TESE PARTE PRÉ-TEXTUAL FABRICIO - Cópia

 UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
ESTUDO DOS POSSÍVEIS EFEITOS GENOTÓXICOS EM TRABALHADORES DE
CURTUME EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS CONTENDO CROMO III EM
TERESINA-PI
FABRÍCIO PIRES DE MOURA DO AMARAL
FORTALEZA
2012
FABRÍCIO PIRES DE MOURA DOAMARAL
ESTUDO DOS POSSÍVEIS EFEITOS GENOTÓXICOS EM TRABALHADORES DE
CURTUME EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS CONTENDO CROMO III EM
TERESINA-PI
Tese submetida à Coordenação do Programa de
Pós-Graduação em Farmacologia, do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia, da Faculdade de Medicina, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para
obtenção do grau de Doutor em Farmacologia, área de
concentração em Farmacologia Clínica.
Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes
FORTALEZA
2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde A514e Amaral, Fabrício Pires de Moura do. Estudo dos possíveis efeitos genotóxicos em trabalhadores de curtume expostos a substâncias químicas contendo cromo III em Teresina-­‐PI / Fabrício Pires de Moura do Amaral. – 2012. 113f. : il. color., enc. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-­‐Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2012. Orientação: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes. 1. Cromo. 2. Curtume. 3. Genotoxicidade. I. Título. CDD 615.1
FABRÍCIO PIRES DE MOURA DO AMARAL
ESTUDO DOS POSSÍVEIS EFEITOS GENOTÓXICOS EM TRABALHADORES DE CURTUME
EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS CONTENDO CROMO III EM TERESINA PIAUÍ.
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia,
do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, da Faculdade de Medicina, da
Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Farmacologia, área de concentração em Farmacologia Clínica.
Aprovada em de 2012
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________
Prof. Dr Manoel Odorico de Moraes
Universidade Federal do Ceará - UFC
__________________________________________________
Prof.a Dr.a Maria Elisabete Amaral de Moraes
Universidade Federal do Ceará - UFC
__________________________________________________
Prof.a Dr.a Gisela Costa Camarão
Universidade Federal do Ceará – UFC
__________________________________________________
Prof. Dr. Luciano da Silva Lopes
Universidade Federa do Ceará
‘
__________________________________________________
Prof.a Dr.a Raquel Carvalho Montenegro
Universidade Federal do Pará
DEDICATÓRIA
DEDICATÓRIA
À minha esposa Elna Joelane Lopes da Silva do
Amaral, mulher da minha vida.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
Esta conquista só pôde ser possível graças a ajuda de diversos colegas e
instituições. Tenho em mente a certeza que não obteria nenhum resultado positivo
se não houvesse estas contribuições. Infelizmente, não conseguirei expressar toda a
minha gratidão, mas as palavras que aqui se encontram são, de fato, sinceras e
verdadeiras.
Agradeço primeiramente a Deus, senhor de nossa vida e guardião de
nossos atos.
Aos meus filhos, Artur e Álvaro razões de minha existência.
Ao meus pais José Osmar do Amaral e Sofia Amélia Pires de Moura do
Amaral, pelo exemplo de ética, lealdade e dedicação à família.
Á Tatiana Chaves e TODA sua família. Sem você e sua força
trabalho não teria sido realizado. Gratidão eterna.
este
Ao Benedito Júnior, pela extrema competência e amizade.
Ao Osvaldo Bonfim, Ronaldo Costa, Ana Cleide e a toda a equipe do
LACEN-PI pela colaboração na realização dos exames laboratoriais.
À professora Dra. Ana Amélia Melo por todo seu ensinamento transmitido.
Estes serviram de base para minha formação pessoal.
A Sarah Izabelly (Sarinha). Esta vitória também é sua.
Aos professores Dra. Elisabete Moraes e Dr:Odorico de Moraes da
Universidade Federal do Ceará por confiarem em mim. Não os decepcionarei, pois
agora que começaremos a colher os frutos e espero que estes sejam os melhores já
colhidos.
À Dra Fátima e toda sua equipe do laboratóro de Toxicologia/setor metais
da FIOCRUZ pela contribuição nas análises de cromo na urina.
Á Fábia Beserra, Maria Teresa Rocha, Flávia Martins e Aura Rhanes pela
amizade,delicadeza e presteza dispensadas em todo decorrer dos anos.
À Secretaria do Estado da Saúde do Piauí pelo apoio institucional.
A FINEP, MCT, MS, FUNCAP, CNPq, CAPES e Instituto Claude Bernard
(InCB), pelo incentivo no desenvolvimento da pesquisa nacional.
Aos trabalhadores do curtume, pela gentileza em contribuir na pesquisa de
campo.
Obrigado por tudo!
EPÍGRAFE
EPÍGRAFE
"Uma mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho
original."
Albert Einstein
RESUMO
RESUMO
ESTUDO DOS POSSÍVEIS EFEITOS GENOTÓXICOS EM TRABALHADORES DE CURTUME
EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS CONTENDO CROMO III EM TERESINA-PI. Fabrício
Pires de Moura do Amaral. Orientador: Manuel Odorico de Moraes. Tese de Doutorado. Programa de
Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2012.
A exposição ocupacional em ambientes de curtumes tem sido objeto de estudo e de investigações
científicas. As informações controversas sobre a toxicidade do cromo III e sua relação com a
epidemiologia do curtume serviram de subsídio para esta pesquisa. O objetivo deste estudo foi avaliar
os possíveis efeitos genotóxicos e mutagênicos da exposição de trabalhadores de curtume de
Teresina (PI) à substâncias químicas contendo cromo III através do uso de biomarcadores de danos
ao DNA e aos cromossomos.Trata-se de uma investigação transversal, observacional e quantitativa.
Foram coletadas amostras de mucosa, sangue e urina de 43 trabalhadores de curtume para análise
de micronúcleo em mucosa (20 trabalhadores), micronúcleo em linfócitos (30 trabalhadores), cometa
em mucosa (20 trabalhadores), cometa em linfócitos (43 trabalhadores), aberrações cromossômicas
(30 trabalhadores) e mensuração de cromo na urina (27 trabalhadores) . As mesmas análises foram
realizadas em trabalhadores não expostos ao ambiente do curtume, para fins de comparação
estatística. Além disso, foi aplicado um questionário de saúde pessoal recomendado pela
International Comission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens-ICPEMC
com intuito de correlacionar suas informações aos dados obtidos nos testes. Os resultados indicaram
aumentos significativos (p<0,05) do número (8,100 ± 3,905 vs1,200± 1,609) e frequência de
micronúcleo em mucosa (0,403± 0,1513vs 0,060± 0,04887), do número (17,73 ± 9,44vs10,90± 7,092)
e frequência de micronúcleos em linfócitos(0,886± 0,472vs 0,306± 0,202), para o total (16,3± 3,38 vs
0,60 ± 0,16) e frequência (8,01 ± 1,82 vs 0,403± 0,09) de aberrações cromossômicas(teste T
Student). Além disso, foi observado aumento sigficativo (ANOVA p<0,05 ) para o todas as classes de
danos e frequência de danos no teste de cometa em mucosa e em linfócitos. O cromo na urina
indicou que os trabalhadores estavam com maior concentração deste metal na urina que os não
expostos (p<0,05 ) ( 1,108 ± 1,277vs 0,089 ± 0,027). As correlações (Pearson) entre o cromo na
urina e as análises genotóxicas indicaram forte relação positiva com a frequência de aberrações
cromossômicas (r=0,841 p= 0,018 ) e frequência de micronúcleo em linfócitos (r=0,730 p <
0,0001).Conclui-se que os trabalhadores de curtume apresentam riscos de toxicidade e de
instabilidade genética associados à exposição ocupacional a misturas químicas contendo crmo III.
Palavras-chaves: Cromo. Curtume. Genotoxicidade.
ABSTRACT
ABSTRACT
Study of the possible genotoxic effects of chemical substances containing chromium
III to Tannery Workers in Teresina, PI. Fabrício Pires de Moura do Amaral. Advisor:
Manuel Odorico de Moraes. Doctoral Thesis. Postgraduate Program in Pharmacology.
Department of Physiology and Pharmacology, UFC, 2012.
Occupational exposure in tannery environments has been the subject of study and scientific
research. Controversial information about the toxicity of chromium III and its relationship with
the epidemiology of the tannery employees served as a subsidy for this research. The
objective of this study was to evaluate the possible genotoxic and mutagenic effects of the
exposure of tannery workers in Teresina (PI) to chemicals containing chromium III through
the use of biomarkers of DNA and chromosomal damage. This was a cross-sectional,
observational and quantitative study. Samples were taken from the mucosa, blood and urine
of 43 tannery workers to analyze mucosal micronuclei (20 workers), lymphocytic micronuclei
(30 workers), mucosal comet assays (20 workers), lymphocytic comet assay (43 workers)
and chromosomal aberrations (30 workers); the level of urinary chromium was also
measured (27 employees).The same analyses were carried out in non-exposed workers of
the tannery environment for statistical comparison. In addition, personal health
questionnaires were administered as recommended by the International Commission for
Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens-ICPEMC with the aim of
correlating their information with data obtained in the tests. The results indicated significant
increases (p <0.05) in: the number (8.100 ± 3.905 vs 1.200 ± 1.609) and frequency (0.403 ±
0.060 vs. 0.1513 ± 0.04887) of mucosal micronuclei; the number (17.73 ± 9.44 vs 10.90 ±
7.092) and frequency (0.886 ± 0.472 vs 0.306 ± 0.202) of lymphocytic micronuclei; and the
total (16.3 ± 3.38 vs 0.60 ± 0.16) and frequency (8.01 ± 1.82 vs 0.403 ± 0.09) of
chromosomal aberrations (Student’s t test). There was a significant increase (ANOVA, p
<0.05) for all types of damage and frequency of damage to the mucosal and lymphocytic
COMET assay. Urine chromium levels was higher in exposed workers than in non-exposed
workers (p <0.05) (1.108 ± 1.277 vs 0.089 ± 0.027).Pearson correlations between the level of
chromium in the urine and genotoxic analyses indicated a strong positive correlation with the
frequency of chromosomal aberrations (r = 0.841, p = 0.018) and frequency of lymphocytic
micronuclei (r = 0.730, p <0.0001). It was concluded that the tannery workers are at risk of
toxicity and genetic instability associated with occupational exposure to chemical mixtures
containing chromium III. Keywords: Chromium. Tannery. Genotoxicity. SUMÁRIO
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 20
1.1.Saúde versus risco ocupacional
20
1.2. Curtume : processo industrial
22
1.3. Epidemiologia do curtume
23
1.4. Exposição a agentes químicos diversos - evidências e contradições
sobre a toxicidade do cromo III
25
1.5. Cromo : aspectos químicos e bioquímicos
27
1.7.Toxicologia do cromo - toxicocinética
29
1.7.Toxicologia do cromo – toxicodinâmica
31
1.8.Bases da instabilidade genética e mutações
33
1.9. Monitorização biológica
1.10. Biomarcadores
1.11.Biomarcadores de genotoxicidade e de mutagenicidade utilizados
34
35
36
como forma de biomonitoramento
1.12.Teste de micronúcleos
36
1.13.Teste de micronúcleos em mucosa bucal
37
1.14.Teste de micronúcleos com bloqueio de citocinese
38
1.15.Teste de aberrações cromossômicas
40
1.16.Teste do cometa
1.17.Avaliação da exposição
42
43
1.18.Fatores não ocupacionais que podem interferir nas análises
genotóxicas
1.18.1.Idade e gênero
46
46
1.18.2.Tabagismo
47
1.18.3.Etilismo
48
1.18.4.Vitaminas e sais minerais
48
2. JUSTIFICATIVA
50
3.OBJETIVOS
51
3.1.Objetivo geral:
52
3.2.Objetivos específicos:
52
4. METODOLOGIA
53
4.1. Delineamento experimental
54
4.1.1. tipo de estudo
54
4.1.2.caracterização dos grupos de estudos
54
4.1.3.critérios de inclusão e exclusão
55
4.1.4.procedimento de coleta
55
4.1.5.coleta e transporte das amostras
56
4.1.6.coleta urinária para análise de cromo
56
4.2. Avaliação Genotóxica
58
4.2.1.teste do cometa em células de mucosa bucal
58
4.2.2.Teste do cometa em linfócitos de sangue periférico
60
4.3.Avaliação mutagênica
4.3.1.teste de micronúcleos
62
62
4.3.1.1.teste de micronúcleo em células esfoliadas de epitélio bucal
63
4.3.1.2.Teste de micronúcleos com bloqueio de citocinese
64
4.3.2.teste de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos
64
4.3.3.Dosagem do cromo na urina
66
4.4. Aspectos Éticos
67
4.5. Análise Estatística
68
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
70
5.1. Características do curtume estudado e perfil do grupo de
70
trabalhadores expostos versus não expostos
5.2. Análises de Genotoxicidade
76
77
5.2.1. teste do cometa em células esfoliadas de mucosa bucal
78
5.2.2. teste do cometa em células sanguíneas (linfócitos)
5. 2.3 Análises das alterações cromossômicas
81
5.2.4.contagem de micronúcleos em células binucleadas de linfócitos
85
utilizando citocalasina b para bloqueio de citocinese (CbMN)
5.2.4.1 Correlação entre frequência de aberrações cromossômicas e
87
frequência de micronúcleos em células binucleadas
5.2.4.2 análise de regressão linear entre a frequência de aberrações
cromossômicas
e
a
frequência
de
micronúcleos
em
células 89
binucleadas.
5.2.5. análise do número de micronúcleos em mucosa bucal
5.2.6.
mensuração
de
cromo
na
urina
(Cr-U)
90
através
de
espectrofotometria de absorção atômica com forno de grafite
92
5.3. Correlações entre os fatores não ocupacionais e os dados 96
genotóxicos
5.4. Correlações entre os valores de cromo na urina e os resultados das
97
análises genotóxicas
5.4.1 Análise de regressão linear
genotóxicos)
6.CONCLUSÃO
(cromo na urina e resultados
98
102
103
7. RECOMENDAÇÕES
8.REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
107
ANEXO I – CARTA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ.
117
ANEXO
IIQUESTIONÁRIO
DE
SAÚDE
PESSOAL
APLICADO
A
TRABALHADORES EXPOSTOS E NÃO EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS
CONTENDO CROMO III
118
ANEXO III: FICHAS DE AVALIAÇÃO DOS TESTES GENOTÓXICOS E
MUTAGÊNICOS
127
19
INTRODUÇÃO
20
1. INTRODUÇÃO
1.1.Saúde versus risco ocupacional
A relação trabalho e saúde ainda se deflagra como um paradigma
atual, sendo objeto de constantes reflexões e transformações. Mesmo com todos
os esforços existentes, ainda são alarmantes os registros de acidentes no
trabalho e doenças relacionadas às atividades laborais (Schulte et al., 2013).
Embora as inovações tecnológicas tenham reduzido a exposição a
alguns riscos ocupacionais em determinados ramos de atividade, contribuindo
para tornar o trabalho nesses ambientes menos insalubre e perigoso, constata-se
que, paralelamente, outros riscos são gerados (Landsbergis et al., 1013). A
difusão de novas tecnologias na área da química fina, na indústria nuclear e nas
empresas de biotecnologia que operam com organismos geneticamente
modificados, por exemplo, acrescentam novos e complexos problemas para o
meio ambiente e a saúde pública. Esses riscos são ainda pouco conhecidos,
sendo, portanto, de controle mais difícil (Shepard, 2013).
Os riscos apresentados pelos produtos químicos, de modo geral,
dependem de sua reatividade. Não é possível estabelecer uma regra geral que
garanta a segurança no manuseio de todas as substâncias químicas. É
necessária uma avaliação considerando não só as características físico-químicas,
a reatividade e a toxicidade, como também as condições de manipulação, as
possibilidades de exposição do trabalhador e as vias de penetração no
organismo. Soma-se a isso a disposição final do produto químico, sob a forma de
resíduo e os impactos que pode causar no meio ambiente (DeMatteo et al., 2012;
Flack e Nylander-french, 2012).
Não é novidade os episódios de intoxicação e mortes acidentais em
ambientes onde a atividade laboral depende da manipulação de agentes
químicos. A exemplo temos os agricultores, os trabalhadores de indústrias de
tintas e solventes, além dos trabalhadores da indústria petroquímica (Field e
Withers, 2012; Malaguarnera et al., 2012; Withers, 2012).
Neste contexto, as análises toxicológicas são uma importante
ferramenta para avaliação de intoxicações por substâncias químicas presentes no
21
trabalho. São utilizados para confirmar casos clinicamente suspeitos, detectar
novos casos de exposição, controlar a qualidade dos produtos ou alimentos
potencialmente associados à exposição e controlar os níveis de poluentes nos
ambientes e os níveis biológicos de exposição aos agentes patogênicos (Agrawal
e Rennert, 2012; Beketov e Liess, 2012; Wyman, 2012).
A monitorização biológica de trabalhadores expostos a substâncias
químicas potencialmente lesivas para a saúde, por meio da realização de exames
toxicológicos, é importante para os procedimentos de vigilância. A legislação
trabalhista, por meio da Norma Regulamentadora (NR) n.o 7, da Portaria/MTb n.o
3.214/1978, e seus complementos, estabelece as situações, as condições e os
parâmetros ou indicadores biológicos, para sua realização e interpretação. Entre
esses parâmetros estão o Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP) e o Valor de
Referência da Normalidade (VRN) (Mendes e Dias, 1991; Aúde, 2004).
Dentre vários ambientes laborais e sua complexa relação saúde
trabalho, destaca-se o ambiente do curtume. No curtume se faz o curtimento, que
é a produção de couro a partir de peles de animais, um subproduto da indústria
de carne (Mikoczy e Hagmar, 2005; Rastogi, Pandey e tripathi, 2008; FigueiredoSganderla,Prodanov e Daroit, 2010) .
O processo de curtimento de peles é complexo e objetiva a
transformação de um produto natural de forma a torná-lo imputrescível e a
conferir-lhe propriedades apropriadas (resistência, maciez e textura) para a
utilização na fabricação de produtos de uso comum. Infelizmente, esta atividade
industrial gera resíduos químicos tóxicos
para o ambiente extremamente
perigosos, frutos de suas etapas produtivas (FIGURA 01) (Pacheco, 2005).
22
Figura 01. fluxograma esquemático de um curtume, indicando formação de
resíduos diversificados Fonte: Pacheco (2005).
1.2. Curtume : processo industrial
De forma geral, couro é uma pele animal que passou por processos de
limpeza, de estabilização (dada pelo curtimento) e de acabamento, para a
confecção de calçados, peças de vestuário, revestimentos de mobília e de
estofamentos de automóveis, bem como de outros artigos (Pacheco, 2005).
O processo de transformação de peles em couros é normalmente
dividido em três etapas principais, conhecidas por ribeira, curtimento e
acabamento (FIGURA 01). O acabamento, por sua vez, é usualmente dividido em
“acabamento molhado”, “pré-acabamento” e “acabamento final” (Pacheco, 2005).
Os curtumes são normalmente classificados em função da realização
parcial ou total destas etapas de processo. Desta forma, tem-se os seguintes
tipos de curtumes:
-curtume integrado: capaz de realizar todas as operações desde o
couro cru (pele fresca ou salgada) até o couro totalmente acabado.
- curtume de “wet-blue”: processa desde o couro cru até o curtimento
ao cromo ou descanso /enxugamento após o curtimento; “wet-blue”, devido ao
23
aspecto úmido e azulado do couro após o curtimento ao cromo.
- curtume de semi-acabado: utiliza o couro “wet-blue” como matériaprima e o transforma em courosemi-acabado, também chamado de “crust”.
-curtume de acabamento: transforma o couro “crust” em couro
acabado.
Corresponde às operações desde cavaletes ou estiramento ou
secagem até o final (estoque / expedição de couros acabados). Há quem também
inclua nesta categoria os curtumes que processam o “wet-blue” até o seu
acabamento final.
Dependendo do estágio no processo de beneficiamento do couro no
curtume, podem ocorrer diversos modos de exposição a diferentes substâncias
químicas (FIGURA 01). Esta exposição acaba por tornar os trabalhadores mais
susceptíveis a eventos adversos, fazendo com que os mesmos sejam objeto de
de notificações epidemiológicas e estudo (Stern et al, 1987; Mikoczy e Hagmar;
2005; Rastogi, Pandey e Tripathi, 2008).
