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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA UNOESC
VICE-REITORIA ACADÊMICA
NÚCLEO BIOTECNOLÓGICO
MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIA E BIOTECNOLOGIA
GISLAINE APARECIDA DENARDI BIASIOLO
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E SELEÇÃO DE BACTÉRIAS
PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL DE VIDEIRA (Vitis sp.)
Videira
2015
GISLAINE APARECIDA DENARDI BIASIOLO
Bióloga
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E SELEÇÃO DE BACTÉRIAS
PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL DE VIDEIRA (Vitis sp.)
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação Mestrado Acadêmico em
Ciência e Biotecnologia da Universidade
do Oeste de Santa Catarina como
requisito para obtenção do título de
Mestre em Ciência e Biotecnologia: Área
de
concentração:
Biotecnologia
Ambiental.
Orientadora: Drª. Sabrina Pinto Salamoni
Coorientador: Dr. João Peterson Pereira Gardin
Videira
2015
Ficha Catalográfica
B579i Biasiolo, Gislaine Aparecida Denardi
Isolamento, caracterização e seleção de bactérias promotoras de
crescimento vegetal de videira (Vitis sp.) Gislaine Aparecida Denardi
Biasiolo – 2015.
92f. : ils. figs, tabs.
Orientadora: Profa. Dra. Sabrina Pinto Salamoni.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Biotecnologia) – Programa
de Pós-Graduação Mestrado Acadêmico em Ciência e Biotecnologia,
Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus Videira –
UNOESC, 2015.
Inclui índice de figuras e tabelas.
1. Bactérias. 2. Crescimento de Videira. 3. Bioprospeção. 4. Vitis.
sp. I. Título. II. Autor. III Orientador.
CDD: 579
Vanessa Pereira – CRB: 14/1446
GISLAINE APARECIDA DENARDI BIASIOLO
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E SELEÇÃO DE BACTÉRIAS
PROMOTORAS DE CRESCIMENTO VEGETAL DE VIDEIRA (Vitis sp.)
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação Mestrado Acadêmico em
Ciência e Biotecnologia da Universidade
do Oeste de Santa Catarina como
requisito para obtenção do título de
Mestre em Ciência e Biotecnologia: Área
de
concentração:
Biotecnologia
Ambiental.
APROVADA: 01 de dezembro de 2015
BANCA EXAMINADORA
_______________________________
_____________________________
Drª. Elisandra Minotto
Dr. Edson Luiz De Souza
Docente / Unoesc
Docente / Unoesc
______________________________
_____________________________
Dr. André Luiz kulkamp de Souza
Dr. João Peterson Pereira Gardin
Engenheiro Agrônomo / Epagri
Coorientador
_______________________________
Drª. Sabrina Pinto Salamoni
Orientadora
Videira, 01 de dezembro de 2015
DEDICO
A minha linda e amada filha Dankieli Denardi Biasiolo
pela alegria que traz para minha vida.
Ao meu marido e companheiro Aldair Biasiolo
pela paciência e amor em todos os momentos.
Eu amo Vocês!
OFEREÇO
Aos meus pais Waldemar Denardi (in memoriam) e Neiva Salete Belotto Denardi
pelo exemplo de vida e por todo o amor e carinho dedica sempre em todos os
momentos.
A minhas irmãs Juciléia Denardi e Indiara Denardi Perazoli pelo carinho e apoio
estando presentes em todos os momentos da minha vida, permitindo sempre que
meus sonhos se tornem realidade.
Aos meus cunhados Heriberto Gati e Ricardo Perazoli pelo apoio e incentivo,
incondicionais, em todos os momentos da minha vida.
Vocês sempre estarão em meu coração!
AGRADECIMENTOS
“O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na intensidade com
que acontecem”. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e
pessoas incomparáveis. (Fernando Pessoa). E por esse grande apoio, os meus
sinceros agradecimentos:
À Deus, pela minha vida, por iluminar meus caminhos e que me permitiu mais está
conquista em minha vida.
À minha orientadora Drª: Sabrina Pinto Salamoni, pela excelente orientação,
dedicação, compreensão, amizade, e incentivo, ao longo destes anos.
