tomato mosaic virus isolado de impatiens hawkeri: análise

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L.M.L. EXPANDIDO
Duarte et al.
RESUMO
TOMATO MOSAIC VIRUS ISOLADO DE IMPATIENS
HAWKERI: ANÁLISE FILOGENÉTICA MOLECULAR*
L.M.L. Duarte1, R.M. Soares2, F.M.C. Fernandes3,
M.A.V. Alexandre1**, A.R.P. Tozetto1, A. Cilli1**, E.B. Rivas1
Instituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, Av. Cons. Rodrigues Alves,
1252, CEP 04014-002, São Paulo, SP, Brasil. E-mail: [email protected]
1
RESUMO
Impatiens hawkeri e I. walleriana (Balsaminaceae) são espécies amplamente utilizadas na ornamentação de jardins. Como são propagadas vegetativamente por sementes, os vírus tendem a se
perpetuar na cultura. O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar um Tobamovirus isolado
de I. hawkeri, bem como estabelecer as relações filogenéticas entre os vírus desse gênero. A presença
de Tomato mosaic virus, descrita pela primeira vez em ornamental no Brasil, foi determinada por
meio de testes serológicos, RT-PCR e seqüenciamento do gene da capa protéica. Na análise de
máxima parcimônia das seqüências de nucleotídeos, uma única árvore mais parcimoniosa, com
1.093 passos, foi encontrada, com valores de “bootstrap” significativos. Discute-se a proposta da
divisão do gênero Tobamovirus em 3 subgrupos, um dos quais envolve todas as espécies isoladas
de Solanaceae, com exceção do isolado aqui caracterizado e do Odontoglossum ringspot virus.
PALAVRAS-CHAVE: Análise de máxima parcimônia, subgrupos de Tobamovirus, planta ornamental.
ABSTRACT
TOMATO MOSAIC VIRUS FROM IMPATIENS HAWKERI: MOLECULAR PHYLOGENETIC
ANALYSIS. Impatiens hawkeri and I. walleriana (Balsaminaceae) have been widely used as
ornamental plants in gardens. Since they are vegetatively propagated, viruses tend to perpetuate
in the crop. The aim of this paper was to identify and characterize the Tobamovirus isolated from
I. hawkeri (tobamo-imp), as well as to establish the phylogenetic relationships among viruses of
the same genus. The presence of Tomato mosaic virus, described for the first time in ornamental
plants in Brazil, was determined by serological tests, RT-PCR and coat protein gene sequencing.
In the maximum parsimony analysis of the nucleotide sequences, a single mostparsimonious 3
with 1,093 steps was found with high bootstrap values. The present paper discusses the proposal
to divide the Tobamovirus genus in three subgroups, one of which involves all the species isolated
from Solanaceae, with the exception of tobamo-imp and Odontoglossum ringspot virus.
KEY WORDS: Maximum parsimony analysis, Tobamovirus subgroups, ornamental plant.
INTRODUÇÃO
A demanda de plantas ornamentais no Brasil
tem aumentado, nos últimos anos, resultando em
um comércio intenso e, dentre as espécies mais
comercializadas, destacam-se Impatiens hawkeri e I.
walleriana (Balsaminaceae).
A ocorrência de diversos vírus já foi relatada
nessas espécies, incluindo Impatiens necrotic spot
virus (Law & Moyer, 1990), Tomato spotted wilt virus
(De Ávila et al., 1992), Tobacco streak virus (Lockhart
& Betzold, 1980), Tobacco ringspot virus (Lockhart &
Pfleger, 1979), Helenium virus S (Koenig & Lesemann,
1983) e Cucumber mosaic virus (CMV) (Herold, 1964).
No Brasil, partículas virais alongado-flexuosas (Sá
& Mattos, 1990 ), CMV (Duarte et al., 1996) e um
Potyvirus não identificado (Castro et al., 1992) foram
relatados.
O objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar um Tobamovirus isolado de I. hawkeri, previamente
relatado (Rivas et al., 2000), bem como examinar as
relações filogenéticas entre vírus do mesmo gênero.
Universidade de São Paulo Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, São Paulo, SP, Brasil.
Universidade de São Paulo, Museu de Zoologia, São Paulo, SP, Brasil.
*Parcialmente financiado pela FAPESP.
**Bolsistas do CNPq.
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Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.70, suplemento 3, p.88-91, 2003
Tomato mosaic virus isolado de Impatiens hawkeri: análise filogenética molecular.
MATERIAL E MÉTODOS
Fonte do vírus
O Tobamovirus isolado de I. hawkeri (tobamo-imp),
apresentando mosaico e deformação foliar, foi
mantido em Nicotiana tabacum "White Burley" e em
preparação purificada a -20° C.
