S. pyogenes

Febre Reumática: Vacina contra o S. pyogenes
para evitar a Febre Reumática
Luiza Guilherme, PhD
Instituto do Coração (InCor)
Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil
[email protected]
2013
S. pyogenes
A resposta imune contra a bactéria, em
indivíduos com suscetibilidade genética,
desencadeia reatividade contra proteínas do
coração - Lesão
Febre Reumática
(3-5% ind. suscetíveis não tratados, 5-18 anos)
Doença Reumática Cardíaca - DRC
•
30-45% dos pacientes – 4 a 8 semanas
•
Lesão valvular – Mitral e/ou Aórtica
•
Estenose / Insuficiência
Narula et. al, 1999
Infecções GAS > 600 milhões casos
WHO 2004
Carapetis J
RHD – 15.9- 19.6 milhões/ano
Carapetis J
Infecções GAS – Mortes no Mundo
~ 500 000/ano
WHO 2005
Febre Reumatica – InCor
São Paulo - 2011
• ~ 600 pacientes ambulatorio / mês
• ~ 2000 pacientes lista de espera - cirurgia valvular
• 38% das cirurgias realizadas : pacientes jovens
CIRURGIAS VALVAR - InCor
1980 - 2004
FR Cirurgias
Numero de Pacientes
Troca Valvular
3873
Plastica Valvular
1131
Total
5004
49.5 % das cirurgias cardiacas realizadas
em 25 anos
Pomerantzeff PMA, Brandao CM , et al. Valve Reconstruction in the Heart Institute of São Paulo, Brazil.; Semin Thorac Cardiovasc Surg, 2002;4: 324-7.
Tratamento da FR/DRC – Custo Annual
(DATASUS-2007)
Tratamento Clínico : US$ 30 000 000.00
Cirurgias : US$ 50 000 000.00
Barbosa PJB, Müller RE, et al , Arq Bras Cardiol, 2009
NH2
N-acetil β-D
glucosamina
S. pyogenes
Goldstein,Zabriskie
1967
Proteina M
B
C
A
D
COOH
Epitopos de Reação Cruzada
com Proteína Humana
Several authors
Kaplan , 1964
“Mimetismo Biológico”
Mecanismo Mimetismo Molecular
Respostas Imune
Celular e Humoral
HLA-DR
HLA-DR
T Cell
Proteina Própria
Peptideo
MHC/Peptideo TCR
APC
Celula T
APC
Peptideo
Proteina M
APC
Febre Reumática : Suscetibilidade Genética
RI Inata
FCN-2 –
Ativa C´ via lectina
Citocinas
SNP
TNF- alfa - Inflamatória
MBL-2- Alelos A / O
TLR-2 - Reconhece patógeno
TGF-beta – Crescimento celular
IL-1 Ra e IL-10
FcRII A – Clearence IgG
RI Adaptiva
Anti-inflamatórias
HLA – Alelos Classe II
Reconhecimento Antigênico pelo Linfócito T
DRC - Reconhecimento Antigênico
PBMC: Proteína M e Proteínas Tecido Cardíaco
80
Respondedores ao peptideo
M5(81-96)
100
60
80
70% pacientes RHD reconhecem
proteinas cardíacas
40
20
0
DR7+
DR7-
DR53+
DR53-
% Responders
Reatividade ( %)
Proteina M5, peptideos: 1-25, 81- 96, 83-103, 163-177
60
Leve DRC
40
controles
20
HLA classe II
0
grave /leve DRC
S grave RDRC
Myoc+ Ao v .
