UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA ESTUDO DOS POSSÍVEIS EFEITOS GENOTÓXICOS EM TRABALHADORES DE CURTUME EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS CONTENDO CROMO III EM TERESINA-PI FABRÍCIO PIRES DE MOURA DO AMARAL FORTALEZA 2012 FABRÍCIO PIRES DE MOURA DOAMARAL ESTUDO DOS POSSÍVEIS EFEITOS GENOTÓXICOS EM TRABALHADORES DE CURTUME EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS CONTENDO CROMO III EM TERESINA-PI Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia, área de concentração em Farmacologia Clínica. Orientador: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes FORTALEZA 2012 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde A514e Amaral, Fabrício Pires de Moura do. Estudo dos possíveis efeitos genotóxicos em trabalhadores de curtume expostos a substâncias químicas contendo cromo III em Teresina-­‐PI / Fabrício Pires de Moura do Amaral. – 2012. 113f. : il. color., enc. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Programa de Pós-­‐Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2012. Orientação: Prof. Dr. Manoel Odorico de Moraes. 1. Cromo. 2. Curtume. 3. Genotoxicidade. I. Título. CDD 615.1 FABRÍCIO PIRES DE MOURA DO AMARAL ESTUDO DOS POSSÍVEIS EFEITOS GENOTÓXICOS EM TRABALHADORES DE CURTUME EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS CONTENDO CROMO III EM TERESINA PIAUÍ. Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, da Faculdade de Medicina, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia, área de concentração em Farmacologia Clínica. Aprovada em de 2012 BANCA EXAMINADORA __________________________________________________ Prof. Dr Manoel Odorico de Moraes Universidade Federal do Ceará - UFC __________________________________________________ Prof.a Dr.a Maria Elisabete Amaral de Moraes Universidade Federal do Ceará - UFC __________________________________________________ Prof.a Dr.a Gisela Costa Camarão Universidade Federal do Ceará – UFC __________________________________________________ Prof. Dr. Luciano da Silva Lopes Universidade Federa do Ceará ‘ __________________________________________________ Prof.a Dr.a Raquel Carvalho Montenegro Universidade Federal do Pará DEDICATÓRIA DEDICATÓRIA À minha esposa Elna Joelane Lopes da Silva do Amaral, mulher da minha vida. AGRADECIMENTOS AGRADECIMENTOS Esta conquista só pôde ser possível graças a ajuda de diversos colegas e instituições. Tenho em mente a certeza que não obteria nenhum resultado positivo se não houvesse estas contribuições. Infelizmente, não conseguirei expressar toda a minha gratidão, mas as palavras que aqui se encontram são, de fato, sinceras e verdadeiras. Agradeço primeiramente a Deus, senhor de nossa vida e guardião de nossos atos. Aos meus filhos, Artur e Álvaro razões de minha existência. Ao meus pais José Osmar do Amaral e Sofia Amélia Pires de Moura do Amaral, pelo exemplo de ética, lealdade e dedicação à família. Á Tatiana Chaves e TODA sua família. Sem você e sua força trabalho não teria sido realizado. Gratidão eterna. este Ao Benedito Júnior, pela extrema competência e amizade. Ao Osvaldo Bonfim, Ronaldo Costa, Ana Cleide e a toda a equipe do LACEN-PI pela colaboração na realização dos exames laboratoriais. À professora Dra. Ana Amélia Melo por todo seu ensinamento transmitido. Estes serviram de base para minha formação pessoal. A Sarah Izabelly (Sarinha). Esta vitória também é sua. Aos professores Dra. Elisabete Moraes e Dr:Odorico de Moraes da Universidade Federal do Ceará por confiarem em mim. Não os decepcionarei, pois agora que começaremos a colher os frutos e espero que estes sejam os melhores já colhidos. À Dra Fátima e toda sua equipe do laboratóro de Toxicologia/setor metais da FIOCRUZ pela contribuição nas análises de cromo na urina. Á Fábia Beserra, Maria Teresa Rocha, Flávia Martins e Aura Rhanes pela amizade,delicadeza e presteza dispensadas em todo decorrer dos anos. À Secretaria do Estado da Saúde do Piauí pelo apoio institucional. A FINEP, MCT, MS, FUNCAP, CNPq, CAPES e Instituto Claude Bernard (InCB), pelo incentivo no desenvolvimento da pesquisa nacional. Aos trabalhadores do curtume, pela gentileza em contribuir na pesquisa de campo. Obrigado por tudo! EPÍGRAFE EPÍGRAFE "Uma mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original." Albert Einstein RESUMO RESUMO ESTUDO DOS POSSÍVEIS EFEITOS GENOTÓXICOS EM TRABALHADORES DE CURTUME EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS CONTENDO CROMO III EM TERESINA-PI. Fabrício Pires de Moura do Amaral. Orientador: Manuel Odorico de Moraes. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2012. A exposição ocupacional em ambientes de curtumes tem sido objeto de estudo e de investigações científicas. As informações controversas sobre a toxicidade do cromo III e sua relação com a epidemiologia do curtume serviram de subsídio para esta pesquisa. O objetivo deste estudo foi avaliar os possíveis efeitos genotóxicos e mutagênicos da exposição de trabalhadores de curtume de Teresina (PI) à substâncias químicas contendo cromo III através do uso de biomarcadores de danos ao DNA e aos cromossomos.Trata-se de uma investigação transversal, observacional e quantitativa. Foram coletadas amostras de mucosa, sangue e urina de 43 trabalhadores de curtume para análise de micronúcleo em mucosa (20 trabalhadores), micronúcleo em linfócitos (30 trabalhadores), cometa em mucosa (20 trabalhadores), cometa em linfócitos (43 trabalhadores), aberrações cromossômicas (30 trabalhadores) e mensuração de cromo na urina (27 trabalhadores) . As mesmas análises foram realizadas em trabalhadores não expostos ao ambiente do curtume, para fins de comparação estatística. Além disso, foi aplicado um questionário de saúde pessoal recomendado pela International Comission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens-ICPEMC com intuito de correlacionar suas informações aos dados obtidos nos testes. Os resultados indicaram aumentos significativos (p<0,05) do número (8,100 ± 3,905 vs1,200± 1,609) e frequência de micronúcleo em mucosa (0,403± 0,1513vs 0,060± 0,04887), do número (17,73 ± 9,44vs10,90± 7,092) e frequência de micronúcleos em linfócitos(0,886± 0,472vs 0,306± 0,202), para o total (16,3± 3,38 vs 0,60 ± 0,16) e frequência (8,01 ± 1,82 vs 0,403± 0,09) de aberrações cromossômicas(teste T Student). Além disso, foi observado aumento sigficativo (ANOVA p<0,05 ) para o todas as classes de danos e frequência de danos no teste de cometa em mucosa e em linfócitos. O cromo na urina indicou que os trabalhadores estavam com maior concentração deste metal na urina que os não expostos (p<0,05 ) ( 1,108 ± 1,277vs 0,089 ± 0,027). As correlações (Pearson) entre o cromo na urina e as análises genotóxicas indicaram forte relação positiva com a frequência de aberrações cromossômicas (r=0,841 p= 0,018 ) e frequência de micronúcleo em linfócitos (r=0,730 p < 0,0001).Conclui-se que os trabalhadores de curtume apresentam riscos de toxicidade e de instabilidade genética associados à exposição ocupacional a misturas químicas contendo crmo III. Palavras-chaves: Cromo. Curtume. Genotoxicidade. ABSTRACT ABSTRACT Study of the possible genotoxic effects of chemical substances containing chromium III to Tannery Workers in Teresina, PI. Fabrício Pires de Moura do Amaral. Advisor: Manuel Odorico de Moraes. Doctoral Thesis. Postgraduate Program in Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology, UFC, 2012. Occupational exposure in tannery environments has been the subject of study and scientific research. Controversial information about the toxicity of chromium III and its relationship with the epidemiology of the tannery employees served as a subsidy for this research. The objective of this study was to evaluate the possible genotoxic and mutagenic effects of the exposure of tannery workers in Teresina (PI) to chemicals containing chromium III through the use of biomarkers of DNA and chromosomal damage. This was a cross-sectional, observational and quantitative study. Samples were taken from the mucosa, blood and urine of 43 tannery workers to analyze mucosal micronuclei (20 workers), lymphocytic micronuclei (30 workers), mucosal comet assays (20 workers), lymphocytic comet assay (43 workers) and chromosomal aberrations (30 workers); the level of urinary chromium was also measured (27 employees).The same analyses were carried out in non-exposed workers of the tannery environment for statistical comparison. In addition, personal health questionnaires were administered as recommended by the International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens-ICPEMC with the aim of correlating their information with data obtained in the tests. The results indicated significant increases (p <0.05) in: the number (8.100 ± 3.905 vs 1.200 ± 1.609) and frequency (0.403 ± 0.060 vs. 0.1513 ± 0.04887) of mucosal micronuclei; the number (17.73 ± 9.44 vs 10.90 ± 7.092) and frequency (0.886 ± 0.472 vs 0.306 ± 0.202) of lymphocytic micronuclei; and the total (16.3 ± 3.38 vs 0.60 ± 0.16) and frequency (8.01 ± 1.82 vs 0.403 ± 0.09) of chromosomal aberrations (Student’s t test). There was a significant increase (ANOVA, p <0.05) for all types of damage and frequency of damage to the mucosal and lymphocytic COMET assay. Urine chromium levels was higher in exposed workers than in non-exposed workers (p <0.05) (1.108 ± 1.277 vs 0.089 ± 0.027).Pearson correlations between the level of chromium in the urine and genotoxic analyses indicated a strong positive correlation with the frequency of chromosomal aberrations (r = 0.841, p = 0.018) and frequency of lymphocytic micronuclei (r = 0.730, p <0.0001). It was concluded that the tannery workers are at risk of toxicity and genetic instability associated with occupational exposure to chemical mixtures containing chromium III. Keywords: Chromium. Tannery. Genotoxicity. SUMÁRIO SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 20 1.1.Saúde versus risco ocupacional 20 1.2. Curtume : processo industrial 22 1.3. Epidemiologia do curtume 23 1.4. Exposição a agentes químicos diversos - evidências e contradições sobre a toxicidade do cromo III 25 1.5. Cromo : aspectos químicos e bioquímicos 27 1.7.Toxicologia do cromo - toxicocinética 29 1.7.Toxicologia do cromo – toxicodinâmica 31 1.8.Bases da instabilidade genética e mutações 33 1.9. Monitorização biológica 1.10. Biomarcadores 1.11.Biomarcadores de genotoxicidade e de mutagenicidade utilizados 34 35 36 como forma de biomonitoramento 1.12.Teste de micronúcleos 36 1.13.Teste de micronúcleos em mucosa bucal 37 1.14.Teste de micronúcleos com bloqueio de citocinese 38 1.15.Teste de aberrações cromossômicas 40 1.16.Teste do cometa 1.17.Avaliação da exposição 42 43 1.18.Fatores não ocupacionais que podem interferir nas análises genotóxicas 1.18.1.Idade e gênero 46 46 1.18.2.Tabagismo 47 1.18.3.Etilismo 48 1.18.4.Vitaminas e sais minerais 48 2. JUSTIFICATIVA 50 3.OBJETIVOS 51 3.1.Objetivo geral: 52 3.2.Objetivos específicos: 52 4. METODOLOGIA 53 4.1. Delineamento experimental 54 4.1.1. tipo de estudo 54 4.1.2.caracterização dos grupos de estudos 54 4.1.3.critérios de inclusão e exclusão 55 4.1.4.procedimento de coleta 55 4.1.5.coleta e transporte das amostras 56 4.1.6.coleta urinária para análise de cromo 56 4.2. Avaliação Genotóxica 58 4.2.1.teste do cometa em células de mucosa bucal 58 4.2.2.Teste do cometa em linfócitos de sangue periférico 60 4.3.Avaliação mutagênica 4.3.1.teste de micronúcleos 62 62 4.3.1.1.teste de micronúcleo em células esfoliadas de epitélio bucal 63 4.3.1.2.Teste de micronúcleos com bloqueio de citocinese 64 4.3.2.teste de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos 64 4.3.3.Dosagem do cromo na urina 66 4.4. Aspectos Éticos 67 4.5. Análise Estatística 68 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 70 5.1. Características do curtume estudado e perfil do grupo de 70 trabalhadores expostos versus não expostos 5.2. Análises de Genotoxicidade 76 77 5.2.1. teste do cometa em células esfoliadas de mucosa bucal 78 5.2.2. teste do cometa em células sanguíneas (linfócitos) 5. 2.3 Análises das alterações cromossômicas 81 5.2.4.contagem de micronúcleos em células binucleadas de linfócitos 85 utilizando citocalasina b para bloqueio de citocinese (CbMN) 5.2.4.1 Correlação entre frequência de aberrações cromossômicas e 87 frequência de micronúcleos em células binucleadas 5.2.4.2 análise de regressão linear entre a frequência de aberrações cromossômicas e a frequência de micronúcleos em células 89 binucleadas. 5.2.5. análise do número de micronúcleos em mucosa bucal 5.2.6. mensuração de cromo na urina (Cr-U) 90 através de espectrofotometria de absorção atômica com forno de grafite 92 5.3. Correlações entre os fatores não ocupacionais e os dados 96 genotóxicos 5.4. Correlações entre os valores de cromo na urina e os resultados das 97 análises genotóxicas 5.4.1 Análise de regressão linear genotóxicos) 6.CONCLUSÃO (cromo na urina e resultados 98 102 103 7. RECOMENDAÇÕES 8.REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 107 ANEXO I – CARTA DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ. 117 ANEXO IIQUESTIONÁRIO DE SAÚDE PESSOAL APLICADO A TRABALHADORES EXPOSTOS E NÃO EXPOSTOS A SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS CONTENDO CROMO III 118 ANEXO III: FICHAS DE AVALIAÇÃO DOS TESTES GENOTÓXICOS E MUTAGÊNICOS 127 19 INTRODUÇÃO 20 1. INTRODUÇÃO 1.1.Saúde versus risco ocupacional A relação trabalho e saúde ainda se deflagra como um paradigma atual, sendo objeto de constantes reflexões e transformações. Mesmo com todos os esforços existentes, ainda são alarmantes os registros de acidentes no trabalho e doenças relacionadas às atividades laborais (Schulte et al., 2013). Embora as inovações tecnológicas tenham reduzido a exposição a alguns riscos ocupacionais em determinados ramos de atividade, contribuindo para tornar o trabalho nesses ambientes menos insalubre e perigoso, constata-se que, paralelamente, outros riscos são gerados (Landsbergis et al., 1013). A difusão de novas tecnologias na área da química fina, na indústria nuclear e nas empresas de biotecnologia que operam com organismos geneticamente modificados, por exemplo, acrescentam novos e complexos problemas para o meio ambiente e a saúde pública. Esses riscos são ainda pouco conhecidos, sendo, portanto, de controle mais difícil (Shepard, 2013). Os riscos apresentados pelos produtos químicos, de modo geral, dependem de sua reatividade. Não é possível estabelecer uma regra geral que garanta a segurança no manuseio de todas as substâncias químicas. É necessária uma avaliação considerando não só as características físico-químicas, a reatividade e a toxicidade, como também as condições de manipulação, as possibilidades de exposição do trabalhador e as vias de penetração no organismo. Soma-se a isso a disposição final do produto químico, sob a forma de resíduo e os impactos que pode causar no meio ambiente (DeMatteo et al., 2012; Flack e Nylander-french, 2012). Não é novidade os episódios de intoxicação e mortes acidentais em ambientes onde a atividade laboral depende da manipulação de agentes químicos. A exemplo temos os agricultores, os trabalhadores de indústrias de tintas e solventes, além dos trabalhadores da indústria petroquímica (Field e Withers, 2012; Malaguarnera et al., 2012; Withers, 2012). Neste contexto, as análises toxicológicas são uma importante ferramenta para avaliação de intoxicações por substâncias químicas presentes no 21 trabalho. São utilizados para confirmar casos clinicamente suspeitos, detectar novos casos de exposição, controlar a qualidade dos produtos ou alimentos potencialmente associados à exposição e controlar os níveis de poluentes nos ambientes e os níveis biológicos de exposição aos agentes patogênicos (Agrawal e Rennert, 2012; Beketov e Liess, 2012; Wyman, 2012). A monitorização biológica de trabalhadores expostos a substâncias químicas potencialmente lesivas para a saúde, por meio da realização de exames toxicológicos, é importante para os procedimentos de vigilância. A legislação trabalhista, por meio da Norma Regulamentadora (NR) n.o 7, da Portaria/MTb n.o 3.214/1978, e seus complementos, estabelece as situações, as condições e os parâmetros ou indicadores biológicos, para sua realização e interpretação. Entre esses parâmetros estão o Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP) e o Valor de Referência da Normalidade (VRN) (Mendes e Dias, 1991; Aúde, 2004). Dentre vários ambientes laborais e sua complexa relação saúde trabalho, destaca-se o ambiente do curtume. No curtume se faz o curtimento, que é a produção de couro a partir de peles de animais, um subproduto da indústria de carne (Mikoczy e Hagmar, 2005; Rastogi, Pandey e tripathi, 2008; FigueiredoSganderla,Prodanov e Daroit, 2010) . O processo de curtimento de peles é complexo e objetiva a transformação de um produto natural de forma a torná-lo imputrescível e a conferir-lhe propriedades apropriadas (resistência, maciez e textura) para a utilização na fabricação de produtos de uso comum. Infelizmente, esta atividade industrial gera resíduos químicos tóxicos para o ambiente extremamente perigosos, frutos de suas etapas produtivas (FIGURA 01) (Pacheco, 2005). 22 Figura 01. fluxograma esquemático de um curtume, indicando formação de resíduos diversificados Fonte: Pacheco (2005). 1.2. Curtume : processo industrial De forma geral, couro é uma pele animal que passou por processos de limpeza, de estabilização (dada pelo curtimento) e de acabamento, para a confecção de calçados, peças de vestuário, revestimentos de mobília e de estofamentos de automóveis, bem como de outros artigos (Pacheco, 2005). O processo de transformação de peles em couros é normalmente dividido em três etapas principais, conhecidas por ribeira, curtimento e acabamento (FIGURA 01). O acabamento, por sua vez, é usualmente dividido em “acabamento molhado”, “pré-acabamento” e “acabamento final” (Pacheco, 2005). Os curtumes são normalmente classificados em função da realização parcial ou total destas etapas de processo. Desta forma, tem-se os seguintes tipos de curtumes: -curtume integrado: capaz de realizar todas as operações desde o couro cru (pele fresca ou salgada) até o couro totalmente acabado. - curtume de “wet-blue”: processa desde o couro cru até o curtimento ao cromo ou descanso /enxugamento após o curtimento; “wet-blue”, devido ao 23 aspecto úmido e azulado do couro após o curtimento ao cromo. - curtume de semi-acabado: utiliza o couro “wet-blue” como matériaprima e o transforma em courosemi-acabado, também chamado de “crust”. -curtume de acabamento: transforma o couro “crust” em couro acabado. Corresponde às operações desde cavaletes ou estiramento ou secagem até o final (estoque / expedição de couros acabados). Há quem também inclua nesta categoria os curtumes que processam o “wet-blue” até o seu acabamento final. Dependendo do estágio no processo de beneficiamento do couro no curtume, podem ocorrer diversos modos de exposição a diferentes substâncias químicas (FIGURA 01). Esta exposição acaba por tornar os trabalhadores mais susceptíveis a eventos adversos, fazendo com que os mesmos sejam objeto de de notificações epidemiológicas e estudo (Stern et al, 1987; Mikoczy e Hagmar; 2005; Rastogi, Pandey e Tripathi, 2008). 