produção e caracterização de proteínas do invólucro

PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS DO INVÓLUCRO DO HIV-2
ALI: CONTRIBUIÇÃO PARA A PRODUÇÃO DE UMA VACINA CONTRA O HIV2
Helena Barroso1,2, José Marcelino3, Carlos Novo3, Nuno Taveira1,2
1. Instituto Superior de Ciências da Saúde-Sul, Monte de Caparica; 2. URIA-CPM,
Faculdade de Farmácia de Lisboa; 3. INETI-Departamento de Biotecnologia-UTPAM,
Lisboa, Portugal
O HIV-2, segundo agente etiológico de SIDA, é endémico na África ocidental, em
alguns países da Europa ocidental com ligações históricas com África (como por
exemplo Portugal e França) e na Índia [1]. Já foram identificados 7 subtipos genéticos
de HIV-2 [2], sendo o subtipo A o mais prevalente em todo o mundo [1].
A entrada do HIV-2 na célula é mediada pelo complexo glicoproteico do invólucro viral
que consiste na glicoproteína de superfície (SU), gp125, e na glicoproteína
transmembranar (TM), gp41. O CD4 é o principal receptor celular para o HIV-2,
ligando-se à gp125 [3]. O complexo gp125-CD4 liga-se em seguida a um receptor das
quimiocinas. Os receptores das quimiocinas CCR5 e CXCR4 são os principais coreceptores para a entrada nas células de isolados primários de HIV-2 [4-6]. Alguns
isolados primários de HIV-2 podem infectar células CD4+ mesmo na ausência de coreceptores, incluindo o CCR5 e o CXCR4 [6-8]. Infecções CD4-independente e CXCR4
ou CCR5-dependentes foram também observadas em HIV-2 passados em laboratório
[9-11] e em isolados primários de HIV-2 [7-12].
As respostas imunitárias, especialmente na fase assintomática da infecção por HIV-2,
são mais fortes e eficazes do que no HIV-1, resultando em níveis mais baixos de
replicação viral [13]. Ao contrário da maioria dos indivíduos infectados com HIV-1, a
maioria dos indivíduos infectados com HIV-2 têm respostas T-celulares proliferativas
para as proteínas Env e Gag de HIV-2 e SIV. Uma resposta citotóxica forte é também
comum na infecção por HIV-2. Na infecção por HIV-1 raramente se encontram
anticorpos neutralizantes [14, 15], mas uma infecção por HIV-2 induz anticorpos
neutralizantes contra vírus homólogos com extensa reactividade cruzada contra vírus
HIV-2 heterólogos, HIV-1 e SIV [16-18]. Estes anticorpos neutralizantes são
específicos para as glicoproteínas do invólucro.
Usando péptidos sintéticos derivados de glicoproteínas do invólucro e soro de
indivíduos infectados pelo HIV-2, foram identificadas cinco regiões altamente
imunogénicas no HIV-2: três na glicoproteína de superfície, nas regiões C2 (aa 234248), V3 (aa 296-337) e C5 (aa 472-507), e duas nas regiões C6 (aa 573-595) e C7 (aa
634-649) da extremidade amino-terminal da glicoproteína transmembranar [19-23]. A
imunogenicidade intrínseca da glicoproteína transmembranar gp36 nos humanos e a sua
utilidade como reagente de diagnóstico têm também sido demonstradas em vários
estudos [24-27].
Os alvos para os anticorpos neutralizantes para o HIV-2 foram apenas parcialmente
identificados, e a caracterização da potencial actividade neutralizante dos anticorpos que
reagem com a gp125 do HIV-2 tem originado resultados conflituosos. Por exemplo, a
região V3 foi identificada como alvo neutralizante por alguns [28-33] mas não por todos
os investigadores [18, 34, 35]. Outros epítopos neutralizantes foram identificados nas
regiões V1, V2, V4, C5, C6 e região COOH-terminal da gp41 [30, 31, 33, 36]. A
amplitude e potência de neutralização de isolados primários, de todos os anticorpos
monoclonais neutralizantes descritos até hoje é bastante baixa.