Myoc>150 KDa
Ao v 90-150 kDa
Ao v 65-90 kDa
Ao v 43-65 kDa
Controles
• Guilherme et al, Infect Immun, 2001
Valvulite Reumática – v. Mitral
Vegetações
Fase Aguda– 67%
Fase Crônica – 20 a 30%
20
• Vimentina
• Colageno VI
• Lumican
SI
10
IE
Clone Intralesional cel T
Martins, C et al, Submetido 2013
Guilherme,L et al, J. Autoimmunity, 2001
Guilherme,L et al, Circulation 1995
0
PepM5 (81-96)
v. Ao 90-150kDa
Th1- TNFa, IFN g
Th17- IL17
IL-23
Citocinas
DRC
Válvula
Miocárdio
Reguladoras
• IL-10
• IL-4
Valvar Tissue
>10% IL4
18%
<10% IL4
82%
Myocardium
<10% IL4
22%
* P < 0.02; O.R. = 15.8
• Progressão das lesões
>10% IL4
78%
• Dano valvular Permanente
Guilherme L, et al,
Am J Pathol, 2004
Sangue Periférico: CélulasT reguladoras da Inflamação
CD4+CD25+FoxP3+
20
Marcadores Celulares de celsT-reg
(FACs)
p= 0.0328
15
CD4+FoxP3+CD62L+
5
5
PBMC - Pencentual (%)
PBMC - Pencentual (%)
10
4
3
2
1
8
p= 0.0270
6
4
2
0
0
RHD
HD
RHD
HD
Fae K, Guilherme L et al , em preparo
Estratégia para a produção de uma vacina
segura e eficaz contra o S. pyogenes para
prevenir FR/DRC
Desenvolvimento Vacina contra o S. pyogenes
Proteína M – Região C-terminal
Região Idêntica
253
KGLRRDLDASREAKKQLEAEQQ279 epitopo T
288 EASRKGLRRDLDASREAKKQVEKA 312 epitope B
PepVac – StreptInCor 55 aa
253KGLRRDLDASREAKKQLEAEQQKLEEQNKISEASRKGLRRDLDASREAKKQVEKA312
RNM
Epitopo B
(31-55 aa)
PDB ID 2KK9
RCSB 101224
Patentes INPI – 0501290 / 0604997-4,
Epitopo T
PCT-BR07/000184
(1-22 aa)
Guilherme L, Kalil, J, et al, Clin Dev Immunol, 2006,
Methods, 2009, J Biol Chem, 2011
HLA Classe II – Predição de Ligação
253KGLRRDLDASREAKKQLEAEQQKLEEQNKISEASRKGLRRDLDASREAKKQVEKA312
A
E
C
B
F
G
D
Guilherme et al, J Biol Chem 2011
Afinidade
P1 - L, I
P4 - D, S, E, A, Q, N
P6 - D, E, Q, R,
P9 - R, K, E, L,
Predição de ligação
Reatividade Humoral e Celular
HLA
Class II molecules
DRB1* 01
DRB1* 02
DRB1* 03
DRB1* 04
DRB1* 11, 12
DRB1* 13, 14
DRB1* 07
DRB1* 08
DRB1* 09
DRB1* 10
DRB5*
DRB3*
DRB4*
1
Overlapping Peptides Recognized
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
≥ 50%
30-49%
29-10%
≤10%
Neg
Guilherme et al, J Biol Chem, 2011
Adesão -
Inibição Adesão/Invasão, soro humano
S. pyogenes
S. pyogenes
Inibição Adesão/Invasão
%
M5
99.0
M6
99.0
M44/61
98.0
M87
97.0
M1
90.0
M71 and M22
70.0
UFC sem soro > 200.000
Soro individuos normais, epitopo B reativos
“StreptInCor” será vacina segura ?
Controle Autoimunidade Vacina com Linhagens T das lesões cardíacas de
pacientes com Doença Reumática Cardíaca
StreptInCor
Variospeptideos)
Clones T
N=49
( 5 Linhagens)
Linhagens T *
N=29
%
%
Negative
23/29
79.3
42/49
85.7
Positive
6/29
20.7
7/49
14.3
IL-10
*
14 válvulas e 15 miocárdio – Linhagens T
Oshiro S, Guilherme L, et al, em Preparo
Cels
T-Reg ?
StreptInCor : EfeitoTerapêutico?
Cels T reguladoras: sangue periferico de pacientes com DRC
CD3+ CD4+ CD25high CD127- Foxp3+
P = NS
100000
StreptInCor
P = 0.0341
Absolute number of cells
Citometria
Fluxo
(vacina candidata )
10000
P = 0.0181
Aumenta número
1000
\
100
T Reguladoras
Naturais
r
co
D
H
R
H
D
10
ug
/m
lS
tr
ep
t In
R
H
D
10
Köhler KF, Guilherme L, et al , em Preparo
Celulas
Análise Experimental
•Camundongos (Balb-C, C57BL6, Swiss,
Transgênicos para HLA- classe II)
•Mini porcos (25-30Kg)
Inibição Adesão/Invasão
Adesão -
S. pyogenes
S. pyogenes - M1
Soro de Camundongos Imunizados StreptInCor
Inibição Adesão/Invasão
BALB/c (N=5)
95.0 %
C57BL6 (N=7)
92.0 %
Swiss (N=3)
98.5 %
CFU sem soro > 200.000
Opsonofagocitose com Células Peritoneais de
Camundongo Balb/C
De Amicis, KM, Guilherme L, Vaccine, 2013
S. pyogenes: Sobrevida pos-vacinação
(StreptInCor + ALUM)
Swiss (n=15)
Sobrevida %
0.05
1x107 bacteria
I.P
10 µg StreptInCor
Controles.