Ao Dr. João Peterson Pereira Gardin pela fundamental co-orientação, dedicação,
tranquilidade, amizade e apoio durante o desenvolvimento da pesquisa.
Aos demais professores que de alguma forma contribuíram para o desenvolvimento
da pesquisa e para minha formação profissional.
Ao meu amigo Daniel Kucmanski, pela colaboração, em diversas etapas do
desenvolvimento deste trabalho.
Aos amigos de laboratório de Microbiologia, do Núcleo Biotecnológico da
Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus Videira.
À universidade do meio oeste catarinense – UNOESC, pela oportunidade concedida
e por fornecer estrutura para realização deste trabalho.
Ao programa de pós-graduação – Mestrado em ciência e Biotecnologia representado
pala Drª: Jane Mary Lafayette Neves Gelinski e pelo Dr. César Milton Baratto, pela
colaboração, convivência e incentivo na condução do trabalho.
Aos técnicos e funcionários da Epagri de Videira pelo carinho e por sempre estarem
dispostos a ajudar.
À Epagri pela infraestrutura oferecida para o desenvolvimento dos experimentos de
casa de vegetação.
Á Fapesc (Fundação de Amparo à Pesquisa e Inovação do Estado de Santa
Catarina) e ao CNPQ (Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e
Tecnológico) pelo apoio financeiro.
Aos meus amigos de pós-graduação pelos momentos alegres que vivenciamos.
À todos que não foram mencionados, mas que contribuíram de maneira direta ou
indiretamente para que esse sonho se tornasse realidade.
À todos minha sincera gratidão.
CADA AVANÇO DA CIÊNCIA DEPENDE DE UMA NOVA OUSADIA DA
IMAGINAÇÃO.
(Walther Waeny)
RESUMO
Isolamento, caracterização e seleção de bactérias promotoras de crescimento
vegetal de videira (vitis sp.)
As bactérias promotoras de crescimento em plantas (BPCP) colonizam a
rizosfera e os tecidos das plantas e atuam tanto pelo controle biológico de
fitopatógenos como diretamente pela promoção de crescimento, aumentando a
produtividade e diminuindo a necessidade de utilização de produtos químicos
fertilizantes e fungicidas. O trabalho teve por objetivo a bioprospecção de bactérias
como agentes promotores de crescimento vegetal e biocontrole de patógenos,
visando à formulação de um bioproduto. Foram isolados microrganismos
provenientes de amostras de solo, em diferentes propriedades da Região do Meio
Oeste de Santa Catarina. Após, avaliados quanto à produção de sideróforos,
solubilização de fosfato, produção de ácido-indol-acético, fixação assimbiótica de
nitrogênio atmosférico, produção de celulase. Cinco bactérias foram selecionadas e
adicionadas ao substrato para avaliar o efeito sobre o crescimento da videira em
casa de vegetação. O delineamento experimental constitui-se de seis Tratamentos
(25 plantas por tratamento) T1 controle; T2 Bactéria C12; T3 Bactéria O7; T4
Bactéria B3; T5 Bactéria I3; T6 Bactérias 2, 3, 4 e 5 (mix), com 5 repetições.
Portanto uma suspensão contendo 1,8 X 108 UFC/mL foi adicionada ao substrato
das estacas enraizadas de porta-enxertos de videira da variedade Paulsen 1103. O
ensaio foi conduzido durante sessenta dias e verificou-se em intervalos regulares a
concentração de clorofila foliar, comprimento do ramo, número de folhas. Ao final do
experimento foi verificada a biomassa fresca e a biomassa seca. No total foram
isoladas 46 bactérias. Destas, todas produziram ácido-indol-acético, 65,21%
produziram sideróforos, 63,04% solubilizaram fosfato, 30,43% fixaram nitrogênio,
34,78% produziram celulase e 8,67% apresentaram atividade contra o Fusarium
oxysporum. Para os parâmetros avaliados no experimento “in vivo”, foram
observadas diferenças estatísticas significativas no comprimento do ramo, embora
houve uma tendência de aumento no número de folhas e na massa fresca e seca,
estás não foram significativas. O comprimento médio do ramo variou de 58,2 cm a
76,7 cm demonstrando um aumento até o 31º dia seguido de redução. O tratamento
2 diferiu significativamente do tratamento controle e dos demais em relação ao
comprimento do ramo, apresentando média superior de 76 cm, sob as condições de
estufa demonstrou potencial para desenvolvimento da parte aérea. A clorofila variou
de 22,1 a 26,9, sendo que os valores mais elevados foram observados após 14 dias
partir, primeira determinação. A massa fresca média das plantas variou de 39,5 g a
47,5 g e a massa seca média variou de 12,6 g a 15,7 g, conforme tratamento. O
número médio de folhas por tratamento variou de 27,1 a 30,8. Os resultados das
avaliações demonstram o potencial biotecnológico das bactérias como agentes de
promoção do crescimento vegetal, sendo uma alternativa para elaboração de um
bioproduto e a redução de insumos agrícolas.
