Simone Cristina Zampollo Torres
Propaganda
i UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO – UNAERP PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA TENTATIVAS DE ISOLAMENTO DE LIBERIBACTER E ANÁLISE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS EM PLANTAS DE CITROS AFETADAS POR HUANGLONGBING SIMONE CRISTINA ZAMPOLLO TORRES Orientador: Prof. Dr. Silvio Aparecido Lopes Co-orientadora: Profª. Drª. Miriam Verginia Lourenço RIBEIRÃO PRETO - SP NOVEMBRO / 2008 i UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO – UNAERP PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA TENTATIVAS DE ISOLAMENTO DE LIBERIBACTER E ANÁLISE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS EM PLANTAS DE CITROS AFETADAS POR HUANGLONGBING Dissertação apresentada ao curso de Biotecnologia da Universidade de Ribeirão Preto para a obtenção do Título de Mestre em Biotecnologia aplicada à saúde. SIMONE CRISTINA ZAMPOLLO TORRES Orientador: Prof. Dr. Silvio Aparecido Lopes Co-orientadora: Profª. Drª. Miriam Verginia Lourenço RIBEIRÃO PRETO - SP NOVEMBRO / 2008 ii Ficha catalográfica preparada pelo Centro de Processamento Técnico da Biblioteca Central da UNAERP - T693t Universidade de Ribeirão Preto - Torres, Simone Cristina Zampollo, 1970Tentativas de isolamento de liberibacter e análise de populações bacterianas em plantas de citros afetadas por huanglongbing / Simone Cristina Zampollo Torres. - Ribeirão Preto, 2008. 42 f. : il. color. Orientador: Prof. Dr. Silvio Aparecido Lopes. Dissertação (mestrado) – Universidade de Ribeirão Preto, UNAERP, Biotecnologia aplicada à saúde. Ribeirão Preto, 2008. 1. Biotecnologia. 2. Citros - Doenças. I. Título. CDD: 660.6 iii Deus, na pessoa de seu filho Jesus, sempre esteve presente na minha vida, principalmente durante a condução deste trabalho. Ele me deu forças e diligência para que diariamente eu conseguisse ser aluna, técnica, dona-de-casa, mãe e esposa. Suas palavras estiveram comigo e guardaram o meu caminho. Minhas forças eram revigoradas quando repetia com oração “Vinde a mim todo os que estais cansados e sobrecarregados, e eu vos aliviarei” (Mateus 11:28). Quando o desânimo e o cansaço conseguiam sobrepujar a minha fé, uma querida irmã em Cristo, Célia, repetia em nossas reuniões “Entrega o teu caminho ao Senhor, confia nele, e o mais ele fará” (Salmo 37:5), deste modo eu era revigorada. Este trabalho muito contribuiu para a minha formação acadêmica, mas sem dúvida para o meu crescimento espiritual. Agradeço imensamente a todos os irmãos, em Cristo, que oraram por mim. iv Dedico este trabalho ao meu marido Éder e a nossa pequena filha Bárbara. Agradeço ao meu marido e companheiro por me apoiar e me compreender nos momentos difíceis, pelos conselhos cautelosos, e por cuidar tão bem de nossa filha nos momentos de minha ausência. “ Melhor é serem dois do que um, ... porque se caírem, um levanta o companheiro...” (Eclesiastes 4: 9-10). Dedico também aos meus pais Oswaldo e Cleuda, à minha irmã Deise e à minha cunhada Sônia. “Honra a teu pai e tua mãe, para que se prolonguem os teus dias na terra que o Senhor teu Deus te dá.” (Êxodo 20:12). v Agradecimentos Agradeço especialmente ao meu orientador Prof. Dr. Silvio Aparecido Lopes, sem o empenho do qual o título de mestre não me seria possível. Muito obrigada pelo crédito e confiança, por me iniciar pacientemente no caminho da pesquisa, e principalmente por ser mais que um amigo, um irmão. Ao Fundecitrus, na pessoa do gerente científico Antônio Juliano Ayres, pela concessão da bolsa de estudos que permitiu a condução do presente trabalho. À Profª. Dr.ª Suzelei de Castro França, pela compreensão, confiança e apoio. Aos meus grandes colaboradores e amigos Guilherme Dagrava e Guilherme Frare, que muito me ajudaram e me animaram nos momentos difíceis, sem os quais não teria forças para chegar ao término dos trabalhos. Aos professores doutores da unidade de Biotecnologia, Ana Lúcia F. Saltoratto, Ana Maria S. Pereira, Bianca W. Bertoni, Eloísa A. M. Kronka, Miriam V. Lourenço, Mozart A. Marins, Paulo S. Pereira e Sônia M. Zingaretti, que sempre estiveram prontos para me atender. À minha companheira de bancada Patrícia Garnica pela ajuda, força e amizade. Aos meus companheiros de trabalho no departamento de Biotecnologia (UNAERP) Edieidia, Sarazete, Sônia, Elenice, Carla, Valéria, Antônio (Buscapé), José (China) e Rosane França. Às minhas amigas Alessandra Garcia, Juliana Coppede, Patrícia Garnica, Rosa de Belem, Silvana Pompéia, Silvana Marcussi e Tatiana Jansen; não somente pelo ombro amigo nas horas difíceis, mas principalmente pelos belos momentos que passamos juntas, recordarei com carinho de cada um deles. Às colaboradoras e amigas do Fundecitrus, Drª. Diva C. Teixeira, Elaine Martins e Priscila Meci. À todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento deste trabalho. vi LISTA DE ABREVIATURAS Ca. L. – Candidatus Liberibacter °C – graus Celsius DNA – ácido desoxirribonucléico dNTP – desoxinucleotídeos trifosfatos EDTA dissodium salt – sal dissódico do ácido etilenodiaminotetraacético HLB – Huanglongbing L – litro mg - miligrama mL – mililitro mM - milimolar ng - nanograma PBS – tampão fosfato salino PCR – reação em cadeia da polimerase q.s.p – quantidade suficiente para Rep-PCR – reação em cadeia da polimerase de palíndromos extragênicos repetitivos TSA – triptona de soja ágar TAE – tampão tris-acetato-EDTA TEB – tampão tris-borato-EDTA µL - microlitro vii LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Inoculação através de enxertia. Caule enxertado com ramo oriundo de planta doente...............................................................................................................................11 Figura 2. A e B Sintomas foliares típicos de plantas com HLB.....................................12 Figura 3. Foto de uma das câmaras climáticas que continham as plantas de citros. ....12 Figura 4. Foto da câmara de fluxo laminar organizada para o início do trabalho de maceração e plaqueamento de material vegetal coletado...............................................14 Figura 5. Detalhe da estufa de incubação. Placas de Petri dentro de sacos plásticos. Detalhe da jarra de anaerobiose......................................................................................19 Figura 6. Detalhe de cultura com colônias isoladas após processo de purificação...... 21 Figura 7. Fotografia de gel mostrando a qualidade e relativa quantidade de DNA extraído de bactérias endofíticas de citros......................................................................29 Figura 8. Fotografia de gel de agarose pós PCR para detecção de Ca. L. americanus..30 viii Figura 9. Fotografia de gel de agarose mostrando distintos padrões de bandas gerados através da análise do DNA genômico de bactérias isoladas de plantas afetadas e não afetadas por HLB, obtidos através de Rep-PCR com primers desenhados para regiões palindrômica repetitivas do genoma bacteriano..............................................................30 Figura 10. Dendograma mostrando grupamentos de bactérias isoladas de plantas sadias e afetadas por Ca. L. americanus ou asiaticus gerado através do programa NTSYS-Pc com base nos padrões de bandas mostrados na Figura 9.................................................31 ix LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. Identificação das plantas contidas dentro das câmaras climáticas .................11 Tabela 2. Variação da composição do tampão fosfato salino ........................................14 Tabela 3. Componentes dos meios de cultura testados no isolamento de Liberibacter, apresentados em ordem cronológica de testes ...........................................................16-17 Tabela 4. Grupamentos de bactérias isoladas de plantas sadias e afetadas por Ca. L. americanus ou Ca. L. asiaticus mostrados na Figura 9 ..................................................32 Tabela 5. Bactérias isoladas de plantas experimentais sadias e afetadas por Ca. L. americanus e Ca. L. asiaticus mantidas por um período de 60 dias no interior das câmaras de climáticas e transferidas para casa de vegetação..........................................33 x TENTATIVAS DE ISOLAMENTO DE LIBERIBACTER E ANÁLISE DE POPULAÇÕES BACTERIANAS EM PLANTAS DE CITROS AFETADAS POR HUANGLONGBING Resumo O huanglongbing (HLB) dos citros é causado por Candidatus Liberibacter spp., uma bactéria Gram-negativa que habita o floema das plantas infectadas e é transmitida por psilídeos, que se alimentam da seiva do floema. As plantas infectadas se tornam improdutivas em poucos anos. O HLB foi descrito no Brasil em 2004, no estado de São Paulo, e atualmente está presente em mais de 200 municípios nos estados de São Paulo, Paraná e Minas Gerais. Ele é conhecido desde 1970, quando foi associado com doença bacteriana, muitos grupos tentaram o seu cultivo in vitro mas sem sucesso. Infelizmente nenhuma composição de meio de cultivo foi publicada. Por esta razão, este trabalho foi conduzido com o objetivo de desenvolver um meio adequado para o crescimento de liberibacter e para um estudo qualitativo de população supostamente endofítica isolada de folhas de plantas sadias e afetadas por HLB, crescidas em câmaras com temperaturas de 22 a 24°C ou 27 a 32°C. Nervuras centrais de folhas foram desinfestadas em álcool e hipoclorito de sódio, maceradas e transferidas para meios sólidos ou líquidos contendo várias composições distintas. O tradicional agar nutritivo (NA) e o infuso de cérebro e coração (BHI) foram inicialmente testados com e sem modificações. Para estes meios foram adicionados vários componentes presentes na composição da seiva do floema de arroz e trigo descritos em literatura. Mais tarde, foi estabelecido um novo meio denominado TO2, contendo açúcares e aminoácidos encontrados na seiva do floema de citros. Todas as colônias que cresceram nas 16 diferentes formulações apresentaram PCR negativo quando submetidas a primers específicos para liberibacter. Para a população endofítica, 3 isolamentos em épocas diferentes foram realizados a partir de plantas experimentais. O meio de cultivo usado foi o TSA acrescido de 80g por litro de sacarose. Contudo liberibacter não foi detectada, uma grande quantidade de endofíticos foi isolada. Os endofíticos foram separados com base no padrão de bandas obtido através de Rep-PCR. No total foram 42 isolados que foram separados em 33 grupos distintos. Aparentemente estes endofíticos não desempenham qualquer papel positivo ou negativo na infecção por liberibacter ou na manifestação de sintoma uma vez que nenhum deles esteve constantemente associado com plantas infectadas ou sadias. xi Abstract Citrus huanglongbing (HLB) is caused by Candidatus Liberibacter spp, Gram-negative bacteria that live in the phloem of the infected tree, and are transmitted by the phloem sucking psyllids. HLB is considered the most destructive citrus disease, causing fruit and leaf drop on all Citrus species and varieties. Infected trees usually become unproductive in a few years. HLB was first reported in Brazil in 2004, in the State of São Paulo, and is currently present in more than 200 municipalities of São Paulo, Paraná and Minas Gerais States. Its is known that since 1970’s, when the disease was found to be associated with bacteria, several attempts were made to grow the organism in vitro, but without success. Unfortunately nothing on medium composition was published. Therefore, this work was conducted with the objective to develop an appropriate condition to grow liberibacter and to qualitatively study the population of bacterial endophytes supposedly isolated from leaves of healthy and HLB affected plants, growing in the field or in growth chambers at 22 to 24°C or 27 to 32°C. Leaf midribs were disinfested in alcohol and sodium hypochlorite, macerated, and transferred to solid or liquid media containing several distinct compositions. The traditional nutrient agar (NA) and brain heart infusion (BHI) were initially employed with and without modifications. To these media several components described