1.3. Epidemiologia do curtume
Vários estudos tem demonstrado que os trabalhadores de curtume
estão incluídos em um grupo peculiar de indivíduos sujeitos a patogenias oriundas
da atividade diária (Kornhauser et al., 2002; Veyalkin e Gerein, 2006; Rastogi,
Pandey e Tripathi, 2008).
Shahzad, Akhtar e Mahmud
(2006), investigaram a prevalência de
asma em 641 trabalhadores de 95 curtumes diferentes em Karachi município
industrial do Paquistão. Os resultados indicaram que
a prevalência de asma
encontrava-se alta, estando associada a escolaridade, raça, tabagismo, uso de
luvas, a percepção de sinais de alergia e a duração do trabalho.
Em um outro estudo, Kornhauser et al. (2002) objetivaram identificar as
reações adversas da exposição ocupacional ao cromo trivalente, mensurando a
quantidade de cromo na urina e de ferro sanguíneo e comparando estes valores a
os de um grupo de pessoas não expostas. os pesquisadores concluíram que o
cromo altera o metabolismo do ferro, tornando-o insuficiente.
Não só alergia e alterações metabólicas foram observadas. Em
pesquisas cujo sujeito da investigação é o profissional de curtume, o nível de
alteração da
pressão arterial foi consideravelmente significante quando
comparado ao controle. Os investigadores evidenciaram que desde o início do
24
trabalho no curtume, em média, cada período de 1 (um) ano, estava associado a
um aumento de cerca de 1,5 mmHg na pressão arterial diastólica, sendo este
componente
o dobro daquele diretamente associado com a idade (Cordeiro,
2004). Os mesmos autores em investigações anteriores relataram prevalência
bruta da hipertensão arterial detectada em trabalhadores (56,1%) com 15,8% de
hipertensão sistólica isolada (Rommel et al., 2004).
Tais estudos são indicativos de que existe um componente de risco à
saúde relacionado com o desempenho funcional.
Estas informações, corroboram com os achados de Montanaro (1997).
pesquisadores em um estudo cujo objetivo era detectar as causas de mortalidade
de 1.244 trabalhadores (870 homens e 374 mulheres) de curtume ( 1955 a 1988),
demonstrou que embora todos os óbitos tenham sido semelhantes aos da
população em geral, os cânceres de bexiga, colo-retal e reto apresentavam níveis
excessivamente superiores aos da comunidade. Estudos anteriores subsidiam
estes achados (Pippard, Acheson e Winter, 1985; Edling, Kling e Flodin, 1986;
Kornhauser et al., 2002). Todavia, outros não encontram essa associação ou
apresentam resultados inconclusivos a respeito do aumento na incidência de
câncer e essa atividade ocupacional
(Stern et al., 1987; Mikoczy e Hagmar,
2005).
Além das investigações epidemiológicas, evidências citogenéticas e
genotóxicas apontam a necessidade de estudos mais aprofundados, com
finalidade de se identificar os mecanismos que justifiquem as alterações de saúde
dos trabalhadores.
Com este objetivo, Balachandar (2010) identificou alterações genéticas
e na fertilidade.
Hilali et al. (2008) investigaram os possíveis efeitos genéticos em
linfócitos de
trabalhadores de curtume em Marrocos. Foi mostrado que as
frequências de células com aberrações cromossômicas e com micronúcleos
estavam significativamente maiores nos linfócitos dos trabalhadores.
Outras
investigações
apontaram
aumento
de
cromossômicas estruturais em relação aos indivíduos não expostos
Neto et al., 2010).
aberrações
(Monteiro
25
1.4. Exposição a agentes químicos diversos - evidências e contradições
sobre a toxicidade do cromo III
Durante todo o processo de preparação do couro, os trabalhadores se
expõem a diversos agentes químicos: agentes biocidas (para conservação da
pele), compostos orgânicos halogenados (para remoção de graxa/gordura),
solventes orgânicos não-halogenados (para acabamento), surfactantes (para
etapas de ribeira), sais de amônio, sais de cromo (agentes de curtimento)
(Pacheco, 2005).
Apesar da diversidade de substâncias químicas, o emprego de sais de
cromo III e sua possível toxicidade têm sido amplamente discutidos, sendo este
metal
considerado menos tóxico que o cromo VI, reconhecido carcinógeno
(ATSDR, 2008; Salnikow e Room, 2009).
Em pequenas quantidades,os especialistas afirmam que o cromo III não
traz prejuízo à saúde humana. É um micronutriente que desempenha papel
essencial no metabolismo da glicose, pois forma um complexo com ácido
nicotínico onde auxilia os processos de degradação do açúcar por ação da
insulina. Estudos
indicam que a administração de cromo pode corrigir a
intolerância à glicose em pacientes com diabetes tipo 2 e hipoglicemia (Abdollahi
et al., 2013).
O Institute of Medicine (IOM) do National Research Council (NRC),
determinou uma ingestão adequada de 20-45 mg de cromo (III) / dia para
adolescentes e adultos. IOM relatou média concentrações plasmáticas de cromo
de 2-3 nmol / L (equivalente a 0,10-16 mg / L) e uma excreção urinária de cromo
média de 0,22 mg / L ou 0,2 mg / dia (ATSDR, 2008).
Outra informação importante aponta que a suplementação alimentar
com cromo aumenta o nível de lipoproteínas de alta densidade em seres
humanos, protegendo o aparelho cardiovascular. A administração de 50 a 200
µg/dia de cromo III inorgânico pode diminuir os níveis de colesterol total (Bernhard
et al., 2012; Abollahi et al., 2013).
Apesar destas informações existirem, relatórios acusando deficiência
de cromo (III) são raros e não há doença reconhecida atribuída à deficiência de
cromo, como existe com a maioria dos outros minerais essenciais.Evidência de
26
sinais claros de deficiência de cromo aparente em humanos é limitada a alguns
relatos de casos (ATSDR, 2008).
Em animais, a deficiência de cromo grave é também difícil de se
reproduzir, mas quando ele foi reproduzido a hiperglicemia, diminuição do ganho
de peso, níveis elevados de colesterol sérico, placas na aorta, opacidades
corneanas, fertilidade, mortalidade e letalidade foram observados. Administração
de compostos inorgânicos de cromo (III) resultou em diminuição dos níveis
sanguíneos de glicose e colesterol e regressão de placas ateroscleróticas. A
sensibilidade à insulina também resultou em um aumento da incorporação de
aminoácidos em proteínas e transporte celular de aminoácidos em ratos que
receberam suplementação de cromo (ATSDR, 2008).
Contudo, mesmo que estas ações benéficas sejam conhecidas, o seu
papel em sistemas biológicos continua controverso, pois não existem dados
suficientemente disponíveis que sejam conclusivos quanto a sua segurança
(Stupar et al., 19999; Services, 2012).
Principalmente no ambiente do curtume, vários autores apontam fatos
que incrementam o debate sobre o tema.
Medeiros et al. (2003) identificou aumento de ligações cruzadas de
DNA - proteína e aumento de micronúcleos em linfócitos de trabalhadores de
curtumes expostos a cromo III.
Zhang et al. (2008) em uma investigação sobre danos ao DNA em 60
(sessenta) trabalhadores de curtume expostos ao cromo trivalente, mostrou que a
exposição ocupacional ao cromo trivalente pode levar a um dano no DNA
detectável de linfócitos periféricos humanos, sendo este dano associado a níveis
elevados de cromo no sangue e na urina.
Cuberos, Rodriguez e Prieto (2009) mensuraram os níveis de cromo na
urina de 827 trabalhadores de curtumes da cidade de Bogotá, estando estes
maiores que os limites normais. Quando estes resultados foram correlacionados
com o risco de desenvolvimento de doenças cardíacas, os trabalhadores
apresentaram um maior risco de apresentarem o quadro clínico.
Embora haja indícios de sua capacidade de alterar estruturas
moleculares importantes. Stouta et al (2009) não encontrou mudanças
biologicamente significativas na sobrevivência, peso corporal, consumo de ração
27
ou lesões não-neoplásicas após a administração na dieta de Rattus norvegicus e
Mus musculus por 02 anos.
Dentro deste contexto, poucos estudos descrevem diretamente a
toxicidade do cromo III, particularmente em exposição por inalação, e essa falta
de informações resultam na incerteza sobre o risco associado a exposição ao
cromo III (Medeiros et al., 2003).
Para fomentar mais o debate,sabe-seque não existe cromo III cem por
cento puro. Assim, há grande possibilidade de contaminações do cromo III com
cromo VI (EPA, 1998).
O EPA (1988) determinou que o cromo VI no ar deve ser considerado
um carcinógeno humano, sendo que para o cromo III não se tem informações
suficientes para determinar uma classificação (ASTDR, 2008).
Todavia, mesmo que alguns estudos tenham encontrado associação
entre atividades relacionadas ao beneficiamento do couro e desenvolvimento de
cânceres bexiga, pâncreas e leucemia, a atividade não éclassificada como
carcinógena em humanos (IARC, 1997).
Devido a conflituosa divergência de informações e devido a
necessidade de se obter dados mais direcionados e mais acurados em relação ao
não
malefício
ou
não
malefício
da
atividade,
há
recomendações
de
monitoramento dos profissionais que atuam no seguimento (ATSDR, 2008).
1.5. Cromo : aspectos químicos e bioquímicos
O cromo é largamente utilizado nos processos industriais, sendo
encontrado em muitos produtos de consumo tais como: madeira tratada com
dicromato de cobre, couro curtido com sulfato crômico e panelas de aço
inoxidável (ATSDR, 2008).
A população em geral está exposta ao cromo através da inalação do ar
ambiente, ingestão de alimentos e beber água contendo cromo. Exposição
dérmica do público em geral ao cromo pode ocorrer a partir de contato da pele
com certos produtos de consumo ou solos que contêm cromo. A principal via de
trabalhadores não-ocupacional, porém, é a ingestão de alimentos. Hoje em dia os
trabalhadores em indústrias relacionadas com cromo podem ser expostos a
concentrações de cromo duas ordens de grandeza maior do que a população em
geral (ATSDR, 2008).
28
O uso de couro contendo cromo é muito frequente no atual mercado
brasileiro, mesmo enquanto matéria-prima para calçados e afins (Abicalçados,
2007; Sindifranca, 2007), no Brasil, verificou-se que o curtimento vegetal ainda é
pouco utilizado por seu alto custo. Em 2003, a produção de couro por tipo de
curtimento foi de aproximadamente 94% ao cromo, 6% ao tanino (extraído da
casca da árvore do angico) e 0,1% com outros métodos (Sindifranca, 2007).
O cromo (Figura 02) é um metal branco prateado, cristalino e
resistente à corrosão. Seu estado de oxidação pode variar de +1 a +6 e sua
valência de zero a VI. O cromo é encontrado naturalmente em solo, animais,
plantas, poeiras e névoas vulcânicas, sendo quase sempre no estado trivalente
(ATSDR, 2008).
Figura 02. Cromo e os seus variados estados de
oxidação (Forma química) (Salniko e Room, 2009).
Embora o cromo apresente graus de oxidação de Cr
1+
a Cr
6+
,e nem
todos possuam a mesma estabilidade, a forma trivalente é a mais comum na
29
natureza, e mais estável, tanto no solo quanto em soluções aquosas naturais e no
uso industrial. As inter-relações entre os estados de oxidação são apresentadas na
figura 03 (Vaidyanathan, Asthana e Nair, 2013).
Figura 03. Sistema redox do cromo. Nriagu e Nieboer (1988).
O sulfato de cromo básico - Cr2(SO4)3, substância utilizada no processo
na produção de couro em curtumes encontra-se no estado de valência III (Zhang
et al., 2008).
1.6.Toxicologia do cromo - toxicocinética
A interação de cromo com o organismo humano ocorre nas seguintes
etapas: absorção; transporte, distribuição; acumulação e excreção (Kirman et al.,
2013).
Para as formas tóxicas do cromo, as vias básicas de absorção são três:
pele, pelo trato gastrointestinal e pelas vias aéreas. Porém pouco se sabe sobre a
fixação do cromo nos pulmões (Seidier et al., 2012).
Os principais dados referentes ao transporte de compostos de cromo
para dentro da pele são: os compostos de cromo VI conseguem penetrar na pele
mais prontamente que os de cromo III; a penetração dos compostos de cromo VI
se eleva com a elevação do pH; a penetração dos sais de cromo III depende da
natureza do ânion presente no composto; a principal barreira da diferença na
30
penetração dos compostos de cromo III e VI parece ser determinada pela camada
da epiderme; a pele e seus componentes favorecem o processo de redução do
cromo VI a cromo III e os compostos de cromo III se unem fortemente a pele e as
proteínas nela contidas (Kirman et al., 2013).
Em geral, pelo grande tamanho do íon hidratado Cr(H2O)63+, o cromo é
mal absorvido, pelo trato gastrointestinal. Entretanto, sua absorção também
depende do ânion acompanhante, e em certo grau ele chega a atravessar aparede
intestinal (Salnikow e Room, 2009).
Figura 04.Toxicocinética do cromo no corpo humano
(Kirman et al., 2013).
Quando absorvido o cromo distribui-se para quase todos os tecidos,
com as maiores concentrações encontradas no rim e no fígado. O Tecido ósseo
também é um depósito grande e pode contribuir para a cinética de longo prazo
retendo o cromo. Cromo (VI) no sangue é absorvido nas células vermelhas do
sangue, onde sofre redução e forma complexos estáveis com a hemoglobina e
outras proteínas intracelulares, que são retidos por uma fração substancial da
vida útil dos glóbulos vermelhos. Cromo absorvido pode ser transferido para os
fetos através da placenta e aos bebês através do leite materno (Kirman et al.,
2013).
Quando absorvido, o cromo III é transportado principalmente pela
31
transferrina plasmática, imitando o transporte do ferro. O cromo pode formar
complexos com diferentes ligantes, entre eles, os grupamentos amino,fosforila,
carboxila e hidroxila (Salnikow e Room, 2009; Kirman et al., 2013)
A figura 04 indica dois caminhos para a excreção do cromo: em um
deles, a parte que não se liga ao plasma é excretada pelos rins em 3,5 horas; no
outro, o cromo é retirado pela descamação celular e eliminado pelas fezes, com
tempo de 7 dias. Esses dois modos de excreção são fortemente apoiados em
dados obtidos em animais, apesar de existirem muitas confirmações indicando que
a excreção urinária é o único caminho em humanos (Vaidyanathan, Asthana e
Nair, 2013).
1.7.Toxicologia do cromo – toxicodinâmica
Os efeitos toxicológicos estão associados à forma química e a
exposição. A toxicidade do cromo depende da espécie química (Services, 2012).
Os trabalhadores de curtumes são continuamente expostos a certo
número de compostos de cromo. Entre estes, figuram os chamados compostos
hexavalentes e os compostos formados por cromo trivalente (Stern et al., 1987).
Os principais efeitos deletérios à saúde humana do cromo VI são
danos renais, alergias, lesões nasais, úlceras gastroduodenais, conjuntivites
crônicas, rinofaringites, além de irritação brônquica, asma e câncer pulmonar;
causados por absorção cutânea, inalação, ingestão ou adsorção no trato
intestinal. A absorção, transporte, distribuição e eliminação dos compostos de
cromo nos seres humanos e animais depende de determinados fatores, por
exemplo, solubilidade, estado de oxidação, tamanho de partícula, e taxa de
exposição (Russo et al.,2005; Salnikow e Room, 2009; Services, 2012).
O cromo VI interage com o DNA, podendo lesá-lo. O dano ao DNA
induzido por Cr VI pode levar à replicação e transcrições disfuncionais que
causam bases de substituições e eliminações que servem como substratos para o
reparo por excisão de basese reparo por excisão de nucleotídeos e, promove
portanto, a instabilidade genômica. Esta, logo pode ser causada por postos de
controle do ciclo celular aberrante e mecanismos de reparo do DNA desregulada
via instabilidade de microssatélites, que desempenham um papel importante na
32
carcinogênese causada pelo Cr VI. Existem várias linhas de evidências sugerindo
a importância da substituição das bases de mutagenicida de em Cr VI, com as
bases G: C, essas substituições mostraram ser o alvo primário in vitro e in vivo,
contudo, estudos que justifiquem a relevância específicade CrVI - Indução
deleções são inconsistentes (Collins et al., 2010; Brocato e Costa, 2013).
Hoje é amplamente aceito que o cromato (Cr VI) é reduzido
intracelularmente a Cr III. Salnikow (2007), (Figura 05), sugere que, in vivo, Cr III
pode afetar a atividade de polimerização durante aduplicação ou reparo de DNA,
com resultados mutagênicos e conseqüências carcinogênicas. Neste caso, o
cromo causa dano às estruturas de ácidos nucléicos.
A grande diferença quanto à ação mutagênica entre o cromo trivalente
e o hexavalente deve-se às diferenças de afinidade com o fosfato extracelular, à
difusão através das membranas e à interação com o DNA. A maior parte dos
testes de genotoxicidade in vitro e in vivo reproduziu a resposta para esses dois
estados mais comuns de oxidação do cromo. O cromo III (Figura 05) penetra as
membranas com maior dificuldade. In vivo, o metabolismo, a distribuição e o
transporte do cromo hexavalente e do cromo trivalente também são bem
divergentes, tendo-se como resultado um menor efeito genotóxico do cromo III,
pelo menos em roedores (Services, 2012).
Figura 05. Esquema dos passos de absorção,
metabolismoe possível dano no DNA induzido pelo
Cromo (VI) e (III) (Salnikow e Room, 2009).
33
O cromo é capaz de se associar à molécula de DNA, formando aductos
de tamanho e complexidade variável. Suspeita-se que o Cromo III possa se
combinar formando um oligômero capaz de criar pontes intercadeias na molécula
de DNA (Flora, De, 2000). Seu principal local de fixação é o grupo fosfato, mas
pode ocasionar mutações diretas principalmente entre as bases Guanina (G) e
Citosina (C), através de sua ligação com resíduos de Cisteína (Cys) (Salnikow e
Room, 2009).
Existem informações mostrando que todas as formas de Cromo VI, em
compostos solúveis e insolúveis em água são carcinogênicas para os órgãos
respiratórios humanos, não havendo evidências de que os compostos de cromo III
aumentem o risco de câncer respiratório (Seidler et al., 2012; Services, 2012).
Contudo, em um recente estudo realizado por Raja e Nair (2008), o
cromo III (peróxido) foi considerado a forma mais lesiva ao DNA. A investigação
concluiu que neste formato a inibição da transcrição do DNA foi mais efetiva,
sendo dependente de sua concentração.
1.8.Bases da instabilidade genética e mutações
A instabilidade genética tem sua origem a partir de uma cascata de
mutações que ocasionam numerosas modificações na estrutura do DNA, tais
como quebras simples ou duplas, deleções ou modificações de bases, pontes de
DNA-DNA ou DNA-proteínas e pontes intercadeias
(Steinemann, Göhring e
Schlegelberger, 2013). Esses são alguns eventos iniciais pelos quais os agentes
genotóxicos químicos e físicos ocasionam doenças hereditárias, cânceres e
letalidades (Vijg e Suh, 2013). Vários estudos epidemiológicos relatam que, em
sua maioria, os cânceres são originados pela exposição contínua a agentes
mutagênicos e carcinogênicos, sendo que a susceptibilidade individual pode
depender da predisposição genética, de diferenças no hábito nutricional e no
estilo de vida (Huang, 2013).
As mutações são detectadas frequentemente através da expressão
fenotípica, causada por uma mudança súbita e hereditária no genótipo de um
organismo, alterando suas características. A ocorrência de mutações, no entanto,
34
depende da natureza da lesão e das respostas celulares aos danos no DNA.
Basicamente, as mutações são divididas em duas grandes categorias: mutações
gênicas e cromossômicas. As primeiras são alterações que ocorrem na seqüência
de nucleotídeos do DNA, ou por substituição de bases, ou ainda adição ou
deleção de nucleotídeos; e as segundas, são as que produzem alterações no
número ou na estrutura dos cromossomos, e são detectadas por análises
citogenéticas celular (Janssen e Medema, 2012).