Log rank test
Postol, E; Guilherme L, Plos One, 2013
Resposta Humoral Camundongos HLA- classe II Tg aos
Peptideos Compartilhados “StreptInCor”
Overlapping Peptides
Sequences
(20 aa residues)
Transgenic Mice Bearing HLA Class II Alleles
Humoral Immune Response (IgG)
DR2
DR4
DQ6
DQ8
KGLRRDLDASREAKKQLEAE
6+/6
5+/6
2+/6
5+/6
KGLRRDLDASREAKKQVEKA
5+/6
5+/6
3+/6
4+/6
GLRRDLDASREAKKQVEKAL
5+/6
5+/6
2+/6
3+/6
LDASREAKKQLEAEQQKLEE
4+/6
5+/6
3+/6
6+/6
KLEEQNKISEASRKGLRRDL
5+/6
4+/6
3+/6
5+/6
KISEASRKGLRRDLDASREA
5+/6
2+/6
2+/6
3+/6
SEASRKGLRRDLDASREAKK
5+/6
4+/6
3+/6
5+/6
ASRKGLRRDLDASREAKKQV
4+/6
4+/6
1+/6
2+/6
Guerino, T; Guilherme L, Vaccine, 2011
Vacina não
induz
autoimunidade
A- Coração
B, C, D – v. Tri, Mi, Ao
E- Articulações
F- Rim
1 ano pós- vacinação
G - Baço
em modelo animal
transgênico
HLA – classe II
Humano
H - Cérebro
I - Fígado
Guerino, T; Guilherme L, et
al, Vaccine, 2011
• Ensaio Clínico Fase I/IIa – 2013 / 2014
Desenho do Estudo
• Randomizado, duplo-cego controlado com placebo: Doses
sequenciais do StreptInCor (50 µg, 100µg, 200 µg - 2 doses com
28d intervalo); 6 meses reforço.
• Voluntários sadios: indivíduos sem doença confirmada ou
infecção que possa comprometer a resposta imune, idade entre
18 e 45 anos.
Prof. Luiza Guilherme, Farm,PhD, Líder grupo Febre Reumatica
Prof Jorge Kalil, MD,PhD Diretor do Lab Imunologia,Instituto Coração
RF/RHD Mecanismos da Patogenese
Kellen Cristhina Faé, PhD
Rajendranath Ramasawy,PhD
Ana Flavia Vigna, PhD
Luciana Nogueira, PhD
Sandra Emiko Oshiro, MSc
Carlo Martins, PhD
Nathalia Moreira Santos, MsC
Selma A Palácios
Simone Santos
Instituto Coração, 1. Cardiologia Pediatrica, 2.Valvopatia,
3.Cirurgia e 4. Divisão Patologia
1. Ana C Tanaka, MD
2. Prof Max Grinberg, MD; Prof Flavio Tarasoutchi, MD; Guilherme Spina, MD;
Roney Sampaio,MD
3. Prof Pablo Pommerantzeff, MD, Carlos Brandão, MD
4. Lea Demarchi, MD, Prof Vera D Aiello, MD: Paulo S Gutierrez
Desevolvimento Vacina
Reumatologia Pediatrica, Hospital Clinicas Prof Maria H Kiss, MD,
Claudio R Puschel, PhD – Sintese Peptideo
Clovis A Silva, MD
Washington R Silva
Samar F Barros, PhD – Biologia Molecular, Microbiologia
Raquel Alencar, MSc
Karine Marafigo De Amicis, MsC
Karen Kohler, PhD Imunologia Celular
Leticia Chaves, MSc – Resposta Humoral
Edilberto Postol, PhD – Experimental
Fabio T Higa
Milton T.G. Silva, MsC
Luiz R Mundel
Frederico Moraes Ferreira, PhD- Análise Estrutural
Colaboradores – Lab Imunologia
Prof Edecio Cunha-Neto, MD,PhD
Veronica Coelho, MD,PhD
HospitalSaint Louis, Paris, France –RCT, CelsTreg
Prof Dominique Charron, MD,PhD; Prof Antoine Toubert, MD,PhD
Universidade Oklahoma, Oklahoma, USA – Estudos Miosina
Cardiaca
Prof Madeleine W Cunningham, PhD
Instituto Finlay, Havana, Cuba –Adjuvante Mucosa
Prof Oliver Perez Martin, MD; Miriam Lastre, MD; Caridad Zayas
Clinica Mayo Rochester, USA, Camundongos Tg HLA-classe II Prof
Chella David, MD,PhD
Agua – viva, Luiza Guilherme 2013