No modelo símio a imunização com um péptido sintético representando a região V3 do
isolado HIV-2SBL6669 induziu uma resposta neutralizante e uma actividade citotóxica
dependente dos anticorpos [30]. A imunização com a glicoproteína externa gp130 do
HIV-2BEN, nativa e purificada, protegeu a maioria dos macacos Cynomolgus contra a
infecção com o vírus homólogo HIV-2BEN, e conferiu também alguma protecção
contra a infecção pelo vírus heterólogo HIV-2SBL6669 [37]. Mais recentemente,
glicoproteínas do invólucro de HIV-2 expressas em vírus Vaccinia ou Canarypox foram
usadas como imunogénios, sozinhas ou em combinação com péptidos sintéticos, em
alguns ensaios em macacos Rhesus [38-41] e Cynomolgus [42]. Foram obtidas boas
respostas imunológicas, mas apenas alguns animais ficaram protegidos contra a
infecção por HIV-2 heterólogos.
Estes estudos foram baseados em isolados de HIV-2 que foram passados múltiplas
vezes em linhas celulares T. É hoje bem conhecido que a adaptação ao crescimento em
células imortalizadas altera as características estruturais e funcionais do invólucro do
HIV-1, com implicações importantes na sua imunogenicidade e propriedades
neutralizantes [43]. Assim, é importante definir os determinantes funcionais, estruturais
e moleculares da antigenicidade e imunogenicidade das glicoproteínas do invólucro de
isolados primários de HIV-2.
O isolado primário HIV-2ALI foi obtido de um paciente da Guiné-Bissau com
complexo relacionado com SIDA, não induz a formação de sincícios em células
mononucleadas do sangue periférico (PBMCs), e utiliza o CCR5 para entrar nas células
[7]. O HIV-2ALI pertence ao subtipo genético A [44], e o seu genoma já foi
completamente sequenciado [2]. Neste estudo, foram investigadas a antigenicidade e
imunogenicidade das glicoproteínas do invólucro do isolado primário HIV-2ALI.
Foram utilizados três tipos de preparações antigénicas: vírus da vacina recombinantes
expressando o gene env do HIV-2ALI, o complexo glicoproteico oligomérico expresso
à superfície celular e um polipéptido correspondente à região C2-C3 que foi expresso
em Escherichia coli.
Mostrou-se que a glicoproteína SU do HIV-2ALI permanece fortemente associada à
glicoproteína TM na superfície da célula, contrariamente ao que se verifica para o HIV2ROD. Uma vez que a associação SU-TM requer uma estrutura terciária complexa que
é dependente da interacção de várias regiões conservadas [45, 46], os resultados
sugerem que as glicoproteínas do invólucro do HIV-2ALI e do HIV-2ROD têm
conformações estruturais diferentes. Como os isolados adaptados HIV-2ISY e HIV-2ST
também libertam a maior parte da sua gp125 [47, 48], parece que o crescimento de
HIV-2 em linhas celulares altera a conformação das glicoproteínas do invólucro
afectando, portanto, a associação SU-TM. Resultados idênticos foram descritos para o
HIV-1 [49].
Observou-se uma menor eficiência de processamento do precursor gp140 no HIV2ROD quando comparado com o HIV-2ALI. No HIV-2ROD, isto foi correlacionado
com a expressão de quantidades crescentes de gp140 na membrana celular, enquanto no
HIV-2ALI a gp140 não processada ficou retida no citoplasma, talvez associada com o
retículo endoplasmático [49, 50]. Estas diferenças estruturais entre as glicoproteínas do
invólucro destes dois vírus podem estar relacionadas com a adaptação do HIV-2ROD ao
crescimento em linhas celulares. O processamento eficiente das glicoproteínas do
invólucro do HIV-2ALI, a forte associação das subunidades SU e TM e a falta de
expressão da proteína precursora gp140 na superfície celular, e presumivelmente na
partícula viral, podem ser importantes em termos de vacinas uma vez que, para o HIV1, a gp160 não processada e a gp120 excretada induzem uma resposta imunitária
humoral não neutralizante que pode impedir o desenvolvimento de anticorpos
neutralizantes contra o complexo oligomérico expresso na partícula viral [43, 51, 52].
Demonstrou-se que os anticorpos presentes no soro de todos os indivíduos infectados
por HIV-2 que foram testados, se ligam à glicoproteína gp125 e ao polipéptido C2-C3
do isolado primário HIV-2ALI, confirmando-se assim a imunogenicidade natural desta
região [27]. Estão em curso estudos adicionais para determinar se esta reactividade é
dirigida contra a V3 loop. Deve, contudo, salientar-se que no HIV-2ROD [25] e no
HIV-2NIH-Z [26] esta região tem sido descrita como fracamente antigénica.