Palavras-chaves: Bactéria. Promoção crescimento vegetal. Bioprospecção. Vitis.sp.
ABSTRACT
Isolation, characterization and selection of plant growth promoting of Bacteria
(Vitis sp.)
The growth promoting bacteria in plants (BPCP) colonizing the rhizosphere of plants
and tissues and act both the biological control of plant pathogens as directly by
promoting growth, increasing productivity and reducing the need for use of chemical
fungicides and fertilizers. The study aimed to bioprospecting of bacteria as agents of
plant growth and biocontrol of pathogens, aimed at formulating a byproduct.
Microorganisms were isolated from soil samples at different properties of the Midwest
Region of Santa Catarina. After evaluated for the production of siderophores,
phosphate solubilization, production-indole acetic acid, assimbiótica fixation of
atmospheric nitrogen, cellulase production. Five bacteria were selected and added to
the substrate to evaluate the effect on the growth of the vine in the greenhouse. The
experiment consisted of six treatments (25 plants per treatment) T1 control; T2
Bacteria C12; T3 Bacteria O7; T4 Bacteria B3; Bacteria T5 I3; T6 Bacteria 2, 3, 4 and
5 (mix) with 5 replications. Therefore a suspension containing 1.8 X 108 CFU / ml
was added to the substrate of rooted cuttings of grapevine rootstocks variety Paulsen
1103. The test was conducted for sixty days and checked at regular intervals the
concentration of chlorophyll, shoot length, number of leaves. At the end of the
experiment the fresh biomass and dry biomass was found. A total of 46 isolated
bacteria. Of these, all produced-indole acetic acid, 65.21% produced siderophores,
63.04% solubilized phosphate, 30.43% fixed nitrogen, 34.78% and 8.67% cellulase
produced showed activity against Fusarium oxysporum. For the parameters used in
the experiment "in vivo", statistically significant differences were observed in shoot
length, although there was an increasing trend in the number of leaves and fresh and
dry weight, it was not significant. The average length of the branch ranged from 58.2
cm to 76.7 cm demonstrating an increase until day 31 followed by reduction.
Treatment 2 differed significantly from the control treatment and the other in relation
to the branch length, with higher average of 76 cm, under greenhouse conditions
showed potential for the shoot development. Chlorophyll the ranged from 22.1 26.9,
with the highest values were observed after 14 days from, the first determination. The
average fresh mass of plants ranged from 39.5 g to 47.5 g and average dry matter
ranged from 12.6 g to 15.7 g as treatment. The average number of leaves per
treatment ranged from 27.1 to 30.8. Evaluation results show the biotechnological
potential of bacteria as agents promoting plant growth, being an alternative to
drawing up a byproduct and the reduction of agricultural inputs.
