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CIÊNCIA EQUATORIAL
Artigo Original
ISSN 2179-9563
Volume 1 - Número 2 - 2º Semestre 2011
AVALIAÇÃO DE MODIFICAÇÕES NO MEIO MRS (SELETIVO PARA Lactobacillus spp)
POR DIFERENTES SAIS DE AMÔNIA E TWEEN 20 EM SUBSTITUIÇÃO AO CITRATO
DE AMÔNIO E TWEEN 80
Anderson Luiz Pena da Costa1; Rhoanny Gizela Uchoa Brito2; Larissa Paula Jardim de Lima Barbosa3; Flávio
Henrique Ferreira Barbosa4
RESUMO
O objetivo desse trabalho foi avaliar modificações ao meio de cultura MRS descrito por ROGOSA (1960) e adaptar este
à disponibilidade de reagentes no Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Universidade de Federal do Amapá,
onde da composição original do meio os reagentes substituídos foram o tween 80 e o citrato de amônio respectivamente
por tween 20 e sais de amônio, sendo os sais testados o acetato de amônio, carbonato de amônio e sulfato de ferro e
amônio. Onde foi avaliada a seletividade dos meios modificados com o plaqueamento de amostras de fermentados
lácteos probióticos contendo Lactobacillus casei, incubados sob condições de microaerofilia a 30°C durante 48 horas.
Na qual as modificações testadas apresentaram resultados satisfatórios para o isolamento de Lactobacillus casei e
provavelmente para outras bactérias do gênero Lactobacillus spp.
Palavras-chave: Lactobacillus spp, MRS, Meio Seletivo Modificado para Lactobacillus.
EVALUATION OF CHANGES IN THE MRS MEDIA (Lactobacillus spp SELECTIVE MEDIA) FOR
DIFFERENT AMMONIUM SALTS AND TWEEN 20 ON THE REPLACEMENT AND
AMMONIUM CITRATE TWEEN 80
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate modifications to the MRS culture medium described by ROGOSA (1960) and
adapt it to the availability of reagents in the Laboratory of Microbiology and Immunology of the Federal University of
Amapa, where in the original composition of the medium reagents tween 80 and ammonium citrate were replaced
respectively by tween 20 and ammonium salts, Being the ammonium salts tested ammonium acetate, ammonium
carbonate and iron and ammonium sulphate. Where were evaluated the selectivity of the media modified plated with
samples of fermented milk containing probiotics Lactobacillus casei, incubated under microaerophilic conditions at 37
° C for 48 hours. In which the modifications tested showed satisfactory results for the isolation of Lactobacillus casei
and probably for other bacteria of the genus Lactobacillus spp.
Keywords: Lactobacillus spp, MRS, Selective Media Modified for Lactobacillus.
INTRODUÇÃO
As bactérias lácticas, ou seja, bactérias
que são capazes de fermentar hexoses
(açucares compostos por seis carbonos) a
ácido lactico, são Gram-positivo, catalase
negativa, e respiração microaerófila, ou seja,
microrganismos que podem utilizar o oxigênio
nas reações químicas para produção de
energia, porém ao contrario dos aeróbicos, não
resistem a níveis de oxigênio presentes na
atmosfera (21%), crescendo melhor em
concentrações de oxigênio variando de 1% a
15%, pois evitam a produção de radicais livres
como OH, H2O2 e O2- (consecutivamente
hidroxila, peróxido de hidrogênio e
superóxido), que não podem ser degradados
devido à ausência das enzimas superóxido
dismutase, peroxidase e catalase, sendo por
tanto substancias extremamente toxicas para
essas células (PELCZAR; M.J.; CHAN;
E.C.S; KRIEG, N.R., 1997, CARLI, 2006)
É um grupo de bactérias que
compreendem tanto bacilos como cocos, não
formadores de esporos e apresentam um
crescimento otimo numa temperatura entre 40°
e 42°C (MADRID et al., 1995, citado por
CARLI, 2006).