in the literature to occur in phloem sap of rice and wheat plants were added. Later, a new medium named TO2, containing sugars and amino acids found in citrus phloem sap, was established. All colonies detected on the surface of 16 distinct medium formulations reacted negatively when PCR with primers specific for liberibacter were used. Later, 3 culturing attempts were made from the experimental plants. The médium used was TSA plus 80g of sucrose per liter. Although no liberibacter was detected, a large amount of endophytes was recovered. The endophytes were separated and grouped based on RepPCR fingerprints. The total 42 isolated could be separated in highly diverse 33 RepPCR groups. Apparently these endophytes do not play any positive or negative role in liberibacter infection or symptom manifestation since no one was constantly associated with infected or healthy plants. xii SUMÁRIO 1 Introdução.......................................................................................................................1 1.1 Bactérias endofíticas........................................................................................1 1.2 Liberibacter e o huanglongbing dos citros.......................................................3 1.3 Insetos transmissores de Liberibacter..............................................................5 1.4 Distribuição geográfica de Liberibacter e medidas de controle do huanglongbing.......................................................................................................5 1.5 Fitoplasma como agente possivelmente associado ao huanglongbing............6 1.6 Técnicas moleculares usadas em diagnose e estudos de endofíticos...............7 2 Objetivo........................................................................................................................10 3 Material e Métodos.......................................................................................................11 3.1 Material vegetal.............................................................................................11 3.2 Processamento das amostras e inoculação nos meios de cultivo...................13 3.3 Meios de cultura.............................................................................................20 3.5 Purificação, clonagem e armazenamento das colônias isoladas....................21 3.6 Teste de Gram................................................................................................22 3.7 Extração de DNA genômico..........................................................................22 3.8 Quantificação do DNA..................................................................................23 3.9 Protocolo de PCR para detecção de Liberibacter..........................................25 3.10 Protocolo de Reação de Rep-PCR...............................................................25 3.11 Construção do dendograma.........................................................................25 4 Resultados e discussão..................................................................................................26 5 Conclusões....................................................................................................................36 6 Referência bibliográfica...............................................................................................37 1 1 Introdução 1.1 Bactérias endofíticas As bactérias formam um dos grupos mais diversos na Terra podendo compreender mais de um milhão de espécies (KENNEDY, 1999). No entanto, estima-se que apenas uma pequena fração delas seja conhecida (TORSVIK et al., 2002). Estão presentes em todos os ambientes e, através de sua atividade metabólica, afetam as propriedades químicas e físicas do ambiente a sua volta (NEWMAN; BANFIELD, 2002). Elas ocupam e colonizam todos os habitat possíveis como o sistema digestório de animais superiores, superfícies e interior de plantas, materiais mortos, água doce e salgada, fontes termais submarinas, e até o interior de rochas e geleiras. As plantas, em particular, se constituem num verdadeiro ecossistema bacteriano. Os diferentes órgãos podem ser colonizados interna ou externamente por bactérias. Estas são encontradas internamente colonizando sistemas vasculares, tecidos e espaços inter e intracelulares. Com base em sua relação interna com o hospedeiro, elas podem ser divididas em dois grupos: endofíticas e patogênicas. O primeiro refere-se às que vivem no interior das plantas sem causar danos visíveis (HALLMANN et al., 1997) e o segundo pode causar danos ao seu hospedeiro. A relação benéfica ou patogênica depende de fatores como as condições ambientais e presença de outras populações bacterianas afetando o seu crescimento no interior da planta, além da presença de fatores de virulência como toxinas, hormônios, enzimas, dentre outros. Para Kloepper et al.(1992), endofíticas são todas as bactérias que colonizam tecidos do interior das plantas independentemente de causar danos ou não ao hospedeiro. Tem sido demonstrado que é através da raiz que os microrganismos endofíticos primeiramente entram na plantas. Partes aéreas como flores, caules e cotilédones podem ser locais de entrada, mas são considerados secundários. Uma vez dentro da planta, essas bactérias podem se localizar tanto no ponto de entrada, como se dispersar de forma sistêmica (HALLMANN et al. 1997; ZINNIEL et al., 2002). A penetração pode ser ativa, através de enzimas hidrolíticas como celulases e pectinases, ou passiva, através de aberturas naturais ou aberturas provocadas por ferimentos (QUADT-HALLMANN et al., 1997). Disseminação entre plantas ou locais pode se dar via sementes, insetos vetores e propagação vegetativa (BALDANI et al., 1997). 2 Por muito tempo microrganismos endofíticos foram considerados inócuos às plantas (AZEVEDO, 1998). A partir da década de 70, no entanto, vários estudos demonstraram efeitos benéficos como promoção do crescimento vegetal, controle biológico de pragas e doenças, fixação biológica de nitrogênio (DOWNING et al., 2000; VERMA et al., 2001; DÖBEREINER; BODDEY, 1981), indução de resistência sistêmica (HALLMANN et al., 1997) e produção de antibióticos (STROBEL; DAISY, 2003). No controle biológico, por exemplo, a bactéria endofítica age como antagonista aos agentes patogênicos e aos insetos (AZEVEDO et al., 2000). A ação se dá através de competição de nutrientes, produção de substâncias nocivas, ou indução de resistência sistêmica na planta hospedeira. Em espécies cultivadas, esse controle, quando efetivo, vem de encontro à necessidade de se reduzir o consumo de agroquímicos (ARAÚJO et al., 2002). Apesar de bactérias da família Pseudomonadaceae e do gênero Nostoc serem usadas no controle biológico de patógenos (RAJKUMAR et al., 2005; BERGSMAN-VLAMI et al., 2005; BIONDI, 2004), a espécie bacteriana atualmente mais usada como antagonista é Bacillus subtilis (BACON et al., 2000). Tsuda et al. (2001) verificaram redução da intensidade de murcha causada pelo patógeno Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae utilizando microrganismos isolados (bactérias e fungos) das raízes de espinafre. Em tomateiros conduzidos em casa de vegetação, BARRETTI et al. (2002), utilizando bactérias endofíticas, verificaram aumento significativo no crescimento das plantas e também no controle de doenças (BARRETTI, 2001, citado por ROMEIRO, 2007). Pratells et al. (1993) testaram 122 isolados de bactérias endofíticas isoladas de pepino, berinjela, pimentão, abóbora, abricó, pêssego e ameixa. Vinte delas proporcionaram alto controle (90%) em pêra para doenças pós-colheita causadas por Monilia laxa e Rhizopus stolonifer. Estudos em citros tiveram como objetivo o levantamento da diversidade bacteriana existente e a identificação de endofíticos possivelmente responsáveis pela resistência à clorose variegada (CVC). O crescimento in vitro de Xylella fastidiosa foi estimulado por Methylobacterium extorquens e inibido por Curtobacterium flaccumfaciens, ficando clara a existência de interação entre endofíticos e patógeno (LACAVA et al., 2004). Em plantas de citros com sintomas de CVC as espécies de Methylobacterium foram as mais freqüentemente isoladas. Nas plantas que não apresentavam sintomas (assintomáticas), a espécie mais freqüentemente isolada foi Curtobacterium flaccumfaciens, mas também foram verificadas as presenças de outras espécies tais como, Bacillus pumilus, Enterobacter 3 cloace, Methylobacterium spp., M. fujisawaense, M. mesophilicum, M. radiotelerans e M. zatmani, Nocordia sp., Pantoea agglomerans e Xanthomonas campestris (ARAUJO et al., 2000). Como as bactérias endofíticas e fitopatógenos colonizam os mesmos tecidos da planta, as endofíticas podem estar, de alguma forma, envolvidas em mecanismos de proteção de seus hospedeiros. Araújo et al. (2002) relacionaram e compararam a população bacteriana de citros com CVC com as de plantas escape (plantas aparentemente sadias em pomares altamente afetados pela doença) e sugeriram que Curtobacterium flaccumfaciens está envolvida na resistência à CVC devido a sua alta freqüência em plantas assintomáticas. No entanto, há poucos estudos sobre a interação endofiticos-patógenos em citros. 1.2 Liberibacter e o huanglongbing dos citros A bactéria Candidatus Liberibacter spp. é a responsável pela doença denominada oficialmente de ‘Huanglongbing’, mas mundialmente conhecida como Greening dos citros. Huanglongbing, ou simplesmente HLB, é uma palavra de origem chinesa e que significa ‘doença do ramo amarelo’. Foi dado este nome em homenagem ao Dr. Li que, em 1956 demonstrou pela primeira vez que a causa da doença era um agente que poderia ser transmitido de uma planta para outra por enxertia de segmento de ramo (HSIANG, 1956, citado por BOVÉ, 2006). Trata-se da doença mais destrutiva de uma planta cítrica e muito temida pelos produtores. É conhecida na China há pelo menos 100 anos onde, até serem publicados os trabalhos do Dr. Li, acreditava se tratar de um problema causado principalmente por desordem nutricional (da GRAÇA, 1991). Liberibacter coloniza o floema da planta hospedeira. A inexistência de um meio que permita o cultivo “in vitro” desta bactéria tem dificultado a realização de estudos mais aprofundados sobre o HLB. A natureza bacteriana do agente do HLB foi confirmada somente na década de 70, inicialmente com a observação de que havia remissão dos sintomas em plantas afetadas quando nelas eram injetados antibióticos (BOVÉ 2006). Posteriormente foram as observações de imagens obtidas em microscopia eletrônica (GARNIER et al., 1984) e, mais recentemente, foi o emprego de técnicas moleculares em estudos de DNA que confirmaram tratar-se de bactéria. Estudos genéticos também permitiram aprimoramento da diagnose, que hoje se baseia na PCR (Reação em Cadeia da DNA Polimerase), e a descrição de três espécies de Liberibacter: Candidatus Liberibacter africanus, Ca. L. asiaticus e Ca L. americanus (BOVÉ, 2006). A primeira espécie ocorre na 4 África, Oriente médio, Ilhas Reunião e Maurício, induz sintomas menos severos nas plantas, é sensível a altas temperaturas e transmitida por Trioza eritrea. A segunda ocorre na Ásia, Oriente médio, Ilhas Reunião e Maurício e nas Américas (São Paulo, Cuba e Flórida), induz sintomas mais severos, é tolerante a altas temperaturas e transmitida por Diaphorina citri. A terceira foi encontrada até agora somente no Brasil, é transmitida por D. citri e induz sintomas muito parecidos com os induzidos pela espécie asiática. Sua tolerância a altas temperaturas está sendo investigada. Uma planta cítrica afetada por HLB manifesta sintomas inicialmente nas folhas próximas à extremidade de um ou mais ramos da copa, que se destacam das demais por se tornarem amareladas. A coloração amarela não é, no entanto, uniforme por todo o limbo foliar como o são os sintomas de deficiências minerais, em particular de nitrogênio, ferro e manganês, muito embora em uma planta afetada pelo agente do HLB, folhas apresentando esses sintomas, além dos de deficiência de zinco, podem estar presentes. A coloração amarela das folhas é difusa e assimétrica e recebeu o termo ‘mosqueado’. Difusa porque não existe um limite claro entre as partes verdes e amareladas, e assimétricas porque não existe correspondência nas duas partes da folha, dividida pela nervura central, no tamanho e formato das manchas amareladas, as folhas mosqueadas caem prematuramente (FUNDECITRUS, 2007). Com a constante queda de folhas há redução da área fotossintética e conseqüente redução na quantidade de açúcares, fontes de energia para a planta, por este motivo os ramos afetados secam e morrem. Se esses sintomas se limitassem às extremidades dos ramos das laranjeiras o problema não seria tão grande. Pelo fato de se alojar no floema, a bactéria transloca-se rapidamente através do fluxo da seiva e se aloja nas demais partes da planta, onde exercerá seus danos (GARNIER et al., 1984). A taxa de translocação, embora não devidamente quantificada, é muito rápida se considerarmos a evolução dos sintomas e o período de vida útil de uma planta cítrica, que gira em torno de 20 anos. Plantas jovens de até dois anos são tomadas pelos sintomas em poucos meses enquanto que plantas adultas, em fase de produção de frutos, são tomadas em dois a quatro anos, quando se tornam totalmente improdutivas. Os sintomas do HLB não se limitam às folhas. Frutos de ramos com folhas sintomáticas se apresentam deformados, pequenos, amarelados por inteiro ou com manchas amareladas na parte externa da casca, de maneira similar ao que ocorre nas folhas. Corte longitudinal dos mesmos mostra um desvio da columela central e escurecimento dos feixes 5 vasculares que irrigam o fruto, iniciando na região de inserção do pedúnculo. Frutos afetados caem prematuramente causando perdas imediatas na produção (FUNDECITRUS, 2007). 