1.3. Epidemiologia do curtume Vários estudos tem demonstrado que os trabalhadores de curtume estão incluídos em um grupo peculiar de indivíduos sujeitos a patogenias oriundas da atividade diária (Kornhauser et al., 2002; Veyalkin e Gerein, 2006; Rastogi, Pandey e Tripathi, 2008). Shahzad, Akhtar e Mahmud (2006), investigaram a prevalência de asma em 641 trabalhadores de 95 curtumes diferentes em Karachi município industrial do Paquistão. Os resultados indicaram que a prevalência de asma encontrava-se alta, estando associada a escolaridade, raça, tabagismo, uso de luvas, a percepção de sinais de alergia e a duração do trabalho. Em um outro estudo, Kornhauser et al. (2002) objetivaram identificar as reações adversas da exposição ocupacional ao cromo trivalente, mensurando a quantidade de cromo na urina e de ferro sanguíneo e comparando estes valores a os de um grupo de pessoas não expostas. os pesquisadores concluíram que o cromo altera o metabolismo do ferro, tornando-o insuficiente. Não só alergia e alterações metabólicas foram observadas. Em pesquisas cujo sujeito da investigação é o profissional de curtume, o nível de alteração da pressão arterial foi consideravelmente significante quando comparado ao controle. Os investigadores evidenciaram que desde o início do 24 trabalho no curtume, em média, cada período de 1 (um) ano, estava associado a um aumento de cerca de 1,5 mmHg na pressão arterial diastólica, sendo este componente o dobro daquele diretamente associado com a idade (Cordeiro, 2004). Os mesmos autores em investigações anteriores relataram prevalência bruta da hipertensão arterial detectada em trabalhadores (56,1%) com 15,8% de hipertensão sistólica isolada (Rommel et al., 2004). Tais estudos são indicativos de que existe um componente de risco à saúde relacionado com o desempenho funcional. Estas informações, corroboram com os achados de Montanaro (1997). pesquisadores em um estudo cujo objetivo era detectar as causas de mortalidade de 1.244 trabalhadores (870 homens e 374 mulheres) de curtume ( 1955 a 1988), demonstrou que embora todos os óbitos tenham sido semelhantes aos da população em geral, os cânceres de bexiga, colo-retal e reto apresentavam níveis excessivamente superiores aos da comunidade. Estudos anteriores subsidiam estes achados (Pippard, Acheson e Winter, 1985; Edling, Kling e Flodin, 1986; Kornhauser et al., 2002). Todavia, outros não encontram essa associação ou apresentam resultados inconclusivos a respeito do aumento na incidência de câncer e essa atividade ocupacional (Stern et al., 1987; Mikoczy e Hagmar, 2005). Além das investigações epidemiológicas, evidências citogenéticas e genotóxicas apontam a necessidade de estudos mais aprofundados, com finalidade de se identificar os mecanismos que justifiquem as alterações de saúde dos trabalhadores. Com este objetivo, Balachandar (2010) identificou alterações genéticas e na fertilidade. Hilali et al. (2008) investigaram os possíveis efeitos genéticos em linfócitos de trabalhadores de curtume em Marrocos. Foi mostrado que as frequências de células com aberrações cromossômicas e com micronúcleos estavam significativamente maiores nos linfócitos dos trabalhadores. Outras investigações apontaram aumento de cromossômicas estruturais em relação aos indivíduos não expostos Neto et al., 2010). aberrações (Monteiro 25 1.4. Exposição a agentes químicos diversos - evidências e contradições sobre a toxicidade do cromo III Durante todo o processo de preparação do couro, os trabalhadores se expõem a diversos agentes químicos: agentes biocidas (para conservação da pele), compostos orgânicos halogenados (para remoção de graxa/gordura), solventes orgânicos não-halogenados (para acabamento), surfactantes (para etapas de ribeira), sais de amônio, sais de cromo (agentes de curtimento) (Pacheco, 2005). Apesar da diversidade de substâncias químicas, o emprego de sais de cromo III e sua possível toxicidade têm sido amplamente discutidos, sendo este metal considerado menos tóxico que o cromo VI, reconhecido carcinógeno (ATSDR, 2008; Salnikow e Room, 2009). Em pequenas quantidades,os especialistas afirmam que o cromo III não traz prejuízo à saúde humana. É um micronutriente que desempenha papel essencial no metabolismo da glicose, pois forma um complexo com ácido nicotínico onde auxilia os processos de degradação do açúcar por ação da insulina. Estudos indicam que a administração de cromo pode corrigir a intolerância à glicose em pacientes com diabetes tipo 2 e hipoglicemia (Abdollahi et al., 2013). O Institute of Medicine (IOM) do National Research Council (NRC), determinou uma ingestão adequada de 20-45 mg de cromo (III) / dia para adolescentes e adultos. IOM relatou média concentrações plasmáticas de cromo de 2-3 nmol / L (equivalente a 0,10-16 mg / L) e uma excreção urinária de cromo média de 0,22 mg / L ou 0,2 mg / dia (ATSDR, 2008). Outra informação importante aponta que a suplementação alimentar com cromo aumenta o nível de lipoproteínas de alta densidade em seres humanos, protegendo o aparelho cardiovascular. A administração de 50 a 200 µg/dia de cromo III inorgânico pode diminuir os níveis de colesterol total (Bernhard et al., 2012; Abollahi et al., 2013). Apesar destas informações existirem, relatórios acusando deficiência de cromo (III) são raros e não há doença reconhecida atribuída à deficiência de cromo, como existe com a maioria dos outros minerais essenciais.Evidência de 26 sinais claros de deficiência de cromo aparente em humanos é limitada a alguns relatos de casos (ATSDR, 2008). Em animais, a deficiência de cromo grave é também difícil de se reproduzir, mas quando ele foi reproduzido a hiperglicemia, diminuição do ganho de peso, níveis elevados de colesterol sérico, placas na aorta, opacidades corneanas, fertilidade, mortalidade e letalidade foram observados. Administração de compostos inorgânicos de cromo (III) resultou em diminuição dos níveis sanguíneos de glicose e colesterol e regressão de placas ateroscleróticas. A sensibilidade à insulina também resultou em um aumento da incorporação de aminoácidos em proteínas e transporte celular de aminoácidos em ratos que receberam suplementação de cromo (ATSDR, 2008). Contudo, mesmo que estas ações benéficas sejam conhecidas, o seu papel em sistemas biológicos continua controverso, pois não existem dados suficientemente disponíveis que sejam conclusivos quanto a sua segurança (Stupar et al., 19999; Services, 2012). Principalmente no ambiente do curtume, vários autores apontam fatos que incrementam o debate sobre o tema. Medeiros et al. (2003) identificou aumento de ligações cruzadas de DNA - proteína e aumento de micronúcleos em linfócitos de trabalhadores de curtumes expostos a cromo III. Zhang et al. (2008) em uma investigação sobre danos ao DNA em 60 (sessenta) trabalhadores de curtume expostos ao cromo trivalente, mostrou que a exposição ocupacional ao cromo trivalente pode levar a um dano no DNA detectável de linfócitos periféricos humanos, sendo este dano associado a níveis elevados de cromo no sangue e na urina. Cuberos, Rodriguez e Prieto (2009) mensuraram os níveis de cromo na urina de 827 trabalhadores de curtumes da cidade de Bogotá, estando estes maiores que os limites normais. Quando estes resultados foram correlacionados com o risco de desenvolvimento de doenças cardíacas, os trabalhadores apresentaram um maior risco de apresentarem o quadro clínico. Embora haja indícios de sua capacidade de alterar estruturas moleculares importantes. Stouta et al (2009) não encontrou mudanças biologicamente significativas na sobrevivência, peso corporal, consumo de ração 27 ou lesões não-neoplásicas após a administração na dieta de Rattus norvegicus e Mus musculus por 02 anos. Dentro deste contexto, poucos estudos descrevem diretamente a toxicidade do cromo III, particularmente em exposição por inalação, e essa falta de informações resultam na incerteza sobre o risco associado a exposição ao cromo III (Medeiros et al., 2003). Para fomentar mais o debate,sabe-seque não existe cromo III cem por cento puro. Assim, há grande possibilidade de contaminações do cromo III com cromo VI (EPA, 1998). O EPA (1988) determinou que o cromo VI no ar deve ser considerado um carcinógeno humano, sendo que para o cromo III não se tem informações suficientes para determinar uma classificação (ASTDR, 2008). Todavia, mesmo que alguns estudos tenham encontrado associação entre atividades relacionadas ao beneficiamento do couro e desenvolvimento de cânceres bexiga, pâncreas e leucemia, a atividade não éclassificada como carcinógena em humanos (IARC, 1997). Devido a conflituosa divergência de informações e devido a necessidade de se obter dados mais direcionados e mais acurados em relação ao não malefício ou não malefício da atividade, há recomendações de monitoramento dos profissionais que atuam no seguimento (ATSDR, 2008). 1.5. Cromo : aspectos químicos e bioquímicos O cromo é largamente utilizado nos processos industriais, sendo encontrado em muitos produtos de consumo tais como: madeira tratada com dicromato de cobre, couro curtido com sulfato crômico e panelas de aço inoxidável (ATSDR, 2008). A população em geral está exposta ao cromo através da inalação do ar ambiente, ingestão de alimentos e beber água contendo cromo. Exposição dérmica do público em geral ao cromo pode ocorrer a partir de contato da pele com certos produtos de consumo ou solos que contêm cromo. A principal via de trabalhadores não-ocupacional, porém, é a ingestão de alimentos. Hoje em dia os trabalhadores em indústrias relacionadas com cromo podem ser expostos a concentrações de cromo duas ordens de grandeza maior do que a população em geral (ATSDR, 2008). 28 O uso de couro contendo cromo é muito frequente no atual mercado brasileiro, mesmo enquanto matéria-prima para calçados e afins (Abicalçados, 2007; Sindifranca, 2007), no Brasil, verificou-se que o curtimento vegetal ainda é pouco utilizado por seu alto custo. Em 2003, a produção de couro por tipo de curtimento foi de aproximadamente 94% ao cromo, 6% ao tanino (extraído da casca da árvore do angico) e 0,1% com outros métodos (Sindifranca, 2007). O cromo (Figura 02) é um metal branco prateado, cristalino e resistente à corrosão. Seu estado de oxidação pode variar de +1 a +6 e sua valência de zero a VI. O cromo é encontrado naturalmente em solo, animais, plantas, poeiras e névoas vulcânicas, sendo quase sempre no estado trivalente (ATSDR, 2008). Figura 02. Cromo e os seus variados estados de oxidação (Forma química) (Salniko e Room, 2009). Embora o cromo apresente graus de oxidação de Cr 1+ a Cr 6+ ,e nem todos possuam a mesma estabilidade, a forma trivalente é a mais comum na 29 natureza, e mais estável, tanto no solo quanto em soluções aquosas naturais e no uso industrial. As inter-relações entre os estados de oxidação são apresentadas na figura 03 (Vaidyanathan, Asthana e Nair, 2013). Figura 03. Sistema redox do cromo. Nriagu e Nieboer (1988). O sulfato de cromo básico - Cr2(SO4)3, substância utilizada no processo na produção de couro em curtumes encontra-se no estado de valência III (Zhang et al., 2008). 1.6.Toxicologia do cromo - toxicocinética A interação de cromo com o organismo humano ocorre nas seguintes etapas: absorção; transporte, distribuição; acumulação e excreção (Kirman et al., 2013). Para as formas tóxicas do cromo, as vias básicas de absorção são três: pele, pelo trato gastrointestinal e pelas vias aéreas. Porém pouco se sabe sobre a fixação do cromo nos pulmões (Seidier et al., 2012). Os principais dados referentes ao transporte de compostos de cromo para dentro da pele são: os compostos de cromo VI conseguem penetrar na pele mais prontamente que os de cromo III; a penetração dos compostos de cromo VI se eleva com a elevação do pH; a penetração dos sais de cromo III depende da natureza do ânion presente no composto; a principal barreira da diferença na 30 penetração dos compostos de cromo III e VI parece ser determinada pela camada da epiderme; a pele e seus componentes favorecem o processo de redução do cromo VI a cromo III e os compostos de cromo III se unem fortemente a pele e as proteínas nela contidas (Kirman et al., 2013). Em geral, pelo grande tamanho do íon hidratado Cr(H2O)63+, o cromo é mal absorvido, pelo trato gastrointestinal. Entretanto, sua absorção também depende do ânion acompanhante, e em certo grau ele chega a atravessar aparede intestinal (Salnikow e Room, 2009). Figura 04.Toxicocinética do cromo no corpo humano (Kirman et al., 2013). Quando absorvido o cromo distribui-se para quase todos os tecidos, com as maiores concentrações encontradas no rim e no fígado. O Tecido ósseo também é um depósito grande e pode contribuir para a cinética de longo prazo retendo o cromo. Cromo (VI) no sangue é absorvido nas células vermelhas do sangue, onde sofre redução e forma complexos estáveis com a hemoglobina e outras proteínas intracelulares, que são retidos por uma fração substancial da vida útil dos glóbulos vermelhos. Cromo absorvido pode ser transferido para os fetos através da placenta e aos bebês através do leite materno (Kirman et al., 2013). Quando absorvido, o cromo III é transportado principalmente pela 31 transferrina plasmática, imitando o transporte do ferro. O cromo pode formar complexos com diferentes ligantes, entre eles, os grupamentos amino,fosforila, carboxila e hidroxila (Salnikow e Room, 2009; Kirman et al., 2013) A figura 04 indica dois caminhos para a excreção do cromo: em um deles, a parte que não se liga ao plasma é excretada pelos rins em 3,5 horas; no outro, o cromo é retirado pela descamação celular e eliminado pelas fezes, com tempo de 7 dias. Esses dois modos de excreção são fortemente apoiados em dados obtidos em animais, apesar de existirem muitas confirmações indicando que a excreção urinária é o único caminho em humanos (Vaidyanathan, Asthana e Nair, 2013). 1.7.Toxicologia do cromo – toxicodinâmica Os efeitos toxicológicos estão associados à forma química e a exposição. A toxicidade do cromo depende da espécie química (Services, 2012). Os trabalhadores de curtumes são continuamente expostos a certo número de compostos de cromo. Entre estes, figuram os chamados compostos hexavalentes e os compostos formados por cromo trivalente (Stern et al., 1987). Os principais efeitos deletérios à saúde humana do cromo VI são danos renais, alergias, lesões nasais, úlceras gastroduodenais, conjuntivites crônicas, rinofaringites, além de irritação brônquica, asma e câncer pulmonar; causados por absorção cutânea, inalação, ingestão ou adsorção no trato intestinal. A absorção, transporte, distribuição e eliminação dos compostos de cromo nos seres humanos e animais depende de determinados fatores, por exemplo, solubilidade, estado de oxidação, tamanho de partícula, e taxa de exposição (Russo et al.,2005; Salnikow e Room, 2009; Services, 2012). O cromo VI interage com o DNA, podendo lesá-lo. O dano ao DNA induzido por Cr VI pode levar à replicação e transcrições disfuncionais que causam bases de substituições e eliminações que servem como substratos para o reparo por excisão de basese reparo por excisão de nucleotídeos e, promove portanto, a instabilidade genômica. Esta, logo pode ser causada por postos de controle do ciclo celular aberrante e mecanismos de reparo do DNA desregulada via instabilidade de microssatélites, que desempenham um papel importante na 32 carcinogênese causada pelo Cr VI. Existem várias linhas de evidências sugerindo a importância da substituição das bases de mutagenicida de em Cr VI, com as bases G: C, essas substituições mostraram ser o alvo primário in vitro e in vivo, contudo, estudos que justifiquem a relevância específicade CrVI - Indução deleções são inconsistentes (Collins et al., 2010; Brocato e Costa, 2013). Hoje é amplamente aceito que o cromato (Cr VI) é reduzido intracelularmente a Cr III. Salnikow (2007), (Figura 05), sugere que, in vivo, Cr III pode afetar a atividade de polimerização durante aduplicação ou reparo de DNA, com resultados mutagênicos e conseqüências carcinogênicas. Neste caso, o cromo causa dano às estruturas de ácidos nucléicos. A grande diferença quanto à ação mutagênica entre o cromo trivalente e o hexavalente deve-se às diferenças de afinidade com o fosfato extracelular, à difusão através das membranas e à interação com o DNA. A maior parte dos testes de genotoxicidade in vitro e in vivo reproduziu a resposta para esses dois estados mais comuns de oxidação do cromo. O cromo III (Figura 05) penetra as membranas com maior dificuldade. In vivo, o metabolismo, a distribuição e o transporte do cromo hexavalente e do cromo trivalente também são bem divergentes, tendo-se como resultado um menor efeito genotóxico do cromo III, pelo menos em roedores (Services, 2012). Figura 05. Esquema dos passos de absorção, metabolismoe possível dano no DNA induzido pelo Cromo (VI) e (III) (Salnikow e Room, 2009). 33 O cromo é capaz de se associar à molécula de DNA, formando aductos de tamanho e complexidade variável. Suspeita-se que o Cromo III possa se combinar formando um oligômero capaz de criar pontes intercadeias na molécula de DNA (Flora, De, 2000). Seu principal local de fixação é o grupo fosfato, mas pode ocasionar mutações diretas principalmente entre as bases Guanina (G) e Citosina (C), através de sua ligação com resíduos de Cisteína (Cys) (Salnikow e Room, 2009). Existem informações mostrando que todas as formas de Cromo VI, em compostos solúveis e insolúveis em água são carcinogênicas para os órgãos respiratórios humanos, não havendo evidências de que os compostos de cromo III aumentem o risco de câncer respiratório (Seidler et al., 2012; Services, 2012). Contudo, em um recente estudo realizado por Raja e Nair (2008), o cromo III (peróxido) foi considerado a forma mais lesiva ao DNA. A investigação concluiu que neste formato a inibição da transcrição do DNA foi mais efetiva, sendo dependente de sua concentração. 