As bactérias lácticas são classificadas
em
homofermentativos
ou
heterofermentativos, de acordo com a via
bioquímica utilizada para fermentar as hexoses
(PANCHENIAK, E; F;R; 2005).
As
bactérias
homofermentativas
utilizam a via glicolítica de EmbdenMeyerhof, onde a glicose é decomposta a duas
moléculas de piruvato e além disso formam se duas moléculas de ATP e NADH, que sob
condições anaeróbicas tem como produto de
fermentação o ácido láctico. Enquanto as
bactérias heterofermentativas utlizam a rota
das hexoses monofosfato, também conhecida
como rota das pentoses fosfato para fermentar
a glicose à ácido lactico. Essa é uma rota
oxidativa muito importante para a sintese de
dois percursores dos processos anabólicos
como NADPH (percursor da biossintese de
lipídios e isoprenóides) e ribose 5 fosfato (um
percursor da biossinteze de nucleotídeos). Essa
classificação se deve a ausência de enzimas
envolvidas no processo glicolítico de EmbdenMeyerhof que são ausentes nas bactérias
Ciência Equatorial, Volume 1 - Número 2 - 2º Semestre 2011
heterofermentativas (KOOLMAN, J; RÖHM,
K-H., 2005, PANCHENIAK, E; F;R; 2005).
Dentre as bactérias lácticas, as do
gênero Lactobacillus spp são bactérias que
possuem ação antagonista contra uma
importante série de patógenos como
Escherichia coli e Salmonella thypimurium.
Esses Lactobacillus spp possuem a capacidade
de aderir se fortemente a parede intestinal e
inibir o crescimento de patógenos com
substâncias produzidas durante a fermentação
da lactose a ácido láctico (NESTLÉ, 2000
citado por CRALI 2006). Havendo estudos
clínicos que demonstram que a ingestão de
Bacillus animalis por idosos pode melhorar os
parâmetros imunológicos do hospedeiro, e
linhagens dessa espécie foram associadas à
prevenção e tratamento da diarreia aguda
causada principalmente por rotavírus em
crianças (Probiotics... 2006, citado por
SANTOS; K;O;, EGITO; A; S; BOMFIM; M;
A; BENEVIDES; S; D, 2008). Mas que
também estão associadas a diversas infecções,
porém são considerados pouco virulentos,
apresentando se especialmente prevalentes em
infecções associadas a fatores predisponentes
como cirurgias, imunodeficiências, doenças
debilitantes como diabetes e câncer. (BROOK
& FRAZIER, 1993 citado por SOUZA, C.A.I.;
SCARCELLI, E., 2000), podendo também
causar infecções como endocardite e infecções
odontogênicas
(TAVARES;
J.C.,2002;
OLIVEIRA, S.S.; BARBOSA, T.C.F.,2007).
Sendo
de
grande
importância
alternativas para o cultivo de bactérias do
gênero Lactobacillus, este trabalho propôs
adaptações de meios de cultura seletivos para
favorecer a realização de trabalhos e pesquisas
com os microrganismos desse gênero, na
carência ou falta de determinado reagente.
MATERIAL E MÉTODOS
Para o preparo do meio MRS
modificado utilizou se peptona de carne (10g),
extrato de levedura (5g), dextrose (20g),
ácetato de sódio (5g), tween 20 (2ml), fosfato
de potássio monobásico (2g), sulfato de
magnésio (0,1g), sulfato de mangânes (0,005g)
e os sais de amônia testados em substituição ao
citrato de amônio, sendo eles: sulfato de ferro
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amônio utilizado (2g), no teste 1, carnonato de
amônio (2g), usado no teste 2 e ácetato de
amônio (2g) no teste 3, e ágar 15g, sendo
todos esses reagente dissolvidos am água
destilada (valores para 1000 ml) e
posteriormente autoclavado durante 15
minutos a 1 atmosfera de pressão e depois
vertido em placas de petri 90x50mm em
cabine de segurança biológica.