1.3 Insetos transmissores de Liberibacter O HLB é destrutivo não somente por invadir rapidamente a planta causando perdas na produção e redução da sua vida útil (LOPES et al., 2005a), é destrutivo também por afetar todos os citros explorados comercialmente e por se disseminar rapidamente entre as plantas de um pomar e entre pomares e propriedades. Isto ocorre porque quem transporta e transmite a bactéria de uma planta para outra são pequenos insetos de duas espécies de psilídeos (Diaphorina citri e Trioza erytreae) que ocorrem em grandes populações, principalmente na primavera e verão (BOVÉ, 2006; BOVÉ et al., 1974). No Brasil ocorre somente D. citri. Medindo aproximadamente 3 mm de comprimento, este inseto se alimenta da seiva do floema das folhas e ramos jovens presentes nas extremidades da copa (LOPES et al., 2005a). A taxa de multiplicação é alta na presença de fontes de alimento que se dá na primavera e verão quando, em decorrência das chuvas e do calor, a planta emite muitas brotações novas. Nestes períodos, uma fêmea pode colocar mais de 800 ovos que eclodirão e se tornarão adultos em períodos que variam de 20 a 40 dias. Se a planta fonte de alimento do inseto estiver infectada pela bactéria do HLB, esta será adquirida e transmitida para uma planta sadia durante a sucção da seiva pelo inseto. Embora este processo não esteja totalmente conhecido, sabe-se que uma vez adquirida, a bactéria será transmitida pelo inseto por toda sua vida, de aproximadamente três a quatro meses. 1.4 Distribuição geográfica de Liberibacter e medidas de controle do huanglongbing Até o ano de 2004, o HLB estava presente oficialmente em países asiáticos e africanos causando intensos prejuízos e limitando a produção de frutas cítricas em várias regiões. Nas Américas, a ocorrência da doença é bem mais recente. Em meados de 2004 foi identificada no estado de São Paulo (COLETTA-FILHO et al., 2004) e, em setembro de 2005, no estado norte americano da Flórida (SUTTON, 2005). Em ambos os locais a constatação do HLB causou muita apreensão por várias razões. Já se sabia, pela experiência 6 dos chineses e sul africanos, que os custos de produção aumentam significativamente com presença da doença nos laranjais, pela necessidade de se empregar medidas caras e de difícil aceitação para conter sua disseminação. Essas medidas envolvem o plantio de mudas sadias, eliminação das plantas sintomáticas e aplicação constante de inseticidas para redução da população dos vetores (LOPES; BASSANEZI, 2007). Ademais, se até 2004 a doença ocorria em países de pouca expressão mundial na produção de suco, agora ocorre nos maiores produtores de laranja envolvendo centenas de milhares de empregos diretos e indiretos. Em São Paulo e Flórida, o nível de severidade dos sintomas nas primeiras plantas encontradas indicava que a infecção não era recente e que a doença já devia estar disseminada por várias localidades. Isto foi confirmado mais tarde pelos levantamentos amostrais que se seguiram. No Brasil, onde, pelos esforços do Fundecitrus (Fundo de Defesa da Citricultura), existem mais informações sobre a distribuição geográfica do HLB, sabe-se que a doença atualmente está presente em mais de 200 municípios nos estados de São Paulo, Paraná e Minas Gerais. Para o controle do HLB no Brasil, recomenda-se plantio de mudas sadias, eliminação de plantas com sintomas visando redução do inóculo (visto que a poda não funciona), e aplicações de inseticidas nas áreas de ocorrência da doença, para redução da população do vetor (LOPES et al., 2005a). A eliminação de plantas com sintomas é obrigatória por lei e fiscalizada por membros da Secretaria de Defesa Fitossanitária do Estado de São Paulo, auxiliados por uma equipe de inspetores treinados e mantidos pelo Fundecitrus. Visa-se com essas medidas senão erradicar o HLB, principalmente nos locais de baixas incidências, mantê-lo em baixos índices, evitando-se que se espalhe para regiões ainda aparentemente livres da doença. Paralelo a esses esforços foi e continua sendo montada uma rede nacional e internacional de discussão e de pesquisa para troca de experiências e conhecimento de todas as facetas do problema visando, em última instância, um aprimoramento das medidas de controle. E para que o controle seja aprimorado é necessário conhecer melhor as interações existentes entre planta, patógeno e vetor. 1.5 Fitoplasma como agente possivelmente associado ao huanglongbing Fitoplasma é um procarioto sem parede celular que habita o floema de plantas e é transmitido por pequenos insetos, as cigarrinhas. Este patógeno não é cultivável em meio de cultura (BEDENDO, 1995). As plantas infectadas apresentam sintomas de clorose, 7 enfezamento, superbrotamento, anomalias foliares, florais e de frutos e virescência. Sua ocorrência nas plantas pode ser constatada pela visualização de corpúsculos pleomórficos presentes nos vasos do floema, através de microscopia eletrônica (DAVIS, 1995a). No Brasil, já foram detectados fitoplasmas em culturas de milho, feijão, soja, tomate, berinjela, maracujá, chuchu e mandioca. Também foram encontrados em plantas invasoras e silvestres como o guanxuma (Sida rhombifolla K. Sch.), picão (Bidens pilosa L.), melão de São Caetano (Momordica charantia L.), sempre-viva (Helichrysum bracteatum) e outras mais (KITAJIMA, 1995). Recentemente, na região norte do estado de SP, foram identificadas algumas plantas cítricas apresentando os sintomas típicos de HLB nas quais nenhuma das espécies conhecidas de Liberbacter foi encontrada. Estudos mais aprofundados levaram à constatação de um fitoplasma com seqüência de DNA altamente similar ao fitoplasma do grupo que causa vassoura de bruxa (termo usado para designar superbrotamento) em feijão de porco ou “Pigeon pea” (TEIXEIRA, D.C. comunicação pessoal). Até o momento não se sabe qual a relação desta nova bactéria com o HLB. A única bactéria sem parede e comprovadamente patogênica a plantas de citros é Spiroplasma citri, responsável pela doença “stubborn” (MARKHAM; TOWNSEND, 1974), presente em vários países, mas não no Brasil. O termo espiroplasma foi proposto em razão da morfologia helicoidal, o que justifica sua denominação e os separa dos fitoplasmas (DAVIS; WORLEY, 1973). Os espiroplasmas são encontrados livremente na superfície de flores e no interior dos vasos do floema, onde atuam como patógenos (MCCOY et al., 1989). Interessante notar que este microrganismo, de natureza fastidiosa, é cultivável em meio rico. Seu primeiro isolamento foi relatado por Fudl-Allah et al. (1971 e 1972). Após o seu isolamento vários estudos puderam ser conduzidos. Foi constatado que seu genoma é significantemente menor que o das bactérias verdadeiras (que possuem parede celular), o mesmo acontece para a proporção de G+C encontrada no genoma. Outra característica que os diferencia é a necessidade de colesterol exógeno para seu desenvolvimento (SAGLIO; WHITCOMB, 1979, citado por BEDENDO, 1997). 1.6 Técnicas moleculares usadas em diagnose e estudos de endofíticos Com o surgimento da biotecnologia, diversas ferramentas moleculares foram desenvolvidas, como exemplo a PCR (Reação em Cadeia da DNA Polimerase), 8 rotineiramente usada na diagnose de doenças de plantas, principalmente daquelas causadas por bactérias não cultiváveis como é o caso de Liberibacter (TEIXEIRA et al., 2005a,b) e fitoplasma (DAVIS, 1995b). O número de trabalhos que utilizam microrganismos endofíticos tem aumentado e o uso de técnicas moleculares tem possibilitado um maior entendimento de sua diversidade. São apresentadas a seguir algumas delas. Eletroforese em Gel com Gradiente Denaturante (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis ou DGGE). Araújo (2000), através de análise por DGGE combinada com “nested” PCR para Beta-proteobactéria, identificou uma banda específica para bactérias encontradas em plantas assintomáticas em pomares altamente afetados por X. fastidiosa, e maior diversidade das bactérias endofiticas em plantas infectadas por X. fastidiosa e manifestando os sintomas da clorose variegada dos citros. Duplo PCR e Análise do Polimorfismo dos Fragmentos de Restrição (Restriction Fragment Length Polymorphism ou RFLP). Bedendo et al. (1999), através de PCR duplo para a amplificação da região 16S rDNA de amostras de plantas de vinca (Catharantus roseus) e de pimenta (Capsicum frutescens) com sintomas típicos causados por fitoplasmas, usaram a PCR com a finalidade de diagnóstico. O seu produto também foi submetido à tratamento com enzimas de restrição. A técnica de duplo PCR se mostrou eficiente para a detecção do patógeno e o RFLP indicou variabilidade entre os fitoplasmas presentes nas plantas analisadas. Somente um fitoplasma foi encontrado em pimenta e este não se encontra relacionado a nenhum dos grupos descritos até o momento. Reação em Cadeia da DNA Polimerase de Palíndromos Extragênicos Repetitivos (Repetitive Extragenic Palindromic Sequences ou Rep-PCR). Rep-PCR se baseia na existência de seqüências repetitivas de DNA dispersas no genoma bacteriano. Stern et al. (1984) denominaram de palíndromos extragênicos repetitivos (REP). Quando amplificadas através de PCR, estas seqüências geram produtos de tamanhos variados que são peculiares para cada indivíduo. Esta “impressão digital” de DNA, conhecida tecnicamente como “fingerprinting”, é visualizada através de eletroforese em gel de agarose (LOPES et al., 2001). Esta técnica foi desenvolvida por Versalovic et al. (1991). Hunton et al. (1991) e Martin et al. (1992) detectaram outras seqüências e denominaram-nas, respectivamente, de ERIC (consensos intergênicos de bactérias entéricas) e de elementos BOX. Lopes et al. (2001) utilizaram os primers BOX e ERIC para analisar o DNA de Xanthomonas albilineans, agente causal da doença denominada escaldadura das folhas de 9 cana-de-açúcar, e bactérias endofíticas desta planta. X. albilineans foi separada em grupos, os quais se correlacionaram com a origem dos isolados. Trindade e Ferreira (2001) verificaram uniformidade entre os padrões de Rep-PCR obtidos para cinco isolados de Xantomonas campestris pv. viticola coletados em duas épocas (1998 e 2000) e três áreas distintas na região de Petrolina – PE, provenientes de videira ‘Red Globe’ e ‘Itália’, e sua diferenciação em relação ao isolado UnB-764, de X. campestris pv. mangiferaeindicae. Em outro trabalho Trindade e Ferreira (2003) caracterizaram 41 isolados de X. ampestris pv.viticola através da PCR com primers para as seqüências REP, ERIC e BOX. Os resultados permitiram agrupar os isolados em cinco subgrupos a 56% de similaridade. Rep-PCR mostrou-se reproduzível e eficiente para caracterizar a variabilidade em X. campestris pv. viticola, podendo também ser útil como técnica adicional para identificação da bactéria. 