Keywords: Bacteria. Promoting plant growth. Bioprospecting. Vitis.sp.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1:
Mapa indicando localização dos municípios de Videira e Tangará. ..... 42
FIGURA 2:
Vista do parreiral na área de coleta no sítio Irakitan, em Tangará-SC. 43
FIGURA 3:
Plantas de Vitis em desenvolvimento em casa de vegetação, sob as
mesmas condições climáticas. .................................................................................. 49
FIGURA 4:
Ensaio de solubilização de fosfato em meio sólido. A = Isolados C11;
I2; N3; e J6; B = C33; C12, são positivas para solubilização de fosfato; B2 é negativo
para solubilização de fosfato. .................................................................................... 55
FIGURA 5:
Leitura do ensaio de produção de sideróforos (A) Isolado A7 (B)
Isolado J4...... ............................................................................................................ 57
FIGURA 6:
Diâmetro do halo de produção de sideróforos. .................................... 58
FIGURA 7:
Curva de crescimento dos ramos de porta-enxertos de videira em casa
de vegetação. ............................................................................................................ 64
FIGURA 8:
Curva do índice de clorofila (IRC) de porta-enxertos de videira em casa
de vegetação. ............................................................................................................ 65
FIGURA 9:
Curva da produção do número de folhas de videira em casa de
vegetação..... ............................................................................................................. 67
FIGURA 10: Média total da biomassa de Vitis sp. após 60 dias de experimento
submetido a diferentes tratamentos; A = Massa Fresca; B = Massa seca. ............... 69
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Concentração média dos nutrientes minerais na matéria seca suficiente
para um adequado desenvolvimento das plantas. .................................................... 24
TABELA 2 - Amostras de solo de diferentes cultivares. .......................................... 43
TABELA 3 - Perfil das bactéria em relação ao gram. .............................................. 52
TABELA 4 - Perfil dos isolados frente aos ensaios in vitro da atividade enzimática,
fisiológica e antifúngica. ............................................................................................ 53
TABELA 5 - Média do Diâmetro do halo de produção de sideróforos das bactérias
isoladas a partir de amostras de solo. ....................................................................... 57
TABELA 6 - Média da produção de ácido-Indol-acético (mg/mL-1) pelos isolados
bacterianos após cultivo com meio suplementado com L triptofano. ........................ 59
TABELA 7 - Bactérias que apresentaram atividade fisiológica quanto a fixação de
nitrogênio................................................................................................................... 60
TABELA 8 - Capacidade
das
bactérias
Isoladas
em
produzir
celulase
e
antagonismo ao fungo Fusarium oxysporum............................................................. 61
TABELA 9 - Média do número de folhas, comprimento do ramo, índice de clorofila,
nos diferentes tratamentos em Vitis sp. .................................................................... 63
TABELA 10 -Média geral do comprimento do ramo, índice de clorofila e número e
folhas a partir do primeiro dia após a inoculação das bactérias com Vitis sp. ........... 64
TABELA 11 -Média da massa seca (mg)e massa fresca (mg) da raiz, folha e ramo
nos diferentes tratamentos, após 60 dias do experimento. ....................................... 68
TABELA 12 -Percentual médio de carbono, hidrogênio, nitrogênio e enxofre na
biomassa vegetal submetida a diferentes
tratamentos, após 60 dias de
experimento............................................................................................................... 70
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 19
2.1 PANORAMA DA VITICULTURA ......................................................................... 19
2.2 CRESCIMENTO VEGETAL X CULTIVO DA VIDEIRA ....................................... 23
2.2.1 Nutrição da videira – Macronutrientes e Micronutrientes........................... 23
2.2.2 Fitormônios..................................................................................................... 27
2.2.3 Fatores biológicos ......................................................................................... 29
2.3 BACTÉRIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO EM PLANTAS (BPCP)... .... 31
2.3.1 Habilidade de disponibilizar fosfato ............................................................. 33
2.3.2 Produção de Sideróforos ............................................................................... 34
2.3.3 Produção de Fitormônios .............................................................................. 35
2.3.4 Bactérias Fixadoras de Nitrogênio ............................................................... 36
2.3.5 Atividade Antimicrobiana .............................................................................. 37
2.4 IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS ........................................................ 39
2.4.1 Caracterização Genotípica das Bactérias .................................................... 39
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 42