Com o meio solidificado, foi plaqueado
100µl de diluições seriadas (10-1, 10-2, 10-3,
104 e 10-5) preparadas apartir do fermentado
lácteo comercial com água destilada estéreo, e
em seguida as amostras foram incubadas sob
condições de microaerofilia a 30°C por 48
horas.
Procedendo após o crescimento das
colônias obtidas no meio MRS modificado,
análises morfo-tintoriais pelo método de
Gram, assim como o teste bioquímico da
catalase, que são testes que caracterizam de
forma sugestiva o gênero Lactobacillus spp.
resíduo de ácido oléico, que possui uma longa
cadeia carbônica e uma insaturação no carbono
09 (NELSON, D,L,; COX, M, M, 2011;
NASCIMENTO, A.E.; SHARIÁ, A.E.N.;
LIMA, M.A.B. TAKAKI, G.M.C, 2000), que
o torna um agente mais surfactante que o
Tween 20, sendo necessário aumentar a
quantidade deste na composição do meio.
O citrato de amônio possui o ânio
amônio, que é dissociado em solução aquosa,
sendo o agente inibitório do crescimento de
outros microrganismos (ACUMEDIA, 2011).
Possibilitando como alternativa ao citrato de
amônio a utilização os sais de amônio como o
acetato de amônio, carbonato de amônio e
sulfato de ferro e amônio como agentes
inibidores e seletivos para Lactobacillus spp,
uma vez que também dissociam o íon NH4 em
meio aquoso.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na composição descrita por Rogosa
(1960) (valores para 1000 mL), os reagentes
que compõem o meio MRS são: extrato de
carne (10g), extrato de levedura (5g) e peptona
(10g), que são fontes de carbono, nitrogênio e
vitaminas
usadas para
satisfazer
as
necessidades dos Lactobacillus spp. Sendo a
dextrose (20g) o carboidrato a ser fermentado.
O acetato de sódio (2g) e citrato de amônio
(2g) são agentes inibidores e seletivos para
Lactobacillus spp. O sulfato de magnésio
(0,1g) e sulfato de manganês (0,05g) são
fornecedores de cátions utilizados no
metabolismo. O fosfato de potássio
monobásico (2g) é o agente tamponante
responsável por equilibrar o pH, e o Tween 80
(1mL) é um agente surfactante que facilita a
captura dos nutrientes pelos Lactobacillus spp.
Sendo o ágar (15g) o agente de solidificação.
Apresentando as colônias de Lactobacillus spp
com características de tamanho grandes e de
cor branca (J. C. De MAN; M. ROGOSA, M.;
ELISABETH SHARPE, 1960).
Nas modificações do meio MRS,
observou se que o Tween 20 é menos apolar
que o Tween 80, pois não apresenta um
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Figura 1. Lactobacillus spp.
Figura 2. Catalase negativo
No meio MRS descrito por Rogosa, a
presença de carne é um suplemento que atende
a necessidade de Lactobacillus spp com
exigência nutricional grande, e sua ausência
nas modificações propostas pode tornar o meio
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menos enriquecido e, por tanto, não apresentar
resultados satisfatórios para o isolamento de
Lactobacillus
spp
muito
exigentes
nutricionalmente.
No teste 1, os Lactobacillus casei
provenientes de fermentados lácteos foram
isolados com sucesso, crescendo inúmeras
colônias brancas de crescimento lento, gram
positivas e catalase negativas. A modificação
no meio de cultura a ser testado foi a adição de
Fe(NH4)2(SO4)2 (2g) e tween 20 (2mL) ao
invés de C6H14N2O7 e tween 80.