10 2 Objetivo Com esta pesquisa objetivou-se: 1. Desenvolver um meio de cultura para o cultivo in vitro de Candidatus Liberibacter americanus e Candidatus Liberibacter asiaticus. 2. Comparar qualitativamente, através de técnicas moleculares, as populações de bactérias endofíticas eventualmente isoladas de plantas cítricas doentes e sadias, quando submetidas a diferentes regimes de temperatura. 3. Analisar se haveria alguma relação entre as bactérias endofíticas eventualmente isoladas e a presença de Liberibacter. 11 3 Material e Métodos 3.1 Material vegetal Plantas de citros (Citrus sinences) oriundas do campo com aproximadamente 5 anos de idade, da variedade Valência enxertadas em limão Cravo e afetadas por HLB, foram selecionadas para as coletas e folhas visando isolamento do patógeno. Foi coletado também material de plantas sadias para o controle. Estas plantas estavam sendo cultivadas em um pomar da Fazenda Santo Antônio do Baixão (quadra A 8), localizada no município de São Carlos – SP. Plantas experimentais com 1 ano de idade, da mesma variedade das plantas do campo, foram cultivadas em vasos, inoculadas através de enxertia de borbulhas (segmentos de ramos) oriundas de citros infectados com Ca. L. americanus e Ca. L. asiaticus, e mantidas em duas câmaras climatizadas (Conviron, Canadá) com diferentes regimes de temperatura, instaladas nas dependências do Fundecitrus em Araraquara - SP. O procedimento de inoculação consistiu na introdução de dois segmentos de ramo infectado, com 4 cm de comprimento, no caule das plantas sadias. Foi feito um corte de cada lado ao longo do caule, a aproximadamente 5 cm acima da linha de enxertia no portaenxerto. O tecido cortado foi levantado cuidadosamente e a fonte de inóculo (segmento de ramo) introduzido e fixado com fita plástica usualmente empregada na formação de mudas cítricas, para que houvesse a adesão do tecido doente ao caule e também para que impedisse a entrada de água e patógenos oportunistas no local da inserção (Figura 1). Figura 1. Inoculação através de enxertia de borbulha. Caule enxertado com ramo oriundo de planta doente. (Foto: arquivo pessoal) 12 Quanto às câmaras climáticas, a câmara 1 foi programada a temperaturas diárias de 22ºC durante seis horas e 24ºC durante dezoito horas, e a câmara 2 a temperaturas diárias de 27ºC durante seis horas e 32ºC durante dezoito horas. As duas câmaras também foram programadas com um mesmo regime de luz diária que consistia de 12 horas de luz contínua e 10 horas de escuro contínuo. Foto de uma das câmaras é mostrada na Figura 2. Para os isolamentos foram empregados macerados de nervura central de folhas sintomáticas (mosqueadas) de plantas afetadas por HLB e de folhas de plantas sadias, vindas do campo e das câmaras climáticas (Figura 2; Tabela 1). Foram também feitas tentativas de isolamento de Liberibacter de columela central de frutos sintomáticos de plantas afetadas pelo patógeno. A presença ou ausência de Liberibacter nas amostras foi confirmada por PCR com o uso de primers específicos (ver adiante). Figura 2. A e B Sintomas foliares típicos de plantas com HLB. (Foto: Silvio A. Lopes) Tabela 1. Identificação das plantas de citros mantidas nas câmaras climatizadas. Câmara 1 (Temperatura 22-24°C) (1) Câmara 2 (Temperatura 27-32°C) Am(1) As(2) Controle(3) Am As Controle 234 235 236 240 242 243 244 - 202 203 204 206 207 209 211 - Plantas infectadas por Ca. L. americanus. (2) Plantas infectadas por Ca. L. asiaticus e sadias. (3) Controle – plantas 13 Figura 3. Foto de uma das câmaras climáticas que continham as plantas de citros. Estas câmaras encontram-se instaladas no Fundecitrus de Araraquara – SP. (Foto: Silvio A. Lopes) Cada câmara continha em seu interior 3 plantas infectadas por Ca. L. americanus, 3 plantas infectadas por Ca. L. asiaticus e 1 planta sadia usada como controle. Antes de serem podadas e transferidas para as câmaras, as plantas infectadas expressavam sintomas foliares característicos de HLB (Figura 2). Os vasos foram colocados nas câmaras no dia 10 de janeiro e retirados no dia 08 de abril. Para estas plantas foram realizados 3 isolamentos, o primeiro no dia 09 de março, o segundo no dia 10 de maio e o terceiro no dia 12 de julho de 2007. Quanto às plantas de campo do pomar citado, foram utilizadas as mesmas quantidades que no experimento das câmaras, ou seja, 3 plantas infectadas por Ca. L. americanus, 3 infectadas por Ca. L. asiaticus e 1 planta sadia usada como controle. Os isolamentos foram realizados continuamente no período de 2006 a 2007 na medida em que novas formulações de meios de cultivo foram elaboradas. 3.2 Processamento das amostras e inoculação nos meios de cultivo Todas as amostras (folhas coletadas) foram lavadas com escova macia, água, detergente de cozinha e enxaguadas em água corrente. A nervura central de cada folha foi retirada com bisturi, enxugada com papel absorvente e pesada. O pecíolo sempre foi 14 mantido na amostra, pois este órgão é em geral processado para extração de DNA para uso em PCR (LOPES; FRARE, 2008). Para a assepsia das amostras dentro da câmara de fluxo laminar foi preparada (i) uma solução de álcool a 70% diluindo-se em água álcool etílico comercial 96º GL, e (ii) uma solução de hipoclorito de sódio a 1% diluindo-se em água o produto comercial contendo 2% de cloro ativo. As soluções foram colocadas em tubos tipo Falcon de 50mL organizados em estantes para facilitar o processo de assepsia (Figura 4). Pinça, bisturi e pistilo foram flambados durante e após o processamento de cada amostra. Figura 4. Foto da câmara de fluxo laminar organizada para o início do trabalho de maceração e plaqueamento de material vegetal coletado. (Foto: arquivo pessoal) Quatro procedimentos de processamento das amostras foram empregados, alterandose a quantidade de tecido e o tampão usado nos isolamentos (Tabela 2). A assepsia dentro do fluxo laminar foi a mesma para todas as amostras foliares. Primeiro procedimento: foram coletadas folhas sintomáticas das plantas com Ca. L. americanus, Ca. L. asiaticus e folhas de plantas controle de plantas de campo e/ou das câmaras. Foram usadas três folhas de cada planta totalizando 0,5g de tecido para cada amostra, em triplicata. No fluxo laminar, as amostras foram mantidas por 1 minuto em álcool, 3 minutos em hipoclorito, 1 minuto em álcool, seguidas de três enxágües de 3 minutos cada em água destilada estéril. As nervuras foram seccionadas com bisturi em recipiente estéril e maceradas com pistilo em 1,5 mL de tampão fosfato salino (Phosphate Buffer Saline - PBS 3 – Tabela 2). O caldo do macerado foi transferido para um microtubo e diluído 10, 100 e 1000 vezes. 15 Tabela 2. Variação da composição do tampão fosfato salino Componentes PBS PBS 1 PBS 2 PBS 3 PBS 4 NaCl 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00 KH2PO4 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 NaH2PO4 2,17 2,17 2,17 2,17 2,17 KCl 0,20 0,20 0,20 0,20 0,20 D-manitol 91,80 Glicina 22,50 Polivinilpirrolidona 1,00 Glicose 8,00 Sacarose 100,00 80,00 pH 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 PBS - Phosphate Buffer Saline. Momento em que as modificações para o tampão foram empregadas: PBS 1 para Chang 1; PBS para Chang 2; PBS 2 para Chang 3; PBS 3 para NA e BHI e modificações, M8 e modificações e PCYE modificado; PBS 4 para TO e modificações e TSA. PBS 1 foi elaborado com base no artigo de Lee; Davis (1983). O primeiro procedimento foi usado para os meios denominados Chang, original e com modificações, NA (Agar Nutritivo), BHI (Brain Heart Infusion) original e com modificações, TO e H+H. Com exceção do meio H+H, descrito por Grosser e Gmitter (1990), a composição dos demais meios encontra-se na Tabela 3. O meio de cultura H+H foi usado no cultivo de calos de citros, neste trabalho além do cultivo de calos, ele também foi empregado na tentativa de isolamento do patógeno (ver item 3.3). 16 17 18 Segundo procedimento: foram usadas três folhas de cada planta totalizando 0,7g de tecido para cada amostra. A assepsia ocorreu como o descrito anteriormente. As nervuras foram maceradas em tampão PBS 3 e diluídas 10 e 100 vezes. Este procedimento foi usado para o meio M8 e variações, PCYE (LOPES; TORRES, 2006) modificado, frutos verdes de coco-da-baía (Cocos nucifera L.) e néctar de flor de laranjeira. Terceiro procedimento: foram coletadas quatro folhas de cada planta das câmaras 1 e 2. No fluxo laminar a assepsia ocorreu como o descrito anteriormente. As nervuras foram seccionadas com bisturi em recipiente estéril, sendo 1/3 do total picado inoculado em 20 mL dos meios líquidos TO2 e TS, e 2/3 macerado com pistilo em 1 mL de tampão fosfato salino PBS 4 (Tabela 2) foram inoculados nos meios sólidos. Este procedimento foi usado para os meios TO2 (sólido e líquido), TO2 com soro (líquido), TSA e TS (ver Tabela 3). Quarto procedimento: foram usados frutos jovens e sintomáticos com no máximo 3 centímetros de diâmetro oriundos de plantas experimentais mantidas em casa de vegetação no Fundecitrus, sendo 10 frutos de plantas afetadas por, Ca. L. asiaticus e 3 de plantas afetadas por Ca. L. americanus. Os frutos foram lavados com detergente e água corrente. Dentro da câmara de fluxo laminar eles foram submetidos à assepsia consistindo de 1 minuto em álcool, 3 minutos em hipoclorito, novamente 1 minuto em álcool e em seguida mergulhados em álcool comercial 100% e flambados superficialmente. Em superfície estéril foram cortados com bisturi até a total separação da columela central, a qual foi picada em fatias transversais e inoculada em 10 mL de meio líquido TO2 e TO2 com soro (2/3 do total) e o restante colocado sobre a superfície do meio sólido TSA (Tabela 3). A diferença da quantidade de frutos infectados ocorreu por causa da disponibilidade dos mesmos no período do isolamento. Diluição das amostras e plaqueamento Em todas as tentativas de cultivo as amostras foram diluídas com o mesmo tampão usado para a maceração do tecido. Para as diluições, o caldo do macerado foi dispensado em um primeiro tubo e uma alíquota de 100µL transferida para outro tubo com 900µL do tampão, seguindo-se sucessivamente desta forma até a obtenção da diluição desejada. Foram plaqueados volumes variáveis (25 ou 50µL) do original e das diluições 100, 1.000 e 10.000 vezes, tanto em meios líquidos como em meios sólidos. Para o plaqueamento em meio sólido dois métodos foram usados. No primeiro dispensou-se 50µL, sendo este volume 19 espalhado com alça de Drigalsk até sua completa absorção no meio. No segundo, dispensouse, em triplicata, um volume de 25µL o qual foi escorrido pela superfície dos meios através de leve inclinação da placa de Petri. Após este procedimento as placas foram deixadas em repouso até completa absorção do inóculo. A água usada na assepsia e o tampão usado no maceramento foram plaqueados de igual maneira em todas as tentativas de isolamentos para a detecção de organismos epifíticos contaminantes. Todas as placas de Petri foram vedadas com Parafilm® (Sigma-Aldrich) e incubadas em estufa biológica a 26ºC (B.O.D – Solab, Piracicaba-SP), sendo observadas constantemente visando detecção de colônias de bactérias em meios sólidos ou turvamento de meios líquidos. Ao chegarem neste estágio passaram por procedimento de clonagem das colônias isoladas, que será descrito mais adiante. Para testes de incubação em anaerobiose, foram usadas duas jarras de anaerobiose em acrílico. O oxigênio foi retirado das jarras através de uma vela acesa em seu interior que, ao fechar à tampa, a chama o consumia até seu esgotamento, indicado pela extinção da chama. As jarras foram colocadas na estufa juntamente com as outras placas (Figura 5). O procedimento de