No decorrer da vida, o DNA sofre alterações, que podem ser causadas
por erros durante a replicação do DNA, na divisão celular. No entanto, a
justificativa da preocupação da exposição a agentes químicos ambientais, é que a
exposição adicional (ocupacional) representa um aumento na carga mutagênica,
e que todo risco em excesso precisa ser identificado e se possível minimizado
(Vijg e Suh, 2013; Heng et al., 2013).
Nesse contexto, é crescente a preocupação sobre o efeito mutagênico
e
carcinogênico
de
agentes
genotóxicos
em
populações
expostas
ocupacionalmente, acidentalmente ou por estilo de vida (Janssen e Medema,
2012).
Para mensuração e acompanhamento dos danos oriundos da
exposição ocupacional utilizam-se métodos de monitorização biológica, onde o
uso de biomarcadores é a ferramenta mais comum.
1.9. Monitorização biológica
A monitorização biológica veio incluir na avaliação da toxicidade, os
mecanismos de toxicidade, metabolização e efeitos químicos. Assim, o cerne do
estudo é o indivíduo exposto e o método consiste na quantificação do composto
tóxico e ou dos seus metabolitos em amostras biológicas, como por exemplo
sangue e urina, de forma aquantificar a concentração que efectivamente foi
absorvida pelo organismo (Sarigiannis e Hansen, 2012).
Segundo (Arnold et al., 2013), a monitorização biológica prevê
variações individuais relativas à taxa de absorção, ao metabolismo, à distribuição
pelo corpo e finalmente à excreção do composto químico.
35
1.10. Biomarcadores
Segundo Suspiro e Prista (2011), um biomarcador é qualquer
substância, processo e/ou produtos que é possível quantificar no corpo.
A escolha de um biomarcador para determinado estudo numa
população varia conforme o tipo de exposição: exposição crônica ou exposição
aguda a um agente possivelmente carcinogênico (Pavanello e Lotti, 2012).
Os biomarcadores podem ser de três tipos: biomarcadores de
exposição, de efeito e de susceptibilidade. Esta classificação não é rígida e não
existe uma categorização convencionalmente aceita uma vez que normalmente
são utilizados diferentes combinações de biomarcadores desde aexposição até ao
efeito (Pavanello e Lotti, 2012).
Existe uma transição contínua entre os biomarcadores de exposição e
os biomarcadores de efeito uma vez que estes últimos funcionam em certa
medida como biomarcadores de exposição e vice-versa. Os fatores de
susceptibilidade genética podem influenciar os biomarcadores de efeito e de
exposição através de polimorfismos genéticos de enzimas envolvidas na ativação
metabólica, ação de detoxificação, reparação de DNA, entre outros (Mateuca,
Decordier e Kirsch-volders, 2012).
Os biomarcadores de suscetibilidade indicam indivíduos mais ou
menos propensos a desenvolver câncer quando expostos à substâncias
cancerígenas (análise de perfis polimórficos de um grupo populacional). Os
biomarcadores de efeito ou de resposta indicam alterações presentes em
tumores; são tardios e permitem avaliar o prognóstico da doença. Os mais
utilizados são as medidas de dano de DNA tais como: alterações de base,
formação de adutos, aberrações cromossômicas, troca de cromátides irmãs e
micronúcleo (Pavanello e Lotti, 2012)
O biomonitoramento da exposição ocupacional a agentes mutagênicos
vem sendo atualmente considerado um dos mecanismos de prevenção e controle
de doenças genéticas. Os biomarcadores de genotoxicidade, mutagenicidade e
carcinogenicidade são importantes para a avaliação de efeitos crônicos de
substâncias químicas mutagênicas e carcinogênicas (Suspiro e Prista, 2011).
36
1.11.Biomarcadores de genotoxicidade e de mutagenicidade utilizados como
forma de biomonitoramento
Os biomarcadores citogenéticos, a exemplos dos de
(MN) e de
micronúcleos
aberrações cromossômicas (AC) têm atraído mais atenção em
inúmeros estudos, pois são importantes indicadores de efeitos biológicos. Existem
evidências de que aumento dos níveis de AC em linfócitos de sangue periférico
pode ser um marcador de risco de câncer. Outro tipo de biomarcador, os MN,
também tem sido bastante usado, nos últimos anos, como um teste de
genotoxicidade para avaliar quebras de cromossomos (clastogenia), perda e não
disjunção (aneugenia) (Luzhna, Kathiria e Kovalchuk, 2013).
Um outro teste muito utilizado é o ensaio docometa. Este
detecta
quebras simples e quebras duplas do DNA, danos oxidativos e capacidade de
reparo (Fikrová et al., 2011). Correlações entre biomarcadores contribuem para o
entendimento da complexidade molecular da exposição aos agentes genotóxicos
em estudos de biomonitoramento ocupacional (Suspiro e Prista, 2011).
1.12.Teste de micronúcleos
O teste de MN é um teste citogenético que pode ser usado como
biomarcador para avaliação de efeitos aneugênicos e clastogênicos em diversos
organismos vivos. Este teste vem sendo usado desde 1980, para demonstrar
danos
citogenéticos
induzidos
por
radiações,
contaminantes
ambientais,
ocupacionais, estilo de vida, deficiências em nutrientes e outras doenças. É
importante ressaltar que o teste de MN é um dos testes para avaliação de
genotoxicidade menos invasivo e que causa poucos transtornos aos pacientes,
quando comparados com os que necessitam de biopsia (Cardinale, Bruzzi e
Bolognesi, 2012).
A ocorrência dos MN representa uma resposta integrada de
instabilidade de cromossomos, fenótipos e alterações celulares causadas por
defeitos genéticos e ou exposição exógena a agentes genotóxicos, refletindo
inúmeras alterações cromossômicas importantes para a carcinogênese (El-Zein,
Vral e Etzel, 2011).
37
Em relação a outros testes, a contagem de MN apresenta vantagens
sobre a análise cromossômica clássica por ser um procedimento simples, eficaz e
realizado a baixo custo. Além disso, a frequência de MN aparece elevada em
tecidos expostos bem antes que qualquer sintoma clínico seja evidente, tornandoo valiosa ferramenta na prevenção da carcinogênese oral (Fenech, 2007).
A formação de MN durante a divisão celular é resultado da quebra de
cromossomos devido às lesões não reparadas ou reparadas de forma incorreta,
ou ainda devido à má segregação dos cromossomos e má função mitótica. Esses
eventos podem ser induzidos por estresse oxidativo, exposição aos agentes
clastogênicos e aneugênicos. Dessa forma, os MN são usados como
biomarcadores
de
instabilidade
cromossômica,
fixação
de
mutações
e
susceptibilidade genética e polimorfismos genéticos, fatores que podem explicar a
sua associação com os riscos de câncer (Fenech, 2007; Fenech e Bonassi,
2011).
O potencial de danos citogenéticos de agentes genotóxicos pode ser
avaliado com o teste de MN como um biomarcador em linfócitos de sangue
periférico e em células de mucosa bucal. Células da mucosa bucal estão em
constantes contatos com contaminantes ambientais. Desta forma, o epitélio bucal
representa um tecido de importância para avaliação dos danos induzidos por
substâncias inalantes. Os MN também podem ser avaliados em eritrócitos,
linfócitos e epitélio esfoliado de mucosas nasal, urogenital, gástrica para avaliação
de danos ao DNA dos organismos (Holland et al., 2007; Kashyap and Reddy,
2012; Luzhna, Kathiria and Kovalchuk, 2013).
1.13.Teste de micronúcleos em mucosa bucal
Os MN de células esfoliadas de mucosa bucal e de outras mucosas
originadas de divisões no tecido epitelial são obtidas rapidamente, sem a
necessidade de divisões ex vivo, como as células oriundas de culturas celulares,
para análise de metáfases que necessita do uso da citocalasina para bloquear a
proliferação de linfócitos (Bonassi et al., 2011; Fenech et al., 2011).
Os MN são reportados como de alto risco para o aparecimento do
câncer, em resposta a agentes genotóxicos e carcinogênicos. Nas células
38
esfoliadas de mucosas, eles refletem os eventos genotóxicos que ocorreram nas
células em divisão da camada basal no período de uma a três semanas depois da
ação dos agentes genotóxicos. Eles podem ser detectados em células esfoliadas
de mucosa bucal (Figura 06) e usados como indicativos de danos ao DNA
(Holland et al., 2008).
Figura 06. Secção da mucosa bucal indicando seus diferentes extratos, bem como
o aparecimento de micronúcleos (Holland et al., 2008).
A análise de células epiteliais é importante, pois cerca de mais de 90 %
dos cânceres tem origem epitelial. Células esfoliadas de mucosa bucal têm sido
mundialmente usadas na avaliação citológica para detectar morfológicas
anormais, alterações de premalignidade e câncer. Assim tecido epitelial pode ser
usado para o monitoramento de populações humanas expostas a vários agentes
químicos e/ou físicos potencialmente genotóxico/mutagênicos e carcinogênicos
(Holland et al., 2008).
1.14. Teste de micronúcleos com bloqueio de citocinese
O teste de MN também pode ser feito com bloqueio de citocinese como
um sistema compreensivo para mensurar danos ao DNA e citocinese (El-Zein,
Vral e Etzel, 2011). O teste pode mensurar: (1) as pontes nucleoplasmáticas, que
indica o rearranjamento de cromossomos que ocorre quando os centrômeros de
cromossomos dicêntricos ou cromátides são puxados para os polos da célula
durante a anáfase ou fusão de telômeros depois de quebras duplas de fita do
39
DNA; (2) brotos, que representam um mecanismo o qual a célula remove
amplificação de DNA que é considerado como um marcador de amplificação de
genes, originada de fragmentos acêntricos terminal ou intersticial (Fenech, 2007).
A metodologia de MN com bloqueio de citocinese (CbMN) ( Figura 07)
é desenvolvida com o uso da citocalasina B para identificar células que dividemse em cultura. A citocalasina B é um inibidor de polimerização de actina o qual é
requerida para a formação do anel que divide o citoplasma durante a citocinese
(Fenech, 2007).
A frequência de MN em sangue periférico tem sido mundialmente
estudada como um biomarcador de danos cromossômicos para testes de
genotoxicidade e estudos de biomonitoramento humano (Chen et al., 2006;
Holland et al., 2007; Cakmak Demircigil et al., 2011).
A preferência sobre o uso de linfócitos deve-se principalmente ao seu
tempo de vida. As células exfoliadas da mucosa bucal apresentam uma duração
de aproximadamente 21 dias e os eritrócitos 120 dias enquanto que os glóbulos
brancos, neste caso os linfócitos apresentam cerca de 1095 dias (cerca de 3
anos) de tempo de vida. Este valor é bastante discutido na literatura e são
apresentados valores entre 730 e 1600 dias (Fenech, 2007).
Os MN em células mononucleadas indicam instabilidade no genoma e
em células binucleadas evidenciam mutações em cromossomos/ genomas antes
do preparo da cultura que se expressam durante cultura in e representam quebras
e perdas de cromossomos e pode ser usado para classificar substâncias químicas
clastogênicas ou aneugênicas (Fenech, 2007).
Os agentes considerados clastogênicos podem levar à formação de
MN que contém no seu interior fragmentos de cromossomos que resultam da
quebra de uma ou de duas cadeias de DNA. Nos casos em que a reparação do
erro não ocorre, esta quebra de cromossomos poderá dar origem a um rearranjo
assimétrico com a formação de um cromossoma dicêntrico e um fragmento
acêntrico (Heng et al., 2013).
O primeiro é arrastado para os pólos da célula durante a anáfase e
forma uma ponte nucleoplasmática entre os núcleos da célula filha, enquanto que
o segundo fragmento sofre um atraso dando origem a um MN que desta forma
40
não é incluído no núcleo da célula filha durante a telófase (Huang, 2013).
Quanto aos agentes com modo de ação aneugênica, o MN é formado
com um cromossoma inteiro que sofreu um atraso aquando da ascensão aos
pólos. Este atraso na ascensão dá-se por falhas no fuso mitótico ou por danos
estruturais no cromossomo (Fenech, 2007).
Após a sua formação, o MN pode seguir diferentes vias apesar de
ainda não estarem esclarecidas todas as etapas. Assim, na fase pós-mitótica
pode ocorrer a eliminação da célula que contém o MN através da apoptose,
expulsão do interior da célula, uma vez que o DNA não se encontra funcional
inclusão do MN no núcleo principal ou, por último, pode dar-se a integração do
MN no citoplasma da célula (Fenech, 2007).
Figura 07. Processo de formação de micronúcleos com e
sem citocalasina B (Fenech, 2007).
1.15.Teste de aberrações cromossômicas
As alterações cromossômicas estruturais são assim denominadas
porque afetam a estrutura dos cromossomos, sendo resultantes de quebras que
ocorrem, em geral, antes da duplicação do DNA. Tais quebras são ditas
espontâneas quando não têm uma causa aparente, mas é sabido que sua
frequência aumenta sob a ação de agentes diversos que são denominados
agentes clastogênicos (Kasahara, 2009).
41
As quebras originam segmentos sem telômeros, os quais são
estruturas essenciais par manter a individualidade dos cromossomos. As
extremidades livres ficam literalmente pegajosas, favorecendo a reunião com
outro segmento nas mesmas condições, isto é, que tenha perdido também a
região telomérica. Os segmentos quebrados podem se soldar, quando entra em
ação a síntese de reparo de DNA da célula, na qual intervém outras polimerases,
diferentes daquelas que atuam na duplicação semiconservativa que antecede as
divisões celulares. As quebras não produzem necessariamente modificação na
estrutura do cromossômo, pois os segmentos podem se reunir no mesmo ponto
onde foram quebrados. Contudo, cromossomos com estrutura alterada podem ser
formados, quando os segmentos se unem de forma distinta da original ou quando
fragmentos são simplesmente perdidos. As quebras não ocorrem, aleatoriamente
em qualquer região do cromossomo, existindo os chamados sítios frágeis mais
propensos a se quebrarem (Kasahara,2009).
Métodos baseados na presença de AC são extensivamente usados
para monitoramento biológico de populações expostos aos agentes mutagênicos
e carcinogênicos (Pastor et al., 2003). O teste de AC detecta mutações
cromossômicas, ou seja, alterações que ocorrem no número ou estrutura de
cromossomos, como quebras, formação de anéis, aumento do número de
centrômeros, dentre outras. As AC são eventos importantes no desenvolvimento
tumoral, pelo fato de que quebras em sítios específicos da molécula do DNA
podem às vezes coincidir com a localização de oncogenes (Shaham et al., 2001).
A frequência de AC é um excelente biomarcador de danos induzidos
por carcinógenos genotóxicos (Dearfield, 2002). Os níveis de AC em linfócitos
periféricos podem ser considerados como relevante biomarcador para identificar
pessoas que correm riscos de câncer (IARC, 2000), mostrando associação com
riscos de câncer (Hagmar et. al., 2004). A alta frequência de AC pode predizer o
aumento de risco de câncer (Rossner et al., 2005).
A maioria dos mutagênicos químicos induz aberrações do tipo
cromatídicas, mas as do tipo cromossômico também ocorrem. Determinar a
frequência de AC em linfócitos do sangue periférico humano, com o propósito de
dosímetro biológico de exposição a agentes mutagênicos químicos, constitui uma
técnica importante para estimar o risco em exposições ocupacionais. Detectar
42
apenas AC indica que existe um dano genético grosseiro; a ausência destas não
exclui outras possíveis alterações no DNA. Porém, a presença de AC indica uma
possível ligação com a exposição a genotóxicos (Ribeiro; Salvadori; Marques ,
2003).
1.16.Teste do cometa
Durante os últimos anos, tem havido um grande interesse no
desenvolvimento de testes rápidos e simples para identificar os efeitos da
exposição aos agentes ambientais que possam afetar a saúde das pessoas
devido aos danos no DNA. Um desses métodos é a ensaio cometa, ideal para
investigações em humanos porque não exige nenhuma pré-marcação com
radioatividade ou outros procedimentos prejudiciais. À semelhança de outros
testes de genotoxicidade, o ensaio cometa não é preditivo de risco de câncer
individual, mas representa uma ferramenta útil para a avaliação precoce de
efeitos genotóxicos devido à exposição ocupacional ou ambiental (Collins et al.,
2008).
Segundo Collins et al. (2008) o ensaio cometa é um excelente teste de
genotoxicidade podendo revelar quebras simples, duplas quebras nas fitas do
DNA, além de cross-links e sítios álcali-lábeis. Sendo usualmente trabalhado para
biomonitoramento ambiental, ocupacionais e mais recentemente para processos
oxidativos do DNA, condicionados por espécies químicas de poder oxidativos
extrínsecos (ingeridos na dieta) ou intrínsecos (gerado pelo processo de
respiração celular) (Møller, Knudsen e Loft, 2000).
A designação de teste cometa foi introduzida por Olive em 1988 devido
à cauda (Figura 08) que formava nos nucleóides lesados, mais tarde, no mesmo
ano, este paralelo aos estudos de Singh viria a produzir modificações no ensaio
que são usadas até hoje, criando doravante uma nova versão para o ensaio
cometa, a alcalina (Azqueta et al., 2011).
Nos últimos anos o monitoramento dos efeitos genotóxicos de químicos
em humanos como objetivo de avaliar os riscos tem aumentado e como resultado
tem sido identificado marcadores da exposição humana a mutágenos e
carcinógenos. O biomonitoramento de populações humanas expostas aos
43
agentes potencialmente mutagênicos e carcinogênicos pode providenciar
informações iniciais de desrregulações celulares e iniciação do desenvolvimento
de câncer. Nos recentes anos o teste do cometa, conhecido como eletroforese em
gel de agarose tem sido importante biomarcador para avaliar danos em
populações expostas ambientalmente ou ocupacionalmente a poluentes do ar,
metais, pesticidas, radiações e outros xenobióticos (Hartmann e Agurell, 2003;
Dusinska e Collins, 2008).
O teste cometa permite avaliar de maneira sensível a presença de
lesões na fitas de DNA e, ainda, se as agressões estão sendo reparadas pela
célula (Collins et al., 2008). Este teste, com pequenas modificações no protocolo,
pode avaliar danos oxidativos nas bases nitrogenadas das fitas da dupla hélice.
Devido a sua sensibilidade, rapidez, baixo custo e ampla aplicação, é
frequentemente empregado em estudos tanto in vivo como in vitro, podendo ser
aplicado a qualquer tecido sem a limitação da proliferação celular para a análise
(Villela et al., 2006).
Figura 08. Critério utilizado para as análises dos cometas
(Villela et al., 2006).
1.17.Avaliação da exposição
A preocupação em evitar o surgimento de doenças decorrentes da
exposição dos indivíduos a agentes químicos no ambiente de trabalho conduz à
tomada de medidas de prevenção.Estas são à base da monitoração biológica e
consistem em veriicar se a concentração destes agentes ou de seus metabólitos
44
no organismo dos trabalhadores esta dentro dosníveis estabelecidos por órgãos
governamentais ou pela comunidade cientíica. Os indicadores biológicos de
exposição e os índices biológicos máximos permitidos são determinados por meio
de estudos epidemiológicos,experimentais e casos clínicos.
As concentrações plasmáticas e urinárias de cromo em grande parte
refletem a exposição relativamente recente. Durante as exposições relativamente
constante que alcança um estado de equilíbrio no plasma, a excreção urinária de
cromo diariamente medido pode vir a ser altamente correlacionada com a
ingestão de cromo (ATSDR, 2008).
No entanto, um aumento nos níveis plasmáticos de cromo pode refletir
tanto a exposição recente quanto exposição que ocorreu durante os últimos
meses, enquanto o cromo urinário elevado reflete principalmente a exposição
sobre 1 - 2 dias (Barceloux, 1999). Medidas distintas de cromo no plasma e
sangue total (refletindo distribuição intracelular de eritrócitos) também ser útil para
distinguir as exposições ao cromo (VI) contra o cromo (III); aumento dos níveis
plasmáticos de cromo pode indicar exposição a ambos os cromo (VI) e cromo (III),
enquanto o cromo aumentado em eritrócitos indica a exposição ao cromo (VI),
uma vez que o cromo (III) não é absorvido pelas hemácias (ATSDR, 2008).