1.8.Bases da instabilidade genética e mutações A instabilidade genética tem sua origem a partir de uma cascata de mutações que ocasionam numerosas modificações na estrutura do DNA, tais como quebras simples ou duplas, deleções ou modificações de bases, pontes de DNA-DNA ou DNA-proteínas e pontes intercadeias (Steinemann, Göhring e Schlegelberger, 2013). Esses são alguns eventos iniciais pelos quais os agentes genotóxicos químicos e físicos ocasionam doenças hereditárias, cânceres e letalidades (Vijg e Suh, 2013). Vários estudos epidemiológicos relatam que, em sua maioria, os cânceres são originados pela exposição contínua a agentes mutagênicos e carcinogênicos, sendo que a susceptibilidade individual pode depender da predisposição genética, de diferenças no hábito nutricional e no estilo de vida (Huang, 2013). As mutações são detectadas frequentemente através da expressão fenotípica, causada por uma mudança súbita e hereditária no genótipo de um organismo, alterando suas características. A ocorrência de mutações, no entanto, 34 depende da natureza da lesão e das respostas celulares aos danos no DNA. Basicamente, as mutações são divididas em duas grandes categorias: mutações gênicas e cromossômicas. As primeiras são alterações que ocorrem na seqüência de nucleotídeos do DNA, ou por substituição de bases, ou ainda adição ou deleção de nucleotídeos; e as segundas, são as que produzem alterações no número ou na estrutura dos cromossomos, e são detectadas por análises citogenéticas celular (Janssen e Medema, 2012). No decorrer da vida, o DNA sofre alterações, que podem ser causadas por erros durante a replicação do DNA, na divisão celular. No entanto, a justificativa da preocupação da exposição a agentes químicos ambientais, é que a exposição adicional (ocupacional) representa um aumento na carga mutagênica, e que todo risco em excesso precisa ser identificado e se possível minimizado (Vijg e Suh, 2013; Heng et al., 2013). Nesse contexto, é crescente a preocupação sobre o efeito mutagênico e carcinogênico de agentes genotóxicos em populações expostas ocupacionalmente, acidentalmente ou por estilo de vida (Janssen e Medema, 2012). Para mensuração e acompanhamento dos danos oriundos da exposição ocupacional utilizam-se métodos de monitorização biológica, onde o uso de biomarcadores é a ferramenta mais comum. 1.9. Monitorização biológica A monitorização biológica veio incluir na avaliação da toxicidade, os mecanismos de toxicidade, metabolização e efeitos químicos. Assim, o cerne do estudo é o indivíduo exposto e o método consiste na quantificação do composto tóxico e ou dos seus metabolitos em amostras biológicas, como por exemplo sangue e urina, de forma aquantificar a concentração que efectivamente foi absorvida pelo organismo (Sarigiannis e Hansen, 2012). Segundo (Arnold et al., 2013), a monitorização biológica prevê variações individuais relativas à taxa de absorção, ao metabolismo, à distribuição pelo corpo e finalmente à excreção do composto químico. 35 1.10. Biomarcadores Segundo Suspiro e Prista (2011), um biomarcador é qualquer substância, processo e/ou produtos que é possível quantificar no corpo. A escolha de um biomarcador para determinado estudo numa população varia conforme o tipo de exposição: exposição crônica ou exposição aguda a um agente possivelmente carcinogênico (Pavanello e Lotti, 2012). Os biomarcadores podem ser de três tipos: biomarcadores de exposição, de efeito e de susceptibilidade. Esta classificação não é rígida e não existe uma categorização convencionalmente aceita uma vez que normalmente são utilizados diferentes combinações de biomarcadores desde aexposição até ao efeito (Pavanello e Lotti, 2012). Existe uma transição contínua entre os biomarcadores de exposição e os biomarcadores de efeito uma vez que estes últimos funcionam em certa medida como biomarcadores de exposição e vice-versa. Os fatores de susceptibilidade genética podem influenciar os biomarcadores de efeito e de exposição através de polimorfismos genéticos de enzimas envolvidas na ativação metabólica, ação de detoxificação, reparação de DNA, entre outros (Mateuca, Decordier e Kirsch-volders, 2012). Os biomarcadores de suscetibilidade indicam indivíduos mais ou menos propensos a desenvolver câncer quando expostos à substâncias cancerígenas (análise de perfis polimórficos de um grupo populacional). Os biomarcadores de efeito ou de resposta indicam alterações presentes em tumores; são tardios e permitem avaliar o prognóstico da doença. Os mais utilizados são as medidas de dano de DNA tais como: alterações de base, formação de adutos, aberrações cromossômicas, troca de cromátides irmãs e micronúcleo (Pavanello e Lotti, 2012) O biomonitoramento da exposição ocupacional a agentes mutagênicos vem sendo atualmente considerado um dos mecanismos de prevenção e controle de doenças genéticas. Os biomarcadores de genotoxicidade, mutagenicidade e carcinogenicidade são importantes para a avaliação de efeitos crônicos de substâncias químicas mutagênicas e carcinogênicas (Suspiro e Prista, 2011). 36 1.11.Biomarcadores de genotoxicidade e de mutagenicidade utilizados como forma de biomonitoramento Os biomarcadores citogenéticos, a exemplos dos de (MN) e de micronúcleos aberrações cromossômicas (AC) têm atraído mais atenção em inúmeros estudos, pois são importantes indicadores de efeitos biológicos. Existem evidências de que aumento dos níveis de AC em linfócitos de sangue periférico pode ser um marcador de risco de câncer. Outro tipo de biomarcador, os MN, também tem sido bastante usado, nos últimos anos, como um teste de genotoxicidade para avaliar quebras de cromossomos (clastogenia), perda e não disjunção (aneugenia) (Luzhna, Kathiria e Kovalchuk, 2013). Um outro teste muito utilizado é o ensaio docometa. Este detecta quebras simples e quebras duplas do DNA, danos oxidativos e capacidade de reparo (Fikrová et al., 2011). Correlações entre biomarcadores contribuem para o entendimento da complexidade molecular da exposição aos agentes genotóxicos em estudos de biomonitoramento ocupacional (Suspiro e Prista, 2011). 1.12.Teste de micronúcleos O teste de MN é um teste citogenético que pode ser usado como biomarcador para avaliação de efeitos aneugênicos e clastogênicos em diversos organismos vivos. Este teste vem sendo usado desde 1980, para demonstrar danos citogenéticos induzidos por radiações, contaminantes ambientais, ocupacionais, estilo de vida, deficiências em nutrientes e outras doenças. É importante ressaltar que o teste de MN é um dos testes para avaliação de genotoxicidade menos invasivo e que causa poucos transtornos aos pacientes, quando comparados com os que necessitam de biopsia (Cardinale, Bruzzi e Bolognesi, 2012). A ocorrência dos MN representa uma resposta integrada de instabilidade de cromossomos, fenótipos e alterações celulares causadas por defeitos genéticos e ou exposição exógena a agentes genotóxicos, refletindo inúmeras alterações cromossômicas importantes para a carcinogênese (El-Zein, Vral e Etzel, 2011). 37 Em relação a outros testes, a contagem de MN apresenta vantagens sobre a análise cromossômica clássica por ser um procedimento simples, eficaz e realizado a baixo custo. Além disso, a frequência de MN aparece elevada em tecidos expostos bem antes que qualquer sintoma clínico seja evidente, tornandoo valiosa ferramenta na prevenção da carcinogênese oral (Fenech, 2007). A formação de MN durante a divisão celular é resultado da quebra de cromossomos devido às lesões não reparadas ou reparadas de forma incorreta, ou ainda devido à má segregação dos cromossomos e má função mitótica. Esses eventos podem ser induzidos por estresse oxidativo, exposição aos agentes clastogênicos e aneugênicos. Dessa forma, os MN são usados como biomarcadores de instabilidade cromossômica, fixação de mutações e susceptibilidade genética e polimorfismos genéticos, fatores que podem explicar a sua associação com os riscos de câncer (Fenech, 2007; Fenech e Bonassi, 2011). O potencial de danos citogenéticos de agentes genotóxicos pode ser avaliado com o teste de MN como um biomarcador em linfócitos de sangue periférico e em células de mucosa bucal. Células da mucosa bucal estão em constantes contatos com contaminantes ambientais. Desta forma, o epitélio bucal representa um tecido de importância para avaliação dos danos induzidos por substâncias inalantes. Os MN também podem ser avaliados em eritrócitos, linfócitos e epitélio esfoliado de mucosas nasal, urogenital, gástrica para avaliação de danos ao DNA dos organismos (Holland et al., 2007; Kashyap and Reddy, 2012; Luzhna, Kathiria and Kovalchuk, 2013). 1.13.Teste de micronúcleos em mucosa bucal Os MN de células esfoliadas de mucosa bucal e de outras mucosas originadas de divisões no tecido epitelial são obtidas rapidamente, sem a necessidade de divisões ex vivo, como as células oriundas de culturas celulares, para análise de metáfases que necessita do uso da citocalasina para bloquear a proliferação de linfócitos (Bonassi et al., 2011; Fenech et al., 2011). Os MN são reportados como de alto risco para o aparecimento do câncer, em resposta a agentes genotóxicos e carcinogênicos. Nas células 38 esfoliadas de mucosas, eles refletem os eventos genotóxicos que ocorreram nas células em divisão da camada basal no período de uma a três semanas depois da ação dos agentes genotóxicos. Eles podem ser detectados em células esfoliadas de mucosa bucal (Figura 06) e usados como indicativos de danos ao DNA (Holland et al., 2008). Figura 06. Secção da mucosa bucal indicando seus diferentes extratos, bem como o aparecimento de micronúcleos (Holland et al., 2008). A análise de células epiteliais é importante, pois cerca de mais de 90 % dos cânceres tem origem epitelial. Células esfoliadas de mucosa bucal têm sido mundialmente usadas na avaliação citológica para detectar morfológicas anormais, alterações de premalignidade e câncer. Assim tecido epitelial pode ser usado para o monitoramento de populações humanas expostas a vários agentes químicos e/ou físicos potencialmente genotóxico/mutagênicos e carcinogênicos (Holland et al., 2008). 1.14. Teste de micronúcleos com bloqueio de citocinese O teste de MN também pode ser feito com bloqueio de citocinese como um sistema compreensivo para mensurar danos ao DNA e citocinese (El-Zein, Vral e Etzel, 2011). O teste pode mensurar: (1) as pontes nucleoplasmáticas, que indica o rearranjamento de cromossomos que ocorre quando os centrômeros de cromossomos dicêntricos ou cromátides são puxados para os polos da célula durante a anáfase ou fusão de telômeros depois de quebras duplas de fita do 39 DNA; (2) brotos, que representam um mecanismo o qual a célula remove amplificação de DNA que é considerado como um marcador de amplificação de genes, originada de fragmentos acêntricos terminal ou intersticial (Fenech, 2007). A metodologia de MN com bloqueio de citocinese (CbMN) ( Figura 07) é desenvolvida com o uso da citocalasina B para identificar células que dividemse em cultura. A citocalasina B é um inibidor de polimerização de actina o qual é requerida para a formação do anel que divide o citoplasma durante a citocinese (Fenech, 2007). A frequência de MN em sangue periférico tem sido mundialmente estudada como um biomarcador de danos cromossômicos para testes de genotoxicidade e estudos de biomonitoramento humano (Chen et al., 2006; Holland et al., 2007; Cakmak Demircigil et al., 2011). A preferência sobre o uso de linfócitos deve-se principalmente ao seu tempo de vida. As células exfoliadas da mucosa bucal apresentam uma duração de aproximadamente 21 dias e os eritrócitos 120 dias enquanto que os glóbulos brancos, neste caso os linfócitos apresentam cerca de 1095 dias (cerca de 3 anos) de tempo de vida. Este valor é bastante discutido na literatura e são apresentados valores entre 730 e 1600 dias (Fenech, 2007). Os MN em células mononucleadas indicam instabilidade no genoma e em células binucleadas evidenciam mutações em cromossomos/ genomas antes do preparo da cultura que se expressam durante cultura in e representam quebras e perdas de cromossomos e pode ser usado para classificar substâncias químicas clastogênicas ou aneugênicas (Fenech, 2007). Os agentes considerados clastogênicos podem levar à formação de MN que contém no seu interior fragmentos de cromossomos que resultam da quebra de uma ou de duas cadeias de DNA. Nos casos em que a reparação do erro não ocorre, esta quebra de cromossomos poderá dar origem a um rearranjo assimétrico com a formação de um cromossoma dicêntrico e um fragmento acêntrico (Heng et al., 2013). O primeiro é arrastado para os pólos da célula durante a anáfase e forma uma ponte nucleoplasmática entre os núcleos da célula filha, enquanto que o segundo fragmento sofre um atraso dando origem a um MN que desta forma 40 não é incluído no núcleo da célula filha durante a telófase (Huang, 2013). Quanto aos agentes com modo de ação aneugênica, o MN é formado com um cromossoma inteiro que sofreu um atraso aquando da ascensão aos pólos. Este atraso na ascensão dá-se por falhas no fuso mitótico ou por danos estruturais no cromossomo (Fenech, 2007). Após a sua formação, o MN pode seguir diferentes vias apesar de ainda não estarem esclarecidas todas as etapas. Assim, na fase pós-mitótica pode ocorrer a eliminação da célula que contém o MN através da apoptose, expulsão do interior da célula, uma vez que o DNA não se encontra funcional inclusão do MN no núcleo principal ou, por último, pode dar-se a integração do MN no citoplasma da célula (Fenech, 2007). Figura 07. Processo de formação de micronúcleos com e sem citocalasina B (Fenech, 2007). 1.15.Teste de aberrações cromossômicas As alterações cromossômicas estruturais são assim denominadas porque afetam a estrutura dos cromossomos, sendo resultantes de quebras que ocorrem, em geral, antes da duplicação do DNA. Tais quebras são ditas espontâneas quando não têm uma causa aparente, mas é sabido que sua frequência aumenta sob a ação de agentes diversos que são denominados agentes clastogênicos (Kasahara, 2009). 41 As quebras originam segmentos sem telômeros, os quais são estruturas essenciais par manter a individualidade dos cromossomos. As extremidades livres ficam literalmente pegajosas, favorecendo a reunião com outro segmento nas mesmas condições, isto é, que tenha perdido também a região telomérica. Os segmentos quebrados podem se soldar, quando entra em ação a síntese de reparo de DNA da célula, na qual intervém outras polimerases, diferentes daquelas que atuam na duplicação semiconservativa que antecede as divisões celulares. As quebras não produzem necessariamente modificação na estrutura do cromossômo, pois os segmentos podem se reunir no mesmo ponto onde foram quebrados. Contudo, cromossomos com estrutura alterada podem ser formados, quando os segmentos se unem de forma distinta da original ou quando fragmentos são simplesmente perdidos. As quebras não ocorrem, aleatoriamente em qualquer região do cromossomo, existindo os chamados sítios frágeis mais propensos a se quebrarem (Kasahara,2009). Métodos baseados na presença de AC são extensivamente usados para monitoramento biológico de populações expostos aos agentes mutagênicos e carcinogênicos (Pastor et al., 2003). O teste de AC detecta mutações cromossômicas, ou seja, alterações que ocorrem no número ou estrutura de cromossomos, como quebras, formação de anéis, aumento do número de centrômeros, dentre outras. As AC são eventos importantes no desenvolvimento tumoral, pelo fato de que quebras em sítios específicos da molécula do DNA podem às vezes coincidir com a localização de oncogenes (Shaham et al., 2001). A frequência de AC é um excelente biomarcador de danos induzidos por carcinógenos genotóxicos (Dearfield, 2002). Os níveis de AC em linfócitos periféricos podem ser considerados como relevante biomarcador para identificar pessoas que correm riscos de câncer (IARC, 2000), mostrando associação com riscos de câncer (Hagmar et. al., 2004). A alta frequência de AC pode predizer o aumento de risco de câncer (Rossner et al., 2005). A maioria dos mutagênicos químicos induz aberrações do tipo cromatídicas, mas as do tipo cromossômico também ocorrem. Determinar a frequência de AC em linfócitos do sangue periférico humano, com o propósito de dosímetro biológico de exposição a agentes mutagênicos químicos, constitui uma técnica importante para estimar o risco em exposições ocupacionais. Detectar 42 apenas AC indica que existe um dano genético grosseiro; a ausência destas não exclui outras possíveis alterações no DNA. Porém, a presença de AC indica uma possível ligação com a exposição a genotóxicos (Ribeiro; Salvadori; Marques , 2003). 1.16.Teste do cometa Durante os últimos anos, tem havido um grande interesse no desenvolvimento de testes rápidos e simples para identificar os efeitos da exposição aos agentes ambientais que possam afetar a saúde das pessoas devido aos danos no DNA. Um desses métodos é a ensaio cometa, ideal para investigações em humanos porque não exige nenhuma pré-marcação com radioatividade ou outros procedimentos prejudiciais. À semelhança de outros testes de genotoxicidade, o ensaio cometa não é preditivo de risco de câncer individual, mas representa uma ferramenta útil para a avaliação precoce de efeitos genotóxicos devido à exposição ocupacional ou ambiental (Collins et al., 2008). Segundo Collins et al. (2008) o ensaio cometa é um excelente teste de genotoxicidade podendo revelar quebras simples, duplas quebras nas fitas do DNA, além de cross-links e sítios álcali-lábeis. Sendo usualmente trabalhado para biomonitoramento ambiental, ocupacionais e mais recentemente para processos oxidativos do DNA, condicionados por espécies químicas de poder oxidativos extrínsecos (ingeridos na dieta) ou intrínsecos (gerado pelo processo de respiração celular) (Møller, Knudsen e Loft, 2000). A designação de teste cometa foi introduzida por Olive em 1988 devido à cauda (Figura 08) que formava nos nucleóides lesados, mais tarde, no mesmo ano, este paralelo aos estudos de Singh viria a produzir modificações no ensaio que são usadas até hoje, criando doravante uma nova versão para o ensaio cometa, a alcalina (Azqueta et al., 2011). Nos últimos anos o monitoramento dos efeitos genotóxicos de químicos em humanos como objetivo de avaliar os riscos tem aumentado e como resultado tem sido identificado marcadores da exposição humana a mutágenos e carcinógenos. O biomonitoramento de populações humanas expostas aos 43 agentes potencialmente mutagênicos e carcinogênicos pode providenciar informações iniciais de desrregulações celulares e iniciação do desenvolvimento de câncer. Nos recentes anos o teste do cometa, conhecido como eletroforese em gel de agarose tem sido importante biomarcador para avaliar danos em populações expostas ambientalmente ou ocupacionalmente a poluentes do ar, metais, pesticidas, radiações e outros xenobióticos (Hartmann e Agurell, 2003; Dusinska e Collins, 2008). O teste cometa permite avaliar de maneira sensível a presença de lesões na fitas de DNA e, ainda, se as agressões estão sendo reparadas pela célula (Collins et al., 2008). Este teste, com pequenas modificações no protocolo, pode avaliar danos oxidativos nas bases nitrogenadas das fitas da dupla hélice. Devido a sua sensibilidade, rapidez, baixo custo e ampla aplicação, é frequentemente empregado em estudos tanto in vivo como in vitro, podendo ser aplicado a qualquer tecido sem a limitação da proliferação celular para a análise (Villela et al., 2006). Figura 08. Critério utilizado para as análises dos cometas (Villela et al., 2006). 