3.1 ÁREA DE COLETA ............................................................................................. 42
3.2 OBTENÇÃO DOS MATERIAIS BIOLÓGICOS .................................................... 43
3.2.1 Isolamentos de microrganismos de amostras da rizosfera ....................... 43
3.3 ENSAIOS IN VITRO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA, FISIOLÓGICA E ANTIFÚNGICA.. ................................................................................................................ 44
3.3.1 Solubilização de fosfatos inorgânicos (Ca3(PO4)2) ...................................... 44
3.3.2 Produção de Sideróforos ............................................................................... 45
3.3.3 Produção de Ácido Indol Acético (AIA) ........................................................ 45
3.3.4 Capacidade das bactérias em fixar nitrogênio ............................................ 46
3.3.5 Produção de celulase..................................................................................... 46
3.3.6 Avaliação do potencial de biocontrole a Fusarium oxysporum ................. 47
3.4 ENSAIOS EM CASA DE VEGETAÇÃO DE PROMOTORES DE CRESCIMENTO
DE PLANTAS ............................................................................................................ 47
3.4.1 Ensaios in vivo de Promoção de Crescimento de Plantas ......................... 47
3.5 IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS ................................................................... 50
3.5.1 Extração Molecular de DNA........................................................................... 50
3.5.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ...................................................... 51
3.5.3 Análise estatística .......................................................................................... 51
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 52
4.1 AVALIAÇÃO DOS MATERIAIS BIOLÓGICOS OBTIDOS................................... 52
4.2 AVALIAÇÃO DOS ENSAIOS EM CASA DE VEGETAÇÃO DE POTENCIAIS
PROMOTORES DE CRESCIMENTO VEGETAL ...................................................... 62
4.3 ANALISE DE SEQUENCIAMENTO DO GENE rpoB DAS BACTÉRIAS ............. 72
5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 74
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 75
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 76
ANEXOS ................................................................................................................... 87
16
1 INTRODUÇÃO
O Brasil é considerado atualmente um país promissor para o cultivo de uvas
destinadas a produção de vinhos, especialmente produzidos na Região Sul. Os
vinhos catarinenses apresentam uma melhor maturação fenólica, devido à grande
amplitude térmica e ao clima subtropical.
A viticultura representa uma atividade de grande importância econômica para
o país. Favorecendo tanto a sustentabilidade da pequena propriedade, bem como a
geração de emprego em empreendimentos que produzem uvas (MELLO, 2012). A
produção de uva segundo IBGE, em 2015, na Região Sul foi de 1.025.536
toneladas, representando um aumento de 6,74% em relação ao ano anterior. Da
produção nacional, 53,11% é destinada ao consumo “in natura” e 46,89% é
processada para produção de vinhos, sucos e derivados, portanto, percebemos que
existe um potencial para aumentar a produção. (MELLO, 2014).
O Brasil, segundo Mello (2014), no ano de 2012, é o 19° país em área
cultivada, o 12º em produção de uvas, e o 13º em produção de vinhos. Atualmente o
Brasil exporta vinhos para 22 países, dentre os principais destacamos Estados
Unidos, Paraguai, Alemanha, Colômbia e China. No panorama mundial, Santa
Catarina tem demonstrado grande potencial na produção de vinhos tanto em alta
qualidade, como sabor e aroma característicos da região.
Durante o ciclo de produção da cultura fatores químico, físicos e biológicos
interferem na qualidade e produtividade da uva. Ocasionando grandes perdas
econômicas inviabilizando a cultura.
A nutrição mineral da videira influência de forma direta na qualidade da uva. A
carência ou excesso nutricional provocam alterações químicas no metabolismo da
cultura, envolvendo a maturação, formação das proteínas, concentração de acidez e
de açúcares, acarretando em perdas na qualidade dos frutos e, consequentemente
no aroma do vinho. (ALBUQUERQUE, 1996; DOMINGOS; LIMA; BRACCINI, 2015).
Para obter maior produtividade os agricultores tornam-se dependentes de
fontes químicas de nitrogênio e fósforo, tornando a produção onerosa e
17
consequentemente esgotando os recursos naturais não renováveis, como petróleo e
gás natural, utilizados na produção destes fertilizantes. (GUPTA et al., 2015).
O uso indiscriminado de fertilizantes como nitrogênio e fósforo durante o
cultivo, em longo prazo, ocasiona a diminuição do pH, o que interfere na microbiota
da rizosfera e os torna indisponível para a planta, além de acarretar a poluição do
solo, do ar e da água diminuindo a produtividade (GUPTA et al., 2015). Fatores
físicos como o solo, clima e elementos topográficos (grau de inclinação, erosão e
drenagem do solo), exercem uma influência significativa sobre os processos
fisiológicos da videira. Fazendo parte do terroir, o solo é o componente mais
importante para viticultura, onde está presente o sistema radicular e inúmeros
metabólitos são produzidos influenciando o desenvolvimento da vinha e, a qualidade
do vinho. (FRAGA et al., 2014).