A relação entre os níveis séricos e os níveis de cromo na urina aos
níveis de exposição ocupacional tem sido investigada em diversos estudos, com
resultados mostrando as correlações entre os níveis de exposição e os níveis de
cromo no sangue e na urina. Em trabalhadores expostos ao cromo (VI) como
trióxido de cromo na indústria de cromagem, uma correlação significativa (r =
0,71) foi observada entre os níveis de exposição e urinária de cromo. Foram
observadas correlações significativas entre as concentrações de cromo no ar
(medido por meio de dispositivos de amostragem pessoal; 8 horas) e os níveis de
cromo no sangue (r = 0,99) e na urina (r = 0,89) em trabalhadores de uma
instalação de liga de cromo (Muttamara e Leong , 2004).
Em relação aos trabalhadores de curtumes observou-se que a
concentração de cromo no soro e na urina foram significativamente elevados em
um grupo de 73 trabalhadores de curtume, com a exposição principalmente ao
cromo (III), em comparação com um grupo de 52 indivíduos controle, (Randall e
45
Gibson, 1987). Soro e os níveis de cromo na urina correlacionados com a área de
trabalho do curtume, com as maiores concentrações em trabalhadores que
manuseiam o crome (tanagem) e departamentos associados (sparação). O nível
médio ponderado no tempo, de cromo total em curtume foi de 1,7 mg/m3 de ar e
não variou significativamente entre os curtumes envolvidos no estudo ou entre as
diversas áreas de trabalho de cada um curtume, com cromo (VI) em níveis de ar
foram abaixo do limite de detecção de (0,1 mg/m3) (ATSDR, 2008).
Métodos frequentemente utilizados para determinar os baixos níveis de
cromo em amostras biológicas incluem a análise por ativação com nêutrons
(NAA); espectrometria de massa (MS); espectrometria de emissão atômica
grafite(AES) e espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (GFAAS)
(Uma técnica recém-adicionado inclui o uso de reflexão total fluorescência de
raios X (TXRF) para a análise de cromo total no ar (Adekola e Eletta, 2007).
No Brasil, a NR-7 e a Portaria n.0 24 de 29 de dezembro de 1994 da
Secretaria deSegurança e Saúde no Trabalho estabelecemos parâmetros
biológicos para controle da exposição a agentes químicos. Conforme esta
portaria, todos os empregados e instituições que admitam trabalhadores como
empregados são obrigados a elaborar e implementar o Programa de Controle
Médico
de
Saúde
Ocupacional
(PCMSO).
Esta
monitoração
biológica
complementa o monitoramento ambiental e a vigilância à saúde, considerando-se
que determina a exposição global diretamente no indivíduo e detecta efeitos
precoces e reversíveis, proporcionando uma melhor estimativa do risco. Alguns
fatores a serem levados emconsideração para o monitoramento biológicoao
cromo incluem:
- Indicador biológico: cromo na urina;
- Exame da amostra: Urina coletada no finaldo último dia da jornada semanal.
Mínimo 50 mL, em frasco de polietileno;
- Conservação: A amostra é guardada em geladeiraa 4º C;
- Valor de referência da normalidade: até 5,0μg/g creatinina (NR-7);
- O índice máximo permitido biológico: 30μg/g creatinina (NR-7).
46
1.18. Fatores não ocupacionais que podem interferir nas análises
genotóxicas
1.18.1 Idade e gênero
Imperfeições no sistema celular de defesa que protege contra a fixação
de danos ao DNA tais como os danos induzidos ao DNA pelas espécies reativas
de oxigênio (EROs) decrescem a eficácia do reparo de DNA e pode levar ao
acúmulo de mutações que em combinação com a idade pode contribuir para o
envelhecimento e o desenvolvimento de patologias relacionadas com idade
(Suspiro e Prista, 2011).
Existem grandes correlações entre o aumento da idade e a frequência
de MN, entretanto, em relação às AC existem baixas correlações (Pavanello e
Lotti, 2012). Depois de 30 anos os efeitos da idade é mais pronunciado em
fêmeas (Vijg e Suh, 2013), sugerida pela perda de cromossomos. Entretanto,
outros estudos não demonstram correlações de MN em linfócitos humanos com
idade (López-Otín et al., 2013).
Ocorre
um aumento espontâneo da instabilidade cromossomal
associado à idade que se reflete com o aumento do número basal de MN. A
formação de MN pode resultar de perturbações no fuso mitótico que levam a
atrasos na ascensão aos pólos dos cromossomas durante a anáfase. A
acumulação de dano genético pode também adivir da ocorrência de quebra de
cadeias de DNA e à progressiva diminuição de reconhecimento de danos e
fenômenos de reparação (Fenech e Bonassi, 2011).
Diversos estudos têm demonstrado esta associação entre gênero e
MN. Sexo e idade são consideradas as variáveis demográficas que mais
influenciam a frequência de MN em linfócitos humanos, apesar de neste estudo a
diferença não ser significativa confirmando resultados obtidos por outros autores
(Suspiro e Prista, 2011).
Uma possível explicação para justificar esta influência deve-se ao fato
do cromossoma X aparecer mais frequentemente em MN. Ou seja, parece haver
uma maior probabilidade de eventos aneuploidogênicos ocorrerem associados ao
cromossoma X (Fenech, 2007; Battershill, Burnett e Bull, 2008; Huang, 2013).
47
1.18.2.Tabagismo
O fumo é uma importante variável para induzir significantes alterações
nomaterial genético, indicado por biomarcadores citogenéticos tais como as AC e
quebras de cromátides irmãs e aumenta os riscos de câncer. Isto tem sido bem
sugerido pelo aumento de MN em células epiteliais de mucosa bucal (Çelik et al.,
2003).
A exposição ao fumo também tem efeitos nas frequências de MN de
células binucleadas (Luzhna, Kathiria e Kovalchuk, 2013).
Em relatos de danos ao DNA em linfócitos de sangue periférico com o
teste de MN e cometa existem diferenças significantes entre fumantes e não
fumantes (Speit et al., 2003; Hoffmann, Högel e Speit, 2005). Associação entre o
fumo e o câncer, devido à diversidade de substâncias químicas que compõe o
tabaco serem consideradas como genotóxicos e carcinógenos (IARC, 2002).
Estudos indicam o aumento da frequência de MN em linfócitos de sangue
periférico em fumantes (Bansal et al., 2012).
Em avaliação genotóxica com o teste cometa diferenças significativas
foram observadas entre população fumantes, não fumantes e fumantes passivos,
pelo aumento da cauda, oriunda da grande migração de DNA nos fumantes, de
forma associada com os níveis de glutationa peroxidase e tocoferol, indicando a
indução de danos oxidativos (Zalata et al., 2007). Entretanto, inúmeros relatos
indicam que não existem associações entre fumantes e o aumento da migração
de DNA em linfócitos periféricos de fumantes de mais de 20 cigarros por dia
(Speit et al., 2003). Diante de muitas controvérsias sobre as influências do uso do
fumo em estudos de biomonitoramento ocupacional, outras análises podem ser
feitas para melhor esclarecer os diferentes relatos, a exemplo do estudo de
polimorfismo genético de populações expostas (Battershill, Burnett and Bull,
2008).
Bonassi (2011), recorrendo a resultados obtidos no projeto Human
Micronucleus project (Projecto de Micronúcleos Humanos) referentes ao efeito
dos hábitos tabágicos na frequência de MN, justifica a fraca ou inexistente
correlação com o fato de os químicos presentes no fumo do cigarro apresentarem
uma concentração mais baixa no sangue do que nos outros órgãos, como os
48
pulmões. Assim, os danos provocados em células sanguíneas não são passíveis
de serem analisados com recurso ao teste do MN.
1.18.3.Etilismo
As bebidas alcoólicas têm sido comumente associadas ao câncer
(Committee on Carcinogenicity, 1995), entretanto os mecanismos de ação ainda
não foram bem elucidados e ainda não existem relatos de mutagenicidade em
roedores, e os dados sobre os efeitos de bebidas alcoólicas na indução de MN e
AC em linfócitos de sangue periférico ainda não são conclusivos (Benassi-Evans
e Fenech, 2011; Fenech e Bonassi, 2011).
1.18.4.Vitaminas e sais minerais
A função dos micronutrientes na manutenção da estabilidade genômica
tem sido extensivamente revisada na literatura. Existem relatos de que dieta
pobre em micronutrientes aumenta o risco de doenças degenerativas, incluindo o
câncer (Fenech, 2010; Fenech and Bonassi, 2011). Sabe-se que as vitaminas e
os minerais são essenciais para a manutenção da estabilidade genômica, bem
como podem influenciar em muitos aspectos do metabolismo do DNA, incluindo
síntese, reparo, metilação e apoptose (Dusinska, 2003).
Dentre os fatores que podem predizer a formação de MN, os
micronutrientes por sua capacidade de proteção ao DNA encontram-se, quando
em deficiências nutricionais como indutor da formação de MN. As quebras e
perdas dos cromossomos envolvem diferentes disfunções celulares como
fragmentos de cromossomos acêntricos resultam em quebras duplas pode levar a
formação de micronúcleos, que pode ser afetada por co-fatores como magnésio e
cálcio (Janssen e Medema, 2012).
As doenças cardiovasculares e câncer são as maiores causas de
mortalidade no mundo. Ambas constituem fatores de riscos, incluindo o fumo e
dieta, como também processos patogênicos, tais como inflamações crônicas e
estresse oxidativo que ocasionam instabilidade genética (López-Otín et al., 2013;
Steinemann, Göhring and Schlegelberger, 2013; Vijg and Suh, 2013).
49
JUSTIFICATIVA
50
2. JUSTIFICATIVA
Embora o curtume seja alvo de investigações epidemiológicas, as
informações
existentes,
até
o
momento,
são
bastante
contraditórias.
Particularmente, quando abordam as patogenias associadas à exposição
ocupacional e os possíveis agentes causadores.
Neste contexto, encontram-se as substâncias utilizadas para o
curtimento, em especial o cromo III. Este metal, considerado benéfico, é utilizado
como agente curtidor.
Todavia, Informações in vitro apontam sua capacidade de promover
lesões no DNA. Isto fomenta o debate a respeito de sua segurança, quando
utilizado de forma crônica. Um adicional a esta informação , encontra-se no fato
de que os estudos in vivo abordam seus efeitos tóxicos por via oral, sendo que a
maioria dos estudos epidemiológicos acusam que a exposição aérea é a mais
maléfica.
Temos no curtume um excelente ambiente para investigações. Nele se
encontram o cromo III, sendo utilizado cronicamente na forma de pó, facilmente
inalado.
Portanto, devido a conflituosa divergência de informações e devido a
necessidade de se obter dados mais acurados em relação ao benefício ou
malefício da exposição ocupacional ao cromo III, justificamos a realização deste
estudo.
51
OBJETIVOS
52
3.OBJETIVOS
3.1.Objetivo geral:
Esta pesquisa teve como finalidade avaliar os possíveis efeitos
genotóxicos
e mutagênicos da exposição de trabalhadores de curtume de
Teresina (PI) à substâncias químicas contendo cromo III através do uso de
biomarcadores de danos ao DNA e aos cromossomos.
3.2.Objetivos específicos:
 Determinar a frequência de micronúcleos em células esfoliadas da
mucosa bucal e em cultura de linfócitos com bloqueio de citocinese
(efeito aneugênico e/ou clastogênico- mutagênicos);
 Identificar
o índice de danos e a frequência de danos ao DNA de
trabalhadores com a aplicação do teste cometa em mucosa bucal e em
cultura de linfócitos (efeito genotóxico);
 Identificar os principais danos aos cromossomos, por meio do teste de
aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos (efeito clastogênicomutagênico);
 Mensurar os níveis de cromo na urina dos trabalhadores;
 Correlacionar
os
possíveis
efeitos
genotóxicos
mutagênicosencontrados à concentração de cromo na urina
e
53
METODOLOGIA
54
4. METODOLOGIA
4.1. Delineamento experimental
4.1.1tipo de estudo
O estudo foi baseado num modelo transversal, observacional e
quantitativo.
Este foi
delineado de forma a permitir que se obtenha uma
avaliação laboratorial dos trabalhadores de curtume expostos a substâncias
químicas contendo cromo III .
4.1.2.caracterização dos grupos de estudos
A população estudada constituiu de uma amostra de 86 voluntários do
sexo masculino, com idade entre 18 e 65 anos, sem restrição quanto ao grupo
étnico. 43 trabalhadores foram selecionados entre os trabalhadores do curtume,
que estão potencialmente expostos misturas químicas complexas. As análises
realizadas encontram-se descriminadas na Tabela 01, com o respectivos número
de indivíduos.
Para o grupo controle foram selecionados 43 indivíduos do sexo
masculino, não expostos ao ambiente do curtume, com funções administrativas
(escritório contábil), na capital Teresina.
Tabela 01. Distribuição dos indivíduos avaliados por teste avaliado, expostos e
não expostos.
Testes
Quantidade de
Quantidade de
indivíduos
indivíduos não
Expostos
Expostos
Micronúcleo em mucosa
20
20
Micronúcleo em linfócitos
30
30
Cometa em mucosa
20
20
Cometa em linfócitos
43
43
Aberrações cromossômicas
30
30
Cromo na urina
27
27
55
4.1.3.critérios de inclusão e exclusão
 Inclusão:
Foram incluídos indivíduos do sexo masculino de 18 a 65 anos de
idade, independentemente do tempo de trabalho no curtume, com uso ou não de
equipamentos de proteção. Foram incluídos ainda etilistas e fumantes, em virtude
do pequeno número amostral.
 Critérios de Exclusão:
Foram excluídos os indivíduos que em algum momento de suas vidas
já desenvolveram alguma doença que sabidamente está relacionada com
alterações gênicas e cromossômicas deorigem biológica (câncer, turbeculose,
toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, AIDS, HTLV, HPV) (Smeets et al. 2009).
Partindo desse ponto foram excluídos os que haviam sido submetidos a
tratamentos radioterápicos, e quimioterápicos, e que estavam fazendo uso de
antibióticos, antiarrítmicos (propranolol, por exemplo), anticonvulsivantes (tipo
fenitoína ecarbamazepina), antihipertensivos (metildopa e captopril), cortisona,
hipoglicemiantes e medicamentos prescrito para controle da tireóide. Os
indivíduos que depois de uma avaliação clinica bucal apresentaram lesões na
cavidade oral foram aexcluídos pela possível relação direta dessas lesões com
alterações genômicas.
4.1.4.procedimento de coleta
O fluxograma desta pesquisa encontra-se representado na figura 09.
Inicialmente, fez-se um contato por telefone com a direção do curtume e , em
seguida, por visita. Nas ocasiões foram enfatizadas a importância da pesquisa,
para a empresa, visto que a saúde de seus funcionários poderia ser verficada de
forma gratuita sem ônus para os proprietários. Além da importância dos
resultados para a comunidade científica, visto que há contradições quanto ao uso
do sulfato de cromo III e sua toxicidade. Após a autorização, marcou-se uma
reunião com todos os trabalhadores para os devidos esclarecimentos e, aos que
56
aceitaram participar foi aplicado o Termo de consentimento livre e Esclarecido
(TCLE) .
Para fins de avaliação do trabalhador, foi aplicado um questionário para
entrevista (ANEXO 01) abrangendo questões demográficas, hábitos de vida
(alimentares, tabaco, álcool, café), bem como ocupacionais, históricos médicos e
familiares, duração da aplicação, tipos dos agrotóxicos e os equipamentos de
proteção individual (EPIs), utilizados para o grupo exposto. O questionário
aplicado é baseado nas recomendações daInternational Comission for Protection
Against Environmental Mutagens and a Carcinogens (ICPEMC) (Carrano and
Natarajan, 1988). Após preenchimento do questionário, realizou-se a coleta de
amostras biológicas dos trabalhadores par a análises laboratoriais.
4.1.5.coleta e transporte das amostras
A coleta das amostras biológicas foi feita por profissionais capacitados
do Laboratório Central de Saúde Pública do Estado do Piauí (LACEN), no local de
trabalho dos voluntários.
Foram utilizadas seringas heparinizadas para as análises dos testes
genotóxicos. A quantidade de sangue coletada de cada trabalhador foi 10 mL
(para análises de micronúcleos em linfócitos, cometa em linfócitos e aberrações
cromossômicas). As células esfoliadas de mucosa bucal (para análises de
micronúcleos em mucosa bucal e cometa em mucosa bucal) foram coletadas com
o uso de escova cervical, sem raspagem da língua, sendo em seguida submersas
em uma solução salina isotônica (0,9 %) contida em tubos Falcon rotulados, com
os códigos dos sujeitos, e protegida da ação da luz até a chegada ao laboratório.
4.1.6.coleta urinária para análise de cromo:
Para análise de cromo na urina foram utilizados coletores de urina de
50 mL, de plástico (polietileno, polipropileno ou PVC com tampa de rosca)
transparente, os quais foram etiquetados (constando nome, data de coleta,
empresa e setor). No ato da coleta, fez-se limpeza das mãos antes. Orientou-se
os trabalhadores que nunca deixassem que os dedos entrassem em contato com
a parte interna do frasco ou tampa.
57
Toda a coleta foi realizada no último dia da jornada semanal de
trabalho (sexta-feira) pela manhã, em um local privativo distante do ambiente do
curtume. Por fim, congelou-se as amostras, mantendo-as neste estado até a
chegada ao laboratório de Toxicologia –setor de metais da Escola Nacional de
Saúde Pública da Fundação Oswaldo Cruz em Manguinhos no Estado do Rio de
Janeiro (capital), local de processamento. Para esta análise utilizou-se a
espectroscopia atômica com forno de grafite acoplado.
Aplicação de TCLE e
Grupo exposto
N = 43
Análises genotóxicas e
mutagênicas
Cometa
Aberrações
cromossômicas
Mucosa N=20
Não Expostos
Questionário saúde
ocupacional
Cromo na
urina N=27
N = 43
Cromo na
urina N= 27
Micronúcleo
Cometa
Mucosa N=20
Mucosa N=20
Análises genotóxicas e
mutagênicas
N= 30
Linfócitos N= 43
Aberrações
cromossômicas
Micronúcleo
Mucosa N=20
N=30
Linfócitos N= 30
Linfócitos N=30
resultados
Linfócitos N=30
resultados
Análises estatísticas
Figura 09.Fluxograma das etapas da pesquisa realizada.
58
4.2. Avaliação Genotóxica
A avaliação de danos induzidos ao material genético foi realizada com
as aplicações da técnica da eletroforese em gel de células individualizadas
(SCGE), ensaio cometa.
4.2.1.teste do cometa em células de mucosa bucal
É
uma
importante
ferramenta
utilizada
nos
estudos
de
biomonitoramento populacional (Collins et al., 2008). As amostras de células
esfoliadas de mucosa bucal (Figura 10) de cada paciente foram centrifugadas por
10 minutos (1500 rpm), em três lavagens, com solução salina a 0,9% NaCl. As
lâminas foram cobertas por solução de agarose de ponto de fusão normal a
0,75%. Posteriormente, foram mantidas em temperatura ambiente até a
solidificação da agarose. Esta camada foi utilizada para promover a adesão da
segunda camada de agarose de baixo ponto de fusão. Foram retirados 30 µL de
células esfoliadas de mucosa bucal suspendidas em PBS e misturadas com 110
µL de agarose low mellting, a 37ºC e colocadas em forma de gotas sobre as
lâminas, e cobertas com as lamínulas (24 x 60 mm), mantidas em baixa
temperatura por 30 min até solidificar a agarose. Depois, a lamínula foi retirada e
a lâmina mergulhada em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA , 10 mM
Tris, 1% Triton X-100, 10 % DMSO; pH 10) a 4ºC e protegida da luz por no
mínimo 24 horas. Ao serem removidas da solução de lise,as lâminas foram
colocadas na posição horizontal na cuba de eletroforese e submetidas à corrida
de eletroforese. Esta estava em um banho de gelo, para manter a temperatura da
eletroforese constante em torno dos 4ºC. A cuba foi, então, preenchida com a
solução de eletroforese (1 mM EDTA, 300 mM NaOH; pH > 13) recém-preparada ,
a um nível superior (0,25cm, em média) às lâminas, ficaram em repouso por 20
min para o desenrolamento do DNA, o afrouxamento de suas ligações e a
exposição dos sítios álcali-lábeis. A eletroforese foi conduzida usando 25 V e 300
mA, por 15 min. Todos estes passos foram realizados na presença de baixa
luminosidade. Após a eletroforese, as lâminas foram retiradas da cuba e
mergulhadas na solução de neutralização (0,4 M tris; pH 7,5, por 5 min). As
lâminas foram fixadas por 10 minutos em solução fixadora (Ácido tricloroacético
59
15%; Sulfato de zinco heptahidratado 5% e Glicerol 5%), posteriormente, foi feita
a coloração com solução de nitrato de prata. Lavou-se 3x com água destilada,
mantendo as lâminas nas cubetas, Adicionou-se a solução de parada ( ácido
acético) nas cubetas deixando-as por 5 minutos, mais três lavagens com água
destilada e deixada secar em bandejas. Imagens de 100 células foram
selecionadas aleatoriamente (50 células de cada uma de duas laminas) por
indivíduo.