1.17.Avaliação da exposição A preocupação em evitar o surgimento de doenças decorrentes da exposição dos indivíduos a agentes químicos no ambiente de trabalho conduz à tomada de medidas de prevenção.Estas são à base da monitoração biológica e consistem em veriicar se a concentração destes agentes ou de seus metabólitos 44 no organismo dos trabalhadores esta dentro dosníveis estabelecidos por órgãos governamentais ou pela comunidade cientíica. Os indicadores biológicos de exposição e os índices biológicos máximos permitidos são determinados por meio de estudos epidemiológicos,experimentais e casos clínicos. As concentrações plasmáticas e urinárias de cromo em grande parte refletem a exposição relativamente recente. Durante as exposições relativamente constante que alcança um estado de equilíbrio no plasma, a excreção urinária de cromo diariamente medido pode vir a ser altamente correlacionada com a ingestão de cromo (ATSDR, 2008). No entanto, um aumento nos níveis plasmáticos de cromo pode refletir tanto a exposição recente quanto exposição que ocorreu durante os últimos meses, enquanto o cromo urinário elevado reflete principalmente a exposição sobre 1 - 2 dias (Barceloux, 1999). Medidas distintas de cromo no plasma e sangue total (refletindo distribuição intracelular de eritrócitos) também ser útil para distinguir as exposições ao cromo (VI) contra o cromo (III); aumento dos níveis plasmáticos de cromo pode indicar exposição a ambos os cromo (VI) e cromo (III), enquanto o cromo aumentado em eritrócitos indica a exposição ao cromo (VI), uma vez que o cromo (III) não é absorvido pelas hemácias (ATSDR, 2008). A relação entre os níveis séricos e os níveis de cromo na urina aos níveis de exposição ocupacional tem sido investigada em diversos estudos, com resultados mostrando as correlações entre os níveis de exposição e os níveis de cromo no sangue e na urina. Em trabalhadores expostos ao cromo (VI) como trióxido de cromo na indústria de cromagem, uma correlação significativa (r = 0,71) foi observada entre os níveis de exposição e urinária de cromo. Foram observadas correlações significativas entre as concentrações de cromo no ar (medido por meio de dispositivos de amostragem pessoal; 8 horas) e os níveis de cromo no sangue (r = 0,99) e na urina (r = 0,89) em trabalhadores de uma instalação de liga de cromo (Muttamara e Leong , 2004). Em relação aos trabalhadores de curtumes observou-se que a concentração de cromo no soro e na urina foram significativamente elevados em um grupo de 73 trabalhadores de curtume, com a exposição principalmente ao cromo (III), em comparação com um grupo de 52 indivíduos controle, (Randall e 45 Gibson, 1987). Soro e os níveis de cromo na urina correlacionados com a área de trabalho do curtume, com as maiores concentrações em trabalhadores que manuseiam o crome (tanagem) e departamentos associados (sparação). O nível médio ponderado no tempo, de cromo total em curtume foi de 1,7 mg/m3 de ar e não variou significativamente entre os curtumes envolvidos no estudo ou entre as diversas áreas de trabalho de cada um curtume, com cromo (VI) em níveis de ar foram abaixo do limite de detecção de (0,1 mg/m3) (ATSDR, 2008). Métodos frequentemente utilizados para determinar os baixos níveis de cromo em amostras biológicas incluem a análise por ativação com nêutrons (NAA); espectrometria de massa (MS); espectrometria de emissão atômica grafite(AES) e espectrometria de absorção atômica com forno de grafite (GFAAS) (Uma técnica recém-adicionado inclui o uso de reflexão total fluorescência de raios X (TXRF) para a análise de cromo total no ar (Adekola e Eletta, 2007). No Brasil, a NR-7 e a Portaria n.0 24 de 29 de dezembro de 1994 da Secretaria deSegurança e Saúde no Trabalho estabelecemos parâmetros biológicos para controle da exposição a agentes químicos. Conforme esta portaria, todos os empregados e instituições que admitam trabalhadores como empregados são obrigados a elaborar e implementar o Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional (PCMSO). Esta monitoração biológica complementa o monitoramento ambiental e a vigilância à saúde, considerando-se que determina a exposição global diretamente no indivíduo e detecta efeitos precoces e reversíveis, proporcionando uma melhor estimativa do risco. Alguns fatores a serem levados emconsideração para o monitoramento biológicoao cromo incluem: - Indicador biológico: cromo na urina; - Exame da amostra: Urina coletada no finaldo último dia da jornada semanal. Mínimo 50 mL, em frasco de polietileno; - Conservação: A amostra é guardada em geladeiraa 4º C; - Valor de referência da normalidade: até 5,0μg/g creatinina (NR-7); - O índice máximo permitido biológico: 30μg/g creatinina (NR-7). 46 1.18. Fatores não ocupacionais que podem interferir nas análises genotóxicas 1.18.1 Idade e gênero Imperfeições no sistema celular de defesa que protege contra a fixação de danos ao DNA tais como os danos induzidos ao DNA pelas espécies reativas de oxigênio (EROs) decrescem a eficácia do reparo de DNA e pode levar ao acúmulo de mutações que em combinação com a idade pode contribuir para o envelhecimento e o desenvolvimento de patologias relacionadas com idade (Suspiro e Prista, 2011). Existem grandes correlações entre o aumento da idade e a frequência de MN, entretanto, em relação às AC existem baixas correlações (Pavanello e Lotti, 2012). Depois de 30 anos os efeitos da idade é mais pronunciado em fêmeas (Vijg e Suh, 2013), sugerida pela perda de cromossomos. Entretanto, outros estudos não demonstram correlações de MN em linfócitos humanos com idade (López-Otín et al., 2013). Ocorre um aumento espontâneo da instabilidade cromossomal associado à idade que se reflete com o aumento do número basal de MN. A formação de MN pode resultar de perturbações no fuso mitótico que levam a atrasos na ascensão aos pólos dos cromossomas durante a anáfase. A acumulação de dano genético pode também adivir da ocorrência de quebra de cadeias de DNA e à progressiva diminuição de reconhecimento de danos e fenômenos de reparação (Fenech e Bonassi, 2011). Diversos estudos têm demonstrado esta associação entre gênero e MN. Sexo e idade são consideradas as variáveis demográficas que mais influenciam a frequência de MN em linfócitos humanos, apesar de neste estudo a diferença não ser significativa confirmando resultados obtidos por outros autores (Suspiro e Prista, 2011). Uma possível explicação para justificar esta influência deve-se ao fato do cromossoma X aparecer mais frequentemente em MN. Ou seja, parece haver uma maior probabilidade de eventos aneuploidogênicos ocorrerem associados ao cromossoma X (Fenech, 2007; Battershill, Burnett e Bull, 2008; Huang, 2013). 47 1.18.2.Tabagismo O fumo é uma importante variável para induzir significantes alterações nomaterial genético, indicado por biomarcadores citogenéticos tais como as AC e quebras de cromátides irmãs e aumenta os riscos de câncer. Isto tem sido bem sugerido pelo aumento de MN em células epiteliais de mucosa bucal (Çelik et al., 2003). A exposição ao fumo também tem efeitos nas frequências de MN de células binucleadas (Luzhna, Kathiria e Kovalchuk, 2013). Em relatos de danos ao DNA em linfócitos de sangue periférico com o teste de MN e cometa existem diferenças significantes entre fumantes e não fumantes (Speit et al., 2003; Hoffmann, Högel e Speit, 2005). Associação entre o fumo e o câncer, devido à diversidade de substâncias químicas que compõe o tabaco serem consideradas como genotóxicos e carcinógenos (IARC, 2002). Estudos indicam o aumento da frequência de MN em linfócitos de sangue periférico em fumantes (Bansal et al., 2012). Em avaliação genotóxica com o teste cometa diferenças significativas foram observadas entre população fumantes, não fumantes e fumantes passivos, pelo aumento da cauda, oriunda da grande migração de DNA nos fumantes, de forma associada com os níveis de glutationa peroxidase e tocoferol, indicando a indução de danos oxidativos (Zalata et al., 2007). Entretanto, inúmeros relatos indicam que não existem associações entre fumantes e o aumento da migração de DNA em linfócitos periféricos de fumantes de mais de 20 cigarros por dia (Speit et al., 2003). Diante de muitas controvérsias sobre as influências do uso do fumo em estudos de biomonitoramento ocupacional, outras análises podem ser feitas para melhor esclarecer os diferentes relatos, a exemplo do estudo de polimorfismo genético de populações expostas (Battershill, Burnett and Bull, 2008). Bonassi (2011), recorrendo a resultados obtidos no projeto Human Micronucleus project (Projecto de Micronúcleos Humanos) referentes ao efeito dos hábitos tabágicos na frequência de MN, justifica a fraca ou inexistente correlação com o fato de os químicos presentes no fumo do cigarro apresentarem uma concentração mais baixa no sangue do que nos outros órgãos, como os 48 pulmões. Assim, os danos provocados em células sanguíneas não são passíveis de serem analisados com recurso ao teste do MN. 1.18.3.Etilismo As bebidas alcoólicas têm sido comumente associadas ao câncer (Committee on Carcinogenicity, 1995), entretanto os mecanismos de ação ainda não foram bem elucidados e ainda não existem relatos de mutagenicidade em roedores, e os dados sobre os efeitos de bebidas alcoólicas na indução de MN e AC em linfócitos de sangue periférico ainda não são conclusivos (Benassi-Evans e Fenech, 2011; Fenech e Bonassi, 2011). 1.18.4.Vitaminas e sais minerais A função dos micronutrientes na manutenção da estabilidade genômica tem sido extensivamente revisada na literatura. Existem relatos de que dieta pobre em micronutrientes aumenta o risco de doenças degenerativas, incluindo o câncer (Fenech, 2010; Fenech and Bonassi, 2011). Sabe-se que as vitaminas e os minerais são essenciais para a manutenção da estabilidade genômica, bem como podem influenciar em muitos aspectos do metabolismo do DNA, incluindo síntese, reparo, metilação e apoptose (Dusinska, 2003). Dentre os fatores que podem predizer a formação de MN, os micronutrientes por sua capacidade de proteção ao DNA encontram-se, quando em deficiências nutricionais como indutor da formação de MN. As quebras e perdas dos cromossomos envolvem diferentes disfunções celulares como fragmentos de cromossomos acêntricos resultam em quebras duplas pode levar a formação de micronúcleos, que pode ser afetada por co-fatores como magnésio e cálcio (Janssen e Medema, 2012). As doenças cardiovasculares e câncer são as maiores causas de mortalidade no mundo. Ambas constituem fatores de riscos, incluindo o fumo e dieta, como também processos patogênicos, tais como inflamações crônicas e estresse oxidativo que ocasionam instabilidade genética (López-Otín et al., 2013; Steinemann, Göhring and Schlegelberger, 2013; Vijg and Suh, 2013). 49 JUSTIFICATIVA 50 2. JUSTIFICATIVA Embora o curtume seja alvo de investigações epidemiológicas, as informações existentes, até o momento, são bastante contraditórias. Particularmente, quando abordam as patogenias associadas à exposição ocupacional e os possíveis agentes causadores. Neste contexto, encontram-se as substâncias utilizadas para o curtimento, em especial o cromo III. Este metal, considerado benéfico, é utilizado como agente curtidor. Todavia, Informações in vitro apontam sua capacidade de promover lesões no DNA. Isto fomenta o debate a respeito de sua segurança, quando utilizado de forma crônica. Um adicional a esta informação , encontra-se no fato de que os estudos in vivo abordam seus efeitos tóxicos por via oral, sendo que a maioria dos estudos epidemiológicos acusam que a exposição aérea é a mais maléfica. Temos no curtume um excelente ambiente para investigações. Nele se encontram o cromo III, sendo utilizado cronicamente na forma de pó, facilmente inalado. Portanto, devido a conflituosa divergência de informações e devido a necessidade de se obter dados mais acurados em relação ao benefício ou malefício da exposição ocupacional ao cromo III, justificamos a realização deste estudo. 51 OBJETIVOS 52 3.OBJETIVOS 3.1.Objetivo geral: Esta pesquisa teve como finalidade avaliar os possíveis efeitos genotóxicos e mutagênicos da exposição de trabalhadores de curtume de Teresina (PI) à substâncias químicas contendo cromo III através do uso de biomarcadores de danos ao DNA e aos cromossomos. 3.2.Objetivos específicos: Determinar a frequência de micronúcleos em células esfoliadas da mucosa bucal e em cultura de linfócitos com bloqueio de citocinese (efeito aneugênico e/ou clastogênico- mutagênicos); Identificar o índice de danos e a frequência de danos ao DNA de trabalhadores com a aplicação do teste cometa em mucosa bucal e em cultura de linfócitos (efeito genotóxico); Identificar os principais danos aos cromossomos, por meio do teste de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos (efeito clastogênicomutagênico); Mensurar os níveis de cromo na urina dos trabalhadores; Correlacionar os possíveis efeitos genotóxicos mutagênicosencontrados à concentração de cromo na urina e 53 METODOLOGIA 54 4. METODOLOGIA 4.1. Delineamento experimental 4.1.1tipo de estudo O estudo foi baseado num modelo transversal, observacional e quantitativo. Este foi delineado de forma a permitir que se obtenha uma avaliação laboratorial dos trabalhadores de curtume expostos a substâncias químicas contendo cromo III . 4.1.2.caracterização dos grupos de estudos A população estudada constituiu de uma amostra de 86 voluntários do sexo masculino, com idade entre 18 e 65 anos, sem restrição quanto ao grupo étnico. 43 trabalhadores foram selecionados entre os trabalhadores do curtume, que estão potencialmente expostos misturas químicas complexas. As análises realizadas encontram-se descriminadas na Tabela 01, com o respectivos número de indivíduos. Para o grupo controle foram selecionados 43 indivíduos do sexo masculino, não expostos ao ambiente do curtume, com funções administrativas (escritório contábil), na capital Teresina. Tabela 01. Distribuição dos indivíduos avaliados por teste avaliado, expostos e não expostos. Testes Quantidade de Quantidade de indivíduos indivíduos não Expostos Expostos Micronúcleo em mucosa 20 20 Micronúcleo em linfócitos 30 30 Cometa em mucosa 20 20 Cometa em linfócitos 43 43 Aberrações cromossômicas 30 30 Cromo na urina 27 27 55 4.1.3.critérios de inclusão e exclusão Inclusão: Foram incluídos indivíduos do sexo masculino de 18 a 65 anos de idade, independentemente do tempo de trabalho no curtume, com uso ou não de equipamentos de proteção. Foram incluídos ainda etilistas e fumantes, em virtude do pequeno número amostral. Critérios de Exclusão: Foram excluídos os indivíduos que em algum momento de suas vidas já desenvolveram alguma doença que sabidamente está relacionada com alterações gênicas e cromossômicas deorigem biológica (câncer, turbeculose, toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, AIDS, HTLV, HPV) (Smeets et al. 2009). Partindo desse ponto foram excluídos os que haviam sido submetidos a tratamentos radioterápicos, e quimioterápicos, e que estavam fazendo uso de antibióticos, antiarrítmicos (propranolol, por exemplo), anticonvulsivantes (tipo fenitoína ecarbamazepina), antihipertensivos (metildopa e captopril), cortisona, hipoglicemiantes e medicamentos prescrito para controle da tireóide. Os indivíduos que depois de uma avaliação clinica bucal apresentaram lesões na cavidade oral foram aexcluídos pela possível relação direta dessas lesões com alterações genômicas. 4.1.4.procedimento de coleta O fluxograma desta pesquisa encontra-se representado na figura 09. Inicialmente, fez-se um contato por telefone com a direção do curtume e , em seguida, por visita. Nas ocasiões foram enfatizadas a importância da pesquisa, para a empresa, visto que a saúde de seus funcionários poderia ser verficada de forma gratuita sem ônus para os proprietários. Além da importância dos resultados para a comunidade científica, visto que há contradições quanto ao uso do sulfato de cromo III e sua toxicidade. Após a autorização, marcou-se uma reunião com todos os trabalhadores para os devidos esclarecimentos e, aos que 56 aceitaram participar foi aplicado o Termo de consentimento livre e Esclarecido (TCLE) . Para fins de avaliação do trabalhador, foi aplicado um questionário para entrevista (ANEXO 01) abrangendo questões demográficas, hábitos de vida (alimentares, tabaco, álcool, café), bem como ocupacionais, históricos médicos e familiares, duração da aplicação, tipos dos agrotóxicos e os equipamentos de proteção individual (EPIs), utilizados para o grupo exposto. O questionário aplicado é baseado nas recomendações daInternational Comission for Protection Against Environmental Mutagens and a Carcinogens (ICPEMC) (Carrano and Natarajan, 1988). Após preenchimento do questionário, realizou-se a coleta de amostras biológicas dos trabalhadores par a análises laboratoriais. 4.1.5.coleta e transporte das amostras A coleta das amostras biológicas foi feita por profissionais capacitados do Laboratório Central de Saúde Pública do Estado do Piauí (LACEN), no local de trabalho dos voluntários. Foram utilizadas seringas heparinizadas para as análises dos testes genotóxicos. A quantidade de sangue coletada de cada trabalhador foi 10 mL (para análises de micronúcleos em linfócitos, cometa em linfócitos e aberrações cromossômicas). As células esfoliadas de mucosa bucal (para análises de micronúcleos em mucosa bucal e cometa em mucosa bucal) foram coletadas com o uso de escova cervical, sem raspagem da língua, sendo em seguida submersas em uma solução salina isotônica (0,9 %) contida em tubos Falcon rotulados, com os códigos dos sujeitos, e protegida da ação da luz até a chegada ao laboratório. 4.1.6.coleta urinária para análise de cromo: Para análise de cromo na urina foram utilizados coletores de urina de 50 mL, de plástico (polietileno, polipropileno ou PVC com tampa de rosca) transparente, os quais foram etiquetados (constando nome, data de coleta, empresa e setor). No ato da coleta, fez-se limpeza das mãos antes. Orientou-se os trabalhadores que nunca deixassem que os dedos entrassem em contato com a parte interna do frasco ou tampa. 