O diagnóstico de uma infecção por HIV-2 baseia-se na detecção de anticorpos
produzidos especificamente contra antigénios de HIV-2, a maior parte das vezes usando
técnicas de imunoensaio enzimático (ELISA). A maioria dos testes serológicos
disponíveis comercialmente são testes mistos que detectam simultaneamente anticorpos
contra o HIV-1 e HIV-2. Os antigénios HIV-2 utilizados nestes ensaios são
normalmente antigénios recombinantes derivados da glicoproteína transmembranar
gp36 de isolados HIV-2 de referência. Contudo, num estudo recente que avaliou a
sensibilidade clínica de 7 testes combinados de Ag e Ac de HIV-1 e HIV-2, nenhum
conseguiu detectar todas as amostras diluídas positivas para HIV-2 que foram testadas
[53]. Dois dos pacientes que participaram no nosso estudo têm títulos muito baixos ou
mesmo não detectáveis de anticorpos contra a glicoproteína gp36. Observações
idênticas foram feitas por outros grupos com outros pacientes infectados por HIV-2
[54]. Conjuntamente com a detecção recente de infecções HIV-2 seronegativas na Índia
[55], estes resultados questionam a sensibilidade dos testes actuais de diagnóstico para
detectar a infecção por HIV-2, em particular para detectar seroconversões recentes.
Estes resultados sugerem também a necessidade de testar novos antigénios que
permitam detectar simultaneamente anticorpos IgM e IgG anti-HIV-2. Neste contexto, o
polipéptido C2-C3 é um bom candidato pois reage com todos os soros de indivíduos
infectados com HIV-2 que analisámos até agora.
Nas áreas endémicas de HIV-2 é importante a capacidade de diferenciação entre
infecções só com HIV-1, só com HIV-2, ou infecções duplas. As glicoproteínas
transmembranares do invólucro do HIV-1 e HIV-2 induzem uma resposta humoral
específica que permite descriminar entre as infecções pelos dois vírus [24, 56]. Assim,
nos kits comerciais para dignóstico serológico, a reactividade com antigénios derivados
das gp36/41 é também usada para destinguir entre infecções HIV-1 e HIV-2 [54].
Contudo, tem sido observado um certo grau de reactividade cruzada que pode complicar
o diagnóstico final [57, 58]. O péptido C2-C3 do HIV-2ALI não reagiu com soros HIV1, confirmando os resultados de Huang e colaboradores [27] com um polipéptido C2-C3
derivado do HIV-2ST. Este polipéptido pode, portanto, ser útil para distinguir
serologicamente as infecções HIV-1 e HIV-2.
A infecção por HIV-2 induz uma resposta em termos de anticorpos neutralizantes mais
potente e mais ampla do que a infecção por HIV-1 [59]. Perceber as bases desta resposta
imunitária protectora é crucial para o desenvolvimento de uma vacina eficaz. Vários
estudos demonstraram que a infecção natural com HIV-2 induz a formação de
anticorpos neutralizantes anti-V3 [29, 31]. O soro de porquinhos-da-Índia imunizados
com péptidos da região V3 pode neutralizar isolados primários de HIV-2 [31]. Foram já
produzidos anticorpos monoclonais anti-V3 com capacidade neutralizante do HIV-2
[32, 33]. Outros estudos, contudo, não confirmam o papel neutralizante da região V3 do
HIV-2 [18, 34, 35]. Neste estudo, verificámos que os anticorpos produzidos pelos
indivíduos infectados com HIV-2 são direccionados contra o complexo oligomérico do
invólucro do isolado primário HIV-2ALI. Demonstrámos ainda que este complexo
oligomérico é altamente imunogénico em ratos Balb/c, induzindo a produção de
anticorpos contra a gp41 e gp125 de várias estirpes de HIV-2, e contra a região
imunodominante do invólucro do HIV-2, a região C2-C3. Adicionalmente, demonstrouse que a região C2-C3 do HIV-2ALI expressa em E. coli é fortemente imunogénica em
ratos. Estudos da actividade neutralizante dos anticorpos produzidos em rato contra a
região C2-C3 e contra o complexo glicoproteico do invólucro do HIV-2ALI estão em
curso. A hipótese que pretendemos confirmar com os estudos de neutralização é a de
que as proteínas recombinantes do invólucro do HIV-2ALI são boas candidatas a
antigénios vacinais, justificando estudos adicionais de imunogenicidade no modelo
símio.
CONCLUSÃO: As glicoproteínas do invólucro do HIV-2ALI são fortemente
antigénicas e imunogénicas e podem ser úteis como reagentes de diagnóstico e como
candidatas a uma vacina para a infecção por HIV-2.
Este trabalho foi financiado pelo projecto CRIA-CR4626 da Comissão Nacional de Luta
Contra a SIDA.
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