. 7) Qualquer dado que possa ser publicado posteriormente em revistas científicas, não revelará a sua identidade. Entretanto, órgãos governamentais ligados à saúde podem solicitar informações a respeito da pesquisa e identidade dos voluntários nela envolvidos. 59 8) Você pode retirar o seu consentimento para participar deste estudo a qualquer momento, inclusive sem justificativas e sem qualquer prejuízo para você. 9) Você terá a garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento de qualquer dúvida a respeito dos procedimentos, riscos, benefícios e de outras situações relacionadas com a pesquisa e o tratamento a que será submetida. Qualquer questão a respeito do estudo ou de sua saúde deve ser dirigida ao Prof. Dr. José Eduardo Tanus dos Santos (telefone 0xx16 3602-3163), do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), ao Dr. Ricardo de Carvalho Cavalli (telefone 0xx16 36022588), do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) ou à Doutora Valéria Cristina Sandrim (telefone 0xx16 36262851, 0xx16 36023329) do Departamento de Farmacologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP). O telefone do Comitê de Ética em Pesquisa da FMRP é 016-3602-2228. Eu, _____________________________________________________________, abaixo assinado, declaro que em ____/____/____ fui devidamente informada em detalhes pelo pesquisador responsável no que diz respeito ao objetivo da pesquisa, aos procedimentos que serei submetido, aos riscos e benefícios, à forma de ressarcimento no caso de eventuais despesas, bem como à indenização quanto por danos decorrentes da pesquisa. Declaro que tenho pleno conhecimento dos direitos e das condições que me foram asseguradas e acima relacionadas. Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que me foram apresentadas e que, livremente, manifesto a minha vontade de participar do referido projeto. Ribeirão Preto, __________ de ______________ de ______. _____________________________ Assinatura do voluntário ____________________________ Assinatura do investigador/testemunha 60