57 Toda a coleta foi realizada no último dia da jornada semanal de trabalho (sexta-feira) pela manhã, em um local privativo distante do ambiente do curtume. Por fim, congelou-se as amostras, mantendo-as neste estado até a chegada ao laboratório de Toxicologia –setor de metais da Escola Nacional de Saúde Pública da Fundação Oswaldo Cruz em Manguinhos no Estado do Rio de Janeiro (capital), local de processamento. Para esta análise utilizou-se a espectroscopia atômica com forno de grafite acoplado. Aplicação de TCLE e Grupo exposto N = 43 Análises genotóxicas e mutagênicas Cometa Aberrações cromossômicas Mucosa N=20 Não Expostos Questionário saúde ocupacional Cromo na urina N=27 N = 43 Cromo na urina N= 27 Micronúcleo Cometa Mucosa N=20 Mucosa N=20 Análises genotóxicas e mutagênicas N= 30 Linfócitos N= 43 Aberrações cromossômicas Micronúcleo Mucosa N=20 N=30 Linfócitos N= 30 Linfócitos N=30 resultados Linfócitos N=30 resultados Análises estatísticas Figura 09.Fluxograma das etapas da pesquisa realizada. 58 4.2. Avaliação Genotóxica A avaliação de danos induzidos ao material genético foi realizada com as aplicações da técnica da eletroforese em gel de células individualizadas (SCGE), ensaio cometa. 4.2.1.teste do cometa em células de mucosa bucal É uma importante ferramenta utilizada nos estudos de biomonitoramento populacional (Collins et al., 2008). As amostras de células esfoliadas de mucosa bucal (Figura 10) de cada paciente foram centrifugadas por 10 minutos (1500 rpm), em três lavagens, com solução salina a 0,9% NaCl. As lâminas foram cobertas por solução de agarose de ponto de fusão normal a 0,75%. Posteriormente, foram mantidas em temperatura ambiente até a solidificação da agarose. Esta camada foi utilizada para promover a adesão da segunda camada de agarose de baixo ponto de fusão. Foram retirados 30 µL de células esfoliadas de mucosa bucal suspendidas em PBS e misturadas com 110 µL de agarose low mellting, a 37ºC e colocadas em forma de gotas sobre as lâminas, e cobertas com as lamínulas (24 x 60 mm), mantidas em baixa temperatura por 30 min até solidificar a agarose. Depois, a lamínula foi retirada e a lâmina mergulhada em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA , 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 10 % DMSO; pH 10) a 4ºC e protegida da luz por no mínimo 24 horas. Ao serem removidas da solução de lise,as lâminas foram colocadas na posição horizontal na cuba de eletroforese e submetidas à corrida de eletroforese. Esta estava em um banho de gelo, para manter a temperatura da eletroforese constante em torno dos 4ºC. A cuba foi, então, preenchida com a solução de eletroforese (1 mM EDTA, 300 mM NaOH; pH > 13) recém-preparada , a um nível superior (0,25cm, em média) às lâminas, ficaram em repouso por 20 min para o desenrolamento do DNA, o afrouxamento de suas ligações e a exposição dos sítios álcali-lábeis. A eletroforese foi conduzida usando 25 V e 300 mA, por 15 min. Todos estes passos foram realizados na presença de baixa luminosidade. Após a eletroforese, as lâminas foram retiradas da cuba e mergulhadas na solução de neutralização (0,4 M tris; pH 7,5, por 5 min). As lâminas foram fixadas por 10 minutos em solução fixadora (Ácido tricloroacético 59 15%; Sulfato de zinco heptahidratado 5% e Glicerol 5%), posteriormente, foi feita a coloração com solução de nitrato de prata. Lavou-se 3x com água destilada, mantendo as lâminas nas cubetas, Adicionou-se a solução de parada ( ácido acético) nas cubetas deixando-as por 5 minutos, mais três lavagens com água destilada e deixada secar em bandejas. Imagens de 100 células foram selecionadas aleatoriamente (50 células de cada uma de duas laminas) por indivíduo. Figura 10. Esquema do teste de cometa conforme protocolo de (Tice et al., 2000) usado para a avaliação de genotoxicidade em agricultores expostos aos agrotóxicos. A avaliação visual (Figura 11) dos cometas é um método de avaliação bem validado que tem uma alta correlação com a análise de imagens por computador (Collins et al., 2008). A análise, feita pelo padrão de escores, onde, de acordo com o tamanho e intensidade da cauda do cometa, os mesmos foram divididos em cinco categorias (0-4) de acordo com a percentagem de DNA na cauda do cometa, que indica o grau de lesão sofrido pela célula: 0 = sem danos (<5%); 1 = baixo nível de danos (5-20%); 2 = médio nível de danos (20-40%); 3 = alto nível de danos (40-95%); 4 = dano total (95%). O controle negativo foi processado separado das amostras dos trabalhadores de curtume. 60 C Á L C U L O 2 D O 0 1 1 2 3 3 Í N D 4 apoptose 4 I apoptose C E Figura 11. Classes de Danos ao DNA analisados no Teste Cometa. (Adaptado de Villela Det al., 2006). E 4.2.2.Teste do cometa em linfócitos de sangue periférico D A As amostras de sangue de cada indivíduo foram coletadas através de N punção venosa, cerca deO 5 mL de sangue periférico com seringa estéril e descartável, contendo o anticoagulante heparina sódica 5000 U/ml. Do sangue ( I final de 9%) , adicionado 13,25% de DMSO. Foram estocadas no freezer a -80º C D e antes do processamente) foram colocadas no banho- Maria a 37º C. O teste heparinizado 100 µL foi colocado em 5 mL de meio RPMI 1640 (na concentração Cometa foi realizado segundo Singh etdeal.Céls (1988), com Total X Total de modificações de Tice et al. Dano Classe de Dano Danos (2000), com adaptações de (Vilella, 2006). As lâminas foram pré-cobertas por 0 _____ x 0 solução de agarose de ponto fusãox 1normal a 0,75%. Posteriormente, foram 1 de_____ 2 _____ mantidas em temperatura ambiente atéxa2 solidificação da agarose. Esta camada 3 _____ x 3 foi utilizada para promover a4 adesão _____da x 4segunda camada de agarose de baixo ID (%)foram ∑Danos ponto de fusão. As amostras centrifugadas a 900 rpm, o sobrenadante descartado e 5 µL do centrifugado foi misturado com 95 µL (0,75%) de agarose 61 de baixo ponto de fusão ( low mellting), a 37ºC e colocadas em forma de gotas sobre as lâminas, e cobertas com as lamínulas (24 x 60 mm), mantidas em baixa temperatura por 5 min até solidificar a agarose. Depois, a lamínula foi retirada e a lâmina mergulhada em solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA , 10 mM Tris, 1% Triton X-100, 10 % DMSO; pH 10) a 4ºC e protegida da luz por no mínimo 24 horas. Ao serem removidas da solução de lise, as lâminas foram colocadas na posição horizontal na cuba de eletroforese. Esta estava em um banho de gelo, para manter a temperatura da eletroforese constante em torno dos 4ºC. A cuba foi, então, preenchida com a solução de eletroforese (1 mM EDTA, 300 mM NaOH; pH > 13) recém-preparada, a um nível superior (0,25cm, em média) às lâminas, ficaram em repouso por 20 min para o desenrolamento do DNA, o afrouxamento de suas ligações e a exposição dos sítios álcali-lábeis. A eletroforese foi conduzida usando 25 V e 300 mA, por 15 min. Todos estes passos foram realizados na presença de baixa luminosidade. Após a eletroforese, as lâminas foram retiradas da cuba e mergulhadas na solução de neutralização (0,4 M tris; pH 7,5, por 5 min). As lâminas foram fixadas por 10 mim em solução fixadora (Ácido tricloroacético 15%; Sulfato de zinco heptahidratado 5% e Glicerol 5%), após secagem das lâminas foram coradas com solução de nitrato de prata (0,02%). Lavou-se 3x com água destilada, mantendo as lâminas nas cubetas, Adicionou-se a solução de parada (ácido acético) nas cubetas deixando-as por 5 minutos, mais três lavagens com água destilada e deixada secar em bandejas. Imagens de 100 células foram selecionadas aleatoriamente (50 células de cada uma de duas lâminas) por indivíduo (Figura 12). Para verificação da ocorrência de cometas em trabalhadores rurais no Estado do Piauí, um total de 15.200 linfócitos foram analisados, a partir da cultura de linfócitos do sangue coletado dos indivíduos pesquisados. contabilizadas 100 células (50 células/lâmina) por indivíduo (ANEXO V). Foram 62 Figura 12. Esquema do teste de cometa em cultura de linfócitos conforme protocolo de Singh et al (1988) eTice et al.(2008) usado para a avaliação de genotoxicidade em trabalhadores de curtume. 4.3.Avaliação mutagênica A avaliação da mutagenicidade dos trabalhadores expostos no curtume foi realizada com os testes citogenéticos de micronúcleo em células esfoliadas do epitélio bucal em cultura de linfócitos com bloqueio da citocinese, como também, pelo teste de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos. 4.3.1.teste de micronúcleos Os MNs representam marcadores simples, e são considerados valiosos na avaliação de danos citogenéticos de populações ocupacionalmente expostas a diversos agentes químicos. 63 4.3.1.1.teste de micronúcleo em células esfoliadas de epitélio bucal O teste de MN foi realizado nas células epiteliais da mucosa oral de acordo com Holland et al., 2008. A coleta de células bucais foi obtida através de fricção na bochecha dos indivíduos com escova cytobrush. As células foram coletadas em tubos falcon contendo 5mL de solução salina (0,9 %) e transportada para processamento no Laboratório de Toxicologia e Genética Molecular LABTOXIGEN do LACEN-PI. Após três lavagens com PBS por centrifugação à 1500 rpm por 10 minutos, com a retirada do sobrenadante entre as centrifugações, 50 μl de suspensão de células foram gotejadas sobre lâminas pré-aquecidas (37º C) em chapa aquecedora. Em seguida, as células foram fixadas com metanol: ácido acético (3:1) durante 15 min, e dispostas horizontalmente à temperatura ambiente por 24 horas. Após esse período, as lâminas foram colocadas em água destilada por 1 minuto para hidratação das células, antes de realizar a coloração. As células foram coradas com Giemsa 10% durante 15 minutos. Realizou-se a lavagem das lâminas por duas vezes com água destilada durante 3 minutos para retirar o excesso do corante. Após secas, as lâminas foram examinadas em microscopia óptica, com o aumento de 1000 X (Figura 13). Foram contadas cerca de 2.000 células para cada indivíduo. Os critérios de identificação do MN foram os descritos por (Holland et al., 2008), como estruturas que apresentem distribuição cromatínica e coloração igual (ou mais clara) do que a do núcleo, que estejam no mesmo plano que este, apresentam limites definidos e semelhantes aos nucleares e o seu tamanho não ultrapassar 1/3 do tamanho do núcleo (Holland et al., 2008). Figura 13.Esquema simplificado do Teste de MN em mucosa bucal representado segundo protocolo de Holland et al. (2008). 64 4.3.1.2.Teste de micronúcleos com bloqueio de citocinese Para o teste de micronúcleo com bloqueio da citocinese (CbMN) o sangue foi coletado em seringas previamente heparinizadas. Cerca de 0,5 mL de sangue foi colocado em 4-5 mL de RPMI 1640 suplementado com 15 % de soro bovino fetal, 1% de antibiótico (penicilina e estreptomicina), 1% de L-glutamina e 1% de fitohemaglutinina. Os linfócitos são incubados por 7 h em até 37ºC. A citocalasina B foi preparada em DMSO na concentração de 6 g/mL e estocada em 20ºC. Essa solução foi adicionada na cultura em 44h. Após as 72h de incubação as culturas foram centrifugadas em 800 rpm por 8 minutos para eliminar as células vermelhas. As células lavadas em RPMI 1640 e tratadas em um meio hipotônico por 2-3 min em 0,075 M de KCL a 4ºC. O procedimento foi feito por 3X. As células foram centrifugadas e adicionadas na solução com metanol-ácido acético 3:1 e gentilmente agitadas. Esse processo foi repetido por 3X. As células foram ressuspendidas e colocadas em lâminas e coradas com GIEMSA a 10% em tampão fosfato a pH 6.8, por 10 minutos (Figura 14). As células foram observadas em microscopia óptica em objetivas de 100X e fotografadas. 1000 células binucleadas com citoplasma preservado foram avaliadas quanto à frequência de micronúcleos (Fenech, 2007). Citocalacina Figura 14. Esquema simplificado do Teste de MN em linfócitos com bloqueio de citocinese (CbMN) (Fenech, 2007). 4.3.2.teste de aberrações cromossômicas em cultura de linfócitos As preparações metafásicas para a análise convencional de AC foram efetuadas de acordo com Sram et. al. (2007), seguindo os seguintes passos 65 (Figura 15), através de punção venosa de cada indivíduo foram coletados cerca de 5 mL de sangue periférico com seringa heparinizada, estéril e descartável. Foram adicionadas 18 gotas do sangue em culturas de 5 mL de meio RPMI 1640, suplementado com 15 % de soro bovino fetal, 1% de antibiótico (penicilina e estreptomicina), 1% de L-glutamina e 1% de fitohemaglutinina( para estimular a divisão celular). As culturas foram incubadas em estufa comum a 37 ºC por 72 horas. Adicionou-se a colchicina (16 g/mL, Sigma), 2 horas antes de completar 48 horas de incubação para obtenção de células em metáfase. Após às 72 horas de incubação, a cultura de linfócitos foi transferida para um tubo falcon de 10 mL estéril e centrifugada a 1000 rpm por 5 minutos, fazendo uma lavagem com solução hipotônica (0,075 M) para rompimento das membranas celulares. Adicionou-se 5 mL de fixador, que consiste em metanol e ácido acético (3:1). As lâminas foram preparadas pelo método de Moorhead et al. (1960) modificado e as metáfases foram coradas com Giemsa (10%), diluído em tampão Sorensen para posterior visualização ao microscópio. Foram analisadas 100 metáfases/indivíduo bem espalhadas e sem sobreposição, em microscópio de luz e em objetiva de imersão. Dentre as AC foram avaliadas em 100 metáfases, identificadas em 300 células de cada indivíduo, os cromossomos dicêntricos e tricêntricos, cromossomos em anéis e em anéis acêntricos, fragmentos cromossômicos, deleções terminais e deleções intersticiais foram identificados segundo Tolbert et al. (1991). Figura 15. Esquema representativo do Teste de Aberrações Cromossômicas montado segundo o protocolo de Sram et al.(2007). 66 4.3.3.Dosagem do cromo na urina Devido ao grande debate acerca do cromo III e sua possível genotoxicidade, fez-se uma coleta de urina afim de quantificarmos o referido metal nos indivíduos estudados. Este procedimento se processou durante a coleta das amostras de sangue e da mucosa bucal. Os primeiros 27 (vinte e sete) indivíduos que forneceram material para as análises. O equipamento utilizado na determinação de cromo na urina foi um espectrômetro de absorção atômica AAnalyst 800 equipado com atomizador eletrotérmico transversal, corretor de fundo Zeeman longitudinal e amostrador automático AS-800, todos Perkin-Elmer( Norwalk , CT , USA ). Tubos “end cap” recobertos com grafite pirolítico (Perkin Elmer Part N°B3000655) foram usados nesses experimentos. O comprimento de onda da lâmpada de catodo oco (PerkinElmer Part N°N3050119) de cromo foi de 357,9 nm, enquanto que a largura da fenda foi de 0,7nm. A metodologia para a determinação do cromo em urina seguiu o protocolo já estabelecido pelo Setor de Metais da FIOCRUZ. As condições STPF ("Stabilized Temperature Platform Furnace") foram adotadas no forno de grafite para reduzir, ou até mesmo eliminar, as interferências. Entre elas, está a utilização de um modificador químico, necessário em matrizes mais complexas, como é o caso da urina, e leituras em área de pico. A exatidão dos resultados é acompanhada através da análise, em cada série de amostras, de materiais de referência. Toda a vidraria e utensílios plásticos utilizados ficaram imersos em uma solução de Extran 5% v/v, por um período mínimo de 24 horas. Após este tempo, o material foi enxaguado com água corrente em abundância e, em seguida, imerso em uma solução de ácido nítrico 10% v/v para a descontaminação por, pelo menos, 48 horas. Após serem enxaguados várias vezes com água deionizada do Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA) , esse material foi seco em estufa a 30ºC, devidamente protegido de contato com superfícies metálicas e de poeira até o uso. Todos os reagentes (Merck, Elmsford , NY , USA ) e água utilizados foram da mais alta pureza: · Padrão de Cr · Nitrato de magnésio 10% (m/v) 67 · Ácido nítrico p.a.; Soluções: · Solução estoque de Cr: 1000 µg mL-1 preparada a partir do concentrado Titrisol-Merck · Solução de trabalho de Cr: 1,00 µg mL -1 preparado a partir da solução acima, por diluição adequada com HNO 3 0,2 % v/v; · Modificador Químico: solução de Mg(NO 3)2 0,5% m/v em HNO 3 0,2 % v/v. Preparação das amostras A urina foi diluída 1+1 em ácido nítrico 0,2% (v/v), enquanto que a amostra de referência Seronorm Trace Elements Urine Lot 0511545 (19,7 +/1,3 µg L-1), foi reconstituída de acordo com as recomendações do fabricante e diluída cinco vezes também em ácido nítrico. 4.4. Aspectos Éticos A pesquisa, com o protocolo experimental e o termo de consentimento, foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFC, credenciado pelo CONEP – Conselho Nacional de Saúde/MS. Os ensaios somente foram iniciados após a aprovação expedida pelo Comitê de Ética. O comitê no ato de suas atribuições expediu o documento de aprovação com número de protocolo 195, no dia 26 de setembro de 2008 (ANEXO 02). Uma cópia da aprovação foi enviada a Secretária de Estado da Saúde do Piauí e à direção do curtume, antes do início do estudo. O Estudo foi conduzido com devido respeito aos critérios estabelecidos pela declaração de Helsinque (1964) e as revisões de Tóquio (1975), Veneza (1983), Hong Kong (1989), Somèrset Oest (1996), e Edimburgo (2000), assim como as regulamentações nacionais (Resolução 196/96 e 251/97 do CNS-MS). Os voluntários receberam explanação da natureza e dos objetivos do estudo (Termo de Consentimento Livre e Esclarecido –TCLE). Foi enfatizado que o estudo tem a finalidade de pesquisa aplicada. Os voluntários foram cientes de que são livres para se retirarem a qualquer momento do estudo, sem serem obrigados a fornecer o motivo de fazê-lo, e sem que isto cause qualquer prejuízo aos mesmos. Todos os resultados obtidos no processamento das amostras foram entregues aos respectivos voluntários da pesquisa e a Diretoria de Vigilância 68 Sanitária, através do Centro Estadual de Referência em Saúde do Trabalhador, respeitando os mesmos e preservando o sigilo das informações. 4.5. Análise Estatística Os dados obtidos neste trabalho foram submetidos ao programa SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) versão 17.0, para análises de correlações de Pearson e regressão linear. O programa Prisma versão 5.0. foi utilizado para tratamento estatístico com Teste t de Student (diferenças entre as médias de frequências dos micronúcleos, aberrações cromossômicas, índices de danos (cometa) e cromo na urina) e análises de variância (ANOVA) para as classes de danos nas comparações entre os indivíduos expostos com os não expostos. Adotou-se níveis de significância de *P<0,05. 