TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM SOJA VISANDO

T61 - TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA EM SOJA VISANDO TOLERÂNCIA À SECA*
A.L. Nepomuceno1*; M.A. Beneventi1,2; Yamaguchi-Shinozaki K.3; N. Yamanaka1,3; K.
Nakashima3, E. Binneck1; J.R.B. Farias1; S.R.R. Marin1; C.A. Silveira1; S.M. Lugle 1,3; R.
Abdelnoor1; A.A.R. Paiva1,4; A.M. Polizel1,2.
1
Embrapa Soja, Cx. P. 231. 86001-970, Londrina, PR, [email protected].
2
Universidade Estadual de Londrina – UEL. 3Japan International Research Center for
Agriculture Science - JIRCAS. 4Centro Universitário Filadélfia - UniFil. *Trabalho
apresentado no IV Congresso Brasileiro de Soja, realizado em Londrina-PR-Brasil de 5 a
8 de junho de 2006.
Palavras chave: biobalística, déficit hídrico, expressão gênica, PCR em tempo real.
INTRODUÇÃO
Períodos de estiagem cada vez maiores têm se mostrado um sério problema à
produção agrícola nacional gerando perdas acentuadas durante o cultivo das lavouras.
Nesse cenário, a ocorrência de eventos de seca, vem destacando-se como a principal
limitação à total expressão do rendimento da cultura da soja, especialmente nos estados
do sul, onde mais de 25% da produção foi perdida nas duas últimas safras.
Durante o déficit hídrico, o metabolismo molecular da planta é consideravelmente
afetado e, consequentemente, diferentes genes são ativados em resposta ao estresse.
Uma seqüência conservada A/GCCGAC nomeada DRE (Dehydration Responsive
Element) regulada por uma família de fatores de transcrição nomeada DREB (Dehidration
Responsive Element Binding Protein), tem sido identificada na região promotora desses
genes e é ativada durante os instantes iniciais de percepção do estresse (ShinozakiYamaguchi et al., 2002).
A utilização do cassete de expressão rd29A:DREB1A, composta pelo promotor rd29A,
contendo a região DRE e a região codante do fator de transcrição DREB, obtidos de
Arabdopsis thaliana tem demonstrado promover aumento de tolerância à seca em plantas
transgênicas de tabaco, (Kasuga et al., 2004), trigo (Pellegrineschi, et al., 2002) e A.
thaliana (Kasuga et al., 1999). Esses resultados indicam a conservação desses elementos
e sugerem que a mesma estratégia pode ser promissora no desenvolvimento de plantas
tolerantes à seca em culturas agronomicamente importantes como a soja.
Assim, o presente trabalho teve como objetivo introduzir por biobalística, os
vetores de expressão rd29A:DREB1A e rd29A:GUS e verificar a indução do promotor
rd29A em condições de déficit hídrico em soja.
MATERIAL E MÉTODOS
No processo de transformação, as construções gênicas foram introduzidas por cotransformação nos embriões da cultivar BR-16 pela técnica de biobalística, utilizando gás
hélio sob alta pressão e micropartículas de tungstênio envoltas por DNA, de acordo com o
método patenteado pela Embrapa (Aragão et al., 2000).
As sementes de soja foram esterilizadas com etanol e hipoclorito de sódio.
Posteriormente, os embriões foram separados dos cotilédones e tiveram a região de
meristema apical exposta pela retirada dos primórdios foliares. Soluções de DNA (1�g/�L)
contendo cada construção foram precipitadas em micropartículas de tungstênio com o
auxílio de CaCl2 e espermidina. A introdução das micropartículas contendo as construções
de interesse nos embriões de soja ocorreu com o auxílio de acelerador de partículas
desenvolvido no Brasil. Para o processo de regeneração e crescimento, os embriões
foram mantidos em câmara de crescimento por aproximadamente 40 dias.
Posteriormente, embriões com multibrotos foram transferidos para vasos contendo uma
mistura de solo e areia em casa de vegetação por mais 40 dias até o início das análises
moleculares para identificação de plantas positivas pela técnica de PCR (Polymerase
Chain Reaction).
O ensaio histoquímico demonstrando a expressão do gene GUS dirigido pelo promotor
rd29A em embriões de soja, foi realizado de 1 a 4 horas após a indução do déficit hídrico.