Figura 10. Esquema do teste de cometa conforme protocolo de (Tice et al.,
2000) usado para a avaliação de genotoxicidade em agricultores expostos aos
agrotóxicos.
A avaliação visual (Figura 11) dos cometas é um método de avaliação
bem validado que tem uma alta correlação com a análise de imagens por
computador (Collins et al., 2008). A análise, feita pelo padrão de escores, onde,
de acordo com o tamanho e intensidade da cauda do cometa, os mesmos foram
divididos em cinco categorias (0-4) de acordo com a percentagem de DNA na
cauda do cometa, que indica o grau de lesão sofrido pela célula: 0 = sem danos
(<5%); 1 = baixo nível de danos (5-20%); 2 = médio nível de danos (20-40%); 3 =
alto nível de danos (40-95%); 4 = dano total (95%). O controle negativo foi
processado separado das amostras dos trabalhadores de curtume.
60
C
Á
L
C
U
L
O
2
D
O
0
1
1
2
3
3
Í
N
D
4
apoptose
4
I
apoptose
C
E
Figura 11. Classes de Danos ao DNA analisados no Teste Cometa.
(Adaptado de Villela Det al., 2006).
E
4.2.2.Teste do cometa em linfócitos de sangue periférico
D
A
As amostras de sangue de cada indivíduo foram coletadas através de
N
punção venosa, cerca deO 5 mL de sangue periférico com seringa estéril e
descartável, contendo o anticoagulante heparina sódica 5000 U/ml. Do sangue
(
I
final de 9%) , adicionado 13,25%
de DMSO. Foram estocadas no freezer a -80º C
D
e antes do processamente) foram colocadas no banho- Maria a 37º C. O teste
heparinizado 100 µL foi colocado em 5 mL de meio RPMI 1640 (na concentração
Cometa foi realizado segundo Singh
etdeal.Céls
(1988),
com
Total
X Total
de modificações de Tice et al.
Dano
Classe de Dano
Danos
(2000), com adaptações de (Vilella, 2006). As lâminas foram pré-cobertas por
0
_____ x 0
solução de agarose de ponto
fusãox 1normal a 0,75%. Posteriormente, foram
1 de_____
2
_____
mantidas em temperatura ambiente
atéxa2 solidificação da agarose. Esta camada
3
_____ x 3
foi utilizada para promover a4 adesão
_____da
x 4segunda camada de agarose de baixo
ID (%)foram
∑Danos
ponto de fusão. As amostras
centrifugadas a 900 rpm, o sobrenadante
descartado e 5 µL do centrifugado foi misturado com 95 µL (0,75%) de agarose
61
de baixo ponto de fusão ( low mellting), a 37ºC e colocadas em forma de gotas
sobre as lâminas, e cobertas com as lamínulas (24 x 60 mm), mantidas em baixa
temperatura por 5 min até solidificar a agarose. Depois, a lamínula foi retirada e a
lâmina mergulhada em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA , 10 mM Tris,
1% Triton X-100, 10 % DMSO; pH 10) a 4ºC e protegida da luz por no mínimo 24
horas. Ao serem removidas da solução de lise, as lâminas foram colocadas na
posição horizontal na cuba de eletroforese. Esta estava em um banho de gelo,
para manter a temperatura da eletroforese constante em torno dos 4ºC. A cuba
foi, então, preenchida com a solução de eletroforese (1 mM EDTA, 300 mM
NaOH; pH > 13) recém-preparada, a um nível superior (0,25cm, em média) às
lâminas, ficaram em repouso por 20 min para o desenrolamento do DNA, o
afrouxamento de suas ligações e a exposição dos sítios álcali-lábeis.
A eletroforese foi conduzida usando 25 V e 300 mA, por 15 min. Todos
estes passos foram realizados na presença de baixa luminosidade. Após a
eletroforese, as lâminas foram retiradas da cuba e mergulhadas na solução de
neutralização (0,4 M tris; pH 7,5, por 5 min). As lâminas foram fixadas por 10 mim
em solução fixadora (Ácido tricloroacético 15%; Sulfato de zinco heptahidratado
5% e Glicerol 5%), após secagem das lâminas foram coradas com solução de
nitrato de prata (0,02%). Lavou-se 3x com água destilada, mantendo as lâminas
nas cubetas, Adicionou-se a solução de parada (ácido acético) nas cubetas
deixando-as por 5 minutos, mais três lavagens com água destilada e deixada
secar em bandejas. Imagens de 100 células foram selecionadas aleatoriamente
(50 células de cada uma de duas lâminas) por indivíduo (Figura 12).
Para verificação da ocorrência de cometas em trabalhadores rurais no
Estado do Piauí, um total de 15.200 linfócitos foram analisados, a partir da cultura
de
linfócitos
do
sangue
coletado
dos
indivíduos
pesquisados.
contabilizadas 100 células (50 células/lâmina) por indivíduo (ANEXO V).
Foram
62
Figura 12. Esquema do teste de cometa em cultura de linfócitos conforme protocolo
de Singh et al (1988) eTice et al.(2008) usado para a avaliação de genotoxicidade em
trabalhadores de curtume.
4.3.Avaliação mutagênica
A avaliação da mutagenicidade dos trabalhadores expostos no
curtume foi realizada com os testes citogenéticos de micronúcleo em células
esfoliadas do epitélio bucal em cultura de linfócitos com bloqueio da citocinese,
como também, pelo teste de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos.
4.3.1.teste de micronúcleos
Os MNs representam marcadores simples, e são considerados valiosos
na avaliação de danos citogenéticos de populações ocupacionalmente expostas a
diversos agentes químicos.
63
4.3.1.1.teste de micronúcleo em células esfoliadas de epitélio bucal
O teste de MN foi realizado nas células epiteliais da mucosa oral de
acordo com Holland et al., 2008. A coleta de células bucais foi obtida através de
fricção na bochecha dos indivíduos com escova cytobrush. As células foram
coletadas em tubos falcon contendo 5mL de solução salina (0,9 %) e transportada
para processamento no Laboratório de Toxicologia e Genética Molecular LABTOXIGEN do LACEN-PI. Após três lavagens com PBS por centrifugação à 1500
rpm por 10 minutos, com a retirada do sobrenadante entre as centrifugações, 50
μl de suspensão de células foram gotejadas sobre lâminas pré-aquecidas (37º C)
em chapa aquecedora. Em seguida, as células foram fixadas com metanol: ácido
acético (3:1) durante 15 min, e dispostas horizontalmente à temperatura ambiente
por 24 horas. Após esse período, as lâminas foram colocadas em água destilada
por 1 minuto para hidratação das células, antes de realizar a coloração. As células
foram coradas com Giemsa 10% durante 15 minutos. Realizou-se a lavagem das
lâminas por duas vezes com água destilada durante 3 minutos para retirar o
excesso do corante. Após secas, as lâminas foram examinadas em microscopia
óptica, com o aumento de 1000 X (Figura 13). Foram contadas cerca de 2.000
células para cada indivíduo. Os critérios de identificação do MN foram os
descritos por (Holland et al., 2008), como estruturas que apresentem distribuição
cromatínica e coloração igual (ou mais clara) do que a do núcleo, que estejam no
mesmo plano que este, apresentam limites definidos e semelhantes aos
nucleares e o seu tamanho não ultrapassar 1/3 do tamanho do núcleo (Holland et
al., 2008).
Figura 13.Esquema simplificado do Teste de MN em mucosa bucal representado
segundo protocolo de Holland et al. (2008).
64
4.3.1.2.Teste de micronúcleos com bloqueio de citocinese
Para o teste de micronúcleo com bloqueio da citocinese (CbMN) o
sangue foi coletado em seringas previamente heparinizadas. Cerca de 0,5 mL de
sangue foi colocado em 4-5 mL de RPMI 1640 suplementado com 15 % de soro
bovino fetal, 1% de antibiótico (penicilina e estreptomicina), 1% de L-glutamina e
1% de fitohemaglutinina. Os linfócitos são incubados por 7 h em até 37ºC. A
citocalasina B foi preparada em DMSO na concentração de 6 g/mL e estocada
em 20ºC. Essa solução foi adicionada na cultura em 44h. Após as 72h de
incubação as culturas foram centrifugadas em 800 rpm por 8 minutos para
eliminar as células vermelhas. As células lavadas em RPMI 1640 e tratadas em
um meio hipotônico por 2-3 min em 0,075 M de KCL a 4ºC. O procedimento foi
feito por 3X. As células foram centrifugadas e adicionadas na solução com
metanol-ácido acético 3:1 e gentilmente agitadas. Esse processo foi repetido por
3X. As células foram ressuspendidas e colocadas em lâminas e coradas com
GIEMSA a 10% em tampão fosfato a pH 6.8, por 10 minutos (Figura 14). As
células foram observadas em microscopia óptica em objetivas de 100X e
fotografadas. 1000 células binucleadas com citoplasma preservado foram
avaliadas quanto à frequência de micronúcleos (Fenech, 2007).
Citocalacina
Figura 14. Esquema simplificado do Teste de MN em linfócitos com bloqueio de
citocinese (CbMN) (Fenech, 2007).
4.3.2.teste de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos
As preparações metafásicas para a análise convencional de AC foram
efetuadas de acordo com Sram et. al. (2007), seguindo os seguintes passos
65
(Figura 15), através de punção venosa de cada indivíduo foram coletados cerca
de 5 mL de sangue periférico com seringa heparinizada, estéril e descartável.
Foram adicionadas 18 gotas do sangue em culturas de 5 mL de meio RPMI 1640,
suplementado com 15 % de soro bovino fetal, 1% de antibiótico (penicilina e
estreptomicina), 1% de L-glutamina e 1% de fitohemaglutinina( para estimular a
divisão celular). As culturas foram incubadas em estufa comum a 37 ºC por 72
horas. Adicionou-se a colchicina (16 g/mL, Sigma), 2 horas antes de completar
48 horas de incubação para obtenção de células em metáfase. Após às 72 horas
de incubação, a cultura de linfócitos foi transferida para um tubo falcon de 10 mL
estéril e centrifugada a 1000 rpm por 5 minutos, fazendo uma lavagem com
solução hipotônica (0,075 M) para rompimento das
membranas celulares.
Adicionou-se 5 mL de fixador, que consiste em metanol e ácido acético (3:1). As
lâminas foram preparadas pelo método de Moorhead et al. (1960) modificado e as
metáfases foram coradas com Giemsa (10%), diluído em tampão Sorensen para
posterior visualização ao microscópio. Foram analisadas 100 metáfases/indivíduo
bem espalhadas e sem sobreposição, em microscópio de luz e em objetiva de
imersão. Dentre as AC foram avaliadas em 100 metáfases, identificadas em 300
células
de
cada
indivíduo,
os
cromossomos
dicêntricos
e
tricêntricos,
cromossomos em anéis e em anéis acêntricos, fragmentos cromossômicos,
deleções terminais e deleções intersticiais foram identificados segundo Tolbert et
al. (1991).
Figura 15. Esquema representativo do Teste de Aberrações Cromossômicas
montado segundo o protocolo de Sram et al.(2007).
66
4.3.3.Dosagem do cromo na urina
Devido ao grande debate acerca do cromo III e sua possível
genotoxicidade, fez-se uma coleta de urina afim de quantificarmos o referido
metal nos indivíduos estudados. Este procedimento se processou durante a coleta
das amostras de sangue e da mucosa bucal. Os primeiros 27 (vinte e sete)
indivíduos que forneceram material para as análises.
O equipamento utilizado na determinação de cromo na urina foi um
espectrômetro de absorção atômica AAnalyst 800 equipado com atomizador
eletrotérmico transversal, corretor de fundo Zeeman longitudinal e amostrador
automático AS-800, todos Perkin-Elmer( Norwalk , CT , USA ). Tubos “end cap”
recobertos com grafite pirolítico (Perkin Elmer Part N°B3000655) foram usados
nesses experimentos. O comprimento de onda da lâmpada de catodo oco (PerkinElmer Part N°N3050119) de cromo foi de 357,9 nm, enquanto que a largura da
fenda foi de 0,7nm. A metodologia para a determinação do cromo em urina seguiu
o protocolo já estabelecido pelo Setor de Metais da FIOCRUZ. As condições
STPF ("Stabilized Temperature Platform Furnace") foram adotadas no forno de
grafite para reduzir, ou até mesmo eliminar, as interferências. Entre elas, está a
utilização de um modificador químico, necessário em matrizes mais complexas,
como é o caso da urina, e leituras em área de pico. A exatidão dos resultados é
acompanhada através da análise, em cada série de amostras, de materiais de
referência.
Toda a vidraria e utensílios plásticos utilizados ficaram imersos em uma
solução de Extran 5% v/v, por um período mínimo de 24 horas. Após este tempo,
o material foi enxaguado com água corrente em abundância e, em seguida,
imerso em uma solução de ácido nítrico 10% v/v para a descontaminação por,
pelo menos, 48 horas. Após serem enxaguados várias vezes com água
deionizada do Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) , esse material foi seco em
estufa a 30ºC, devidamente protegido de contato com superfícies metálicas e de
poeira até o uso.
Todos os reagentes (Merck, Elmsford , NY , USA ) e água utilizados
foram da mais alta pureza:
· Padrão de Cr
· Nitrato de magnésio 10% (m/v)
67
· Ácido nítrico p.a.;
Soluções:
·
Solução estoque de Cr: 1000 µg mL-1 preparada a partir do
concentrado Titrisol-Merck
· Solução de trabalho de Cr: 1,00 µg mL -1 preparado a partir da
solução acima, por diluição adequada com HNO 3 0,2 % v/v;
· Modificador Químico: solução de Mg(NO 3)2 0,5% m/v em HNO 3
0,2 % v/v.
Preparação das amostras
A urina foi diluída 1+1 em ácido nítrico 0,2% (v/v), enquanto que a
amostra de referência Seronorm Trace Elements Urine Lot 0511545 (19,7 +/1,3 µg L-1), foi reconstituída de acordo com as recomendações do fabricante e
diluída cinco vezes também em ácido nítrico.
4.4. Aspectos Éticos
A pesquisa, com o protocolo experimental e o termo de consentimento,
foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFC, credenciado pelo CONEP
– Conselho Nacional de Saúde/MS. Os ensaios somente foram iniciados após a
aprovação expedida pelo Comitê de Ética. O comitê no ato de suas atribuições
expediu o documento de aprovação com número de protocolo 195, no dia 26 de
setembro de 2008 (ANEXO 02). Uma cópia da aprovação foi enviada a Secretária
de Estado da Saúde do Piauí e à direção do curtume, antes do início do estudo. O
Estudo foi conduzido com devido respeito aos critérios estabelecidos pela
declaração de Helsinque (1964) e as revisões de Tóquio (1975), Veneza (1983),
Hong Kong (1989), Somèrset Oest (1996), e Edimburgo (2000), assim como as
regulamentações nacionais (Resolução 196/96 e 251/97 do CNS-MS). Os
voluntários receberam explanação da natureza e dos objetivos do estudo (Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido –TCLE). Foi enfatizado que o estudo tem a
finalidade de pesquisa aplicada. Os voluntários foram cientes de que são livres
para se retirarem a qualquer momento do estudo, sem serem obrigados a
fornecer o motivo de fazê-lo, e sem que isto cause qualquer prejuízo aos
mesmos. Todos os resultados obtidos no processamento das amostras foram
entregues aos respectivos voluntários da pesquisa e a Diretoria de Vigilância
68
Sanitária, através do Centro Estadual de Referência em Saúde do Trabalhador,
respeitando os mesmos e preservando o sigilo das informações.
4.5. Análise Estatística
Os dados obtidos neste trabalho foram submetidos ao programa SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences) versão 17.0, para análises de
correlações de Pearson e regressão linear. O programa Prisma versão 5.0. foi
utilizado para tratamento estatístico com Teste t de Student (diferenças entre as
médias de frequências dos micronúcleos, aberrações cromossômicas, índices de
danos (cometa) e cromo na urina) e análises de variância (ANOVA) para as
classes de danos nas comparações entre os indivíduos expostos com os não
expostos. Adotou-se níveis de significância de *P<0,05.
69
RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO
70
5.1. Características do curtume estudado e perfil do grupo de trabalhadores
expostos versus não expostos
O curtume, ambiente do estudo, localiza-se na rua Poty velho nº 380 na
cidade de Teresina capital do Estado do Piauí (Figura 16).Em sua rotina
empresarial, processa, em média, 1.000 (mil) peças por mês. Sua matéria prima
(a pele) é oriunda de 03 (três) Estados- Piauí, Ceará e Maranhão.
Figura 16. Vista aérea do curtume local do estudo. Seta
indicando as dependências da empresa.
No momento da pesquisa, contava com 106 funcionários. Destes, 13
respondiam pelo setor administrativo, 03 pelos serviços gerais e 90 por todo o
processamento do couro.
O processamento de couro esta dividido em setores. Estes setores
são: recebimento e armazenamento de pele, ribeira, curtimento e acabamento
(Figura 17). A empresa funciona de 07:00 horas da manhã às 18:00 horas da
noite de segunda a sexta, sendo de 08:00 às 12:00 h nos sábados.
71
Figura 17. Ambiente sem barreira física dos setores. Armazenamento dos produtos
químicos utilizados no processamento da pele. Bateria de fulões. Ajuste das
espessuras do couro recém curtidos com cromo (wet-blue).
Ficou evidente que o ambiente, composto por galpões, não possuia
barreira física (Figura 17). Os setores encontram-se em um mesmo ambiente
atmosférico. Misturas de odores e gases torna-se perceptível já na parte externa
da fábrica aumentando a sua intensidade próximo ao ambiente.
Dos 86 (oitenta e seis) indivíduos estudados, 43 (quarenta e três) eram
trabalhadores do curtume (expostos) e 43 (quarenta e três ) não trabalhavamno
curtume (não expostos/controle negativo). Sobre estes últimos, correspondiam a
profissionais liberais e funcionários de um escritório de contabilidade da cidade de
Teresina –PI, não expostos a substâncias químicas na sua rotina laboral.
A idade dos indivíduos objeto da investigação não diferiu
significativamente dos não expostos (Tabela 02) .
72
Tabela 02. Média das idades e desvio padrão das cargas horárias semanais
de trabalho dos indivíduos expostos e dos indivíduos não expostos.
Teresina, 2008 a 2011.
GRUPOS
IDADE
EXPOSTO
34,42 ± 9,61
(n=43)
NÃO EXPOSTO
(n=43)
CARGA
HORÁRIA/SEMANA
44,51± 0,98
(18-65)
(44-50)
32,40 ± 8,10
44,19± 0,93
(20-51)
(44-50)
p> 0,05 para carga horária através do teste χ2 (qui-quadrado)
Este dado é importante pois disparidades entre as idades dos grupos
poderia significar
não confiabilidade no resultado. Ocorre um aumento
espontâneo da instabilidade cromossomal associado à idade que se reflete com o
aumento do número basal de MN. Contudo, apesar de existirem grandes
correlações entre o aumento da idade e a frequência de MN, em relação às AC
existem baixas correlações (Cardinale, Bruzzi e Bolognesi, 2012).
Ainda em relação à idade, a moda encontrava-se entre25 e 30 anos
(18 indivíduos) nos expostos e nos não expostos encontrava-se entre 22 e 32(06
indivíduoscada) (Figura18:A e B).
73
8
6
10
frequência
Frequência
15
5
4
2
0
0
0
20
A)
40
60
80
0
20
40
60
B)
Figura 18. A) histograma dos trabalhadores expostos N=43, Mínimo=18, Máximo=
65, Média 34,4.Moda = 25 a 30 (18 indivíduos). B) Histograma dos trabalhadores
não expostos N= 43, Mínimo= 20, Máximo= 51, Média= 32,4, Moda= 22 (6 indivíduos)
e 32 (6 indivíduos).