69 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.RESULTADOS E DISCUSSÃO 70 5.1. Características do curtume estudado e perfil do grupo de trabalhadores expostos versus não expostos O curtume, ambiente do estudo, localiza-se na rua Poty velho nº 380 na cidade de Teresina capital do Estado do Piauí (Figura 16).Em sua rotina empresarial, processa, em média, 1.000 (mil) peças por mês. Sua matéria prima (a pele) é oriunda de 03 (três) Estados- Piauí, Ceará e Maranhão. Figura 16. Vista aérea do curtume local do estudo. Seta indicando as dependências da empresa. No momento da pesquisa, contava com 106 funcionários. Destes, 13 respondiam pelo setor administrativo, 03 pelos serviços gerais e 90 por todo o processamento do couro. O processamento de couro esta dividido em setores. Estes setores são: recebimento e armazenamento de pele, ribeira, curtimento e acabamento (Figura 17). A empresa funciona de 07:00 horas da manhã às 18:00 horas da noite de segunda a sexta, sendo de 08:00 às 12:00 h nos sábados. 71 Figura 17. Ambiente sem barreira física dos setores. Armazenamento dos produtos químicos utilizados no processamento da pele. Bateria de fulões. Ajuste das espessuras do couro recém curtidos com cromo (wet-blue). Ficou evidente que o ambiente, composto por galpões, não possuia barreira física (Figura 17). Os setores encontram-se em um mesmo ambiente atmosférico. Misturas de odores e gases torna-se perceptível já na parte externa da fábrica aumentando a sua intensidade próximo ao ambiente. Dos 86 (oitenta e seis) indivíduos estudados, 43 (quarenta e três) eram trabalhadores do curtume (expostos) e 43 (quarenta e três ) não trabalhavamno curtume (não expostos/controle negativo). Sobre estes últimos, correspondiam a profissionais liberais e funcionários de um escritório de contabilidade da cidade de Teresina –PI, não expostos a substâncias químicas na sua rotina laboral. A idade dos indivíduos objeto da investigação não diferiu significativamente dos não expostos (Tabela 02) . 72 Tabela 02. Média das idades e desvio padrão das cargas horárias semanais de trabalho dos indivíduos expostos e dos indivíduos não expostos. Teresina, 2008 a 2011. GRUPOS IDADE EXPOSTO 34,42 ± 9,61 (n=43) NÃO EXPOSTO (n=43) CARGA HORÁRIA/SEMANA 44,51± 0,98 (18-65) (44-50) 32,40 ± 8,10 44,19± 0,93 (20-51) (44-50) p> 0,05 para carga horária através do teste χ2 (qui-quadrado) Este dado é importante pois disparidades entre as idades dos grupos poderia significar não confiabilidade no resultado. Ocorre um aumento espontâneo da instabilidade cromossomal associado à idade que se reflete com o aumento do número basal de MN. Contudo, apesar de existirem grandes correlações entre o aumento da idade e a frequência de MN, em relação às AC existem baixas correlações (Cardinale, Bruzzi e Bolognesi, 2012). Ainda em relação à idade, a moda encontrava-se entre25 e 30 anos (18 indivíduos) nos expostos e nos não expostos encontrava-se entre 22 e 32(06 indivíduoscada) (Figura18:A e B). 73 8 6 10 frequência Frequência 15 5 4 2 0 0 0 20 A) 40 60 80 0 20 40 60 B) Figura 18. A) histograma dos trabalhadores expostos N=43, Mínimo=18, Máximo= 65, Média 34,4.Moda = 25 a 30 (18 indivíduos). B) Histograma dos trabalhadores não expostos N= 43, Mínimo= 20, Máximo= 51, Média= 32,4, Moda= 22 (6 indivíduos) e 32 (6 indivíduos). Os hábitos de vida foram investigados. Em relação ao consumo de cigarros e ao consumo de álcool, dos 43 trabalhadores expostos 20 (46,5 %) e 26 (60,5 %) não expostos confirmaram o hábito, respectivamente (Tabela 03). Em relação ao nível educacional, todos os indivíduos possuíam apenas o nível fundamental de escolaridade (dados não mostrados). Cordeiro (1998) em um estudo realizado em curtumes da cidade de Botucatu em São Paulo detectou que um terço da população estudada era composta por fumantes. Outro terço nunca teria fumado, sendo o terço restante é composto por ex-fumantes. Quarenta e dois por cento da população estudada foi composta por etilistas. Quarenta por cento referiram nunca, ou apenas eventualmente, ingerirem bebidas alcoólicas. O restante foi composto por exetilistas. Hábitos como o tabagismo e o consumo de álcool podem atuar comoimportantes fatores nas lesões ao DNA, aumentando as chances de ocorrência de micronúcleos (El-Zein, Vral e Etzel, 2011; Fenech e Bonassi, 2011) Em nossa pesquisa não foram excluídos os fumantes dos não fumantes, visto que o n foi reduzido. Além disso, existem dados conflitantes em relação ao hábito de fumar e o aparecimento de MN. Inúmeros relatos indicam que não existem associações entre fumantes e o aumento da migração de DNA em linfócitos periféricos de fumantes de mais de 20 cigarros por dia (Fenech e Bonassi, 2011). 74 Assim, para evitar perdas, visto que grande parte dos trabalhadores fuma (Tabela 03), nenhum dos indivíduos foi descartado. Fez-se na sequência uma análise de correlação para avaliar até que ponto o hábito de fumar influenciou na avaliação mutagênica e genotóxica ( Tabela 10). Na maioria dos países existe uma correlação entre tabagismo e etilismo, baixa renda e baixo nível de escolaridade. Na China, indivíduos com nenhuma escolaridade têm uma probabilidade cerca de 7 vezes maior de seremfumantes do que indivíduos que têm o terceiro grau. No Brasil, entre os grupos de indivíduos com baixonível de escolaridade essa probabilidade é 5 vezes maior (World Bank, 2003). Tabela 03. Hábito de fumar e consumo de álcool dos indivíduos expostos e dos indivíduos não expostos. Teresina, 2008 a 2011. GRUPOS HÁBITO DE FUMAR CONSUMO DE ÁLCOOL % SIM 20 46,5 26 60,5 NÃO 23 53,5 17 39,5 TOTAL 43 100,0 43 100,0 13 30,2 30 69,8 30 69,8 13 30,2 43 100,0 43 100,0 % EXPOSTO (n=43) NÃO EXPOSTO(n=43) SIM NÃO TOTAL p = 0,183 para o hábito de fumar.Teste exato de Fisher; p= 0,497 para o consumo de álcool.Teste exato de Fisher O tempo de trabalho e o setor em que trabalham na empresa também foram verificados. 75 Observou-se que os que possuem entre 1 a 05 anos de tempo de serviço correspondiam a maior porcentagem de indivíduos seguidos dos que exercem a função por mais de 10 anos. Dentre os setores o que possuiu maior número de indivíduos investigados foi do wet-blue com 44,19 % dos casos (Tabela 04). Tabela 04. Tempo de trabalho e setor de trabalhos dos indivíduos expostos. Teresina, 2008 a 2011. TEMPO DE TRABALHO < 1ANO 4 SETOR DO CURTUME % % x2 WET-BLUE 9,30 19 x2 44,19 27,56 13,65 1A5 ANOS 16 37,21 gL=18 SEMI-ACABADO 4 9,30 gL=3 6 A 10 ANOS 09 20,93 P=0,07 PRODUÇÃO 6 13,95 p=0,003 > 10 ANOS 14 32,56 SEPARAÇÃO DE PELE 14 32,56 TOTAL 43 100,00 TOTAL 43 100,00 Teste x2(qui-quadrado). gL (grau de liberdade) O uso de Equipamento individual também foi verificado. A figura 19 mostra a porcentagem de trabalhadores que relataram utilizar EPI e os que disseram não utilizar. 76 Figura 19. Percentual de trabalhadores que utilizam EPI (azul n=40) e percentual dos trabaladores que não utilizam EPI (vermelho n=03) A importância dos EPI foi descrita por Bull et al. (2006) onde investigaram arelação de uso de EPIs e danos genéticos. Eles poderam concluir que o uso demedidas de proteção individual (>60%) levavam a resultados negativos para apresença a danos ao DNA. Porém sete dos oitos estudos onde ficou evidenciado o uso inadequado ou ausência dos equipamentos de proteção, puderam observar um aumento estatisticamente significativo de danos citogenéticos. Sugerindo que o uso dos EPIs produzem algum grau de proteção na prevenção da exposição ocupacional. 5.2. Análises de Genotoxicidade 5.2.1. teste do cometa em células esfoliadas de mucosa bucal Para a análise de danos ao DNA fez-se o teste de cometa em mucosa bucal em 40 (quarenta ) indivíduos , sendo 20 (vinte) expostos e 20 (vinte) não expostos. Os resultados indicaram que os trabalhadores de curtume apresentaram aumento significativos das classes de danos em relação ao grupo não exposto (Figura 20). 77 Classes de danos por grupo 100 80 *** 60 Expostos 40 Não expostos *** 20 *** ** * 0 D o an 0 D o an 1 D o an 2 D o an 3 D o an 4 D o an 0 D o an 1 D o an 2 D o an 3 D o an 4 Figura 20. Classes de danos obtidas através do teste cometa em mucosa dos expostos em comparação as mesmas classes de danos observadas nos não expostos *p<0,05; ** p< 0,001; ***p<0,0001 Teste t (classe por classe). Da mesma que as classes de danos, os resultados indicaram que os indivíduos expostos apresentaram um maior índice e frequência de danos ( Figura 21) . O teste cometa é um método visual para detectar danos em células interfásicas, sendo uma técnica especialmente rápida e sensível em captar lesões no DNA (Hartmann e Agurell, 2003). Os danos mensurados correspondem a escores de 0 a 4, que segundo Tice et al. (2000) a depender da extensão do dano podem ser reparáveis. 78 *** 100 80 N A) ão p ex s to os os st o p Ex 40 20 0 st os 0 60 ex po 20 *** Nã o 40 80 Ex po st os 60 Frequência de danos (%) Índice de danos % 100 B) Figura 21. índice (A) e frequência de danos (B) observados em trabalhadores expostos (n=20) e não expostos (n=20) ***p<0,0001 Teste t. Foi observado, em todos os escores, um aumento dos níveis de danos ao DNA dos trabalhadores expostos quando comparados ao grupo controle, indicando um forte componente ambiental como contribuidor no aparecimento destas lesões. Contudo, segundo (Tice et al., 2000) os danos observados podem ser reparados. Quando comparado o índice e a frequência dos danos, avaliados pelo teste do cometa, o grupo de trabalhadores expostos apresentou um aumento significativo de danos ao DNA (p<0,0001) quando comparado ao grupo controle, indicando que os mesmos estão sofrendo quebras nas fitas de DNA, e que a exposição repetida e continuada a algum componente no ambiente laboral, vem causando danos contínuos ao DNA nas células dos trabalhadores. 5.2.2. teste do cometa em células sanguíneas (linfócitos) Para o teste de cometa em linfócitos foram utilizados 86 (oitenta e seis) sujeitos (43 expostos e 43 não expostos). Similarmente aos resultados do teste do cometa em mucosa as análises indicaram uma diferença significativa nos valores de danos nos trabalhadores expostos. Através do teste t classe por classe (exposto versus não exposto) obteve-se p<0,0001 (Figuras 22 e 23). 79 Classes de danos por grupo 100 EXPOSTOS NÃO EXPOSTOS 80 *** 60 40 *** 20 *** *** *** 0 o an D 0 D o an 1 D o an 2 D o an 3 D o an 4 D o an 0 o an 1 D o an D 2 o an D 3 o an D 4 Figura 22. Classes de danos observadas nas análises do teste do cometa em linfócitos dos trabalhadores expostos (n=43) em comparação as mesmas classes de danos observadas nos não expostos (n=43) *p<0,05; ** p< 0,001; ***p<0,0001 Teste t (por classe). *** Freqüência de danos (%) 20 A) 20 0 ão N ão Ex Ex po st os po st os 0 40 po st os 40 60 Ex 60 80 B) N 80 *** 100 Ex po st os Índice de danos 100 A) Figura 23. índice de danos (A) e frequência de danos (B) obtidos através do teste do cometa em linfócitos. Trabalhadores expostos vs não expostos ***p< 0,0001 Teste t. Zhang (2008), analisou, através do teste de cometa em linfócitos, o nível de lesão em 60 trabalhadores de curtume ocupacionalmente expostos ao cromo trivalente. Os resultados o sugeriram que a exposição ocupacional ao cromo trivalente pode levar a danos ao DNA detectáveis. A oxidação ao DNA é conhecida como o mais comum mecanismo de dano ao DNA humano, especialmente induzido por Espécies Reativas de 80 Oxigênio (EROS), que geram os radicais livres e outras formas reativas de oxigênio (peróxido de hidrogênio, anion superóxido, oxigênio singlet, radical hidroxil, óxido nítrico e peroxinitritos). As EROs são produzidas nas células durante metabolismo normal envolvendo os processos com oxigênio. São geradas durante respiração celular, processos de biossíntese e biodegradação, biotransformação de xenobióticos e ativação fagocítica. Existem cerca de 60 reações enzimáticas envolvendo o oxigênio como substrato. A presença de EROs pode ser significantemente aumentada pela exposição a diferentes toxinas ambientais produzidas na indústria, agricultura, hábitos de fumar ou poluição acidental (Azqueta et al., 2011). A principal forma de lesão ao DNA gerado pela interação com o Cr é através da formação de adutos. A maioria (50-75%)de adutos gerados in Vitro Cr (VI) são complexos binários (Cr-DNA). Adutos binários são fracamente mutagênicos. A forma predominante de complexos Cr-DNA em células são crosslinks, que incluem pontes deCr (III)- DNA e pequenas moléculas celulares. São quatro, as principais formas de adutos: glutationa-Cr-DNA, cisteínaCr-DNA, histidina-Cr-DNA, Todos e ascorbato-Cr-DNA. estes adutos são mais mutagênicos que os adutos binário. Todavia, tais adutos são substratos para o reparo por excisão de nucleotídeos (NER) em humanos (Salnikow e Room, 2009). Neste estudo, todas as classes de danos foram significativamente maiores em relação aos trabalhadores não expostos, indicando que os indivíduos estão se expondo a eventos genotóxicos. Os danos observados no presente estudo podem ser provavelmente, relacionados às quebras simples e duplas, formação de adutos ao DNA e pontes intra e intercadeias, possíveis de serem detectados na versão alcalina do teste do cometa (Møller, Knudsen and Loft, 2000; Tice et al., 2000; Šrut, Štambuk and Klobučar, 2013). Enfatiza-se que o teste cometa é um biomarcador de genotoxicidade que indica danos recentes ao DNA, com ações da maquinaria de reparo de DNA e que infelizmente, não foram realizadas novas análises para verificarmos o grau de reparo dos danos no DNA dos indivíduos expostos. Contudo, outros biomarcadores de mutagenicidade foram aplicados para a avaliação de 81 instabilidade genética com capacidade para evidenciar a fixação de danos em células de mucosa bucal e em linfócitos de sangue periférico (Collins et al., 2008). 5. 2.3 Análises das alterações cromossômicas Os efeitos da exposição a substâncias químicas contendo cromo III em indústria de curtume de Teresina, são mostrados na Tabela 05. Diferenças significantes (P < 0,0001) na frequência de AC foram observadas entre os trabalhadores expostos (8,01 ± 1,82) em relação aos trabalhadores não expostos (0,403± 0,09) Gráfico II figura 24. Além disso, ados não significantes (P>0,05) foram encontrados em relação a % de metáfase (índice metafásico) Gráfico I figura 24. Em relação aos tipos de aberrações cromossômicas estruturais dados significantes foram encontrados para cromossomos tricêntricos (P<0,01), anéis (P<0,0001) e anéis acêntricos (P<0,01). Na figura 25 são apresentadas o perfil dos cromossomos encontrados nos trabalhadores de curtume estudados. Os resultados das aberrações cromossômicas, em nosso estudo, coinfirmam os dados sobre os danos de DNA encontrados no teste do cometa, indicando uma possível consequencia destes efeitos. A indução de AC resulta de processos complexos ainda não entendidos completamente, dentre seus mecanismos citamos as quebras diretas no DNA, os danos diretos no DNA durante replicação, a inibição da síntese de DNA e inibição da topoisomerase II (Bolzán, 2012). As análises de AC são um dos mais importantes testes citogenéticos. Atuam como um forte indicativo de riscos de cânceres em populações expostas ocupacionalmente e no ambiente a agentes químicos que induzem genotoxicidade. Estudos prévios sugerem que o aumento da frequência de AC em sangue periférico indica uma predisposição ao cânce (Romm, Oestreicher e Kulka, 2009). 82 Tabela 05. Índice metafásico e aberrações cromossômicas em trabalhadores de indústria de curtume de Teresina-PI, 2008 a 2011. Grupos Nº de células a IM a % Aberrações cromossômicas Dicêntrico Tricêntrico Anel Anel Fraguimentos Total de AC a Del.Terminais AC a % Del.Intersticiais acêntrico Expostos n=30 Não Expostos 376,2 ± 106,0 109,2 ± 14,6 53,9 ± 23,3 2,1 ± 0,6** 4,9± 4,0*** 2,35 ± 1,45** 1,00± 0,50 (218-502) (75-141) (0 - 99) (0-10) (0-15) (0-26) (0-9) 322,6 ± 67,80 101,9 ± 14,8 5,4 ± 1,74 0,0 ± 0,0 0,5± 0,2 0,05 ± 0,05 0,05 ± 0,05 (195 - 432) (57-125) (0-6) (0- 0) (0- 4) (0 - 1) (0 - 1) 1,9 ± 0,51 (0 - 8) 0,10 ± 0,06 (0 - 1) 0,35 ± 0,1 16,3± 3,38*** 8,01 ± 1,82*** (0 - 2) 0,0 ± 0,0 (0 - 0) (4 - 51) (0,8-43,7) 0,60 ± 0,16 0,403± 0,09 (0-2) (0 – 2,2) n=30 aMédia ± Erro padrão. Diferenças significantes em ***P< 0,0001 em relação ao trabalhadores não expostos, observadas com o Teste t de Student. 83 I) Índice Metafásico 150 100 50 Ex po st os N ão ex po st os 0 II ) 150 *** Número de Aberrações cromossômicas Número de Aberrações cromossômicas 150 III) 100 50 0 *** 100 50 0 to os xp o st po x E ão E N o st po x E ão o st po x E N Figura 24. I índice metafásico grupo exposto versus não exposto p>0,05. II e III número e frequência de aberrações cromossômicas obtidas através das análises de aberrações cromossômicas em linfócitos ***p>0,0001 Teste t expostos (n= 30) não expostos (n=30). Semelhante aos nossos achados, Monteiro (2010) encontrou grande número de AC em trabalhadores de um curtume na cidade de São Paulo. As AC são particularmente perigosas para a célula porque a descontinuidade física do cromossomo pode causar perda de informação genética, e até mesmo morte celular (Heng et al., 2013). 84 ac a ac A) B) C) D) Figura 25. Perfil Estrutural dos cromossomos com aberrações cromossômicas identificadas em trabalhadores expostos em curtume. Em (A) observa-se que os cromossomos anéis (a) e anéis acêntricos (ac); (B) cromossomos dicêntrico e tricêntrico; (C) deleções terminais e intersticiais e em (D) aberrações cromatídica do tipo quebra. Corroborando com o estudo de Medeiros et al., (2003) e Monteiro (2010) encontraram aumento do número de AC em trabalhadores de curtumes do Brasil, Marrocos e na Itália, respectivamente, expostos a agentes químicos diversos. A frequência de AC é uma análise citogenética sensível e que pode ser comumente usada como um excelente biomarcador de risco ocupacional em indústria de tratamento de couro, onde os trabalhadores estão expostos a agentes genotóxicos e ou mutagênicos. Avaliação citogenética em sangue periférico após exposição aos agentes clastogênicos tem sido aceita como uma técnica para o biomonitoramento biológico de danos genéticos em células somáticas desde 1970 (Hamamy, AlHakkak e Hussain, 1987). Muitas teorias que estão envolvidas nos mecanismos das AC ressaltam conceitos de que clastogênicos agem diretamente sobre o DNA e causam quebras e 85 empareamento incorreto, com fixação de alterações nos cromossomos que são visíveis em metáfases. Cabe enfatizar que as quebras vistas em metáfases e anáfases não são originadas diretamente de quebras induzidas por agentes clastogênicos, mas derivam de quebras geradas por enzimas envolvidas em reparode DNA. As quebras são criadas: (1) durante o enovelamento normal do DNA (topoisomerases) durante replicação do DNA, (2) quebras associadas com reparo que ocorrem antes da replicação; (3) enzimas envolvidas no desenovelamento do DNA, participam da síntese e reparo, mas não se ligam covalentemente ao DNA (Luzhna, Kathiria e Kovalchuk, 2013). As aberrações estruturais são oriundas de quebras e rearranjos cromossômicos. Quando ocorre quebra, os fragmentos soltos dos cromossomos podem estarem associados a aumentos de micronúcleos . 