Além das características de solo comentadas anteriormente, Zarraonaindia et
al. (2015), estudaram a influência de comunidades bacterianas agregadas a
rizosfera da videira as quais influenciam as propriedades organolépticas do vinho e
consequentemente na formação de um terroir regional. As rizobactérias promotoras
de crescimento em plantas colonizam a rizosfera e os tecidos das plantas, e atuam
tanto pelo controle biológico de doenças, como diretamente pela promoção de
crescimento, aumentando a produtividade e desenvolvimento das plantas.
(MARIANO et al., 2004). Estes microrganismos podem produzir uma ampla gama de
metabólitos auxiliares que incluem aleloquímicos, sideróforos, antibióticos, enzimas,
fosfatos, fitormônios e outros, diminuindo a necessidade de utilização de produtos
químicos fertilizantes e fungicidas (ADESEMOYE; TORBERT e KLOEPPER, 2008).
Metabólitos secundários envolvidos no biocontrole são conhecidos por
conferir a bactéria produtora uma vantagem competitiva e seletiva contra outros
organismos, contribuindo para a colonização da planta. (COMPANT et al., 2010).
Segundo Haas e Défago (2005), algumas bactérias podem secretar um ou mais
metabólitos/aleloquímicos garantindo a elas uma maior competitividade com a
microbiota natural da rizosfera e rizoplano.
A rizosfera é o local onde os exsudatos são liberados beneficiando a
propagação da microbiota, induzindo a alterações nas estruturas radiculares, e
características físico-químicas do solo (MARASCO et al., 2013), aumentando a
disponibilidade de nutrientes e água. O que constitui uma alternativa promissora
18
para diminuir o uso de insumos químicos e pesticidas artificiais na agricultura.
(RUZZI; AROCA, 2015).
O desenvolvimento de doenças fitopatogênicas do solo apresenta um fator de
difícil controle, principalmente na Região Sul, devido a baixas temperaturas e
umidade elevada. Os fitopatógenos Infectam diferentes cultivares de Vitis sp
causando o declínio e morte de videiras. Uma forma de diminuir as perdas e os
danos causados por esses fitopatógenos é o uso de microrganismos que estão,
frequentemente, envolvidos, à rápida colonização da rizosfera e a capacidade de
competir por nutrientes e consequentemente atuando no biocontrole (GARRIDO et
al., 2004). Poucos estudos têm investigado o potencial de bactérias promotoras de
crescimento associadas à videira. Por isso e devido à importância econômica da
viticultura o presente trabalho teve por objetivo a) Isolar microrganismos do solo de
videira; b) Avaliar a capacidade dos microrganismos em solubilizar fosfato
inorgânico; c) Avaliar a capacidade de produzir sideróforos, celulase e ácido indol
acético (AIA); d) Avaliar capacidade de fixar Nitrogênio; e) Avaliar a atividade
antagônica ao Fusarium oxysporum; f) Selecionar os microrganismo para os ensaios
in vivo; g) Avaliar o potencial biotecnológico como agentes promotores de
crescimento vegetal de Vitis. sp.
19
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1
PANORAMA DA VITICULTURA
A uva (Vitis sp.), um dos alimentos mais antigos da humanidade, há 6.000
anos a.C. No Brasil é introduzida na década de setenta, com o avanço nas
tecnologias de cultivo de forma mais sistemática, adquire relevância econômica
mundial, favorecendo o desenvolvimento econômico nacional (MELLO, 2012).