Serologia
Foi realizado ELISA-indireto com anti-soros
contra os Tobamovirus: Tobacco mosaic virus (TMV-p)
isolado de Petunia hybrida; Tomato mosaic virus, isolado
de tomate (ToMV-br) e o homólogo (tobamo-imp). O
índice de distância serológica (SDI) entre os tobamovírus foi determinado de acordo com Jaegle & Van
Regenmortel (1985) utilizando-se uma concentração
viral de 10 μg/mL e diluições dos anti-soro de 1/8
a 1/2097152.
Transcriptase reversa - reação da polimerase em
cadeia (RT-PCR)
O RNA viral foi extraído a partir da preparação
purificada do tobamo-imp (1 mg/mL) com TRIzol
LS, de acordo com as instruções do fabricante. Foram
utilizados 20 pmoles dos .primers. PS1 e PAS1 (Alexandre et al., 2000) e um outro "primer" anti-senso
(PAS2) foi desenhado.
Seqüenciamento
Os produtos amplificados do tobamo-imp foram purificados utilizando-se o Kit de extração e
seqüenciados, utilizando-se o ABI Prism Big Dye
Terminator System e os primers PS1, PAS1 e PAS2.
Análise das seqüências
A seqüência de um fragmento de 480 pares de
bases (pb) correspondendo ao gene completo da
capa protéica (CP) do tobamo-imp foi submetida
ao BLAST 2.0 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov./
BLAST/) e alinhada com outras 17 espécies ou
isolados de tobamovirus, utilizando-se o programa
CLUSTAL X.
Análise filogenética
Seqüências de 18 espécies ou isolados de
Tobamovirus, incluindo tobamo-imp, foram submetidas à análise filogenética. Foi realizada a análise
de máxima parcimônia (MP) com busca heurística, empregando-se o programa PAUP v. 4.0b10
(Swofford, 2002). Os valores de "bootstrap" foram
obtidos usando-se o método "branch-and-bound"
(Thompson, 1987). Os índices de consistência (IC)
e de retenção (IR) (Felsenstein, 1978) foram obtidos com o programa MacClade 3.03 (Maddison &
Maddison, 1992).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O tobamo-imp foi serologicamente mais relacionado com o ToMV-br do que com o TMVp,
com um valor de SDI de 0,64. Considerando-se que
valores menores do que 1,0 indicam que se trata
de um isolado do mesmo vírus (Hamilton et al.,
1981), pode-se afirmar que o isolado de Impatiens
é um ToMV.
A RT-PCR foi realizada, inicialmente, utilizandose o par de "primers", PS1 e PAS1, descritos por
Alexandre et al. (2000). Com o emprego desse par
de "primers", amplificaram-se dois fragmentos, que
diferiam um do outro por cerca de 50 pb. Assim,
com o objetivo de amplificar apenas um fragmento,
um novo “primer” anti-senso foi desenhado (PAS2:
AACTTTATATTTCAGCACCTATGC), com base
na seqüência de consenso de isolados do ToMV,
incluindo a região 3 -UTR.
Após análises de MP das seqüências de nucleotídeos, foi obtida uma única topologia de árvore mais
parcimoniosa, com 1.093 passos. O IC foi 0,667 e o
IR foi 0,807 e a topologia da árvore, não enraizada,
está representada na Figura 1. Três clados principais foram visualizados, correspondentes aos três
subgrupos de Tobamovirus previamente relatados
(Lartey et al., 1996).
Esses subgrupos foram propostos com base na
localização dos genes, posição filogenética e família
botânica das hospedeiras (Lartey et al., 1996; Aguillar
et al., 1996). Com relação às hospedeiras, no subgrupo
I estão, principalmente, as solanáceas; no subgrupo
II, as cucurbitáceas e leguminosas e no subgrupo III,
as crucíferas. Os valores de "bootstrap" encontrados
para os ramos que separam os 3 subgrupos foram
de 100%, permitindo sugerir que não houve viés
homoplástico na topologia da árvore envolvendo
os três subgrupos (Fig. 1).
Embora os 3 subgrupos de tobamovírus apresentem sinapomorfia, propõe-se que, pelo menos
em parte, a família da planta hospedeira pode ser
considerada como uma autapomorfia exibida em
cada subgrupo.
O presente relato descreve a ocorrência de uma
infecção por ToMV (subgrupo I) em uma espécie
não solanácea, I. hawkeri (Balsaminaceae), sendo este
o primeiro relato de ToMV em planta ornamental
no Brasil.
CONCLUSÃO
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Fig. 1 - Árvore não enraizada das seqüências do gene da CP de espécies de Tobamovirus após análise da máxima parcimônia.
Valores de “bootstrap” estão indicados próximos aos ramos. Círculos I, II e III representam os respectivos subgrupos.