5.2.4.contagem de micronúcleos em células binucleadas de linfócitos utilizando citocalasina b para bloqueio de citocinese (CbMN) Foram realizadas análises de micronúcleos em linfócitos. Ao todo foram contadas 1000 (mil) células binucleadas por indivíduo (Figura 26). Os achados indicaram que os trabalhadores de curtumes possuíam um maior número e frequência de micronúcleos quando comparados ao controle p<0,0012 e p< 0,0001 respectivamente (Tabela 06 e figura 27). A B Figura 26. Fotomicrografia: (A) linfócito binucleado e (B) célula binucleada com com micronúcleo. 86 Tabela 06. Número de micronúcleos e frequência de micronúcleos em células binucleadas de linfócitos em indivíduo expostos e indivíduo não exposto, Teresina, 2008 a 2011. GRUPOS Nº DE MN / 1000 CÉLULAS BINUCLEADAS % FREQUÊNCIA DE MN 17,73± 9,44a ** 0,886±0,472a *** (0-33)b (0-1,65)b 10,90± 7,092a 0,306±0,202a (2-30)b (0-0,75)b EXPOSTO (n=30) NÃO EXPOSTOS (n=30) a= média e desvio padrão ; b= mínimo e máximo **p=0,0012 ***p <0,0001 Teste t 25 20 1.5 ** 1.0 15 *** 10 0.5 5 0 Ex ão p ex N N ão to os Ex po st os s po st os 0.0 o st po x E A) B) Figura 27. Número de micronúcleos (A) e frequência de micronúcleos (B) grupo exposto (n=30) e grupo não exposto (n=30)**p=0,0012***p< 0,0001 Teste t. Os nossos achados foram semelhantes ao de Hilali (2008). Da mesma forma, o pesquisador evidenciou um aumento na frequência de micronúcleos em linfócitos em trabalhadores de curtumes em Marrocos. O investigador não conclui em seus estudos qual o componente ambiental (ou não ) responsável pelos efeitos. 87 Outro estudo que compactua com nossos resultados foi o de Balachandar (2010) no Sul da Índia. O pesquisador encontrou aumento do número de micronúcleos nos trabalhadores de curtume da região quando comparado ao grupo de trabalhadores não expostos. Mais que isso, dosou o cromo na urina dos expostos, demonstrando que os mesmos estão com níveis acima do recomendado. Concluíram que os eventos genotóxicos diretos e indiretos possuem relação com a exposição ao cromo. Embora no estudo não tenham sido realizados análises de correlações entre as variáveis. Em contradição, Migliori (1991) na análise de micronúcleos em controles e de pessoas expostas em um curtume da Itália, não encontrou diferença estatisticamente significativa entre as frequências de MN. Os dados obtidos revelam danos aneugênicos e ou clastogênicos, refletindo que nos trabalhadores expostos algum componente ambiental pode ter contribuido, gerando um maior número de MN nos indivíduos investigados. 5.2.4.1 Correlação entre frequência de aberrações cromossômicas e frequência de micronúcleos em células binucleadas O objetivo da análise de correlação é medir e interpretar a força de uma relação linear ou não linear entre duas variáveis contínuas. No âmbito da análise de correlação, utilizamos o conceito de associação no sentido de "associação linear" cuja representação, em nosso caso, estará expressa em um coeficiente r de Pearson. Este pode assumir valores entre -1 e +1, que vão desde ser negativamente correlacionada (-1) para não correlacionadas (0) positivamente correlacionados (+1). O sinal do coeficiente de correlação (ou seja, positivo ou negativo) define a direção do relacionamento. O valor absoluto indica a força da correlação (Bishara e Hittner, 2012; Scott, Flaherty e Currall, 2013). Os dados desta pesquisa foram correlacionados. O valor foi significante p<0,0001 para um r de Pearson de 0,557 (Tabela 07), apontando uma relação moderada entre as variáveis. Logicamente, refletindo que há um impacto no valor final devido ao efeito aneugênico, já que como mencionamos anteriormente a quebra cromossômica justifica em parte a presença dos micronúcleos encontrados. 88 Tabela 07.correlação aberrações entre cromossômicas e frequência de frequência de micronúcleos em células binucleadas, 2008 a 2011. Frequência de aberrações cromossômicas (n=26) Variável Frequência de micronúcleos em linfócitos (n=29) r = 0,557 P<0,0001 Coeficientede Pearson = r Ainda sobre os resultados encontrados, ao se elevar o valor do coeficiente encontrado (r 2) obtêve-se o valor de variância compartilhada pelas variáveis. Como pode-se observar 0,557 2 corresponde a 0,3102 ou apenas 0,31. Multiplicando-se este resultado por 100 (cem) têm-se o valor em porcentagem 31%. Tal achado reflete a interação destes dados, 31 % dos micronúcleos encontrados nesta pesquisa podem ter sido oriundos do efeito clastogênico nos cromossomos. Pelo diagrama de Venn (Figura 28) o compartilhamento torna-se mais visível Através da ilustração, percebe-se que a maior parte dos micronúcleos encontrados nas análises podem ter surgido devido a efeitos aneugênicos, resultante de algum comprometimento na maquinaria da divisão celular, mais precisamente do momento da migração dos cromossomos para os pólos. 89 FREQ DE CBMN FREQ DE AC I) Frequência de MN (CbMN) Frequência de ac 31 % II ) Porcentagem de compartilhamento Figura 28. Diagrama de Venn demonstrando valor da variância compartilhada da frequência de aberrações cromossômicas e frequência de micronúcleos em células binucleadas em porcentagem. Em I variáveis separadas e em II porcentagem de 31%. 5.2.4.2 análise de regressão linear entre a frequência de aberrações cromossômicas e a frequência de micronúcleos em células binucleadas. Uma análise de regressão linear foi conduzida para determinar o efeito da variação da frequência de aberrações cromossômicas na frequência de micronúcleos em células binucleadas. Constatou-se que para cada aumento no escore de frequência de aberrações cromossômicas aumenta-se 5,74 no valor da frequência de micronúcleos em células binucleadas (Figura 29). 90 Figura 29. Regressão linear.Frequência de aberrações cromossômicas (Y) e frequência de micronúcleos em linfócitos (X).Equação Y=5,747345078049613x + 0,2209072463180102. 5.2.5. análise do número de micronúcleos em mucosa bucal Os dados epidemiológicos do cromo descrevem a exposição oral e ou nasal como as principais fontes de contaminação. Estudos apontam que os danos pulmonares e nasais em trabalhadores de curtume foram os principais achados , sendo importante, assim, avaliações em mucosas. No entanto alguns estudos têm revelado que quando comparadas diferentes células, os linfócitos são consideradas as células preferíveis para estudo uma vez que além do tempo de vida apresentam um número basal de MN mais constante e elevado (Fenech, 2007). Para a análise de micronúcleos em mucosa bucal foram selecionados aleatoriamente 40 (quarenta) sujeitos, divididos em 20 (vinte) expostos e 20 (vinte) não expostos. Os resultados indicaram maior número e frequência de micronúcleos em mucosa bucal quando comparados com o controle controle (Tabela 08 e figura 30). 91 Tabela 08. Número de micronúcleos (MN) e frequência de micronúcleos em mucosa bucal por indivíduo expostos e indivíduo não exposto, Teresina, 2008 a 2011. GRUPOS NÚMERO DE MN /2000 CÉLULAS MUCOSA FREQUÊNCIA DE MN MUCOSA BUCAL BUCAL EXPOSTO (n=20) NÃO EXPOSTOS (n=20) 8,100 ± 3,905a *** 0,403±0,1513a *** (3-17)b (0-0,65)b 1,200± 1,609a 0,060±0,04887a (0-6)b (0-0,15)b 0.8 Frequência de MN (%) *** 20 *** 15 10 5 0.6 0.4 0.2 A) número de micronúcleos em mucosa bucal ex po N ão N ão ex po st os Ex po st os st os 0.0 0 Ex po st os número de micronúcleos em mucosa bucal + 2.000 células avaliadas por indivíduo. a= média e desvio padrão ; b= mínimo e máximo***p <0,0001 Teste t de Student B) 20 Figura 31. Número (A) e frequência de micronúcleos (B) em trabalhadores de curtume (n=20) ***p<0,0001 em relação ao grupo não exposto (n=20) Teste t. 15 *** 10 Relativamente ao grupo controle, encontram-se resultados similares aos obtidos em outros estudos, onde a maior percentagem de indivíduos encontra-se 5 com um número menor de MN. A presença de MN na população controle N ão ex po st os Ex po st os corresponde 0ao número basal de dano genético que ocorre naturalmente no 92 organismo (Bolognesi, 2003) Não existem dados de micronúcleos em células de mucosa bucal em trabalhadores de curtume na literatura que corroborem ou não com os dados encontrados nesta pesquisa. Contudo, em relação tanto ao número quanto a frequência de micronúcleos, os expostos apresentaram uma maior score que os não expostos (p< 0,0001). O teste do micronúcleo tem sido uma valiosa ferramenta metodológica para avaliar a ocorrência de danoscromossômicos e sua relação com a carcinogênese, podendo ser executado emlinfócitos de sangue periférico, em células de medula óssea, assim como em células esfoliadas de diversos tecidos (Samanta, 2012). As células da mucosa bucal são consideradas as primeiras barreiras pós inalação e ingestão deagentes potencialmente genotóxicos, e no epitélio oral os micronúcleos sãoconsiderados importantes biomarcadores do risco de desenvolvimento de câncer esua progressão (Holland et al., 2008). Em muitos estudos tem sido reportado um aumento significante no número de micronúcleo nesses tiposde células, dos indivíduos expostos a substâncias suspeitas de genotoxicidadequando comparado ao grupo controle (Fenech et al., 2009). 5.2.6 mensuração de cromo na urina (Cr-U) através de espectrofotometria de absorção atômica com forno de grafite Devido ao grande debate acerca do cromo III e sua possível genotoxicidade, fez-se uma coleta de urina afim de quantificarmos o referido metal nos indivíduos estudados. Embora haja exposição a vários agentes químicos como anilina e tolueno, tal análise torna-se importante visto que existem várias discussões a respeito de sua genotoxicidade. Este procedimento sedeu durante a coleta das amostras de sangue e da mucosa e os 27 (vinte e sete) indivíduos expostos e os demais 27 (vinte e sete) indivíduos do grupo controle. Segundo ATSDR (2008), a quantificação total de Cromo na urina, tem sido usada para avaliar a exposição ao Cromo. Os metais como o Cromo são essenciais à vida, mas, em baixas concentrações. O trato gastrointestinal e a pele 93 regulam o influxo até certo grau, porém, o excesso pode induzir difusão passiva que pode levar à concentração excessiva e toxicidade. Segundo NR-15, item 15.1.5 – Limite de Tolerância (LT): “entende-se por limite de tolerância, para fins desta norma, a concentração ou intensidade máxima ou mínima, relacionada com a natureza e o tempo de exposiçãoao agente, que não causará dano á saúde do trabalhador, durante a sua vida laboral”. NoBrasil, quando não há limite de tolerância paradeterminado composto, a legislação brasileira,de acordo com a NR-9 item 9.3.5.1 alínea “c”,utiliza valores da ACGIH – American Conference of Governmental Industrial Hygyenists ,ou aqueles que venham a ser estabelecidos emnegociação coletiva de trabalho, desde quemais rigorosos do que os critérios técnico-legaisestabelecidos. No caso do cromo, o únicolimite que consta é para o ácido crômico (cromoVI), composto solúvel, com LT de 0,04mg/m3 (ar). O biomarcador de exposição ocupacional Segundo a legislação brasileira é o cromo urinário com Índice Biológico Máximo Permitido de 30 mg/g de creatinina (Silva, 2001). Em relação a este estudo, os resultados demonstraram que os expostos apresentaram uma maior média de cromo na urina em comparação aos não expostos (Tabela 09 e Figura 31). Dentre os setores avaliados, os indivíduos que trabalhavam no setor de classificação de peles apresentaram os maiores valores quantificados . Tabela 09. Dosagem de cromo na urina de indivíduos expostos e de indivíduos não expostos, Teresina, 2008 a 2011. GRUPOS CROMO NA URINA µg/g de creatinina EXPOSTO 1,108 ± 1,277a *** (n=27) (0,019 – 4,678)b NÃO EXPOSTOS 0,089 ± 0,027a (n=27) (0,083- 0,23)b a= média e desvio padrão ; b= mínimo e máximo ***p <0,0001 Teste t valor de cromo na urina ug/g de creatinina 94 *** 1.5 1.0 0.5 N Ã O EX P EX PO O ST ST O S O S 0.0 Figura 31. Níveis de cromo na urina de indivíduos expostos e de indivíduos não expostos. P< 0,0001. Este dado ratifica o achado de Randall and Gibson (1989) que ao analisarem a concentração de cromo na urina de um grupo de 73 trabalhadores de curtume, com a exposição principalmente ao cromo (III), obteram valores mais elevados quando comparados a um grupo de 52 indivíduos controle . A exposição ao cromo pode resultar em concentrações aumentadas no sangue (sangue total, soro e eritrócitos), urina, ar expirado, cabelo e unhas, dos quais, as elevações de cromo no sangue e urina são considerados os indicadores mais confiáveis da exposição (Cuberos, 2009). A eliminação urinária possui uma meia vida de 40 horas. A concentração plasmática e a taxa de excreção urinária de cromo atinje 95% dos níveis de estado estacionário em aproximadamente 7 dias. Depois que o estado de equilíbrio é atingido, a quantidade diária de cromo excretado na urina irá refletir a quantidade absorvida diariamente. As concentrações plasmáticas e urinárias de cromo em grande parte refletem a exposição relativamente recente. Durante as exposições relativamente constante ou repetitivo que alcança um estado de equilíbrio no plasma, a excreção urinária de cromo diariamente mensurada pode vir a ser 95 altamente correlacionada com a ingestão de cromo. Essa correlação vai enfraquecendo com a maior intermitência na exposição (ATSDR, 2008). Os princípios acima enunciados gerais aplicam-se às posições sobre a absorção de cromo III, pois o cromo VI tem um tempo maior de retenção no sangue. Cromo VI que entra no sangue é absorvida pelas células vermelhas do sangue, reduzido a cromo (III), e, no processo, forma adutos com a hemoglobina dos glóbulos vermelhos e outras proteínas. Estes complexos são suficientemente estáveis para permanecer nas células vermelhas do sangue por uma fração substancial do tempo de vida do glóbulo vermelho. Assim, um aumento nos níveis plasmáticos de cromo pode refletir tanto a exposição recente e exposição que ocorreu durante os últimos meses, enquanto o cromo urinário elevado reflete principalmente a exposição sobre 1 - 2 dias (ATSDR, 2000). 5.3. Correlações entre os fatores não ocupacionais e os dados genotóxicos Foram realizadas análises de correlação entre os fatores não ocupacionais e os resultados obtidos através das análises genotóxicas (Tabela 10). Não foram encontradas correlações entre idade e frequência de AC e frequência de CBMN em linfócitos, frequência de MN em mucosa, dano 3 e dano 4 em linfócitos e dano 4 em mucosa (para todos p>0,05). Contudo a idade correlacionou-se positivamente com o teste cometa em mucosa dano 3 (r =0,209, p=0,46). Outra influência não ocupacional avaliada foi o hábito de fumar. As análises de correlação obtidas evidenciaram que este hábito está negativamente relacionado a frequência de AC (r = - 0,319, p=0,014 ) e positivamente com a frequência de MN em mucosa (r= 0,496 p= 0,069). Houve ainda uma correlação negativa entre o hábito de fumar e dano 4 em mucosa (r= - 0,287 p=0,069). Porém, não foram encontradas correlações entre o hábito de fumar e frequência de CBMN, dano 3, dano 4 (linfócitos) e dano 4 em mucosa (p> 0,05). Em relação ao álcool e consumo de vegetais não foram encontradas correlações significativas com nenhum dos resultados genotóxicos. Aumento na frequência de MN também não foi relacionado com a ingestão de álcool (Gomez-arroyo et al., 2000). Resultados semelhantes foram 96 observados por Salaija et al. (2006), onde fatores de confundimento como idade, sexo, tabagismo e consumo de álcool não influenciaram no aumento da frequência de MN e AC. Por fim, foi correlacionado o tempo de exposição e uso de EPIs com os dados genotóxicos. Quanto ao tempo de exposição os resultados evidenciaram correlação positiva (r=0,245 p=0,048) com frequência de AC e correlação negativa com cometa em mucosa dano 3 (r= - 0, 353 p= 0,033) e dano 4 ( r = - 0,329 p = 0,043). Não foram encontradas correlações com as demais variáveis genotóxicas estudadas. Em relação ao uso de EPI, nenhuma correlaçãoo siginifactva foi encontrada. Embora não tenham sido encontradas correlações quanto ao uso de EPI e os resultados dos testes, sabe-se que o uso de equipamentos de proteção é uma importante forma de prevenção na exposição ocupacional e diminui os danos genéticos induzidos por estes agentes (Costa et al., 2007). O Ambiente de trabalho com uso de EPI e o tempo e condições de exposição são descritos na literatura como fatores capazes de afetar os níveis de dano citogenético (Bolognesi, 2003). Tabela 10. Correlações entre os fatores não ocupacionais e os resultados das análises genotóxicas, Teresina , 2011. Variáveis Freq. de AC Freq. de CBMN Cometa linfócitos dano 3 Cometa linfócitos dano 4 Freq. de MN mucosa Cometa mucosa dano 3 Cometa mucosa dano 4 Idade - - - - - r= 0,209* p=0,46 n=20 - Fumo r=-0,319** p=0,014 n=47 - - - r=0,496** p=0,003 n=20 - r= - 0,287 p=0,069* n=20 Álcool - - - - - - - Consumo de vegetais - - - - - - - r=0,245 * p=0,048 n=48 - - - - r=-0,353* p=0,033 n= 20 r= -0,329* p=0,043 n=20 - - - - - - - Tempo de Exposição Uso de EPI Coeficientede Pearson = r ; p significante quando < 0,05. ( - ) não houve correlação significante 97 5.4. Correlações entre os valores de cromo na urina e os resultados das análises genotóxicas Da mesma forma que a análise de correlação entre os fatores não ocupacionais e os resultados genotóxicos. Fez-se testes de correlação entre o nível de cromo na urina com os os testes genotóxicos (Tabela 11). Em nossas análises houve correlação positiva forte entre frequência de AC e cromo na urina (r=0,841 p= 0,018 ) , correlação positiva forte entre frequência de CBMN e cromo na urina ( r=0,730 p < 0,0001 ) e correlações positivas entre cromo na urina e dano 4 em cometa linfócitos (r=0,357 p=0,031) e dano 3 cometa em mucosa ( r= 0,338 p=0,01). Não foram encontrada correlações com os demais parâmetros. Tabela 11. Correlações entre os valores de cromo na urina e os resultados das análises genotóxicas, Teresina, 2011. Variáveis Freq. de AC Freq. de CBMN Cometa linfócitos dano 3 Cometa linfócitos dano 4 Freq. de MN mucosa Cometa mucosa dano 3 Cometa mucosa dano 4 Cromo na urina r=0,841 p<0,0001 n=26 r= 0,730** p<0,0001 n=30 - r= 0,357* p=0,031 n= 43 - r=0,338* p=0,01 n=20 - Coeficientede Pearson = r ; p significante quando < 0,05. ( - ) não houve correlação significante 5.4.1 Análise de regressão linear (cromo na urina e resultados genotóxicos) Fez-se análises de regressão linear para frequência de aberrações cromossômicas e micronúcleo em linfócitos com dosagem de cromo na urina. O objetivo destas análises é verificar até que ponto uma variação no escore de cromo na urina influenciou na variação dos escores dos dados genotóxicos e tentar predizer como a alteração no cromo da urina pode alterar os valores genotóxicos. A primeira análise verificou a frequência de aberrações cromossômicas e a concentração de cromo encontrada em 26 trabalhadores expostos. 