Os hábitos de vida foram investigados. Em relação ao consumo de
cigarros e ao consumo de álcool, dos 43 trabalhadores expostos 20 (46,5 %) e 26
(60,5 %) não expostos confirmaram o hábito, respectivamente (Tabela 03). Em
relação ao nível educacional, todos os indivíduos possuíam apenas o nível
fundamental de escolaridade (dados não mostrados).
Cordeiro (1998) em um estudo realizado em curtumes da cidade de
Botucatu em São Paulo detectou que um terço da população estudada era
composta por fumantes. Outro terço nunca teria fumado, sendo o terço restante é
composto por ex-fumantes. Quarenta e dois por cento da população estudada foi
composta por etilistas. Quarenta por cento referiram nunca, ou apenas
eventualmente, ingerirem bebidas alcoólicas. O restante foi composto por exetilistas.
Hábitos como o tabagismo e o consumo de álcool podem atuar
comoimportantes fatores nas lesões ao DNA, aumentando as chances de
ocorrência de micronúcleos (El-Zein, Vral e Etzel, 2011; Fenech e Bonassi, 2011)
Em nossa pesquisa não foram excluídos os fumantes dos não
fumantes, visto que o n foi reduzido. Além disso, existem dados conflitantes em
relação ao hábito de fumar e o aparecimento de MN. Inúmeros relatos indicam
que não existem associações entre fumantes e o aumento da migração de DNA
em linfócitos periféricos de fumantes de mais de 20 cigarros por dia (Fenech e
Bonassi, 2011).
74
Assim, para evitar perdas, visto que grande parte dos trabalhadores
fuma (Tabela 03), nenhum dos indivíduos foi descartado. Fez-se na sequência
uma análise de correlação para avaliar até que ponto o hábito de fumar
influenciou na avaliação mutagênica e genotóxica ( Tabela 10).
Na maioria dos países existe uma correlação entre tabagismo e
etilismo, baixa renda e baixo nível de escolaridade. Na China, indivíduos com
nenhuma escolaridade têm uma probabilidade cerca de 7 vezes maior de
seremfumantes do que indivíduos que têm o terceiro grau. No Brasil, entre os
grupos de indivíduos com baixonível de escolaridade essa probabilidade é 5
vezes maior (World Bank, 2003).
Tabela 03. Hábito de fumar e consumo de álcool dos indivíduos expostos e dos
indivíduos não expostos. Teresina, 2008 a 2011.
GRUPOS
HÁBITO
DE
FUMAR
CONSUMO DE
ÁLCOOL
%
SIM
20
46,5
26
60,5
NÃO
23
53,5
17
39,5
TOTAL
43
100,0
43
100,0
13
30,2
30
69,8
30
69,8
13
30,2
43
100,0
43
100,0
%
EXPOSTO
(n=43)
NÃO
EXPOSTO(n=43)
SIM
NÃO
TOTAL
p = 0,183 para o hábito de fumar.Teste exato de Fisher; p= 0,497 para o consumo de álcool.Teste
exato de Fisher
O tempo de trabalho e o setor em que trabalham na empresa também
foram verificados.
75
Observou-se que os que possuem entre 1 a 05 anos de tempo de
serviço correspondiam a maior porcentagem de indivíduos seguidos dos que
exercem a função por mais de 10 anos. Dentre os setores o que possuiu maior
número de indivíduos investigados foi do wet-blue com 44,19 % dos casos
(Tabela 04).
Tabela 04. Tempo de trabalho e setor de trabalhos dos indivíduos expostos.
Teresina, 2008 a 2011.
TEMPO DE
TRABALHO
< 1ANO
4
SETOR DO CURTUME
%
%
x2
WET-BLUE
9,30
19
x2
44,19
27,56
13,65
1A5
ANOS
16
37,21
gL=18
SEMI-ACABADO
4
9,30
gL=3
6 A 10
ANOS
09
20,93
P=0,07
PRODUÇÃO
6
13,95
p=0,003
> 10
ANOS
14
32,56
SEPARAÇÃO DE
PELE
14
32,56
TOTAL
43
100,00
TOTAL
43
100,00
Teste x2(qui-quadrado). gL (grau de liberdade)
O uso de Equipamento individual também foi verificado. A figura 19
mostra a porcentagem de trabalhadores que relataram utilizar EPI e os que
disseram não utilizar.
76
Figura 19. Percentual de trabalhadores que utilizam EPI (azul n=40) e
percentual dos trabaladores que não utilizam EPI (vermelho n=03)
A importância dos EPI foi descrita por Bull et al. (2006) onde
investigaram arelação de uso de EPIs e danos genéticos. Eles poderam concluir
que o uso demedidas de proteção individual (>60%) levavam a resultados
negativos para apresença a danos ao DNA. Porém sete dos oitos estudos onde
ficou evidenciado o uso inadequado ou ausência dos equipamentos de proteção,
puderam
observar
um
aumento
estatisticamente
significativo
de
danos
citogenéticos. Sugerindo que o uso dos EPIs produzem algum grau de proteção
na prevenção da exposição ocupacional.
5.2. Análises de Genotoxicidade
5.2.1. teste do cometa em células esfoliadas de mucosa bucal
Para a análise de danos ao DNA fez-se o teste de cometa em mucosa
bucal em 40 (quarenta ) indivíduos , sendo 20 (vinte) expostos e 20 (vinte) não
expostos.
Os
resultados
indicaram
que
os
trabalhadores
de
curtume
apresentaram aumento significativos das classes de danos em relação ao grupo
não exposto (Figura 20).
77
Classes de danos por grupo
100
80
***
60
Expostos
40
Não expostos
***
20
***
**
*
0
D
o
an
0
D
o
an
1
D
o
an
2
D
o
an
3
D
o
an
4
D
o
an
0
D
o
an
1
D
o
an
2
D
o
an
3
D
o
an
4
Figura 20. Classes de danos obtidas através do teste cometa em mucosa
dos expostos em comparação as mesmas classes de danos observadas
nos não expostos *p<0,05; ** p< 0,001; ***p<0,0001 Teste t (classe por
classe).
Da mesma que as classes de danos, os resultados indicaram que os
indivíduos expostos apresentaram um maior índice e frequência de danos (
Figura 21) .
O teste cometa é um método visual para detectar danos em células
interfásicas, sendo uma técnica especialmente rápida e sensível em captar lesões
no DNA (Hartmann e Agurell, 2003).
Os danos mensurados correspondem a
escores de 0 a 4, que segundo Tice et al. (2000) a depender da extensão do dano
podem ser reparáveis.
78
***
100
80
N
A)
ão
p
ex
s
to
os
os
st
o
p
Ex
40
20
0
st
os
0
60
ex
po
20
***
Nã
o
40
80
Ex
po
st
os
60
Frequência de danos (%)
Índice de danos %
100
B)
Figura 21. índice (A) e frequência de danos (B) observados em
trabalhadores expostos (n=20) e não expostos (n=20) ***p<0,0001
Teste t.
Foi observado, em todos os escores, um aumento dos níveis de danos
ao DNA dos trabalhadores expostos quando comparados ao grupo controle,
indicando um forte componente ambiental como contribuidor no aparecimento
destas lesões. Contudo, segundo (Tice et al., 2000) os danos observados podem
ser reparados.
Quando comparado o índice e a frequência dos danos, avaliados pelo
teste do cometa, o grupo de trabalhadores expostos apresentou um aumento
significativo de danos ao DNA (p<0,0001) quando comparado ao grupo controle,
indicando que os mesmos estão sofrendo quebras nas fitas de DNA, e que a
exposição repetida e continuada a algum componente no ambiente laboral, vem
causando danos contínuos ao DNA nas células dos trabalhadores.
5.2.2. teste do cometa em células sanguíneas (linfócitos)
Para o teste de cometa em linfócitos foram utilizados 86 (oitenta e seis)
sujeitos (43 expostos e 43 não expostos). Similarmente aos resultados do teste do
cometa em mucosa as análises indicaram uma diferença significativa nos valores
de danos nos trabalhadores expostos.
Através do teste t classe por classe
(exposto versus não exposto) obteve-se p<0,0001 (Figuras 22 e 23).
79
Classes de danos por grupo
100
EXPOSTOS
NÃO EXPOSTOS
80
***
60
40
***
20
***
***
***
0
o
an
D
0
D
o
an
1
D
o
an
2
D
o
an
3
D
o
an
4
D
o
an
0
o
an
1
D
o
an
D
2
o
an
D
3
o
an
D
4
Figura 22. Classes de danos observadas nas análises do teste do cometa em
linfócitos dos trabalhadores expostos (n=43) em comparação as mesmas classes
de danos observadas nos não expostos (n=43) *p<0,05; ** p< 0,001; ***p<0,0001
Teste t (por classe).
***
Freqüência de danos (%)
20
A)
20
0
ão
N
ão
Ex
Ex
po
st
os
po
st
os
0
40
po
st
os
40
60
Ex
60
80
B)
N
80
***
100
Ex
po
st
os
Índice de danos
100
A)
Figura 23. índice de danos (A) e frequência de danos (B) obtidos através do teste
do cometa em linfócitos. Trabalhadores expostos vs não expostos ***p< 0,0001
Teste t.
Zhang (2008), analisou, através do teste de cometa em linfócitos, o
nível de lesão em 60 trabalhadores de curtume ocupacionalmente expostos ao
cromo trivalente. Os resultados o sugeriram que a exposição ocupacional ao
cromo trivalente pode levar a danos ao DNA detectáveis.
A oxidação ao DNA é conhecida como o mais comum mecanismo de
dano ao DNA humano, especialmente induzido por Espécies Reativas de
80
Oxigênio (EROS), que geram os radicais livres e outras
formas reativas de
oxigênio (peróxido de hidrogênio, anion superóxido, oxigênio singlet, radical
hidroxil, óxido nítrico e peroxinitritos). As EROs são produzidas nas células
durante metabolismo normal envolvendo os processos com oxigênio. São
geradas durante respiração celular, processos de biossíntese e biodegradação,
biotransformação de xenobióticos e ativação fagocítica. Existem cerca de 60
reações enzimáticas envolvendo o oxigênio como substrato. A presença de EROs
pode ser significantemente aumentada pela exposição a diferentes toxinas
ambientais produzidas na indústria, agricultura, hábitos de fumar ou poluição
acidental (Azqueta et al., 2011).
A principal forma de lesão ao DNA gerado pela interação com o Cr é
através da formação de adutos. A maioria (50-75%)de adutos gerados in Vitro Cr
(VI) são
complexos binários (Cr-DNA). Adutos binários são fracamente
mutagênicos. A forma predominante de complexos Cr-DNA em células são crosslinks, que incluem pontes deCr (III)- DNA e pequenas moléculas celulares. São
quatro, as principais formas de adutos:
glutationa-Cr-DNA, cisteínaCr-DNA,
histidina-Cr-DNA,
Todos
e
ascorbato-Cr-DNA.
estes
adutos
são
mais
mutagênicos que os adutos binário. Todavia, tais adutos são substratos para o
reparo por excisão de nucleotídeos (NER) em humanos (Salnikow e Room, 2009).
Neste estudo, todas as classes de danos foram significativamente
maiores em relação aos trabalhadores não expostos, indicando que os indivíduos
estão se expondo a eventos genotóxicos.
Os danos observados no presente estudo podem ser provavelmente,
relacionados às quebras simples e duplas, formação de adutos ao DNA e pontes
intra e intercadeias, possíveis de serem detectados na versão alcalina do teste do
cometa (Møller, Knudsen and Loft, 2000; Tice et al., 2000; Šrut, Štambuk and
Klobučar, 2013).
Enfatiza-se que o teste cometa é um biomarcador de genotoxicidade
que indica danos recentes ao DNA, com ações da maquinaria de reparo de DNA
e que infelizmente, não foram realizadas novas análises para verificarmos o grau
de reparo dos
danos no DNA dos indivíduos expostos. Contudo, outros
biomarcadores de mutagenicidade foram aplicados para a avaliação de
81
instabilidade genética com capacidade para evidenciar a fixação de danos em
células de mucosa bucal e em linfócitos de sangue periférico (Collins et al., 2008).
5. 2.3 Análises das alterações cromossômicas
Os efeitos da exposição a substâncias químicas contendo cromo III em
indústria de curtume de Teresina, são mostrados na Tabela 05. Diferenças
significantes (P < 0,0001) na frequência de AC foram observadas entre os
trabalhadores expostos (8,01 ± 1,82) em relação aos trabalhadores não expostos
(0,403± 0,09) Gráfico II figura 24. Além disso, ados não significantes (P>0,05)
foram encontrados em relação a % de metáfase (índice metafásico) Gráfico I
figura 24. Em relação aos tipos de aberrações cromossômicas estruturais dados
significantes foram encontrados para cromossomos tricêntricos (P<0,01), anéis
(P<0,0001) e anéis acêntricos (P<0,01). Na figura 25 são apresentadas o perfil
dos cromossomos encontrados nos trabalhadores de curtume estudados.
Os resultados das aberrações cromossômicas, em nosso estudo,
coinfirmam os dados sobre os danos de DNA encontrados no teste do cometa,
indicando uma possível consequencia destes efeitos.
A indução de AC resulta de processos complexos ainda não
entendidos completamente, dentre seus mecanismos citamos as quebras diretas
no DNA, os danos diretos no DNA durante replicação, a inibição da síntese de
DNA e inibição da topoisomerase II (Bolzán, 2012).
As análises de AC são um dos mais importantes testes citogenéticos.
Atuam como um forte indicativo de riscos de cânceres em populações expostas
ocupacionalmente
e
no
ambiente
a
agentes
químicos
que
induzem
genotoxicidade.
Estudos prévios sugerem que o aumento da frequência de AC em sangue
periférico indica uma predisposição ao cânce (Romm, Oestreicher e Kulka, 2009).
82
Tabela 05. Índice metafásico e aberrações cromossômicas em trabalhadores de indústria de curtume de Teresina-PI, 2008 a 2011.
Grupos
Nº de
células a
IM a
%
Aberrações cromossômicas
Dicêntrico
Tricêntrico
Anel
Anel
Fraguimentos
Total de
AC a
Del.Terminais
AC a
%
Del.Intersticiais
acêntrico
Expostos
n=30
Não
Expostos
376,2 ± 106,0
109,2 ± 14,6 53,9 ± 23,3
2,1 ± 0,6** 4,9± 4,0***
2,35 ± 1,45** 1,00± 0,50
(218-502)
(75-141)
(0 - 99)
(0-10)
(0-15)
(0-26)
(0-9)
322,6 ± 67,80
101,9 ± 14,8
5,4 ± 1,74
0,0 ± 0,0
0,5± 0,2
0,05 ± 0,05
0,05 ± 0,05
(195 - 432)
(57-125)
(0-6)
(0- 0)
(0- 4)
(0 - 1)
(0 - 1)
1,9 ± 0,51
(0 - 8)
0,10 ± 0,06
(0 - 1)
0,35 ± 0,1 16,3± 3,38*** 8,01 ± 1,82***
(0 - 2)
0,0 ± 0,0
(0 - 0)
(4 - 51)
(0,8-43,7)
0,60 ± 0,16
0,403± 0,09
(0-2)
(0 – 2,2)
n=30
aMédia ± Erro padrão. Diferenças significantes em ***P< 0,0001 em relação ao trabalhadores não expostos, observadas com o Teste t de Student.
83
I)
Índice Metafásico
150
100
50
Ex
po
st
os
N
ão
ex
po
st
os
0
II )
150
***
Número de Aberrações
cromossômicas
Número de Aberrações
cromossômicas
150
III)
100
50
0
***
100
50
0
to
os
xp
o
st
po
x
E
ão
E
N
o
st
po
x
E
ão
o
st
po
x
E
N
Figura 24. I índice metafásico grupo exposto versus não exposto p>0,05. II e III
número e frequência de aberrações cromossômicas obtidas através das análises
de aberrações cromossômicas em linfócitos ***p>0,0001 Teste t expostos (n= 30)
não expostos (n=30).
Semelhante aos nossos achados, Monteiro (2010) encontrou grande
número de AC em trabalhadores de um curtume na cidade de São Paulo.
As AC são particularmente perigosas para a célula porque a
descontinuidade física do cromossomo pode causar perda de informação genética, e
até mesmo morte celular (Heng et al., 2013).
84
ac
a
ac
A)
B)
C)
D)
Figura 25. Perfil Estrutural dos cromossomos com aberrações cromossômicas
identificadas em trabalhadores expostos em curtume. Em (A) observa-se que os
cromossomos anéis (a) e anéis acêntricos (ac); (B) cromossomos dicêntrico e
tricêntrico; (C) deleções terminais e intersticiais e em (D) aberrações cromatídica
do tipo quebra.
Corroborando com o estudo de Medeiros et al., (2003) e Monteiro (2010)
encontraram aumento do número de AC em trabalhadores de curtumes do Brasil,
Marrocos e na Itália, respectivamente, expostos a agentes químicos diversos. A
frequência de AC é uma análise citogenética sensível e que pode ser comumente
usada como um excelente biomarcador de risco ocupacional em indústria de
tratamento de couro, onde os trabalhadores estão expostos a agentes genotóxicos e
ou mutagênicos. Avaliação citogenética em sangue periférico após exposição aos
agentes clastogênicos tem sido aceita como uma técnica para o biomonitoramento
biológico de danos genéticos em células somáticas desde 1970 (Hamamy, AlHakkak e Hussain, 1987).
Muitas teorias que estão envolvidas nos mecanismos das AC ressaltam
conceitos de que clastogênicos agem diretamente sobre o DNA e causam quebras e
85
empareamento incorreto, com fixação de alterações nos cromossomos que são
visíveis em metáfases. Cabe enfatizar que as quebras vistas em metáfases e
anáfases não são originadas diretamente de quebras induzidas por agentes
clastogênicos, mas derivam de quebras geradas por enzimas envolvidas em
reparode DNA. As quebras são criadas: (1) durante o enovelamento normal do DNA
(topoisomerases) durante replicação do DNA, (2) quebras associadas com reparo
que ocorrem antes da replicação; (3) enzimas envolvidas no desenovelamento do
DNA, participam da síntese e reparo, mas não se ligam covalentemente ao DNA
(Luzhna, Kathiria e Kovalchuk, 2013).
As aberrações estruturais são oriundas de quebras e rearranjos
cromossômicos. Quando ocorre quebra, os fragmentos soltos dos cromossomos
podem estarem associados a aumentos de micronúcleos .
5.2.4.contagem de micronúcleos em células binucleadas de linfócitos
utilizando citocalasina b para bloqueio de citocinese (CbMN)
Foram realizadas análises de micronúcleos em linfócitos. Ao todo foram
contadas 1000 (mil) células binucleadas por indivíduo (Figura 26).
Os achados indicaram que os trabalhadores de curtumes possuíam um
maior número e frequência de micronúcleos quando comparados ao controle
p<0,0012 e p< 0,0001 respectivamente (Tabela 06 e figura 27).
A
B
Figura 26. Fotomicrografia: (A) linfócito binucleado e (B) célula binucleada com
com micronúcleo.
86
Tabela 06. Número de micronúcleos e frequência de micronúcleos em células
binucleadas de linfócitos em indivíduo expostos e indivíduo não exposto, Teresina,
2008 a 2011.
GRUPOS
Nº DE MN / 1000 CÉLULAS
BINUCLEADAS
% FREQUÊNCIA DE MN
17,73± 9,44a **
0,886±0,472a ***
(0-33)b
(0-1,65)b
10,90± 7,092a
0,306±0,202a
(2-30)b
(0-0,75)b
EXPOSTO
(n=30)
NÃO EXPOSTOS
(n=30)
a= média e desvio padrão ; b= mínimo e máximo **p=0,0012 ***p <0,0001 Teste t
25
20
1.5
**
1.0
15
***
10
0.5
5
0
Ex
ão
p
ex
N
N
ão
to
os
Ex
po
st
os
s
po
st
os
0.0
o
st
po
x
E
A)
B)
Figura 27. Número de micronúcleos (A) e frequência de micronúcleos (B) grupo
exposto (n=30) e grupo não exposto (n=30)**p=0,0012***p< 0,0001 Teste t.
Os nossos achados foram semelhantes ao de Hilali (2008). Da mesma
forma, o pesquisador evidenciou um aumento na frequência de micronúcleos em
linfócitos em trabalhadores de curtumes em Marrocos. O investigador não conclui
em seus estudos qual o componente ambiental (ou não ) responsável pelos efeitos.