Esse ensaio histoquímico é baseado na clivagem do substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-�-
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Mejoramiento Genético
D-glucuronídeo (X-gluc) pela �-glucuronidase, e o produto dessa reação, na presença de
oxigênio, forma dímeros, resultando em um precipitado insolúvel de cor azul.
Para a análise de expressão gênica por PCR em Tempo Real, amostras de folha de
cada planta foram coletadas em nitrogênio líquido e, posteriormente, armazenadas em
freezer a –80oC. O nível de expressão do transgene AtDREB1A foi analisado na planta
parental nomeada P58-T0 em experimento de suspensão de irrigação e na planta
pertencente a sua progênie nomeada P58-T1-01em experimento de desidratação celular.
No experimento de suspensão de irrigação foram coletadas folhas da planta
transformada, mas não positiva, nomeada 232, e da planta não transformada, nomeada
BR16, utilizadas como controles negativos. A planta positiva para inserção do gene
AtDREB1A, nomeada P58, teve as amostras de folhas coletadas em três condições
diferentes. A primeira coleta foi realizada 36 horas após a planta ser submetida a déficit
hídrico total (suspensão de irrigação por 36h), a segunda coleta ocorreu 30 dias após a
reidratação, sendo coletada parte de uma folha nova que não foi submetida ao estresse e
parte de uma folha já existente durante o estresse.
Para o experimento de desidratação celular foram coletados dois folíolos pertencentes
ao mesmo trifólio em cada planta utilizada no experimento. As plantas utilizadas foram:
P58-T0 e P58-T1-01 positivas para a construção rd29A:DREB1A e como controles
negativos foram utilizadas as plantas BR-16 não transformada e plantas AHAS
transformada apenas com o gene ahas. Um folíolo correspondeu ao tempo 0 min.
(utilizado como controle da expressão do gene AtDREB1A) e o segundo folíolo foi
utilizado no tratamento de desidratação celular por 90 min sob exposição à luz solar em
casa de vegetação, (30oC � 2oC; UR 60% � 5%) para a indução do promotor rd29A e
expressão de AtDREB1A.
A extração de RNA total foi feita usando reagente trizol (Invitrogen – Life Technologies),
conforme recomendações do fabricante. As reações de transcrição reversa ocorreram
utilizando-se a enzima transcriptase reversa (Moloney Murine Leukemia Virus - M-MLV)
para obtenção do DNA complementar (DNAc), de acordo com Panchuk et al. (2002). Para
amplificar o gene AtDREB1A exógeno e o gene RNAr 18S (controle interno utilizado para
normalizar as amostras), foram desenhados primers, pelo programa Primer Express
(Applyed Biosystems, Foster, CA, USA), próximo à região 3´ do gene, obtendo amplicons
de aproximadamente 150 pares de base (pb).
As reações de PCR em tempo real foram realizadas, em termociclador 7300 Real Time
System (Applied Biosystems, Foster, CA, USA), utilizando-se o kit Platinum�SYBR�Green
qPCR SuperMix UDG (Invitrogen – Life Technologies), conforme recomendações do
fabricante.
RESULTADOS E CONCLUSÕES
De 941 plantas transformadas e testadas por PCR, 17 plantas foram confirmadas
positivas utilizando primers específicos de amplificação para as construções
rd29A:DREB1A e rd29A:GUS (Fig. 1). A eficiência de transformação foi de 1,8%.
Através do ensaio histoquímico foi possível observar a expressão transiente em
embriões de soja, transformados com o vetor rd29A:GUS (Fig.1). O promotor rd29A foi
induzido em embriões de soja em condições de desidratação celular e mostrou estar
ativado dentro de 1 hora de estresse, demonstrando a efetividade do promotor rd29A em
soja.
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Mejoramiento Genético
A
B
Figura 1. Ensaio histoquímico demonstrando a expressão do gene GUS dirigido pelo promotor
rd29A em embriões de soja, induzido por déficit hídrico (A). Confirmação por PCR de plantas de
soja geneticamente modificadas com o promotor rd29A e o fator de transcrição DREB1A (B).