Segundo Protas e colaboradores (2002), os colonizadores portugueses foram
os pioneiros em trazer para o Brasil, os primeiros cultivares de uvas de origem
europeia, em meados de 1532. No século XlX, com a chegada dos imigrantes
Italianos, a vitivinicultura se consolidou com a cultivar da uva Isabel (Vitis labrusca)
de origem americana, sendo esta mais resistente as doenças e culminando na
substituição das cultivares Vitis vinifera de origem europeia. Expandindo-se
primeiramente em São Paulo depois para o Rio Grande do Sul. Atualmente a
produção de uva e vinho vem se expandindo para as regiões Nordeste (Vale do São
Francisco, Petrolina-PE), Centro Oeste (Mato Grosso) e Sudeste (estado de São
Paulo). (CAMARGO et al., 2010).
O Setor Vitivinícola brasileiro é formado por várias cadeias produtivas: uvas
finas, americanas e híbridas para mesa, uvas para elaboração de vinhos finos, de
vinhos de mesa e sucos. O melhoramento genético tem contribuído para o
desenvolvimento de cultivares de uva para diferentes finalidades e adaptadas às
condições climáticas brasileiras (CAMARGO et al., 2010).
No Brasil, as uvas comuns de mesa, como ‘Niágara Rosada’, ‘Isabel’ e
‘Niágara Branca’, são produzidas tradicionalmente na Região Sul, nos meses de
janeiro e fevereiro e representam 50% do volume comercializado de uvas “in natura”,
(CAMARGO; MAIA, 2008).
A viticultura é uma atividade que há décadas vem fazendo parte da vida das
pessoas, os produtos dela derivados além de gerar riquezas e desenvolvimento,
agregam as pessoas confraternizações, lazer e fé fazendo parte do histórico da
cultura humana (ALI et al., 2010).
20
De acordo com dados da União Brasileira de Vitivinicultura (UVIBRA), a
produção de uvas no Brasil apresenta três destinações: para o comércio “in natura”,
para a produção de sucos e para produção de vinhos. Em 2015 segundo IBGE, a
produção nacional foi de 1.502.147 toneladas, apresentando um crescimento de
4,52% em relação ao ano anterior, sendo, que 42,93% destinada ao consumo “in
natura” e 830,92 milhões de quilos, isto é 57,07%, processada para produção de
vinhos, sucos e derivados (MELLO, 2013).
Sendo uma das primeiras espécies cultivadas a uva é a fruta mais estimada
em todo o mundo. A produção mundial em 2015, segundo OIV (Organização
Internacional da Vinha e do Vinho), é de 7,573 milhões de hectares de vinhedo. A
maior concentração da produção de uvas ocorre na China com, 11.100 milhões de
quilos, seguida dos Estados Unidos com, 7.700 milhões de quilos. A Europa embora
venha reduzindo sua área e produção, de forma expressiva, o país de maior área
cultivada com videiras é à Espanha, representando 15,66% da produção mundial
(MELLO, 2012).
Devido ao grande potencial agrícola e as vantagens climáticas intrínsecas ao
território brasileiro, o plantio da uva é uma alternativa em diferentes regiões
brasileiras para diferentes consumos, visto que no Brasil algumas regiões se
destacam no cultivo de uvas de qualidade destinadas a produção de vinhos
espumantes e sucos (PEREIRA; GAMEIRO, 2008).
De acordo com dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento,
as frutas têm apresentado uma crescente importância econômica no país, tanto no
mercado interno como no internacional. As exportações de frutas frescas em 2014
foram de U$ 877,6 milhões, quase 50% maior que em 2013, que foi de U$ 634,5
milhões, apresentaram um aumento nas exportações. As projeções de produção da
uva até 2022/2023 mostram que deverá ocorrer uma expansão de produção de
1,7% de crescimento ao ano.
No Brasil, a Região Sul segundo IBGE, em 2015, destaca-se como a maior
produtora de uvas, com 1.025.536 toneladas, ainda assim, a Região Sudeste
apresenta uma produção de 157.883 toneladas, a Nordeste 315.338 toneladas,
sendo estas as mais viáveis para investimentos no aspecto produtivo da uva, pois
nos últimos anos estão entre os principais produtores nacionais (PEREIRA;
GAMEIRO, 2008; MELLO, 2013).