anaerobiose foi usado para os meios TO e H+H com e sem calos de citros, alem do TO2 e TSA. Figura 5. Detalhe da estufa de incubação. Placas de Petri dentro de sacos plásticos. Detalhe da jarra de anaerobiose. (Foto: arquivo pessoal) 20 3.3 Meios de cultura Procedimentos gerais. Todos os componentes usados nos meios de cultivo testados estão descritos na Tabela 3. Como procedimentos gerais, todos os meios foram autoclavados durante 20 minutos a 120°C a 1 atmosfera. Os componentes termolábeis foram filtrados em membranas de acetato de celulose com poros de 0,22µm (Corning®) submetidos a pressão negativa através do uso de bomba de vácuo (Tabela 3). Quando se tratava de meio sólido, o componente filtrado era adicionado à parte autoclavada somente depois deste haver sido estabilizado em banho-maria à temperatura de 50°C. Os meios sólidos foram vertidos em câmara de fluxo laminar em placas de Petri de 90mm de diâmetro e 14mm de altura. Procedimentos específicos. Como procedimentos específicos citam-se os casos do BHICuscuta, TO e H+H, com e sem calos de citros. BHI-Cuscuta - Cinqüenta gramas de cipós de cuscuta (Cuscuta sp.) frescos foram removidos de plantas de pingo-de-ouro (Duranta repens), mantidas em casa de vegetação, e triturados em liquidificador em 100mL de tampão PBS. O caldo foi filtrado em papel e depois esterilizado em membrana 0,22µm. Em câmara de fluxo laminar, 100µL do caldo filtrado foi espalhado na superfície dos meios BHI com alça de Drigalsk até completa absorção. TO e H+H com e sem calos de citros - O meio TO foi desenhado com base na composição da seiva do floema de citros (OGATA, comunicação pessoal) (Tabela 3). O meio H+H é empregado na cultura de tecidos vegetais inclusive citros (GROSSER; GMITTER, 1990). Calos de tangor Murcott, cultivados em meio H+H, foram gentilmente cedidos pelo professor Francisco A. Mourão Filho, da ESALQ Piracicaba. Os calos foram incluídos nos meios TO (líquido e sólido) e H+H (sólido). Duas modalidades foram empregadas: calos inteiros e calos macerados. Porções de aproximadamente 250mg dos calos, coletadas com a extremidade de uma espátula estéril pequena, foram espalhados no fundo das placas de Petri antes dos meios serem vertidos. No caso do TO líquido os calos foram simplesmente adicionados ao meio. Ambos os meios foram usados (em triplicata para cada amostra inoculada), com e sem calos, da seguinte forma: (i) meio TO sólido com calos inteiros e sem calos; (ii) meio H+H sólido com calos inteiros e sem calos; (iii) meio TO líquido, com calos inteiros, com calos macerados e sem calos. 21 Além dos meios descritos, foram também considerados como meios de cultura o Néctar de flor de laranjeira e a Água de coco-da-baía. No caso do néctar, foi coletado 4,2mL de néctar de flores de plantas de citros, no campo, durante época de florada, no mês de setembro de 2006 e mantido a 8°C. Na unidade de Biotecnologia da UNERP o pH 5,0 foi aferido por meio de fita pH-Fix 0-14 (Macherey Nagel – MN), porque por haver um volume muito pequeno não foi possível usar o pHmetro. Em seguida o líquido foi filtrado em membrana de acetato de celulose com poro 0,2µm e armazenado a –20°C. Foram adicionados 500µL do néctar mais 1,5mL do caldo do macerado de folhas de citros sintomáticas (sem diluição) e na diluição 10-2, sem repetições. No caso da água de coco, inoculou-se com 50µL da das diluições 10-1 e 10-2, em 5 repetições para cada amostra em 2mL de água de coco estéril. Foram também testados frutos verdes de coco-da-baía. Neste caso, 3 frutos foram lavados e banhados em álcool 70%. As extremidades foram cortadas cuidadosamente para não perfurar a bolsa de água. Com uma seringa e agulha (0,7x25mm), injetou-se no fruto 1mL do caldo do macerado de folhas de citros sintomáticas, sem diluição. Usou-se um fruto para cada amostra. O orifício foi vedado com parafina derretida. Os frutos foram então mantidos a temperatura ambiente. 3.5 Purificação, clonagem e armazenamento das colônias isoladas Após o crescimento, cada colônia foi separada de acordo com sua morfologia. Uma colônia isolada de cada tipo foi estriada com alça de platina em meio de cultura através do método de estriagem por esgotamento. O meio de cultivo usado para os repiques foi o TSA com sacarose (Tabela 3). Este procedimento se repetiu por três vezes para a obtenção de colônias triplamente clonadas onde, durante os repiques, todas as colônias em fase de purificação têm que apresentar a mesma morfologia (Figura 6). Figura 6. Detalhe de cultura com colônias isoladas após processo de purificação. (Foto: arquivo pessoal) 22 Para as bactérias que cresceram em meio líquido, após a turvação, a separação das mesmas também foi feita através de esgotamento em meio sólido, onde os indivíduos de cada tipo passaram pela metodologia citada. Durante as clonagens as placas foram incubadas durante 4 a 5 dias a 28ºC. Após a purificação, as culturas foram armazenadas de 3 diferentes maneiras: (i) em placas de Petri com meio TSA em câmara fria a 8ºC, (ii) em microtubos contendo 1mL de água estéril Milli-Q e mantidas a 8ºC, e (iii) em microtubos contendo 500µL de glicerol 20% e 100µL de meio de cultura TSB (peptona de caseína 17g/L; peptona de soja 3g/L; NaCl 5g/L; K2HPO4 2,5g/L) e mantidos a -85ºC. 3.6 Teste de Gram Para a separação das bactérias em grupos Gram-positivas e Gram-negativas empregou-se o teste do hidróxido de potássio (KOH) a 3%. Esta solução é usada para romper a parede de bactérias Gram-negativas. Quando isto ocorre, o material genético extravasa e é observado como fios viscosos. O teste seguiu o seguinte protocolo. Sobre uma lâmina de microscopia foram depositados 20µL da solução de KOH. Foi coletada com a alça de platina uma colônia individualizada da bactéria a ser testada e misturada com a solução em pequenos movimentos circulares durante 20 segundos. A alça foi erguida a distância de 1 a 2cm da superfície da lâmina para observação da presença ou não do visgo. 3.7 Extração de DNA genômico Para a extração do DNA genômico empregou-se o protocolo de Woo et al. (1992) com modificações. Colônias individualizadas de cada isolado foram inoculadas em microtubos contendo 1 mL de meio líquido TS e incubadas durante 14 horas a 28ºC. As células bacterianas foram concentradas por meio de centrifugação a 17.900g durante 1 minuto à temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado dissolvido cuidadosamente em 1mL de tampão TNE (Tris-HCl pH 8.0 10mM, NaCl 10mM, Na2EDTA pH 8 10mM). A solução bacteriana foi novamente concentrada através de centrifugação a 17.900g, durante 1 min à temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o precipitado dissolvido vagarosamente em 135 µL do tampão TNE. Em seguida foram adicionados 135µL de TNE com 2% de Triton X-100, 30 µL de lisozima (5mg/mL) e 3µL de RNAse (10mg/mL). A solução foi homogeneizada gentilmente e incubada em banho- 23 maria a 37ºC durante 30 minutos. Após esta primeira incubação foi acrescentado 15µL de proteinase K (20mg/mL), misturados por inversão, e incubados novamente em banho-maria a 65ºC durante 2 horas. Depois de esfriar a temperatura ambiente, foram adicionados 600µL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico na proporção de 25:24:1 partes, misturados por inversão e centrifugados a 15.300g durante 5 minutos. A parte aquosa (superior) foi cuidadosamente recuperada (aproximadamente 200µL) e colocada em um novo microtubo onde foram adicionados 600 µL de isopropanol gelado e incubados a -20ºC durante 30 minutos. Em seguida foram centrifugados a 15.300g durante 5 minutos e o sobrenadante descartado. Os tubos foram então cuidadosamente vertidos sobre papel absorvente. O precipitado foi lavado por 2 vezes em 1mL de etanol 70% gelado e centrifugado a 15.300g durante 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado e os microtubos inclinados cuidadosamente em papel absorvente em temperatura ambiente até estarem completamente secos (aproximadamente 45 minutos). O DNA foi ressuspendido em 100µL de tampão TE (Tris-HCl pH 8 10mM, Na2EDTA 1mM, pH 8) e armazenado a -20°C. A extração de DNA de bactérias Gram-positivas, quando comparadas com Gramnegativas, apresenta maior dificuldade devido à estrutura da parede celular destes microrganismos. Para o rompimento da parede celular das Gram-positivas foi necessário a adoção de alguns procedimentos antes de se iniciar o protocolo de extração descrito anteriormente. De acordo com Lema et al. (1994), 1 colônia ou 10µL da suspensão bacteriana foram ressuspendidos em 100µL de tampão TE, centrifugados por 5 minutos a 15.300g e o precipitado ressuspendido em 200µL de acetona. O ressuspendido foi incubado em gelo por 5 minutos e à temperatura ambiente por mais 5 minutos e, em seguida, centrifugado por 5 minutos. Após a secagem o precipitado foi ressuspendido em 100µL do tampão TE contendo 2mg/mL de lisozima e incubado durante 1 hora a 37ºC. 3.8 Quantificação do DNA A quantificação do DNA foi feita visualmente (FERREIRA; GRATAPAGLIA 1998) em gel de agarose a 0,8% em tampão Tris-borato (TEB) 1X (Tris 121,1g; ácido bórico 51,3g; EDTA 3,72g; água destilada q.s.p. 1L, para solução estoque 10X concentrada). Foram aplicados 5µL cada de amostra com 5µL de tampão TEB de corrida (azul de bromofenol 0,12%, ficol (400X) 15% diluído em 10mL de TEB 5X). Para a quantificação visual foram aplicados 10µL de cada padrão, preparados a partir de DNA de bacteriófago 24 Lâmbda [BioLabs (500µL/mL)], diluídos a 50, 150, 300 e 600 ng/µL. Todos os géis de quantificação foram colocados em cuba de eletroforese horizontal, com tampão TEB 1X e submetidos a uma corrente de 80V durante 2 horas. A quantificação foi realizada comparando-se a intensidade da banda das amostras com a intensidade das bandas dos padrões (Figura 7). 3.9 Protocolo de PCR para detecção de Liberibacter O DNA de todas as amostras foi analisado através de PCR com primers específicos para detecção Ca. L. americanus e Ca. L. asiaticus. Estes primers são utilizados no Fundecitrus para o diagnóstico de HLB em pomares comerciais, em reação duplex, ou seja, os dois pares são utilizados na mesma reação. Para eliminar a hipótese de competição entre os pares de primers, os pares foram usados em reações separadas. As seqüências dos primers para a detecção de Ca. L. asiaticus RPLA2 forward (5’ – TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT – 3’) e RPLJ5 reverse (5’ – ACAAAAGCAGAAA TAGCACGAACAA – 3’) amplificam um fragmento de tamanho aproximado de 700 pares de base. Para Ca. L. americanus GB1 forward (5’- AAGTCGAGCGAGTACGCAAGTACT – 3’) e GB3c reverse (5’- CCAACTTAATGATGG CAAATATAG – 3’) amplificam um fragmento de tamanho de 1027 pares de bases (TEIXEIRA et al., 2005a). Os DNAs foram diluídos a 20ng/µL onde 1µL de cada isolado foi adicionado, respectivamente, em 39µL da solução de reação de PCR. A solução para a reação de cada amostra continha 4,0µL buffer 10X (Invitrogen); 1,6µL dNTP 5 mM (Invitrogen); 1,6µL MgCl2 50 mM; 0,2µL primer 10 µM (forward); 0,2µL primer 10 µM (reverse); 27,1µL H2O Milli-Q autoclavada, e 0,3µL de Taq DNA polimerase 5U/µL (Invitrogen). Em todas as reações, foram adicionados um controle negativo onde o DNA foi substituído por H2O Milli-Q e controles positivos para Ca. L. americanus e Ca. L. asiaticus. As amostras foram colocadas em termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc.) com desnaturação inicial de 30 segundos a 94ºC, hibridação dos iniciadores a 62ºC durante 30 segundos, extensão a 72ºC durante 1 minuto, seguido de 35 ciclos. Para todos os isolados foram aplicados 20µL da reação em gel de agarose a 1% com tampão TEB 1X. O tempo de eletroforese para todos os testes foi de 1:30 horas a 100V (Figura 8). 