87
Outro estudo que compactua com nossos resultados foi o de Balachandar
(2010) no Sul da Índia. O pesquisador encontrou aumento do número de
micronúcleos nos trabalhadores de curtume da região quando comparado ao grupo
de trabalhadores não expostos. Mais que isso, dosou o cromo na urina dos
expostos, demonstrando que os mesmos estão com níveis acima do recomendado.
Concluíram que os eventos genotóxicos diretos e indiretos possuem relação com a
exposição ao cromo. Embora no estudo não tenham sido realizados análises de
correlações entre as variáveis.
Em contradição, Migliori (1991) na análise de micronúcleos em controles e
de pessoas expostas em um curtume da Itália, não encontrou diferença
estatisticamente significativa entre as frequências de MN.
Os dados obtidos revelam danos aneugênicos e ou clastogênicos,
refletindo que nos trabalhadores expostos algum componente ambiental pode ter
contribuido, gerando um maior número de MN nos indivíduos investigados.
5.2.4.1 Correlação entre frequência de aberrações cromossômicas e frequência
de micronúcleos em células binucleadas
O objetivo da análise de correlação é medir e interpretar a força de uma
relação linear ou não linear entre duas variáveis contínuas. No âmbito da análise de
correlação, utilizamos o conceito de associação no sentido de "associação linear"
cuja representação, em nosso caso, estará expressa em um coeficiente r de
Pearson. Este pode assumir valores entre -1 e +1, que vão desde ser negativamente
correlacionada (-1) para não correlacionadas (0) positivamente correlacionados (+1).
O sinal do coeficiente de correlação (ou seja, positivo ou negativo) define a direção
do relacionamento. O valor absoluto indica a força da correlação (Bishara e Hittner,
2012; Scott, Flaherty e Currall, 2013).
Os dados desta pesquisa foram correlacionados. O valor foi significante
p<0,0001 para um r de Pearson de 0,557 (Tabela 07), apontando uma relação
moderada entre as variáveis. Logicamente, refletindo que há um impacto no valor
final devido ao efeito aneugênico, já que como mencionamos anteriormente a
quebra cromossômica justifica em parte a presença dos micronúcleos encontrados.
88
Tabela
07.correlação
aberrações
entre
cromossômicas
e
frequência
de
frequência
de
micronúcleos em células binucleadas, 2008 a 2011.
Frequência de aberrações
cromossômicas (n=26)
Variável
Frequência de
micronúcleos em linfócitos
(n=29)
r = 0,557
P<0,0001
Coeficientede Pearson = r
Ainda sobre os resultados encontrados, ao se elevar o valor do coeficiente
encontrado (r 2) obtêve-se o valor de variância compartilhada pelas variáveis. Como
pode-se observar 0,557
2
corresponde a 0,3102 ou apenas 0,31. Multiplicando-se
este resultado por 100 (cem) têm-se o valor em porcentagem 31%. Tal achado
reflete a interação destes dados, 31 % dos micronúcleos encontrados nesta
pesquisa podem ter sido oriundos do efeito clastogênico nos cromossomos.
Pelo
diagrama de Venn (Figura 28) o compartilhamento torna-se mais visível
Através da ilustração, percebe-se que a maior parte dos micronúcleos
encontrados nas análises podem ter surgido devido a efeitos aneugênicos,
resultante de algum comprometimento na maquinaria da divisão celular, mais
precisamente do momento da migração dos cromossomos para os pólos.
89
FREQ DE
CBMN
FREQ DE
AC
I)
Frequência de
MN (CbMN)
Frequência
de ac
31 %
II )
Porcentagem de
compartilhamento
Figura 28. Diagrama de Venn demonstrando valor da variância compartilhada da
frequência de aberrações cromossômicas e frequência de micronúcleos em
células binucleadas em porcentagem. Em I variáveis separadas e em II
porcentagem de 31%.
5.2.4.2 análise de regressão linear entre a frequência de aberrações
cromossômicas e a frequência de micronúcleos em células binucleadas.
Uma análise de regressão linear foi conduzida para determinar o efeito da
variação
da
frequência
de
aberrações
cromossômicas
na
frequência
de
micronúcleos em células binucleadas. Constatou-se que para cada aumento no
escore de frequência de aberrações cromossômicas aumenta-se 5,74 no valor da
frequência de micronúcleos em células binucleadas (Figura 29).
90
Figura 29. Regressão linear.Frequência de aberrações cromossômicas (Y) e
frequência de micronúcleos em linfócitos (X).Equação Y=5,747345078049613x
+ 0,2209072463180102.
5.2.5. análise do número de micronúcleos em mucosa bucal
Os dados epidemiológicos do cromo descrevem a exposição oral e ou
nasal como as principais fontes de contaminação. Estudos apontam que os danos
pulmonares e nasais em trabalhadores de curtume foram os principais achados ,
sendo importante, assim, avaliações em mucosas. No entanto alguns estudos têm
revelado que quando comparadas diferentes células, os linfócitos são consideradas
as células preferíveis para estudo uma vez que além do tempo de vida apresentam
um número basal de MN mais constante e elevado (Fenech, 2007).
Para a análise de micronúcleos em mucosa bucal foram selecionados
aleatoriamente 40 (quarenta) sujeitos, divididos em 20 (vinte) expostos e 20 (vinte)
não expostos. Os resultados indicaram maior número e frequência de micronúcleos
em mucosa bucal quando comparados com o controle controle (Tabela 08 e figura
30).
91
Tabela 08. Número de micronúcleos (MN) e frequência de micronúcleos em mucosa
bucal por indivíduo expostos e indivíduo não exposto, Teresina, 2008 a 2011.
GRUPOS
NÚMERO DE MN /2000
CÉLULAS MUCOSA
FREQUÊNCIA DE MN
MUCOSA BUCAL
BUCAL
EXPOSTO
(n=20)
NÃO EXPOSTOS
(n=20)
8,100 ± 3,905a ***
0,403±0,1513a ***
(3-17)b
(0-0,65)b
1,200± 1,609a
0,060±0,04887a
(0-6)b
(0-0,15)b
0.8
Frequência de MN (%)
***
20
***
15
10
5
0.6
0.4
0.2
A)
número de micronúcleos em mucosa bucal
ex
po
N
ão
N
ão
ex
po
st
os
Ex
po
st
os
st
os
0.0
0
Ex
po
st
os
número de micronúcleos em mucosa bucal
+ 2.000 células avaliadas por indivíduo. a= média e desvio padrão ; b= mínimo e
máximo***p <0,0001 Teste t de Student
B)
20
Figura 31. Número (A) e frequência de micronúcleos (B) em trabalhadores de curtume
(n=20) ***p<0,0001 em relação ao grupo não exposto (n=20) Teste t.
15
***
10
Relativamente
ao grupo controle, encontram-se resultados similares aos
obtidos em outros estudos, onde a maior percentagem de indivíduos encontra-se
5
com um número menor de MN. A presença de MN na população controle
N
ão
ex
po
st
os
Ex
po
st
os
corresponde 0ao número basal de dano genético que ocorre naturalmente no
92
organismo (Bolognesi, 2003)
Não existem dados de micronúcleos em células de mucosa bucal em
trabalhadores de curtume na literatura que corroborem ou não com os dados
encontrados nesta pesquisa. Contudo, em relação tanto ao número quanto a
frequência de micronúcleos, os expostos apresentaram uma maior score que os não
expostos (p< 0,0001).
O teste do micronúcleo tem sido uma valiosa ferramenta metodológica
para avaliar a ocorrência de danoscromossômicos e sua relação com a
carcinogênese, podendo ser executado emlinfócitos de sangue periférico, em células
de medula óssea, assim como em células esfoliadas de diversos tecidos (Samanta,
2012). As células da mucosa bucal são consideradas as primeiras barreiras pós
inalação e ingestão deagentes potencialmente genotóxicos, e no epitélio oral os
micronúcleos
sãoconsiderados
importantes
biomarcadores
do
risco
de
desenvolvimento de câncer esua progressão (Holland et al., 2008). Em muitos
estudos tem sido reportado um aumento significante no número de micronúcleo
nesses tiposde células, dos indivíduos expostos a substâncias suspeitas de
genotoxicidadequando comparado ao grupo controle (Fenech et al., 2009).
5.2.6 mensuração de cromo na urina (Cr-U) através de espectrofotometria de
absorção atômica com forno de grafite
Devido ao grande debate acerca do cromo III e sua possível
genotoxicidade, fez-se uma coleta de urina afim de quantificarmos o referido metal
nos indivíduos estudados. Embora haja exposição a vários agentes químicos como
anilina e tolueno, tal análise torna-se importante visto que existem várias discussões
a respeito de sua genotoxicidade.
Este procedimento sedeu durante a coleta das amostras de sangue e da
mucosa e os 27 (vinte e sete) indivíduos expostos e os demais 27 (vinte e sete)
indivíduos do grupo controle.
Segundo ATSDR (2008), a quantificação total de Cromo na urina, tem
sido usada para avaliar a exposição ao Cromo. Os metais como o Cromo são
essenciais à vida, mas, em baixas concentrações. O trato gastrointestinal e a pele
93
regulam o influxo até certo grau, porém, o excesso pode induzir difusão passiva que
pode levar à concentração excessiva e toxicidade.
Segundo NR-15, item 15.1.5 – Limite de Tolerância (LT): “entende-se por
limite de tolerância, para fins desta norma, a concentração ou intensidade máxima
ou mínima, relacionada com a natureza e o tempo de exposiçãoao agente, que não
causará dano á saúde do trabalhador, durante a sua vida laboral”. NoBrasil, quando
não há limite de tolerância paradeterminado composto, a legislação brasileira,de
acordo com a NR-9 item 9.3.5.1 alínea “c”,utiliza valores da ACGIH – American
Conference of Governmental Industrial Hygyenists ,ou aqueles que venham a ser
estabelecidos emnegociação coletiva de trabalho, desde quemais rigorosos do que
os critérios técnico-legaisestabelecidos. No caso do cromo, o únicolimite que consta
é para o ácido crômico (cromoVI), composto solúvel, com LT de 0,04mg/m3 (ar).
O biomarcador de exposição ocupacional Segundo a legislação brasileira
é o cromo urinário com Índice Biológico Máximo Permitido de 30 mg/g de creatinina
(Silva, 2001).
Em relação a este estudo, os resultados demonstraram que os expostos
apresentaram uma maior média de cromo na urina em comparação aos não
expostos (Tabela 09 e Figura 31). Dentre os setores avaliados, os indivíduos que
trabalhavam no setor de classificação de peles apresentaram os maiores valores
quantificados .
Tabela 09. Dosagem de cromo na urina de indivíduos
expostos e de indivíduos não expostos, Teresina,
2008 a 2011.
GRUPOS
CROMO NA URINA
µg/g de creatinina
EXPOSTO
1,108 ± 1,277a ***
(n=27)
(0,019 – 4,678)b
NÃO EXPOSTOS
0,089 ± 0,027a
(n=27)
(0,083- 0,23)b
a= média e desvio padrão ; b= mínimo e máximo ***p <0,0001
Teste t
valor de cromo na urina
ug/g de creatinina
94
***
1.5
1.0
0.5
N
Ã
O
EX
P
EX
PO
O
ST
ST
O
S
O
S
0.0
Figura 31. Níveis de cromo na urina de
indivíduos expostos e de indivíduos não
expostos. P< 0,0001.
Este dado ratifica o achado de Randall and Gibson (1989) que ao
analisarem a concentração de cromo na urina de um grupo de 73 trabalhadores de
curtume, com a exposição principalmente ao cromo (III), obteram valores mais
elevados quando comparados a um grupo de 52 indivíduos controle .
A exposição ao cromo pode resultar em concentrações aumentadas no
sangue (sangue total, soro e eritrócitos), urina, ar expirado, cabelo e unhas, dos
quais, as elevações de cromo no sangue e urina são considerados os indicadores
mais confiáveis da exposição (Cuberos, 2009).
A eliminação urinária possui uma meia vida de 40 horas. A concentração
plasmática e a taxa de excreção urinária de cromo atinje 95% dos níveis de estado
estacionário em aproximadamente 7 dias. Depois que o estado de equilíbrio é
atingido, a quantidade diária de cromo excretado na urina irá refletir a quantidade
absorvida diariamente. As concentrações plasmáticas e urinárias de cromo em
grande parte refletem a exposição relativamente recente. Durante as exposições
relativamente constante ou repetitivo que alcança um estado de equilíbrio no
plasma, a excreção urinária de cromo diariamente mensurada pode vir a ser
95
altamente correlacionada com a ingestão de cromo. Essa correlação vai
enfraquecendo com a maior intermitência na exposição (ATSDR, 2008).
Os princípios acima enunciados gerais aplicam-se às posições sobre a
absorção de cromo III, pois o cromo VI tem um tempo maior de retenção no sangue.
Cromo VI que entra no sangue é absorvida pelas células vermelhas do sangue,
reduzido a cromo (III), e, no processo, forma adutos com a hemoglobina dos
glóbulos vermelhos e outras proteínas. Estes complexos são suficientemente
estáveis para permanecer nas células vermelhas do sangue por uma fração
substancial do tempo de vida do glóbulo vermelho. Assim, um aumento nos níveis
plasmáticos de cromo pode refletir tanto a exposição recente e exposição que
ocorreu durante os últimos meses, enquanto o cromo urinário elevado reflete
principalmente a exposição sobre 1 - 2 dias (ATSDR, 2000).
5.3. Correlações entre os fatores não ocupacionais e os dados genotóxicos
Foram realizadas
análises
de
correlação
entre
os
fatores
não
ocupacionais e os resultados obtidos através das análises genotóxicas (Tabela 10).
Não foram encontradas correlações entre idade e frequência de AC e
frequência de CBMN em linfócitos, frequência de MN em mucosa, dano 3 e dano 4
em linfócitos
e dano 4 em mucosa (para todos p>0,05). Contudo a idade
correlacionou-se positivamente com o teste cometa em mucosa dano 3 (r =0,209,
p=0,46).
Outra influência não ocupacional avaliada foi o hábito de fumar. As
análises de correlação obtidas evidenciaram que este hábito está negativamente
relacionado a frequência de AC (r = - 0,319, p=0,014 ) e positivamente com a
frequência de MN em mucosa (r= 0,496 p= 0,069). Houve ainda uma correlação
negativa entre o hábito de fumar e dano 4 em mucosa (r= - 0,287 p=0,069). Porém,
não foram encontradas correlações entre o hábito de fumar e frequência de CBMN,
dano 3, dano 4 (linfócitos) e dano 4 em mucosa (p> 0,05).
Em relação ao álcool e consumo de vegetais não foram encontradas
correlações significativas com nenhum dos resultados genotóxicos.
Aumento na frequência de MN também não foi relacionado com a
ingestão de álcool (Gomez-arroyo et al., 2000). Resultados semelhantes foram
96
observados por Salaija et al. (2006), onde fatores de confundimento como idade,
sexo, tabagismo e consumo de álcool não influenciaram no aumento da frequência
de MN e AC.
Por fim, foi correlacionado o tempo de exposição e uso de EPIs com os
dados genotóxicos. Quanto ao tempo de exposição os resultados evidenciaram
correlação positiva (r=0,245 p=0,048) com frequência de AC e correlação negativa
com cometa em mucosa dano 3 (r= - 0, 353 p= 0,033) e dano 4 ( r = - 0,329 p =
0,043). Não foram encontradas correlações com as demais variáveis genotóxicas
estudadas. Em
relação ao uso de EPI, nenhuma correlaçãoo siginifactva foi
encontrada.
Embora não tenham sido encontradas correlações quanto ao uso de EPI
e os resultados dos testes, sabe-se que o uso de equipamentos de proteção é uma
importante forma de prevenção na exposição ocupacional e diminui os danos
genéticos induzidos por estes agentes (Costa et al., 2007). O Ambiente de trabalho
com uso de EPI e o tempo e condições de exposição são descritos na literatura
como fatores capazes de afetar os níveis de dano citogenético (Bolognesi, 2003).
Tabela 10. Correlações entre os fatores não ocupacionais e os resultados das
análises genotóxicas, Teresina , 2011.
Variáveis
Freq. de
AC
Freq. de
CBMN
Cometa
linfócitos
dano 3
Cometa
linfócitos
dano 4
Freq. de
MN
mucosa
Cometa
mucosa
dano 3
Cometa
mucosa
dano 4
Idade
-
-
-
-
-
r= 0,209*
p=0,46
n=20
-
Fumo
r=-0,319**
p=0,014
n=47
-
-
-
r=0,496**
p=0,003
n=20
-
r= - 0,287
p=0,069*
n=20
Álcool
-
-
-
-
-
-
-
Consumo
de vegetais
-
-
-
-
-
-
-
r=0,245 *
p=0,048
n=48
-
-
-
-
r=-0,353*
p=0,033
n= 20
r= -0,329*
p=0,043
n=20
-
-
-
-
-
-
-
Tempo de
Exposição
Uso de EPI
Coeficientede Pearson = r ; p significante quando < 0,05. ( - ) não houve correlação significante
97
5.4. Correlações entre os valores de cromo na urina e os resultados das
análises genotóxicas
Da mesma forma que a análise de correlação entre os fatores não
ocupacionais e os resultados genotóxicos. Fez-se testes de correlação entre o nível
de cromo na urina com os os testes genotóxicos (Tabela 11).
Em nossas análises houve correlação positiva forte entre frequência de
AC e cromo na urina (r=0,841 p= 0,018 ) , correlação positiva forte entre frequência
de CBMN e cromo na urina ( r=0,730 p < 0,0001 ) e correlações positivas entre
cromo na urina e dano 4 em cometa linfócitos (r=0,357 p=0,031) e dano 3 cometa
em mucosa ( r= 0,338 p=0,01). Não foram encontrada correlações com os demais
parâmetros.
Tabela 11. Correlações entre os valores de cromo na urina e os resultados das
análises genotóxicas, Teresina, 2011.
Variáveis
Freq. de
AC
Freq. de
CBMN
Cometa
linfócitos
dano 3
Cometa
linfócitos
dano 4
Freq. de
MN
mucosa
Cometa
mucosa
dano 3
Cometa
mucosa
dano 4
Cromo na
urina
r=0,841
p<0,0001
n=26
r= 0,730**
p<0,0001
n=30
-
r= 0,357*
p=0,031
n= 43
-
r=0,338*
p=0,01
n=20
-
Coeficientede Pearson = r ; p significante quando < 0,05. ( - ) não houve correlação significante
5.4.1 Análise de regressão linear (cromo na urina e resultados genotóxicos)
Fez-se análises de regressão linear para frequência de aberrações
cromossômicas e micronúcleo em linfócitos com dosagem de cromo na urina. O
objetivo destas análises é verificar até que ponto uma variação no escore de cromo
na urina influenciou na variação dos escores dos dados genotóxicos e tentar
predizer como a alteração no cromo da urina pode alterar os valores genotóxicos.
A primeira análise verificou a frequência de aberrações cromossômicas e
a concentração de cromo encontrada em 26 trabalhadores expostos.
98
Tabela 12.
Análise de regressão linear entre a frequências de aberrações
cromossômicas e a concentração de cromo na urina encontrada nos trabalhadores
Erro
R
2
padrão
0,765
1,78
F
b
A
Limites de confiança (95%)
280, 11***
2,89
0,78
2,54 a 3,24
*** p< 0,001
As análises indicaram que 76 % (R ajustado- R2) da variância do aumento
da frequência de aberrações cromossômicas pode ser explicada pelo aumento do
cromo na urina. Precisamente, tem-se para cada aumento de cromo na urina
aumenta-se em 2,89 a frequência de aberrações. Os limites de confiança possuem
intervalos estreitos (2,54 a 3,24) dando credibilidade aos resultados. O valor de F =
280,11 com p<0,0001 demonstra que
é pouco provável que o resultado tenha
ocorrido por erro amostral (Tabela 12).
A melhor linha de aderência pode ser visualizada na figura 32. Com a
análise realizada tem-se uma fórmula algébrica y = 2,89x + 0,78.
Figura 32. Regressão linear. Frequência de aberrações
cromossômicas (Y) e níveis de cromo na urina /por
indivíduo (n=26) (X). Equação Y = 2,893698879289154 x +
0,78654702541123336
99
Tabela 13. Análise de regressão linear entre a frequências de micronúcleos em
células binucleadas de linfócitos e a concentração de cromo na urina encontrada
nos trabalhadores expostos.