P58 NÃO ESTRESSADA
A análise feita por PCR em Tempo Real (RT-PCR) permitiu verificar os níveis de
expressão do fator de transcrição AtDreb1A introduzido na planta P58-T0 e em uma
linhagem de sua progênie P58-T1-01, confirmando que o transgene é diferencialmente
expresso em condições de déficit hídrico. Após 36 horas de déficit hídrico, foi detectado
aumento do nível de expressão do fator de transcrição AtDREB1A na amostra coletada da
planta P58-T0. Trinta dias após a reidratação, ainda foi detectado aumento do nível de
expressão na folha remanescente ao estresse (Fig. 2). No experimento de desidratação
celular a indução do promotor rd29A ocorreu dentro de 90 minutos, assim como o
aumento no nível de expressão do fator de transcrição AtDREB1A, nos folíolos das
plantas P58-T1-01 e P58-T0 submetidos à desidratação celular (Fig. 3). Esses resultados
sugerem a eficiência do promotor rd29A de A. thaliana em regular a expressão do fator de
transcrição DREB1A durante o déficit hídrico em soja, mas também indicam que nos
eventos P58, mesmo em condição não estressada existe expressão basal do fator
AtDREB1A.
Branco
P58-T1-90min
P58-T1-0 min
P58 90 min
P58 0 min
BR16 90 min
1
5
BR16 0 min
2
Ahas 90 min
3
Ahas 0 min
Nível de Expressão
4
BRANCO
SADA
P58 ESTRESSADA
10
BR16
BR16
15
P232
P232
Nível de Expressão
20
P58 DEPOIS DO ESTRESSE
25
Tratamentos
Tratamentos
Tratamentos
Figura 2. Nível de expressão do transgene
AtDreb1A em soja correspondente aos
tratamentos utilizados: plantas controle
negativo (P232 e BR-16), P58 estressada
(36 horas após a planta ser submetida a
déficit hídrico total), P58 depois do estresse
(30 dias após a reidratação), P58 não
estressada e branco (sem DNA).
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Figura 3: Nível de expressão do
transgene AtDREB1A em soja sob
condições normais e tratamento de
desidratação celular durante 90
minutos. Amostras: Ahas e BR16,
utilizadas como controles negativos;
P58-R0 e P58-T1-01, contendo o
gene alvo e branco.
Mejoramiento Genético
Considerando a complexidade do mecanismo de resposta ao déficit hídrico ocasionado
por seca, que pode variar de acordo com a intensidade, tempo de estresse e estádio de
desenvolvimento da planta, esses resultados iniciais indicam que a expressão de
DREB1A dirigida pelo promotor rd29A, ambos de A. thaliana, podem promover tolerância
à seca em soja por transferência genética (Fig. 4). Estudos preliminares em condições
controladas em casa-de-vegetação também foram realizados e permitiram observar que
os valores de taxa fotossintética e condutância estomática ficaram superiores aos da
testemunha quando comparados em condições de déficit hídrico (dados não
apresentados). Não necessariamente este resultado implicará em redução total das
perdas de produtividade em condições reais de seca em lavouras a campo, mas o que se
espera é que essas perdas sejam menores do que as que normalmente ocorrem com
plantas não geneticamente modificadas.
Linhagem P58
(BR16 COM o gene
DREB)
BR16 SEM gene DREB
5% UG no Solo
Figura 4. Plantas de soja da variedade BR16 geneticamente modificadas COM a construção
rd29:AtDREB1A comparadas com plantas também da variedade BR16 SEM a construção
rd29:AtDREB1A. As plantas desenvolveram-se em vasos com areia em umidade gravimétrica de
15% (Capacidade de Campo). Após atingirem o estádio de desenvolvimento R1, a umidade
gravimétrica no solo foi reduzida para 5%.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem o apoio financeiro da Embrapa Soja e Jircas.
BIBLIOGRAFIA
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molecule results in the recovery of fertile transgenic soybean plants at a high frequency, Theor Appl Genet,
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Kasuga, M.; Miura, S.; Shinozaki, K.; Yamaguchi-Shinozaki, K. A combination of the Arabdopsis DREB1A gene
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Pellegrineschi, A.; Ribaut, J.-M; Trethowan, R.; Yamaguchi-Shinozaki, K.; Hoisintong, D. Progress in the genetic
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