25 3.10 Protocolo de reação de Rep-PCR Nas reações de Rep-PCR foram empregados os primers ERIC 1 (5’- ATGTAA GCTCCTGGGGATTCAC –3’) e ERIC 2 (5’- AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG –3’) (VERSALOVIC et al., 1991). A solução de reação para cada amostra continha 2,5µL buffer 10X (Invitrogen); 1,0µL dNTP 5 mM (Invitrogen); 1,0µL MgCl2 50 mM; 4,2µL ERIC 1 (primer 10 ng/µL); 4,2µL ERIC 2 (primer 10 ng/µL); 9,85µL H2O Milli-Q autoclavada, e 0,25µL de Taq DNA polimerase 5U/µL (Invitrogen) e 2µL de DNA (20ng/µL) de cada isolado, respectivamente. Em todas as reações foi acrescentado DNA de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27873) em duplicata, para controle de reprodutibilidade dos resultados, e adicionado um controle negativo onde o DNA foi substituído por H2O Milli-Q. As amostras foram colocadas em termociclador com desnaturação inicial de 3 minutos a 90ºC, desnaturação de 1 minuto a 94ºC, hibridação dos iniciadores a 50ºC durante 1 minuto, extensão a 65ºC durante 4 minutos, seguido de 30 ciclos e um período de extensão final de 10 minutos a 65ºC. Para todos os isolados foram aplicados 20µL da reação em gel de agarose a 1,6% em tampão Tris-acetato (TAE) 1X. O tempo de eletroforese foi de 4 horas a 50V (Figura 9). O tampão Tris-acetato (TAE) é composto de Tris 242,0g; ácido acético glacial 57,1mL; EDTA 18,6g; água destilada q.s.p. 1L, para solução estoque 50X concentrada. 3.11 Construção do Dendograma Na análise do gel da Rep-PCR, foram escolhidas 24 bandas significativas e que se repetiram nas duas reações. Uma matriz binária foi construída através da análise da presença ou ausência destas bandas. A partir da matriz binária foi gerada uma matriz de dissimilaridade entre as bactérias com o programa NTSYS-Pc (ROHLF, 1990). Os níveis de dissimilaridade entre as bactérias foram explicitadas no dendograma obtido pelo mesmo programa (ROHLF, 1990; FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1996). Para a obtenção desses níveis foi calculado o complemento aritmético do Índice de Jaccard com a seguinte fórmula: Complemento aritmético do Índice de Jaccard = 1- [(a/(b+c+d)], onde “a” representa o número de concordâncias positiva do tipo 1-1, “b” o número de discordância 1-0 e, “c” o número de discordância do tipo 0-1 (BERTONI, 2003). A confiabilidade dos nós da árvore do dendograma “bootstrap” foi feita em mil repetições através do programa Free Tree (HAMPL et al., 2001). 26 4 Resultados e Discussão Este trabalho de pesquisa teve como objetivo principal o cultivo de Liberibacter de plantas afetadas por HLB. Não existe em literatura nenhuma informação a respeito das tentativas de isolamento feitas em outros países. Por causa disto foram tomadas decisões sem embasamento bibliográfico com relação à composição dos meios que seriam testados. Decidiu-se por iniciar o trabalho com um meio com composição química baseada (embora muito modificado) no meio de cultura de Chang (CHANG, 1984), desenvolvido para Spiroplasma floricula. Excluiu-se, neste trabalho, o emprego do meio usado para S. citri porque este já havia sido extensivamente testado sem sucesso em Bordeaux, França, pelo grupo liderado pela pesquisadora do INRA Monique Garnier (J. M. Bové, comunicação pessoal). As diferentes modificações no meio de Chang (Tabela 3) foram feitas com base na disponibilidade de substâncias nos laboratórios do Fundecitrus e UNAERP. As três versões do meio de Chang consistiram no acréscimo ou exclusão de componentes de um segundo meio (o BHI) além da adição de extrato de levedura, sal, fosfato de potássio, sulfato ferroso e glicose e mudanças no pH. Talvez por terem sido empregadas diluições muito altas (de 100, 1.000 e 10.000 vezes) do macerado original de folhas sintomáticas, um pequeno número de bactérias cresceu nestes meios, ou seja, em aproximadamente 10% das placas inoculadas. As poucas colônias que cresceram foram avaliadas por PCR com primers específicos para Liberibacter. Assim como aconteceu com os demais meios de cultura testados, em nenhum caso houve amplificação de DNA de tamanho esperado para Ca. L. americanus ou Ca. L. asiaticus. Dado o insucesso com estes meios, novas tentativas foram feitas, agora empregandose meios tradicionais usados em microbiologia agrícola e médica (NA, BHI, PCYE e TSA), além de alguns meios desenvolvidos, também empiricamente, com base na composição estabelecida por Hayashi; Chino (1986) e Fukumorita; Chino (1982) no que tange à química da seiva do floema de arroz e trigo (M8) e seiva do floema de espécie vegetal muito próxima de citros (TO de “Trifoliata Orange”) que, na verdade, se trata de Poncyrus trifoliata, usada no Brasil e em outros países como porta-enxerto. A denominação M8 foi feita por ser o oitavo protocolo de cultivo testado. A composição química de P. trifoliata foi determinada por Ogata e seus colaboradores no Japão (dados não publicados, comunicação pessoal). Somente a partir do conhecimento da composição da seiva do floema de P. trifoliata é que se padronizaram as quantidades de 27 aminoácidos e açúcares e formulados os meios TO e TO2. O meio TO foi preparado de acordo com os componentes e quantidades detectados nas pesquisas de Ogata, inclusive a quantidade de ácidos (ver Tabela 3). Como conseqüência o pH ficou muito baixo sendo necessária a adição de grande quantidade de hidróxido de potássio para que este atingisse pH 5. Nenhum microrganismo cresceu neste meio, nem mesmo contaminantes. Na modalidade TO2 foi mantida uma pequena quantidade de ácido cítrico, facilitando o ajuste do pH para 7, permitindo cultivo de diversas bactérias. O meio NA, por sua vez, é rotineiramente empregado no cultivo de bactérias fitopatogênicas de diversos hospedeiros, e o meio BHI é empregado no cultivo de patógenos humanos nutricionalmente exigentes. O meio PCYE foi desenvolvido para o isolamento de X. fastidiosa, uma bactéria de crescimento lento habitante do xilema de citros. O TSA é empregado para o isolamento de bactérias em geral – do meio ambiente, plantas e patógenos humanos. Estes meios diferem radicalmente entre si em doses, na presença ou ausência de alguns elementos químicos, nas fontes de carbono e sais minerais. Três modificações foram feitas no meio BHI. Testou-se a fórmula original (BHI), que é composta exclusivamente de infuso de cérebro e coração, disponível comercialmente mas totalmente indefinido quanto a sua composição química. Quando ao BHI original foi acrescentado macerado da planta parasítica cuscuta, a qual é conhecida por permitir intensa multiplicação de liberibacter em seus tecidos (GHOSH, et al., 1977), este foi denominado de BHI 2. Já o BHI 3 incluiu parte da composição da seiva do floema de mamona (Ricinus communis L.), feita de acordo com a descrição sem muitos detalhes feitas por Taiz & Zeiger (2004). Embora se trate de planta de parentesco distante de Citrus, o estudo feito com a mamona trouxe algumas informações que poderiam ser úteis no preparo de um meio apropriado para cultivo de Liberibacter. A seiva da mamona contém grande quantidade de sacarose e, entre os aminoácidos, a glutamina e asparagina. Todos estes componentes foram acrescentados ao BHI3. Três versões do meio M8 também foram testadas. As diferenças entre elas estavam na adição ou não de suco de laranja e água de coco. Com exceção do meio NA e BHI, em suas três versões, onde algumas colônias foram isoladas, no meio M8, também em suas três versões, nenhuma bactéria cresceu. O mesmo ocorreu para os frutos de coco-da-baía. Até então o principal objetivo da pesquisa era cultivar somente as bactérias responsáveis pelo HLB. Por causa disto, logo após análise do PCR para liberibacter, todos os isolados de bactérias tidas como contaminantes e/ou endofíticas eram descartados. A partir daquele momento passou-se a empregar o PCYE, TO2 e TSA, meios mais ricos que 28 os anteriores em fontes de carbono e aminoácidos, pois além do cultivo de Liberibacter, passou-se a ter como foco o cultivo de bactérias endofíticas que, de alguma forma, poderiam estar associadas ao HLB. Como conseqüência do uso desses meios, um número maior de bactérias passou a ser cultivada. Dentre os meios testados o melhor foi o TSA que contém peptonas de origem animal e vegetal. Desde o início de seu emprego, ao meio TSA sempre foi adicionado sacarose. O objetivo foi favorecer o isolamento de bactérias que também vivem no floema da planta, local onde este açúcar ocorre em altas concentrações (OGATA, 1997). Dessa forma um grande número de bactérias foi cultivado tanto desde plantas afetadas por Ca. L. americanus como de plantas afetadas por Ca. L. asiaticus e de plantas sadias. Em TSA, as primeiras colônias foram observadas a partir do terceiro dia de incubação. Por causa da diversidade de microrganismos isolados, o tempo de crescimento variou muito (5 a 20 dias) entre os indivíduos. O acompanhamento do crescimento foi diário. As placas que continham colônias com morfologia definida eram armazenadas em geladeira, visando paralisar seu desenvolvimento. As demais placas continuavam na estufa para que as colônias de crescimento mais lento atingissem o mesmo estágio de desenvolvimento. Quanto às jarras de anaerobiose, as bactérias que ali cresceram apresentaram caracteísticas muito similares as que cresceram em aerobiose. Isto pode ser atribuído a possíveis problemas de vedação, permitindo a entrada do oxigênio durante o período de incubação que foi de 20 dias. As bactérias isoladas variaram em cor, formato de colônia e rapidez de crescimento. Como todas essas variáveis podem ser alteradas com o ambiente, decidiu-se proceder a uma análise de DNA, empregando-se como ferramenta a PCR com primers para regiões palindrômicas repetitivas, denominado coletivamente de Rep-PCR. Para tanto foi necessário extrair e purificar o DNA de cada indivíduo. Depois de serem selecionadas e preliminarmente identificadas, as colônias foram clonadas quatro vezes através do método de estriagem por esgotamento de uma colônia isolada, onde todas as colônias, depois de crescidas, têm que apresentar a mesma cor e morfologia. Após a purificação procedeu-se a extração do DNA genômico bem como sua quantificação. A quantificação foi feita visualmente em gel de agarose (Figura 7). 29 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Figura 7. Fotografia de gel mostrando a qualidade e relativa quantidade de DNA extraído de bactérias endofíticas de citros. De 1 a 14 indivíduos do primeiro isolamento. De 15 a 18 padrões de DNA de bacteriófago Lâmbda [BioLabs (500µL/mL)], diluídos a 50, 150, 300 e 600 ng/µL, respectivamente. Gel de agarose a 0,8%. Tempo de corrida 1:30 horas a 80V. Embora este método não seja preciso quanto à quantidade de DNA presente na solução, quando comparado a soluções com concentrações conhecidas (canaletas de 15 a 18, Fig 7), é um indicativo da qualidade e se a concentração é suficiente para uso em PCR. Análise da Figura 7 indica que as extrações dos endofiticos resultaram em DNA com qualidade e quantidade satisfatórias. Em seguida, com base nos padrões (DNA do bacteriófago Lambida), todos as amostras de DNA foram diluídas à concentração aproximada de 20ng/µL para serem usados nas reações de PCR (para a detecção de Ca L. americanus e Ca. L asiaticus) e de Rep-PCR (para avaliação da diversidade dos endofíticos isolados). Em nenhum gel de agarose se detectou produto de PCR (ou banda) do tamanho esperado para Ca L. americanus ou Ca. L asiaticus (Figura 8), demonstrando, conforme mencionado anteriormente, o insucesso no desenvolvimento de meio de cultura que permitisse o cultivo desses microrganismos. Esse resultado confirma o obtido por diversos outros pesquisadores em diversas partes do mundo, que, de acordo com J. Bové, tentaram sem sucesso cultivar Liberibacter. 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 M Figura 8. Fotografia de gel de agarose pós PCR para detecção de Ca. L. americanus. De 1 a 42 indivíduos dos três isolamentos (ver tabela 4 e 5); 43 controle positivo para Ca. L. americanus (1027 pb); 44 controle negativo da reação; M marcador de 100 pares de base. Gel de agarose a 1,0%. Tempo de corrida 2:30 h a 100V. Por outro lado, o gel de eletroforese dos produtos do Rep-PCR mostrou haver grande diversidade genética na população de bactérias endofíticas. Ao todo foram contadas 24 bandas significativas em termos de intensidade mas com padrões distintos de migração no gel, específicos para cada indivíduo. A contagem e identificação das diferentes bandas foram feitas através de linhas traçadas horizontalmente sobre uma foto do gel usando o programa Power Point 2003 (Windows XP – Microsoft). A foto do gel com padrões para todos os indivíduos isolados é mostrada na Figura 9. 