Figura 5. Teste 3
CONCLUSÃO
As modificações propostas nos teste 02
e 03 foram as que apresentaram os melhores
resultados para o cultivo de Lactobacillus
casei
e
possivelmente
para
outros
microrganismos desse gênero.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Figura 3. Teste 1
No teste 2, os Lactobacillus casei
provenientes de fermentados lácteos foram
isolados com sucesso, crescendo colônias
brancas de crescimento rápido, gram positivas
e catalase negativas. Onde a modificação no
meio de cultura a ser testado foi a adição de
CH3COONH4 (2g) e tween 20 (2mL) ao invés
de C6H14N2O7 e tween 80.
ACUMEDIA, Lactobacilli MRS Agar
(7543), PI 7543, Rev. 4, março de 2011
PELCZAR; M.J.; CHAN; E.C.S; KRIEG,
N.R., Microbiologia: Conceitos e aplicações,
2°Ed, volume 2, editora Pearson, INBS 97885-346-0454-3, 1997
TAVARES;
J.C,
Microbiologia
e
Farmácologia Simplificada, Rio de Janeiro,
Editora Revinter, 2002
CARLI; E;M;,Utilização de Lactobacillus
paracasei como probiótico para controle de
salmonella spp em frango de corte,
Universidade federal de Santa Maria,
Disertação de mestrado, 2006
Figura 4. Teste 2
No teste 3 os Lactobacillus casei
provenientes de fermentados lácteos foram
isolados apresentaram características idênticas
aos crescidos no teste 2. Sendo as
modificações propostas nesse meio de cultura
a adição de (NH4)2CO3 (2g)e tween 20 (2mL)
ao invés de C6H14N2O7 e tween 80.
Ciência Equatorial, Volume 1 - Número 2 - 2º Semestre 2011
J. C. De MAN; M. ROGOSA, M.;
ELISABETH SHARPE., A medium for the
cultivayion of Lactobacilli, Journal of
Applied Microbiology, Volume 23, Issue 1,
pages 130–135, April 1960
NASCIMENTO, A.E.; SHARIÁ, A.E.N.;
LIMA, M.A.B. TAKAKI, G.M.C, A
Cytochemical Study of Acid Carbohydrates on
The Surface of Candida lypolytica Grown in
Página 4
Tween 80 Containing Medium, Brazilian
Journal of Microbiology, 2000
NELSON, D,L,; COX, M, M, Princípios de
Bioquímica de Lehninger, 5° Edição, Porto
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OLIVEIRA, S.S.; BARBOSA, T.C.F.,
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Noticias e Artigos, Acervo CISPRE, 2007
SOUZA, C.A.I.; SCARCELLI, E., Agressão
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Artigo de Revisão, Arq. Inst. Biol., São
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PANCHENIAK, E; F;R; Isolamento, seleção,
caracterização bioquímica e molecular para
produção e avaliação do potencial
probiótico de Lactobacillus reuteri LPB P01001 em suínos, Universidade Federal do
Paraná, Tese de doutorado, 2005
KOOLMAN, J; RÖHM, K-H., Bioquímica:
Textos e Atlas, 3°Ed, Editora Artmed, INBS
978-85-363-0290-4, 2005
SANTOS; K;O;, EGITO; A; S; BOMFIM; M;
A; BENEVIDES; S; D, Produção de queijo s
probióticos para agregação de valor ao leite
caprino, Embrapa Caprinos e Ovinos, Ceará,
2008.
_____________________________________
1 – Anderson Luiz Pena da Costa, Acadêmico do Curso
de Bacharelado em Ciências Biológicas da UNIFAP.
2 – Rhoanny Gizela Uchoa Brito, Acadêmica do Curso
de Bacharelado em Ciências Farmacêuticas da
UNIFAP.
3 – Larissa Paula Jardim de Lima Barbosa, BSc,
Bióloga / Especialista
Real Biológica Ltda.
4 – Prof. Flávio Henrique Ferreira Barbosa, PhD
Biólogo / Professor Adjunto I
Colegiado Ciências Farmacêuticas
Universidade Federal do Amapá – UNIFAP
[email protected]
Ciência Equatorial, Volume 1 - Número 2 - 2º Semestre 2011
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