98 Tabela 12. Análise de regressão linear entre a frequências de aberrações cromossômicas e a concentração de cromo na urina encontrada nos trabalhadores Erro R 2 padrão 0,765 1,78 F b A Limites de confiança (95%) 280, 11*** 2,89 0,78 2,54 a 3,24 *** p< 0,001 As análises indicaram que 76 % (R ajustado- R2) da variância do aumento da frequência de aberrações cromossômicas pode ser explicada pelo aumento do cromo na urina. Precisamente, tem-se para cada aumento de cromo na urina aumenta-se em 2,89 a frequência de aberrações. Os limites de confiança possuem intervalos estreitos (2,54 a 3,24) dando credibilidade aos resultados. O valor de F = 280,11 com p<0,0001 demonstra que é pouco provável que o resultado tenha ocorrido por erro amostral (Tabela 12). A melhor linha de aderência pode ser visualizada na figura 32. Com a análise realizada tem-se uma fórmula algébrica y = 2,89x + 0,78. Figura 32. Regressão linear. Frequência de aberrações cromossômicas (Y) e níveis de cromo na urina /por indivíduo (n=26) (X). Equação Y = 2,893698879289154 x + 0,78654702541123336 99 Tabela 13. Análise de regressão linear entre a frequências de micronúcleos em células binucleadas de linfócitos e a concentração de cromo na urina encontrada nos trabalhadores expostos. R2 Erro F b a Limites de confiança (95%) 46,43*** 0,22 0,53 0,155 a 0,286 padrão 0,53 0,33 ***p<0,001 Nestes dados as análises indicaram que 53% (R ajustado- R2) da variância do aumento da frequência de micronúcleo em células binucleadas de linfócitos pode ser explicada pelo aumento do cromo na urina. Cada aumento de cromo na urina corresponde a 0,22 no aumento de micronúcleos. Os limites de confiança apresentaram intervalos estreitos (0,155 a 0,286). O valor de F = 46,43 com p<0,0001 (Tabela 13). A melhor linha de aderência pode ser visualizada na figura 33. Com a análise realizada tem-se uma fórmula algébrica y = 0,22x + 0,53. Figura 33. Regressão linear.Frequência de micronúcleos em células binucleadas em linfócitos (Y) e níveis de cromo na urina /por indivíduo (n=30) (X). 100 Estes achados são curiosos. As correlações fornecem uma indicação de que as alterações encontradas possuem uma relação direta com o cromo ingerido. Na literatura, as correlações foram feitas entre o nível de cromo na urina e o nível de cromo no plasma. Não havendo dados entre a relação da variável cromo e dados genotóxicos. Infelizmente, não podemos, neste estudo, apontar o real responsável pelos danos (Cr III ou Cr VI ou outra substância), visto que, a análise de cromo na urina por espectofotometria não pôde nos fornecer esta informação. Contudo, através dos dados existente poderíamos supor que como se tratam de trabalhadores expostos continuamente ao cromo, seus sistemas biológicos estariam saturados, havendo, portanto, uma maior excreção diária de cromo III pela urina, refletindo uma exposição recente. Esta hipótese é sustentada pelo fato de não existir sulfato de cromo III 100 por cento puro, havendo sempre uma contaminação deste pelo cromo VI. Isso nos faria deduzir que, como o cromo VI possui uma maior capacidade de penetrar na célula, estaria ao se reduzir, aumentando a concentração intracelular de cromo III, dificultando mais ainda sua penetração e aumentando sua excreção urinaria. Portanto o agente causador dos danos seria o cromo VI e seus componentes gerados apos sua redução intracelular. Outra hipótese que poderíamos considerar é que, mesmo a literatura apontando a dificuldade do cromo III entrar na célula, devido a seu estado de oxidação. Este estaria, cronicamente, conseguindo penetrar e portanto, saturar os sistemas, gerando uma maior excreção do metal na urina. Contudo, esta hipótese só teria validade se tivéssemos verificado a pureza do pó utilizado no processo de curtimento. Verificação esta que não realizamos. 101 CONCLUSÃO 102 6.CONCLUSÃO Através das análises mutagênicas e genotóxicas realizadas nos trabalhadores de curtume em Teresina, capita do estado do Piauí. Conclui-se que : -O número e a frequência de micronúcleos, tanto de células da mucosa bucal quanto dos linfócitos, estão aumentados nos trabalhadores de curtume, indicando efeitos mutagênicos e genotóxicos; -O índice de danos e a frequência de danos ao DNA encontrados aumentados nos trabalhadores, em relação ao controle, indicam que os mesmos se expuseram a eventos genotóxicos; -A análise do teste de aberrações cromossômicas mostrou os trabalhadores com maior número e frequência destas alterações, indicando efeito clastogênico; -Através da análise de correlação entre o micronúcleo em linfócitos e as aberrações cromossômicas, concluiu-se que a maioria dos micronúcleos em linfócitos encontrados, nesta pesquisa, são decorrentes de eventos aneugênicos; -A mensuração do cromo na urina demonstrou que a quantidade do metal encontrava-se aumentada quando comparada ao controle; -A correlação encontrada entre as aberrações cromossômicas e o cromo na urina indicou que este metal é, possivelmente, o responsável pelos eventos clastogênicos. 103 RECOMENDAÇÕES 104 7. RECOMENDAÇÕES Através dos resultados de genotoxicidade pode-se deduzir que os trabalhadores estão sujeitos um risco real dos efeitos resultantes da genotoxicidade/mutagenicidade. O ambiente do curtume deve ser alvo de monitorização e de preocupação por parte de ações de saúde pública. Ações voltadas a minimizar a instabilidade genética devem ser empregadas imediatamente, com intuito de minimizar odanos, pois exposição repetida do ser humano às misturas químicas complexas favorecem a mutações , sendo este um estágio inicial para a formação de tumores. Portanto, o referido biomonitoramento é de suma importância e deve ser incluído em políticas de saúde pública. As conclusões geradas através deste trabalho são altamente relevantes para a gênese de políticas locais e nacionais voltadas para a saúde do trabalhador. Têm-se então, um documento, cujos dados podem e devem ser utilizados pelo poder público como meio de intervenção e de transformação de uma realidade social, voltada, preferencialmente, para o bem do trabalhador piauiense. Desta forma, o presente trabalho propõe a ser uma etapa importante na preparação da estratégia temática, através de medidas de vigilância em saúde dos utilizadores e, nomeadamente, dos trabalhadores de curtumes, visando estabelecer a implantação de medidas de proteção a estes trabalhadores. Dessa forma reforçase a necessidade de: (1) Realização do biomonitoramento, pelo menos semestralmente para indivíduos que estão em riscos de instabilidade genética, especialmente com o uso dos testes de micronúcleos em mucosa bucal e cometa em linfócitos de sangue periférico, devido suas eficácias, sensibilidades e baixos custos financeiros; (2) Regulamentação dos programas de colaborações científicas com instituições de ensino superior e de pesquisas nos níveis locais, regionais, nacionais e internacionais, capacitação técnica, estágios e iniciação científica;. visando a permanente 105 (3) Implementação de políticas de saúde públicas voltadas para prevenção do câncer; com elaboração de programas informativos sobre os riscos dos agentes químicos/físicos, uso de equipamentos de proteção, vigilância da qualidade de nutrientes consumidos e biomonitoramento da saúde ambiental ocupacional; (4) Melhor articulação entre órgãos de governo para apoio técnico e maior rigor pelos órgãos de fiscalização coibindo a exploração do trabalhador e exigindo o uso de EPIs. 106 REFERÊNCIAS 107 8.REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABDOLLAHI, M. et al. 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A participação é espontânea e constará destas informações gerais sobre saúde e dieta, mais uma coleta de sangue para estudo citogenético. O estudo consiste em uma avaliação de mutações nos cromossomos de cada participante. Mutações cromossômicas ocorrem normalmente nas células de todas as pessoas em nível bastante baixo, e são apontadas, entre outros efeitos, nos processos de envelhecimento e do câncer. Trabalhadores em atividades de risco (por exemplo, radiologia, quimioterapia, uso de óxido de etileno e outras), se não seguirem normas adequadas de segurança, podem aumentar a freqüência de mutações cromossômicas em suas células. Este estudo poderá servir como sinal de alerta para prevenir e melhorar as condições de segurança. Caso não se encontrem diferenças entre trabalhadores de atividades de risco e outros de atividades diversas, poderemos concluir que os itens de segurança são efetivos neste aspecto. Isto servirá de estímulo para continuar tomando cuidados com a vida no local de trabalho. Leia e responda cuidadosamente as seguintes questões. A informação dada por você não será associada com o seu nome, sendo conhecida apenas pelos pesquisadores associados a este estudo. As respostas deste questionário poderão ter influência direta na interpretação de nossos resultados. Por isso, contamos com sua cooperação em fornecer informações corretas. Obrigado pelo seu interesse. 1. Nome Data: Código n Para ser preenchido pelo pesquisador Essa folha será destacada das demais do questionário e arquivada. Apenas o número do código será usado como identificação nas próximas páginas. Se espaços adicionais forem necessários para completar uma resposta, por favor escreva atrás da página e identifique o complemento da resposta com o número da questão. 119 HISTÓRIA PESSOAL Data de hoje:_________________________________________________. Qual a sua idade? _______________(em anos). Sexo: ( )Masculino ( )Feminino A qual grupo étnico você pertence: ( )Caucasiano ( )Negro ( )Chinês ( )Japonês ( )Outro. Qual?__________________________________________________ . Qual o seu estado civil? ( )Casado ( )Solteiro ( )Separado ( )Divorciado ( )Viúvo De quantos filhos você é pai natural (isto é, não inclua filhos adotados e de criação, e inclua filhos que moram separadamente)? _________________________________ HISTÓRIA OCUPACIONAL Qual o seu local de trabalho ? _______________________________________. Há quanto tempo você trabalha neste local? ___________________________. Se há menos de dez anos, onde você trabalhou previamente e por quanto tempo? ________________________________________________________________. Que tipo de trabalho você faz? __________________________________________ _____________________________________________________________________ EXPOSIÇÃO Liste os agentes químicos (por exemplo, gases tóxicos, benzeno, chumbo, fármacos, agrotóxicos,etc.) ou físicos (radiação) a que você se expôs nos últimos 10 anos em seu trabalho. 120 Nos últimos 12 meses: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ Nos últimos 10 anos: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ Liste os agentes químicos ou físicos a que você se expôs nos últimos 10 anos fora de seu trabalho. Nos últimos 12 meses: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ Nos últimos 10 anos: Quantas vezes por mês: ___________________ ___________________ ___________________ ___________________ HISTÓRIA DE FUMO Alguma vez você fumou? ( )Sim ( )Não Se sim, continue: a)Quanto tempo você fumou?______________(em anos) b)Você fuma atualmente? ( )Sim ( )Não Se sim, passe para a c) Se não: Quando você parou de fumar?___________________(mês e ano). 121 c)Você fuma cigarros? ( )Sim ( )Não Se sim, quantas carteiras por dia? ( )Menos de ½ carteira ( )½ a 1 carteira ( )Mais de 1 carteira, quantas?______ Você fuma cigarros com filtro? ( )Sim ( )Não Qual a sua marca usual?_________________________________ . d)Você fuma charutos? ( )Sim ( )Não Se sim, quantos charutos por dia? ( )1 charuto ( )2 a 3 charutos ( )4 ou mais charutos. Quantos?____ e)Você fuma cachimbo? ( )Sim ( )Não Se sim, quantas vezes por dia? ( )1 vez ( )2 a 3 vezes ( )4 ou mais vezes. Quantas?_______ f)O que você fumava no passado? ( )Cigarros ( )Charutos ( )Cachimbo g)Você mastiga tabaco? ( )Sim ( )Não 122 MEDICAMENTOS E DOENÇAS Você tem tomado algum medicamento prescrito pelo médico no último ano (por exemplo, comprimidos para pressão, insulina, tranquilizantes, relaxantes musculares, etc.)? ( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique: Per íodo .Tipo de medicamento: Dose: Quantos por dia: Início(mês): Tér mino(mês): _________________ ________ ___________ _________ ___________ Você tem tomado algum medicamento não prescrito por médico no último ano (por exemplo, aspirina, antiácidos, antihistaminas,sedativos ou outras drogas)? ( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique: Per íodo : Tipo de medicamento: Dose: Quantos por dia: Início(mês): Tér mino(mês): _________________ ________ ___________ _________ ___________ Você toma ou tomou alguma vitamina nos últimos 6 meses? ( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique:Tipo de vitamina: Dose: Quantas vezes por semana: _________________ __________ _______________________ a)Você teve ou tem alguma dessas doenças? Câncer ( )Sim ( )Não Hepatite ( )Sim ( )Não Mononucleose ( )Sim ( )Não Herpes ( )Sim ( )Não 123 AIDS ( )Sim ( )Não Meningite ( )Sim ( )Não Infecção bacteriana ou viral ( )Sim ( )Não Doença cardiovascular ( )Sim ( )Não Diabete ( )Sim ( )Não Outras doenças importantes ( )Sim ( )Não b)Se sim, indique abaixo: Doença: Per íodo da doença: Tr atamento: ________________ _________________ ___________ c)Liste as vacinações que você recebeu nos últimos 12 meses. Vacina: Data: ___________________________ ___________________ d)Liste os raiosX diagnósticos e terapêuticos, recebidos nos últimos 10 anos. Razão par a o r aioX Data(ano) ___________________________ ___________ e)Você fez alguma cirurgia durante o último ano? Data: Razão: ______________ _______________________________________ f)Dê as datas de quando você teve febre nos últimos 12 meses. Data(mês): Doença associada: Medicamento tomado: _______________ __________________ ____________________ 124 DIETAS (deve refletir apenas os hábitos frequentes) Você come apenas vegetais? ( )Sim ( )Não Você come carne? ( )Sim ( )Não a)Se sim, com que frequência você come o seguinte: Dias por semana : 1 a 2;3 a 4; 5 a 6 todos dias Carne bovina _________ Peixe ________ Galinha ________ Porco ________ Outras ________ b)Como você prefere sua carne? ( )Mal passada ( )No ponto ( )Bem passada Você usa adoçantes? ( )Sim ( )Não Quantos por dia?____________ Você bebe refrigerantes? ( )Sim ( )Não Quantos por dia?____________ Comente sobre sua dieta, caso ela tenha algo de especial (por exemplo, dieta rica em proteínas e pobre em carbohidratos,etc). Você bebe café? ( )Sim ( )Não Quantos xícaras pequenas por dia?__________ Você bebe chá? ( )Sim ( )Não Quantos xícaras por dia?__________ Você toma chimarrão? ( )Sim ( )Não Com que freqüência?____________________ Você bebe cerveja? ( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique sua média de consumo semanal: ( )1-6 garrafas por semana ou menos. 125 ( )7-12 garrafas por semana. ( )13-24 garrafas por semana. ( )Mais de 24 garrafas por semana. Quantas?_________ . Você bebe vinho? ( )Sim ( )Não Se sim, por favor indique sua média de consumo semanal: ( )1-4 copos por semana ou mais. ( )5-8 copos por semana. ( )9-16 copos por semana. ( )Mais de 16 copos por semana. Quantos?__________ . Você bebe outras bebidas alcoólicas (excluindo cerveja e vinho)? ( )Sim ( )Não Se sim, qual ou quais?____________________________ Por favor, indique sua média de consumo semanal: ( )1-4 copos por semana ou menos. ( )5-8 copos por semana. ( )9-16 copos por semana. ( )Mais de 16 copos por semana. Quantos?___________ . HISTÓRIA GENÉTICA Você tem conhecimento de algum defeito de nascimento ou outra desordem genética ou doença hereditária que tenha afetado seus pais, irmãos, irmãs ou seus filhos? ( )Sim ( )Não Se sim, por favor especifique: ___________________________________ Você ou a sua esposa teve ou tem dificuldade para engravidar? ( )Sim ( )Não Se sim, por favor especifique: ___________________________________ 126 Você já teve um filho que tenha nascido prematuramente ou que tenha sido abortado? ( )Sim ( )Não Você tem um gêmeo idêntico vivo? ( )Sim ( )Não 127 ANEXO III: FICHAS DE AVALIAÇÃO MUTAGÊNICOS DOS TESTES GENOTÓXICOS E 128 SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI LABORATORIO CENTRAL DE SAÚDE PUBLICA - LACEN “Dr. COSTA ALVARENGA.” Laboratório de Toxicologia Genética Molecular (LABTOXGEN-MOL) FICHA DE AVALIAÇÃO DO TESTE DE MICRONÚCLEO EM CÉLULAS HUMANAS IN VITRO Expostos : Não Expostos: Projeto : Trabalhadores: Pacientes Nº DE BN BN com MN BN com 1 MN BN com 2 MN BN com +3 MN Nº MN EM BN OUTROS DANOS CITOGENÉTICOS CÉLULAS VIÁVEIS COM % BN/MN 1 NÚCLEO 2 NÚCLEOS 3 NÚCLEOS 4 NÚCLEOS IDN CÉLULAS APOPTÓTICAS CÉLULAS NECRÓTICAS PONTES NUCLEOPLASMÁTICAS CÉLULAS COM BROTO IDN = [ M1+2(M2)+3(M3)+4(M4)]/N LEGENDA: IDNC = Índice de divisão nuclear considerando citotoxicidade; M1 – N° de céls com 1 núcleo; M2 – N° de céls com 2 núcleos; M3 – N° de céls com 3 núcleos; M4 – N° de céls com 4 núcleos; N – N° total de céls viáveis BN, MN, IDN IDNC 129 SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI LABORATORIO CENTRAL DE SAÚDE PUBLICA - LACEN “Dr. COSTA ALVARENGA.” Laboratório de Toxicologia Genética Molecular (LABTOXGEN-MOL) FICHA DE AVALIAÇÃO DE FREQUÊNCIA DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS Projeto: _____________________________________________ Data: ___/___/_______ Responsável: ___________________________ ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS PACIENTES CAMPO Nº DE % Nº CÉLULAS METÁFASES METÁFASE ABERRAÇÕES CROMATÍDICAS Dicêntricos Tricêntricos Anel Acêntrico Fragmentos TOTAL DE AC DELEÇÕES Terminais Índice Metafásico (IM) = N° de Metáfases X 100 300 % AC= Total de AC X 100 300 Intersticiais % DE AC 130 SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI LABORATORIO CENTRAL DE SAÚDE PUBLICA - LACEN “Dr. COSTA ALVARENGA.” Laboratório de Toxicologia Genética Molecular (LABTOXGEN-MOL) FICHA DE AVALIAÇÃO DO TESTE COMETA Projeto Material Biológico: Grupo: Pacientes Não Expostos Pacientes Expostos CÉLULA CLASSE CÉLULA 1. 26. 2. 27. 3. 28. 4. 29. CLASSE CÁLCULO DO ÍNDICE DE DANO DANOS TOTAL DE CÉLULAS X CLASSE DE DANOS 5. 30. 6. 31. 0 _______X 0 7. 32. 1 _______X 1 8. 33. 2 _______X 2 9. 34. 3 _______X 3 10. 35. 4 _______X 4 11. 36. 12. 37. 13. 38. 14. 39. 15. 40. 16. 41. 17. 42. 18. 43. 19. 44. 20. 45. 21. 46. 22. 47. 23. 48. 24. 49. 25. 50. TOTAL DE DANOS ID (%) ...............Ʃ DANOS CÁLCULO DA FREQUÊNCIA DE DANOS (FD - %) FD = 100 – Total de Danos 0 FD= ________ 131 SECRETARIA DE SAUDE DO ESTADO DO PIAUI LABORATORIO CENTRAL DE SAÚDE PUBLICA - LACEN “Dr. COSTA ALVARENGA.” Laboratório de Toxicologia Genética Molecular (LABTOXGEN-MOL) FICHA DE AVALIAÇÃO DE FREQUÊNCIA DE MICRONÚCLEOS Projeto: Controle: Data: Responsável Campo Nº células FREQUÊNCIA DE MN = Nº de MN % MN Cariorrexe N° de alterações X 100 2000 Cariólise Células Binucleadas