1º isolamento 2º isolamento 3º isolamento Figura 9. Fotografia de gel de agarose mostrando distintos padrões de bandas gerados através da análise do DNA genômico de bactérias isoladas de plantas afetadas e não afetadas por HLB, obtidos através de Rep-PCR com primers desenhados para regiões palindrômicas repetitivas do genoma bacteriano. A identificação e origem de cada indivíduo são mostradas nas Tabelas 4 e 5 e na Figura 10. 31 Procurando-se quantificar níveis de similaridade entre os indivíduos isolados, e se também haveria alguma relação entre indivíduos ou grupos de indivíduos com a sua origem (estado de sanidade da planta, presença de Ca. L. americanus ou Ca. L. asiaticus), data de isolamento e regimes de temperatura, os padrões de bandas mostrados na Figura 9 foram usados para em análise de cluster representado no dendograma mostrado na Figura 10. Figura 10. Dendograma mostrando grupamentos de bactérias isoladas de plantas sadias e afetadas por Ca. L. americanus ou Ca. L. asiaticus gerado através do programa NTSYS-Pc com base nos padrões de bandas mostrados na Figura 9. 32 A análise resultou em 4 grandes grupos de bactérias, com grandes diferenças entre grupos e entre indivíduos dentro de cada grupo, sendo, em sua maioria, com menos de 50% de dissimilaridade. O cruzamento das informações do dendograma com as variáveis mencionadas e listadas na Tabela 4 mostrou ausência de qualquer tipo de correlação. Com estes dados foi montada a Tabela 2, onde os indivíduos foram nomeados, para fins de análise, com base no seu número de identificação no gel de Rep-PCR, o qual foi seguido da inicial da espécie de liberibacter infectando planta (AM para Ca. L. americanus, AS para Ca. L. asiaticus), ou se se tratava de planta sadia usada como controle (CT), seguido ainda da condição de temperatura da câmara de crescimento onde a planta estava mantida, sendo Q para quente (27 a 32°C) e F para fria (22 a 24°C). 33 Tabela 4. Grupamentos de bactérias isoladas de plantas sadias e afetadas por Ca. L. americanus ou Ca. L. asiaticus mostrados na Figura 10. Identificação Identificação Número do Teste de Temperatura Condição da bactéria no da bactéria isolamento(4 Gram ambiente em da ) dendograma(2) na planta(3) °C(5) planta(6) 1 1 1 AMQ 1 27 e 32 Am 2 12 12 AMF 1 22 e 24 Am 3 2 2 AMQ 1 27 e 32 Am 4 14 14 ASF 1 22 e 24 As 5 27 27 ASF 2 + 22 e 24 As 6 9 9 CTQ 1 27 e 32 Controle 7 43 ATCC ATCC 44 ATCC ATCC 8 31 31 ASF 2 + 22 e 24 As 9 3 3 ASQ 1 27 e 32 As 10 34 34 ASQ 3 27 e 32 As 41 41 ASF 3 22 e 24 As 42 42 CTF 3 22 e 24 Controle 38 38 AMF 3 22 e 24 Am 35 35 ASQ 3 27 e 32 As 11 5 5 ASQ 1 27 e 32 As 12 6 6 CTQ 1 27 e 32 Controle 13 7 7 CTQ 1 27 e 32 Controle 14 13 13 AMF 1 22 e 24 Am 15 8 8 CTQ 1 27 e 32 Controle 16 39 39 AMF 3 22 e 24 Am 17 11 11 AMF 1 22 e 24 Am 18 23 23 AMF 2 + 22 e 24 Am 19 33 33 AMQ 3 27 e 32 Am 40 40 AMF 3 22 e 24 Am 20 16 16 AMQ 2 27 e 32 Am 17 17 AMQ 2 27 e 32 Am 21 21 AMF 2 22 e 24 Am 24 24 AMF 2 22 e 24 Am 29 29 ASF 2 + 22 e 24 As 21 30 30 ASF 2 22 e 24 As 22 25 25 ASF 2 + 22 e 24 As 23 4 4 ASQ 1 27 e 32 As 24 28 28 ASF 2 22 e 24 As 25 26 26 ASF 2 22 e 24 As 26 32 32 AMQ 3 + 27 e 32 Am 27 19 19 ASQ 2 27 e 32 As 28 10 10 AMF 1 22 e 24 Am 29 15 15 AMQ 2 27 e 32 Am 30 18 18 ASQ 2 27 e 32 As 31 22 22 AMF 2 22 e 24 Am 32 20 20 AMQ 2 27 e 32 Am 33 37 37 AMQ 3 27 e 32 Am 34 36 36 AMQ 3 27 e 32 Am (1) Os indivíduos dentro de cada grupo são idênticos quanto ao padrão e bandas obtidos por rep-PCR (Figura 9); (2) Com base no dendograma (Figura 10); (3) As diferentes letras indicam a doença e o regime de temperatura; (4) Isolamentos feitos depois de 60 de incubação nas câmaras de crescimento (1), e 30 (2) e 60 dias (3) depois de as plantas terem sido retiradas das câmaras; (5) Regimes diários de temperatura do ar no interior das câmaras; (6) Plantas infectadas por Ca. L. americanus (Am), Ca. L. asiaticus (As) e Sadia (Controle); ATCC 27873 – Pseudomonas aeruginosa. Grupamento s genético(1) 34 Apesar da ausência de correlação entre as variáveis apresentadas, a análise feita por Rep-PCR permitiu identificar os indivíduos endofiticos e analisar sua diversidade dentro de sua origem, ambiente e datas de isolamento, como mostrado na Tabela 5. Tabela 5. Bactérias isoladas de plantas experimentais sadias e afetadas por Ca. L. americanus e Ca. L. asiaticus mantidas por um período de 60 dias no interior de câmaras climáticas e transferidas para casa de vegetação. Regime(1 ) 22 a 24°C Condição da planta(2) No. da planta Ca. L. americanu s 234 235 236 Ca. L. asiaticus 240 242 243 Primeiro isolamento(3) 10 AMF 11 AMF; 12 AMF; 13 AMF 14 ASF - Sadia 244 Indivíduos distintos no regime 27 a Ca. L. 202 32°C americanu 203 s 204 Ca. L. 206 asiaticus 207 209 Sadia 211 Indivíduos distintos no regime Total de indivíduos distintos 6 1 AMQ; 2 AMQ 3 ASQ 4 ASQ 5 ASQ 6 CTQ; 7 CTQ; 8 CTQ; 9 CTQ 9 14 Bactérias isoladas Segundo Terceiro isolamento(4) isolamento(5) Tota l 21 AMF; 22AMF 23 AMF; 24 AMF - 38 AMF; 39 AMF 40 AMF 11 25 ASF; 26 ASF 27 ASF; 28 ASF 29 ASF; 30 ASF; 31 ASF 9 15 AMQ 16 AMQ 17 AMQ 18 ASQ 19 ASQ; 20 AMQ - 41 ASF 9 - 42 CTF 3 32 AMQ 33 AMQ 34 ASQ 35 ASQ; 36 AMQ; 37 AMQ - 5 13 5 6 1 7 10 4 19 42 (1) Regimes diários de temperatura em câmaras de crescimento; (2)Afetada ou não por Liberibacter; Isolamento realizado em plantas mantidas por 60 dias nas câmaras (3), ou após 30(4) e 60 dias(5) depois de retiradas das câmaras e mantidas em casa de vegetação. Os indivíduos marcados em cores diferentes apresentaram, dentro de cada cor, 100% de similaridade genética (Figuras. 9 e 10) Análise da Tabela 5 indica que houve, no total, variação no número de indivíduos distintos dentro de cada data de isolamento, sendo maior no primeiro isolamento, com 14 indivíduos, seguido do segundo com 13, e do terceiro com 6. Quando se compara as datas de isolamento dentro de cada câmara nota-se, no entanto, inversão dos valores, com um maior número de indivíduos no segundo isolamento para as plantas da câmara mais fria e maior número de indivíduos no primeiro isolamento para as plantas da câmara mais quente. Essas diferenças em número de indivíduos podem simplesmente refletir o efeito do ambiente em que as plantas foram mantidas. 35 Do ponto de vista de se procurar estabelecer associação entre endofíticos e Liberibacter, comparação mais importante é talvez aquela que se faz entre as espécies de Liberibacter afetando as plantas dentro de cada câmara. Nota-se, neste caso, maior variação no número de indivíduos de plantas afetadas por Ca. L. americanus, sendo maior na câmara mais fria (total de 11) do que o número obtido na câmara mais quente (total de 7). Quando se trata de Ca. L. asiaticus, no entanto, número parecido de indivíduos (9 e 10 respectivamente) foi isolado. Neste caso, pode estar havendo ao menos três efeitos: i) do patógeno sobre a população de endofíticos, ii) do regime de temperatura sobre a população de endofíticos, e iii) do regime de temperatura sobre a interação patógeno/endofítico. Sabese de outros estudos (LOPES et al, no prelo) que o regime de temperatura de 27 a 32°C por 60 dias é letal para Ca. L. americanus. Quando se procedeu ao primeiro isolamento, as plantas já haviam sido mantidas neste regime por 60 dias. Isto indica que todos os endofiticos isolados das plantas da câmara mais quente o foram na ausência de Ca. L. americanus. Portanto, o único ou o mais importante efeito sobre estes indivíduos ao longo do tempo se deve, provavelmente, à ação da temperatura. A grande diversidade mostrada na Tabela 5 também revela que houve, ao longo do tempo, variação nas populações dominantes de indivíduos nas plantas amostradas. Nenhum dos indivíduos se repetiu nos diferentes isolamentos. Isto pode estar relacionado a uma sucessão de populações, com umas substituindo outras à medida que o tempo passa e o ambiente se altera, por exemplo, em termos de disponibilidade de nutrientes. Já foi demonstrado por Onuki et al. (2002) e Heredia et al (2006) que, em folhas sintomáticas de planta afetadas pelo HLB apresentando mosqueado típico, há acúmulo de amido no tecido parenquimático. Apesar de o amido encontrar-se aparentemente imobilizado nas células do parênquima (HEREDIA et al., 2006), este pode, de alguma forma, interferir na composição química do floema e consequentemente na sucessão populacional de endofiticos e, possivelmente, até mesmo na de Liberibacter. A análise das variações de endofiticos observadas ao longo do tempo nas folhas das plantas estudadas é dificultada pelo fato de as amostras não terem sido as mesmas para todos os isolamentos. Por se tratar de folhas, uma vez coletadas, não haveria substitutas no mesmo local da planta num segundo isolamento. Variação na idade das folhas entre os isolamentos é um outro fator que dificulta a análise dos dados obtidos. Entre as coletas houve senescência de algumas folhas em decorrência da infecção, da idade e do próprio ambiente. 36 5 Conclusões . O cultivo de Liberibacter requer a presença de substâncias ou de combinação de substâncias não incluídas no meios de cultura avaliados, ou ainda, de métodos de processamento das amostras não testados no presente trabalho. Em nenhuma das tentativas de cultivo em meio de cultura cresceu bactérias que, quando analisada por PCR, resultou em banda de tamanho esperado para Liberibacter. . A técnica rep-PCR foi apropriada para a separação e análise da diversidade das bactérias isoladas de plantas afetadas ou não por huanglongbing. . Não houve associação entre presença de liberibacter e ocorrência de qualquer bactéria endofítica em particular nas plantas avaliadas, nas três datas de isolamento. 37 6 Referência Bibliográfica ARAÚJO, W.L. A comunidade bacteriana endofítica de citros e sua interação com Xylella fastidiosa, agente causal da clorose variegada dos citros (CVC). Piracicaba: ESALQ/USP, 2000. 131 p. Tese de Doutorado. ARAÚJO, W.L.; MARCON, J.; MACCHERONI JR.W.; VAN ELSAS, J.D.; VAN VUURDE, J.W.L.; AZEVEDO, J.L. Diversity of endofitic bacterial population and intertion with Xylella fastidiosa in citrus plants. Applied and Environmental Microbiology, v. 68, p. 4906-4914, 2002. AZEVEDO, J.L., Microrganismos endofíticos. In: Ecologia Microbiana. Eds. MELO, I.S. e AZEVEDO, J.L. Jaguariúna, Embrapa-CNPMA, p.117-137, 1998. AZEVEDO, J. L.; MACCHERONI Jr., W.;.PEREIRA, J. O; ARAÚJO, W. L. Endophytic microorganisms a review on insect control and recent advances on tropical plants. Electronic Journal of Biotechnology, v. 3, 2000, http://www.ejb.org/content/vol3/issue1/full3 BACON, C. W.; YATES, I. E.; HINTON, D. M.; MEREDITH, F. Biological control of Fusarium moniliforme in maize. Environmental Health Perspectives, v. 109, n. 2, p. 324332, 2000. BARRETTI, P. B.; ROMEIRO, R. S.; ANDRADE, C. G.; SILVA, H. S. A Evidência experimental de que alguns endofitas podem atuar como agentes de biocontrole em tomateiro por indução de resistência. Fitopatologia Brasileira, v. 27, p. S224, 2002. [abstract] BALDANI J. I.; CARUSO, L.; BALDANI, V. L. D.; GOI, S. R.; DÖBEREINER, J. Recent advances in BNF with non-legume plants. Soil Biology Biochemistry, v. 29, n. 5/6, p. 911922, 1997. BEDENDO, I. P.; DAVIS, R.E.; DALLY, E.L. Detecção e caracterização de fitoplasmas em vinca (Catharantus roseus) e pimenta (Capsicum frutescens) através das técnicas de duplo PCR e de RFLP. Summa Phytopathologica, v. 25, n.3, p. 197-201, 1999. BEDENDO, I.P. Micoplasmas e Espiroplasmas. In: Manual de Fitopatologia Princípios e Conceitos, BERGAMIN FILHO, A., KIMAT, H., AMORIM, L. (Ed.):. São Paulo: Editora Agronômica Ceres, 1995. v. 1 ,cap. 9. p. 202-210. BEDENDO, I.P. Espiroplasmas patogênicos a plantas. Revisão Anual de Patologia de Plantas (RAPP), vol.5, p.99-131, 1997. BERGSMA-VLAMI, M.; PRINS, M. E.; STAATS, M.; RAAIJMAKERS, J. M.. Assessment of genotypic diversity of antibiotic-producing Pseudomonas species in the rhizosphere by denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and Environmental Microbiology, v. 71, n. 2, p. 993-1003, 2005. 