A ocorrência de ToMV em I. hawkeri permite
sugerir que este vírus possa ter vindo de uma hospedeira solanácea para uma espécie de outra família,
indicando um relaxamento das restrições biológicas
envolvendo hospedeiras do subgrupo I. Esse “salto”
de linhagens de vírus tem sido usado para explicar
a evolução de tobamovírus do subgrupo III (Lartey
et al., 1996). No presente caso, o “salto” é observado
dentro do subgrupo I, o que é extremamente significativo para o manejo de plantas economicamente
importantes, especialmente aquelas propagadas
vegetativamente. Como o ToMV é um vírus bastante
infectivo, medidas fitossanitárias rígidas devem ser
tomadas para prevenir a dispersão desse vírus, pois,
a incidência de infecção viral nas matrizes poderá
reduzir, e até mesmo impedir, a produção com
qualidade de espécies de Impatiens.
Referências Bibliográficas
Aguilar, I. Sánches, F.; Martin, A.M.; Martinez-Herrera,
D.; Ponz, F. Nucleotide sequence of chinese rape
mosaic virus (oilseed rape mosaic virus), a crucifer
tobamovirus infectious on Arabidopsis thaliana. Plant
Mol. Biol., v.30, p.191-197, 1996.
Alexandre, M.A.V.; Soares, R.M.., Rivas, E.B.; Duarte,
L.M.L.; Chagas, C.M.; Saunal, H.; Van Regenmortel,
M.H.V.; Richtzehain, L.J. Characterization of a strain
of Tobacco mosaic virus from Petunia. J. Phytopathol.,
v.148, p.601-607, 2000.
Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.70, suplemento 3, p.88-91, 2003
Tomato mosaic virus isolado de Impatiens hawkeri: análise filogenética molecular.
Castro, L.C.; Oliveira, J.M.; Barradas, M.M. Ocorrência
de potyvirus na espécie ornamental Impatiens hostii.
REUNIÃO ANUAL DO INSTITUTO BIOLOGICO.
5., 1992, São Paulo. Resumos. São Paulo: 1992. p.3.
Resumo 006.
De Ávila, A.C.; De Haan, P.; Smeets, M.L.L.; Resende, R.O.;
Kormelink, R.; Kitajima, E.W.; Goldbach, R.W.; Peters,
D. Distinct levels of relationships between Tospovirus
isolates. Arch. Virol., v.128 p.211-227, 1992.
Duarte, L.M.L.; Rivas, E.B.; Alexandre, M.A.V.; Matos,
M.F. Hypocyrta nervosa e Impatiens walleriana naturalmente infectadas com o vírus do mosaico do pepino.
Fitopatol. Bras., v.21, p.424, 1996.
Felsenstein, J. The number of evolutionary trees. Syst. Zool.,
v.27, p.27-33, 1978.
Hamilton, R.I.; Edwardson, J.R.; Francki, R.I.B.; Hsu, H.T.;
Hull, R.; Koenig, R.; Milne, R.G. Guidelines for the
identification and characterization of plant viruses. J.
Gen. Virol., v.54, p.223-241, 1981.
Herold, F. Natural infection of Impatiens sultani with
Cucumber mosaic virus. Plant Dis. Rep., v.48, p.603605, 1964.
Jaegle, M. & Van Regenmortel, M.H.V. Use of ELISA for
measuring the extent of serological cross-reactivity
between plant viruses. J. Virol. Meth., v.11, p.189-198,
1985.
Koenig, R. & Lesemann, D.-E. Helenium virus S. CMI/AAB.
Descriptions of plant viruses, n.265, 1983.
Lartey, R.T.; Voss, T.C.; Melcher, U. Tobamovirus evolution: gene overlaps, recombination, and taxonomic
implications. Mol. Biol. Evol., v.13, p.1327-1338, 1996.
Law, M.D. & Moyer, J.W. A tomato spotted wilt-like viruses
with a serological distinct N protein. J. Gen. Virol.,
v.71, p.933-938, 1990.
Lockhart, B.E.L. & Betzold, J.A. Leaf-curl of impatiens
caused by tobacco streak virus infection. Plant Dis.,
v.64, p.289-290, 1980.
Lockhart, B.E.L. & Pfleger, F.L. Identification of a strain
of tobacco ringspot virus causing a disease of impatiens in commercial greenhouses. Plant Dis. Rep., v.63,
p.258-261, 1979.
Maddison, W.P. & Maddson, D.R. MacClade version 3:
Analysis of phylogeny and character evolution. Sunderland: Sinauer Associates, 1992.
Sá, P.B. de & Mattos, J.K.A. Infecção natural de duas balsamináceas ornamentais (Impatiens spp.) no Distrito Federal
por um vírus alongado. Fitopatol. Bras., v.15, p.127, 1990.
Swofford, D.L. In: PAUP: Phylogenetic Analysis Using Parsimony (and related methods). Version 4.0.
Sunderland:Sinauer Associates, 2002.
Rivas, E.B.; Pezani, E.F.; Alexandre, M.A.V.; Duarte, L.M.L.
First report of Tobamovirus in Dieffenbachia and Impatiens. Plant Dis., v.84, p.707, 2000.
Thompson, E.A. Crossover counts and likelihood in
multipoint linkage analysis. IMA J; Math. Applied.
Med. Biol., v.4, p.93-108, 1987.
Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.70, suplemento 3, p.88-89, 2003
91