R2
Erro
F
b
a
Limites de confiança (95%)
46,43***
0,22
0,53
0,155 a 0,286
padrão
0,53
0,33
***p<0,001
Nestes dados as análises indicaram que 53% (R ajustado- R2) da
variância do aumento da frequência de
micronúcleo em células binucleadas de
linfócitos pode ser explicada pelo aumento do cromo na urina. Cada aumento de
cromo na urina corresponde a 0,22 no aumento de micronúcleos. Os limites de
confiança apresentaram intervalos estreitos (0,155 a 0,286). O valor de F = 46,43
com p<0,0001 (Tabela 13).
A melhor linha de aderência pode ser visualizada na figura 33. Com a
análise realizada tem-se uma fórmula algébrica y = 0,22x + 0,53.
Figura 33. Regressão linear.Frequência de micronúcleos
em células binucleadas em linfócitos (Y) e níveis de cromo
na urina /por indivíduo (n=30) (X).
100
Estes achados são curiosos. As correlações fornecem uma indicação de
que as alterações encontradas possuem uma relação direta com o cromo ingerido.
Na literatura, as correlações foram feitas entre o nível de cromo na urina e
o nível de cromo no plasma. Não havendo dados entre a relação da variável cromo e
dados genotóxicos.
Infelizmente, não podemos, neste estudo, apontar o real responsável
pelos danos (Cr III ou Cr VI ou outra substância), visto que, a análise de cromo na
urina por espectofotometria não pôde nos fornecer esta informação.
Contudo, através dos dados existente poderíamos supor que como se
tratam de trabalhadores expostos continuamente ao cromo, seus sistemas biológicos
estariam saturados, havendo, portanto, uma maior excreção diária de cromo III pela
urina, refletindo uma exposição recente. Esta hipótese é sustentada pelo fato de não
existir sulfato de cromo III 100 por cento puro, havendo sempre uma contaminação
deste pelo cromo VI. Isso nos faria deduzir que, como o cromo VI possui uma maior
capacidade de penetrar na célula, estaria ao se reduzir, aumentando a concentração
intracelular de cromo III, dificultando mais ainda sua penetração e aumentando sua
excreção urinaria. Portanto o agente causador dos danos seria o cromo VI e seus
componentes gerados apos sua redução intracelular.
Outra hipótese que poderíamos considerar é que, mesmo a literatura
apontando a dificuldade do cromo III entrar na célula, devido a seu estado de
oxidação. Este estaria, cronicamente, conseguindo penetrar e portanto, saturar os
sistemas, gerando uma maior excreção do metal na urina. Contudo, esta hipótese só
teria validade se tivéssemos verificado a pureza do pó utilizado no processo de
curtimento. Verificação esta que não realizamos.
101
CONCLUSÃO
102
6.CONCLUSÃO
Através das análises mutagênicas e genotóxicas realizadas nos
trabalhadores de curtume em Teresina, capita do estado do Piauí. Conclui-se que :
-O número e a frequência de micronúcleos, tanto de células da
mucosa bucal quanto dos linfócitos, estão aumentados nos trabalhadores de
curtume, indicando efeitos mutagênicos e genotóxicos;
-O índice de danos e a frequência de danos ao DNA encontrados
aumentados nos trabalhadores, em relação ao controle, indicam que os
mesmos se expuseram a eventos genotóxicos;
-A análise do teste de aberrações cromossômicas mostrou os
trabalhadores com maior número e frequência destas alterações, indicando
efeito clastogênico;
-Através da análise de correlação entre o micronúcleo em
linfócitos e as aberrações cromossômicas, concluiu-se que a maioria dos
micronúcleos em linfócitos encontrados, nesta pesquisa, são decorrentes de
eventos aneugênicos;
-A mensuração do cromo na urina demonstrou que a quantidade
do metal encontrava-se aumentada quando comparada ao controle;
-A correlação encontrada entre as aberrações cromossômicas e
o cromo na urina indicou que este metal é, possivelmente, o responsável
pelos eventos clastogênicos.
103
RECOMENDAÇÕES
104
7. RECOMENDAÇÕES
Através dos resultados de genotoxicidade pode-se deduzir que os
trabalhadores
estão
sujeitos
um
risco
real
dos
efeitos
resultantes
da
genotoxicidade/mutagenicidade.
O ambiente do curtume deve ser alvo de monitorização e de
preocupação por parte de ações de saúde pública. Ações voltadas a minimizar a
instabilidade genética devem ser empregadas imediatamente, com intuito de
minimizar odanos, pois exposição repetida do ser humano às misturas químicas
complexas favorecem a mutações , sendo este um estágio inicial para a formação de
tumores. Portanto, o referido biomonitoramento é de suma importância e deve ser
incluído em políticas de saúde pública.
As conclusões geradas através deste trabalho são altamente relevantes
para a gênese de políticas locais e nacionais voltadas para a saúde do trabalhador.
Têm-se então, um documento, cujos dados podem e devem ser utilizados pelo poder
público como meio de intervenção e de transformação de uma realidade social,
voltada, preferencialmente, para o bem do trabalhador piauiense.
Desta forma, o presente trabalho propõe a ser uma etapa importante na
preparação da estratégia temática, através de medidas de vigilância em saúde dos
utilizadores e, nomeadamente, dos trabalhadores de curtumes, visando estabelecer
a implantação de medidas de proteção a estes trabalhadores. Dessa forma reforçase a necessidade de:
(1)
Realização
do
biomonitoramento,
pelo
menos
semestralmente para indivíduos que estão em riscos de instabilidade
genética, especialmente com o uso dos testes de micronúcleos em mucosa
bucal e cometa em linfócitos de sangue periférico, devido suas eficácias,
sensibilidades e baixos custos financeiros;
(2)
Regulamentação
dos
programas
de
colaborações
científicas com instituições de ensino superior e de pesquisas nos níveis
locais,
regionais,
nacionais e internacionais,
capacitação técnica, estágios e iniciação científica;.
visando
a
permanente
105
(3)
Implementação de políticas de saúde públicas voltadas
para prevenção do câncer; com elaboração de programas informativos sobre
os riscos dos agentes químicos/físicos, uso de equipamentos de proteção,
vigilância da qualidade de nutrientes consumidos e biomonitoramento da
saúde ambiental ocupacional;
(4)
Melhor articulação entre órgãos de governo para apoio
técnico e maior rigor pelos órgãos de fiscalização coibindo a exploração do
trabalhador e exigindo o uso de EPIs.
106
REFERÊNCIAS
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116
ANEXOS E APÊNDICES
117
ANEXO I – CARTA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ.
118
ANEXO II- QUESTIONÁRIO DE SAÚDE PESSOAL APLICADO A TRABALHADORES
EXPOSTOS E NÃO EXPOSTOS AOS AGROTÓXICOS
(De acordo com modelo recomendado por: International Commission for Protection against
Environmental Mutagens and Carcinogens (ICPEMC) Mutation Research, 204:379406,
1988)
Este questionário, assim como o estudo a ele relacionado, deve ser de seu interesse. A
participação é espontânea e constará destas informações gerais sobre saúde e dieta, mais
uma coleta de sangue para estudo citogenético. O estudo consiste em uma avaliação de
mutações nos cromossomos de cada participante. Mutações cromossômicas ocorrem
normalmente nas células de todas as pessoas em nível bastante baixo, e são apontadas,
entre outros efeitos, nos processos de envelhecimento e do câncer. Trabalhadores em
atividades de risco (por exemplo, radiologia, quimioterapia, uso de óxido de etileno e outras),
se não seguirem normas adequadas de segurança, podem aumentar a freqüência de
mutações cromossômicas em suas células. Este estudo poderá servir como sinal de alerta
para prevenir e melhorar as condições de segurança. Caso não se encontrem diferenças
entre trabalhadores de atividades de risco e outros de atividades diversas, poderemos
concluir que os itens de segurança são efetivos neste aspecto. Isto servirá de estímulo para
continuar tomando cuidados com a vida no local de trabalho.
Leia e responda cuidadosamente as seguintes questões. A informação dada por você não
será associada com o seu nome, sendo conhecida apenas pelos pesquisadores associados
a este estudo. As respostas deste questionário poderão ter influência direta na interpretação
de nossos resultados. Por isso, contamos com sua cooperação em fornecer informações
corretas.
Obrigado pelo seu interesse.
1. Nome
Data:
Código n
Para ser preenchido pelo pesquisador
Essa folha será destacada das demais do questionário e arquivada. Apenas o número do
código será usado como identificação nas próximas páginas. Se espaços adicionais forem
necessários para completar uma resposta, por favor escreva atrás da página e identifique o
complemento da resposta com o número da questão.
119
HISTÓRIA PESSOAL
Data de hoje:_________________________________________________.
Qual a sua idade? _______________(em anos).
Sexo: ( )Masculino ( )Feminino
A qual grupo étnico você pertence:
( )Caucasiano ( )Negro ( )Chinês ( )Japonês
( )Outro. Qual?__________________________________________________ .
Qual o seu estado civil?
( )Casado ( )Solteiro ( )Separado ( )Divorciado ( )Viúvo
De quantos filhos você é pai natural (isto é, não inclua filhos adotados e de criação, e inclua
filhos que moram separadamente)? _________________________________
HISTÓRIA OCUPACIONAL
Qual o seu local de trabalho ? _______________________________________.
Há quanto tempo você trabalha neste local? ___________________________.
Se há menos de dez anos, onde você trabalhou previamente e por quanto tempo?
________________________________________________________________.
Que tipo de trabalho você faz? __________________________________________
_____________________________________________________________________
EXPOSIÇÃO
Liste os agentes químicos (por exemplo, gases tóxicos, benzeno, chumbo, fármacos,
agrotóxicos,etc.) ou físicos (radiação) a que você se expôs nos últimos 10 anos em seu
trabalho.
120
Nos últimos 12 meses:
Quantas vezes por mês:
___________________
___________________
___________________
___________________
Nos últimos 10 anos:
Quantas vezes por mês:
___________________
___________________
___________________
___________________
Liste os agentes químicos ou físicos a que
você se expôs nos últimos 10 anos fora de seu trabalho.
Nos últimos 12 meses:
Quantas vezes por mês:
___________________
___________________
___________________
___________________
Nos últimos 10 anos:
Quantas vezes por mês:
___________________
___________________
___________________
___________________
HISTÓRIA DE FUMO
Alguma vez você fumou? ( )Sim ( )Não
Se sim, continue:
a)Quanto tempo você fumou?______________(em anos)
b)Você fuma atualmente? ( )Sim ( )Não
Se sim, passe para a c)
Se não: Quando você parou de fumar?___________________(mês e ano).
121
c)Você fuma cigarros? ( )Sim ( )Não
Se sim, quantas carteiras por dia?
( )Menos de ½ carteira
( )½ a 1 carteira
( )Mais de 1 carteira, quantas?______
Você fuma cigarros com filtro? ( )Sim ( )Não
Qual a sua marca usual?_________________________________ .
d)Você fuma charutos? ( )Sim ( )Não
Se sim, quantos charutos por dia? ( )1 charuto
( )2 a 3 charutos
( )4 ou mais charutos. Quantos?____
e)Você fuma cachimbo? ( )Sim ( )Não
Se sim, quantas vezes por dia? ( )1 vez
( )2 a 3 vezes
( )4 ou mais vezes. Quantas?_______
f)O que você fumava no passado? ( )Cigarros
( )Charutos
( )Cachimbo
g)Você mastiga tabaco? ( )Sim ( )Não
122
MEDICAMENTOS E DOENÇAS
Você tem tomado algum medicamento prescrito pelo médico no último ano (por exemplo,
comprimidos para pressão, insulina, tranquilizantes, relaxantes musculares, etc.)?
( )Sim ( )Não
Se sim, por favor indique:
Per íodo .Tipo de medicamento: Dose: Quantos por dia: Início(mês): Tér mino(mês):
_________________ ________ ___________ _________ ___________
Você tem tomado algum medicamento não prescrito por médico no último ano (por
exemplo, aspirina, antiácidos, antihistaminas,sedativos ou outras drogas)?
( )Sim ( )Não
Se sim, por favor indique:
Per íodo : Tipo de medicamento: Dose: Quantos por dia: Início(mês): Tér mino(mês):
_________________ ________ ___________ _________ ___________
Você toma ou tomou alguma vitamina nos últimos 6 meses?
( )Sim ( )Não
Se sim, por favor indique:Tipo de vitamina: Dose: Quantas vezes por semana:
_________________ __________ _______________________
a)Você teve ou tem alguma dessas doenças?
Câncer ( )Sim ( )Não
Hepatite ( )Sim ( )Não
Mononucleose ( )Sim ( )Não
Herpes ( )Sim ( )Não
123
AIDS ( )Sim ( )Não
Meningite ( )Sim ( )Não
Infecção bacteriana ou viral ( )Sim ( )Não
Doença cardiovascular ( )Sim ( )Não
Diabete ( )Sim ( )Não
Outras doenças importantes ( )Sim ( )Não
b)Se sim, indique abaixo: Doença: Per íodo da doença: Tr atamento:
________________ _________________ ___________
c)Liste as vacinações que você recebeu nos últimos 12 meses.
Vacina: Data:
___________________________ ___________________
d)Liste os raiosX diagnósticos e terapêuticos, recebidos nos últimos 10 anos.
Razão par a o r aioX Data(ano)
___________________________ ___________
e)Você fez alguma cirurgia durante o último ano?
Data: Razão:
______________ _______________________________________
f)Dê as datas de quando você teve febre nos últimos 12 meses.
Data(mês): Doença associada: Medicamento tomado:
_______________ __________________ ____________________
124
DIETAS
(deve refletir apenas os hábitos frequentes)
Você come apenas vegetais? ( )Sim ( )Não
Você come carne? ( )Sim ( )Não
a)Se sim, com que frequência você come o seguinte:
Dias por semana : 1 a 2;3 a 4; 5 a 6 todos dias
Carne bovina _________
Peixe ________
Galinha ________
Porco ________
Outras ________
b)Como você prefere sua carne? ( )Mal passada ( )No ponto ( )Bem passada
Você usa adoçantes? ( )Sim ( )Não Quantos por dia?____________
Você bebe refrigerantes? ( )Sim ( )Não Quantos por dia?____________
Comente sobre sua dieta, caso ela tenha algo de especial (por exemplo, dieta rica em
proteínas e pobre em carbohidratos,etc).
Você bebe café? ( )Sim ( )Não Quantos xícaras pequenas por dia?__________
Você bebe chá? ( )Sim ( )Não Quantos xícaras por dia?__________
Você toma chimarrão? ( )Sim ( )Não Com que freqüência?____________________
Você bebe cerveja? ( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique sua média de consumo
semanal:
( )1-6 garrafas por semana ou menos.
125
( )7-12 garrafas por semana.
( )13-24 garrafas por semana.
( )Mais de 24 garrafas por semana. Quantas?_________ .
Você bebe vinho? ( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique sua média de consumo semanal:
( )1-4 copos por semana ou mais.
( )5-8 copos por semana.
( )9-16 copos por semana.
( )Mais de 16 copos por semana. Quantos?__________ .
Você bebe outras bebidas alcoólicas (excluindo cerveja e vinho)?
( )Sim ( )Não Se sim, qual ou quais?____________________________
Por favor, indique sua média de consumo semanal:
( )1-4 copos por semana ou menos.
( )5-8 copos por semana.
( )9-16 copos por semana.
( )Mais de 16 copos por semana. Quantos?___________ .
HISTÓRIA GENÉTICA
Você tem conhecimento de algum defeito de nascimento ou outra desordem genética ou
doença hereditária que tenha afetado seus pais, irmãos, irmãs ou seus filhos?
( )Sim ( )Não Se sim, por favor especifique: ___________________________________
Você ou a sua esposa teve ou tem dificuldade para engravidar?
( )Sim ( )Não Se sim, por favor especifique: ___________________________________
126
Você já teve um filho que tenha nascido prematuramente ou que tenha sido abortado?
( )Sim ( )Não
Você tem um gêmeo idêntico vivo? ( )Sim ( )Não
127
ANEXO
III: FICHAS DE AVALIAÇÃO
MUTAGÊNICOS
DOS TESTES GENOTÓXICOS E
128
SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI
LABORATORIO CENTRAL DE SAÚDE PUBLICA - LACEN
“Dr. COSTA ALVARENGA.”
Laboratório de Toxicologia Genética Molecular (LABTOXGEN-MOL)
FICHA DE AVALIAÇÃO DO TESTE DE MICRONÚCLEO EM CÉLULAS HUMANAS IN VITRO
Expostos :
Não Expostos:
Projeto :
Trabalhadores:
Pacientes
Nº
DE
BN
BN
com
MN
BN
com
1
MN
BN
com
2
MN
BN
com
+3
MN
Nº
MN
EM
BN
OUTROS DANOS CITOGENÉTICOS
CÉLULAS VIÁVEIS COM
%
BN/MN
1
NÚCLEO
2
NÚCLEOS
3
NÚCLEOS
4
NÚCLEOS
IDN
CÉLULAS
APOPTÓTICAS
CÉLULAS
NECRÓTICAS
PONTES
NUCLEOPLASMÁTICAS
CÉLULAS
COM
BROTO
IDN = [ M1+2(M2)+3(M3)+4(M4)]/N
LEGENDA: IDNC = Índice de divisão nuclear considerando citotoxicidade; M1 – N° de céls com 1 núcleo; M2 – N° de céls com 2 núcleos; M3 – N° de céls com 3 núcleos; M4 – N°
de céls com 4 núcleos; N – N° total de céls viáveis BN, MN, IDN
IDNC
129
SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI
LABORATORIO CENTRAL DE SAÚDE PUBLICA - LACEN
“Dr. COSTA ALVARENGA.”
Laboratório de Toxicologia Genética Molecular (LABTOXGEN-MOL)
FICHA DE AVALIAÇÃO DE FREQUÊNCIA DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS
Projeto: _____________________________________________
Data: ___/___/_______ Responsável: ___________________________
ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS
PACIENTES
CAMPO
Nº DE
%
Nº CÉLULAS
METÁFASES METÁFASE
ABERRAÇÕES
CROMATÍDICAS
Dicêntricos
Tricêntricos
Anel
Acêntrico
Fragmentos
TOTAL
DE AC
DELEÇÕES
Terminais
Índice Metafásico (IM) = N° de Metáfases X 100
300
% AC= Total de AC X 100
300
Intersticiais
% DE AC
130
SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI
LABORATORIO CENTRAL DE SAÚDE PUBLICA - LACEN
“Dr. COSTA ALVARENGA.”
Laboratório de Toxicologia Genética Molecular (LABTOXGEN-MOL)
FICHA DE AVALIAÇÃO DO TESTE COMETA
Projeto Material Biológico:
Grupo:
Pacientes Não Expostos
Pacientes Expostos
CÉLULA
CLASSE
CÉLULA
1.
26.
2.
27.
3.
28.
4.
29.
CLASSE
CÁLCULO DO ÍNDICE DE DANO
DANOS
TOTAL DE
CÉLULAS X
CLASSE DE
DANOS
5.
30.
6.
31.
0
_______X 0
7.
32.
1
_______X 1
8.
33.
2
_______X 2
9.
34.
3
_______X 3
10.
35.
4
_______X 4
11.
36.
12.
37.
13.
38.
14.
39.
15.
40.
16.
41.
17.
42.
18.
43.
19.
44.
20.
45.
21.
46.
22.
47.
23.
48.
24.
49.
25.
50.
TOTAL DE
DANOS
ID (%) ...............Ʃ DANOS
CÁLCULO DA FREQUÊNCIA
DE DANOS (FD - %)
FD = 100 – Total de Danos 0
FD= ________
131
SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI
LABORATORIO CENTRAL DE SAÚDE PUBLICA - LACEN
“Dr. COSTA ALVARENGA.”
Laboratório de Toxicologia Genética Molecular (LABTOXGEN-MOL)
FICHA DE AVALIAÇÃO DE FREQUÊNCIA DE MICRONÚCLEOS
Projeto:
Controle:
Data:
Responsável
Campo
Nº células
FREQUÊNCIA DE MN =
Nº de MN
% MN
Cariorrexe
N° de alterações X 100
2000
Cariólise
Células
Binucleadas