38 BERTONI, B. W. Propagação, variabilidade genética e química de Zeyheria montana Mart. Jaboticabal: UNESP, 2003, p.165. Tese de Doutorado. BIONDI, N.; PICCARDI, R.; MARGHERI, M. C.; RODOLFI, L.; SMITH, G. D.; TREDICI, M. R. Evaluation of Nostoc strain ATCC 53789 as a potential source of natural pesticides. Applied and Environmental Microbiology, v. 70, n. 6, p. 3313-3320, 2004. BOVÉ, J.M.; CALAVAN E.C.; CAPOOR S.P.; CORTEZ R.E.; SCHWARZ R.E.. Influence of temperature on symptoms of California stubborn, South African greening, Indian citrus decline and Philippines leaf mottling diseases. In: Proc. 6th Conf. IOCV, IOCV, Riverside, CA., pp 12-15. 1974. BOVÉ, J.M. Wall-less prokaryotes of plants. Annual Review of Phytopathology, v. 23, p. 361-396, 1984. BOVÉ J.M., Huanglongbing: a destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology, v.88, p.7-37, 2006. CHANG, C.J. Vitamin requeriments of three spiroplasmas. Journal of Bacteriology, v. 160, p.488-490, 1984. COLETTA-FILHO H.D.; TARGON M.L.P.N.; TAKITA M.A.; DE NEGRI J.D.; POMPEU JR J.; MACHADO M.A. First report of the causal agent of Huanglongbing (“Candidatus Liberibacter Asiaticus”) in Brazil. Plant Disease v.88, p.1382, 2004. DAVIS, R.E.; WORLEY, J.F. Spiroplasma: motile, helical microorganism associated with corn stunt disease. Phytopathology, v.63, p. 403-408, 1973. DAVIS, R.E. Fitoplasmas: fitopatógenos procarióticos sem parede celular, habitantes de floema e transmitidos por artrópodos. Revisão Anual de Patologia de Plantas (RAPP), Passo Fundo, v.3, p. 1-21, 1995a. DAVIS, R.E. New perspectives on yellows diseases and their causal agents gained though molecular methods for pathogen detection and identification. Summa Phytopathologica, Jaguariuna, v.21, p.86-87, 1995b. DÖBEREINER, J.; BODDEY, R. M. Nitrogen fixation in association with gramineae. Current Perspectives in Nitrogen Fixation, Gibson, A. H; Newton, W.E. (eds), Canberra: Aust. Acad. Sci., p. 305-312, 1981. DOWNING, K. J. ; LESLIE, G.; THOMSON, J. A. Biocontrol of the sugarcane borer Eldana saccharina by expression of the Bacillus thringiensis cry1Ac7 and Serratia marcescens chiA genes in sugarcane-associated bacteria. Applied and Environmental Microbiology, v. 66, n. 7, p. 2804-2810, 2000. FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. Embrapa Cenargen, Brasília, DF. 1996. p.39-42. 39 FUDL-ALLAH, A.; CALAVAN, E.C.; IGWEGBE, E.C. Culture of a micoplasmalike organism associated with stubborn disease of citrus. Phytopathology, v. 61, p. 1321 (abstr.), 1971. FUDL-ALLAH, A.; CALAVAN, E.C.; IGWEGBE, E.C. Culture of a micoplasmalike organism associated with stubborn disease of citrus. Phytopathology, v. 62, p. 729-731, 1972. FUKUMORITA, T.; CHINO, M. Sugar, amino acid and inorganic contents in rice phloem sap. Plant & Cell Physiology, v. 23(2), p. 273-283, 1982. FUNDECITRUS, (Fundo de Defesa da Citricultura) Manual de técnico de Greening, 2007. GARNIER, M.; DANEL, N.; BOVÉ, J.M. The greening organism is a Gram negative bacterium. In: Proc. 9th Conf. IOCV, IOCV, Riverside CA., pp 115-124, 1984. da GRAÇA, J.V.. Citrus greening disease. Annual Review of Phytopathology, v. 29, p.109-36, 1991. GHOSH S.K.; GIANNOTTI J.; LOUIS C. Multiplication intense des procaryotes associés aux maladies de type “greening” des agrumes dans les cellules criblées de Cuscutes. Ann. Phytopathology, v. 9(4), p. 525-530, 1977. GROSSER, J.W.; GMITTER JR., F.G. Protoplast fusion and citrus improvement. Plant Breeding Reviews, v.8, p.339-374, 1990. HALBERT S.E.; MANJUNATH K.L.. Asan citrus psyllids (Sternorrhycha: Psyllidae) and greening disease of citrus: a literature review and assessment of risk in Florida. Florida Entomologist, v.87, p. 330-53, 2004. HALLMANN, J.; QUADT-HALLMANN, A.; MAHAFFEE, W.F.; KLOEPPER, J.W. Bacterial endophytes in agricultural crops. Canadian Journal of Microbiology, v.43, p. 895-914, 1997. HAMPL, V.; PAVLÍCEK, A.; FLEGR, J. Constrution and bootstrap of DNA fingerprintingbased phylogenic trees wich the freeware program Free Tree: application to trichomonad par Astes. International Journal of Systemic and Evolutionary Microbiology, v.51, p.731735, 2001. HAYASHI, H.; CHINO, M. Collection of pure phloem sap from wheat and its chemical composition. Plant & Cell Physiology, v.27(7), p. 1387-1393, 1986. HEREDIA, M.; GARCIA, A. L.; TORRES, S. C. Z.; LOPES, S. A. Microscopic analysis of leaves of sweet orange trees affected by huanglongbing. In: Huanglongbing-GreeningWorkshop Internacional, Ribeirao Preto-SP. Proceeding of the Huanglongbing- greenig Internacional Workshop. Araraquara-S, v. 1, p. 89-89, 2006. 40 HULTON, C.S.J.; HIGGINS, C.F.; SHARP, P.M. ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria. Molecular Microbiology, v.5, p. 825-834, 1991. KENNEDY, A.C. Bacterial diversity in agroecosystems. Agriculture, ecosystems and Environment, v. 74, p.65-76, 1999. KITAJIMA, E.W. Enfermidades de plantas associadas a organismos do tipo micoplasma. Revisão Anual de Patologia de Plantas (RAPP), Passo Fundo, v.2, p. 153-174, 1995. KLOEPPER, J.W., SCHIPPERS, B. AND BAKKER, P.A.H.M. Proposed elimination of the term Endorhizosphere. Phytopathology, v. 82, p. 726-727, 1992. LACAVA, P. T.; ARAÚJO, W.L.; MARCON, J.; MACCHERONI, W. Jr.; AZEVEDO, J. L. Interaction between endoophytic bacteria from citrus plants and the phytopathogenic bacteria Xylella fastidiosa, causal agent of citrus-variedated chlorosis. Applied and Environmental Microbiology, v. 39, p. 55-59, 2004. LEMA, M.W.; BROWN, A.; CLAKINS, J.H. A general method for the extracion of DNA from bacteria. Journal of Microbiological Methods, v. 19, p. 167-172, 1994. LEE, L.M.; DAVIS, R.E. Phloem-limited prokaryotes in sieve elements isolated by enzyme treatment of diseased plant tissues. Phytopathology, v 73, p. 1540-1543, 1983. LOPES, S.A.; DAMANN, K.E; GRELEN, L.B. Xanthomonas albilineans diversity and identification basead on rep-pcr fingerprints. Current Microbiology, v. 42, p. 155-159, 2001 LOPES, S.A.; FRARE, G.F.; YAMAMOTO, P.T.; AYRES, A. J. Ineficácia da poda no controle do huanglongbing dos citros. Fitopatologia Brasileira, v 30, p.64, 2005a. LOPES, S.A.; FRARE, G.F.; MARTINS, E.C. Plantas Hospedeiras de Liberibacter no Br Asl,. Huanglongbing greening internacional workshop, Ribeirão Preto, SP, resumo S11, pag. 27, 2005b. LOPES, S.A.; MARTINS, E.C.; FRARE, G.F. Detecção de Candidatus Liberibacter americanus em Murraya paniculata. Summa Phytopathologica, v31, p. 48-49, 2005c. LOPES S.A.; TORRES S.C.Z. An effective and low-cost culture medium for isolation and growth of Xylella fastidiosa from citrus and coffee plants. Current Microbiology, v.53(6), p.467-469, 2006 LOPES, S.A.; BASSANEZI, R.B. A doença huanlongbing dos citros no Estado de São Paulo. In: Manejo Integrado de Doenças de Fruteiras. Eds. Sociedade Br Asleira de Fitopatologia, Lavras, Universidade Federal de Lavras, p.233-243, 2007. LOPES, S.A.; FRARE, G.F. Graft Transmission and Cultivar Reaction of Citrus to ‘Candidatus Liberibacter americanus’. Plant Disease, v.92, p.21-24, 2008. 41 MCCOY, R. E.; CAUDWELL, A.; CHANG, C. J.; YANG, I. L.; ZHU, B. M.; SEEMULLER, E. Plant diseases associated with mycoplasma-like organisms. In: WHITCOMB, R. F.; TULLY, J. G. The Mycoplasmas. New York: Academic Press, 1989. v.5, p.545-640. MARKHAM, P.G.; TOWNSEND, R. Transmission of Spiroplasma citri to plants. Inst. Natl. Sante Rech. Med. Colloq., v. 33, p. 201-206, 1974. MARTIN, B.; HUMBERT, O.; CAMARA, M.; GUENZI, E.; WALKER, J.; MITCHELL, T.; ANDREW, P.; PRUDHOMME, M.; ALLOING, G.; HAKENBECK, R.; MORRISON, D.A.; BOULNOIS, G.J.; CLAVERIS, J-P. A highly conserved repeated DNA element located in the cromossome of Streptococcus pneumonie. Nucleic Acidis Research, v.20, p.3479-3483, (1992). NEWMAN D.K.; BANFIELD, J.F. Geomicrobiology: how molecular-scale interactions underpin biogeochemical systems. Science, n.10, v. 296, p.1071-7, 2002. OGATA, T. Método de coleta da seiva do floema de citros. Nova Técnica de Árvore Frutífera. Nova Descoberta, v 62 – Japão,1997. ONUKI, M.; TRUC, N.T.N.; NESUMI, H.; HONG, L.T.T.; KOBAYASHI, H. Useful histological method for distinguishing citrus yellowing leaves infected with huanglongbing from those caused by other factors. Proceedings of 2002 annual workshop of JIRCAS Mekong Delta Projets, 2002. PRATELLS, G. C.; MARI, M.; GUIZZARDI, M.; FOLCHI, A. Preliminary studies on the efficiency of endophytes in the biological control of the postharvest pathogens Monilinia laxa and Rhizopus stolonifer in stone fruit. Postharvest Biology and Technology, v. 3, p. 361-368, 1993. QUADT- HALLMANN, A.; BENHAMOU, N.; KLOEPPER, J. W. Bacterial endophytes in cotton: mechanisms of entering the plant. Canadian Journal Microbiology, v. 43, p. 577582, 1997. RAJKUMAR, M.; LEE W. H.; LEE K.J. Screening of bacterial antagonists for biological control of Phytophthora blight of pepper. Journal Basic Microbiology, v. 45, n. 1, p. 55-63, 2005. ROHLF, F.J. NTSYS-Pc- (Numerical Taxonomy and. Multivariate Analysis System). New York: Exeter Publishers, 1989. ROMEIRO R.S., Procariotas endofitas como potenciais agentes de biocontrole. In: Controle Biológico de Doenças de Plantas – procedimentos. UFV, p. 111-134, 2007. STERN, M.J.; AMES, G.F.-L.; SMITH, N.H.; ROBINSON, E.C.; HIGGINS, C.F. Repetitive extragenic palindromic sequences: a major component of the bacterial genome. Cell, v. 37, p. 1015-1026, 1984. STROBEL G, DAISY B. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. Microbiology Molecular Biology Review, v.67, n. 4, p.491-502, 2003 42 SUTTON B.D. Detection and identification of citrus huanglongbing (Greening) in Florida, USA. Proc. 2nd international citrus canker and huanglongbing research workshop, Florida Citrus Mutual, Orlando, FL., abstract H-11, 2005. TAIZ, L.; ZEGER, E. Fisiologia Vegetal, 3º edição. Artmed, Porto Alegre-RS, 719p. 2004. TEIXEIRA, D.C.; DANE, J.L.; EVEILLARD S.; MARTINS, E.C.; JESUS JUNIOR, W.C.; YAMAMOTO, P.T.; LOPES S.A.; BASSANEZI, R.B.; AYRES, A.J.; SAILLARD C.; BOVÉ J.M. Citrus huanglongbing in São Paulo State, Brazil: PCR detection of the “Candidatus” Liberibacter species associated with the disease. Molecular and Cellular Probes, v 19, p.173-179,. 2005a. TEIXEIRA, D.C.; SAILLARD, C.; EVEILLARD, S.; DANET, J.L.; AYRES, A.J.; BOVÉ, J.M. “Candidatus Liberibacter americanus” associated with citrus huanglongbing (greening disease) in São Paulo State, Brazil. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v 55, p. 1857-1862, 2005b. TORSVIK V, OVREAS L, THINGSTAD TF. Prokaryotic diversity--magnitude, dynamics, and controlling factors. Science, v. 10, n. 296; p. 1064-6, 2002. TRINDADE, L. C.; FERREIRA, M. A. Caracterização de Xanthomonas campestris pv. viticola através de REP-PCR. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 25, Suplemento, p. 285, 2001. TRINDADE, L. C.; FERREIRA, M. A. Caracterização de Xanthomonas campestris pv. Viticola através de REP, ERIC e BOX-PCR. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 28, Suplemento, p. 370,2003. TSUDA, K.; KOSAKA, Y.; TSUGE, S.; KUBO,Y.; HORINO, O Evaluation of the enondophyte Enterobabacter cloace SM10 isolated from spinach roots for biological control against Fusarium wilt of spinach. Journal of General Plant Pathology, v. 67, p. 78-84, 2001. VERMA, S. C.; LADHA, J. K.; TRIPATHI, K. Evaluation of plant growth promoting and colonization ability of endophytic diazotrophic from deep water rice. Journal of Biotechnology, v. 91, p. 127-141, 2001. VERSALOVIC, J.; KOEUTH, T.; LUPSKI, J.R. Distribuition of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, v. 19, p. 6823-6831, 1991. WOO, T.H.S.; CHENG, A.F.; LING, J.M. An application of a simple method for the preparation of bacterial DNA. Biotechniques, v.13, n.5, p. 696-698, 1992. ZINNIEL, D. K.; LAMBRECHT, P.; HARRIS, N. B.; FENG, Z.; KUCZMARSKI, D.; HIGLEY, P.; ISHIMARU, C. A.; ARUNAKUMARI, A.; BARLETTA, R. G.; VIDAVER, A. K. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and praire plants. Applied and Environmental Microbiology, v. 68, n. 5, p. 2198-2208, 2002.