21
A Região Sul, é responsável por cerca de 90% de toda a produção nacional
tendo como principal destino do cultivo a produção de vinhos e sucos. De acordo
com a UVIBRA, (2015) a produção de sucos, apresentou um crescimento médio de
134,06%, no período de 2010 a 2015. O estado de Santa Catarina vem se
destacando na produção de uvas destinadas a vinhos espumantes. A produção
nacional em 2015 segundo (IBGE) foi de 69.250 toneladas, apresentando um
crescimento de 2,86% em relação a 2014. Atualmente a principal Mesorregião
produtora de uvas em Santa Catarina é o meio-oeste catarinense, localizada no Vale
do Rio do Peixe, com uma produção de 54.262 toneladas, predominando as
variedades Isabel, Niágara e Bordo (DESPLOBINS; SILVA, 2005).
O Brasil tem desenvolvido uma capacidade excepcional para a produção de
vinhos. Destacam-se as cultivares de Vitis labrusca, videiras de origem americana,
como base da vitivinicultura brasileira, principalmente a cultivar “Isabel” muito
utilizada na produção de vinho e “Niágara Branca” e “Niágara Rosada” como uvas
de mesa (MELLO, 2013).
Os cultivares da Vitis vinifera de origem europeia não se desenvolveram com
êxito devido às perdas causadas por doenças fúngicas. A partir do século XX com
desenvolvimento de fungicidas utilizados para o controle destas doenças, o cultivo
de videiras europeias ganhou expressão, sobretudo nos estados do Rio Grande do
Sul e São Paulo (IBRAVIN, 2010).
A videira, conhecida como vinha ou parreira, é uma espécie do tipo
trepadeira. Seu caule é retorcido; os ramos vergam facilmente; as folhas são
copiosas, divididas em cinco nervuras com terminações em pontas agudas; as flores
têm a tonalidade verde e o formato de é um cacho de botões; botanicamente falando
é uma inflorescência, o fruto é a uva, bagas que apresentam diferentes formas e
dimensões muito variáveis, além da coloração da casca, consistência, sabor,
perfume etc., (SANTANA, 2004).
A videira pertence ao Reino Plantae, Classe Magnoliopsida, Ordem Vitales,
Família Vitaceae, Gênero Vitis, este é composto por mais de 60 espécies, cuja
distribuição geográfica espontânea contempla os continentes Asiático, Europeu e
Americano (ALI et al., 2010; CAMARGO et al., 2010).
Encontramos várias espécies de videira descritas na Ásia e no continente
americano, mas sua ocorrência natural vai desde o Canadá até a Venezuela.
22
(SOUSA, 1996). Entre o continente Asiático e o Americano, há uma grande
diversidade genética, com espécies adaptadas a diferentes condições ambientais.
No continente europeu ocorrem apenas duas espécies, Vitis vinifera e Vitis silvestris.
Entre as espécies americanas, apenas três apresentam variedades cultivadas: Vitis
labrusca, Vitis bourquina e Muscadinea rotundifolia. Nenhuma cultivar comercial
pertence ao grupo das espécies Asiáticas (CAMARGO et al., 2010).
Segundo Myles, e colaboradores (2001) dentre as uvas europeias, ou uvas
finas, a Vitis vinifera é a espécie mais cultivada no mundo apresentando grande
número de cultivares, tanto de uvas para vinho como também de uvas de mesa e de
uvas para a produção de passas.
No Brasil encontraram-se aproximadamente 70 cultivares de uvas finas. As
principais cultivares tintas, pelo volume processado, é Cabernet Sauvignon, Merlot,
Cabernet Franc, Tannat, Ancellota, Pinot Noir e Egiodola, mais expressivas no Sul
do país, e as cultivares. Syrah e Alicante Bouschet, mais importantes na Região
Nordeste. As uvas finas brancas para processamento chegam a mais de 50
cultivares, destacando-se, no Sul, Moscato Branco, Riesling Itálico, Chardonnay,
Prosecco, Trebbiano, e Moscato Giallo, e, na região Nordeste, as cultivares Chenin
Blanc, Moscato Canelli e Itália, esta última também utilizada como uva de mesa
(CAMARGO et al., 2008).
A Vitis labrusca é a segunda em importância pela área cultivada no mundo, é
utilizada para consumo “in natura” e para a elaboração de suco de uva e vinho.
(MAIA, 2008). O cultivo de Vitis bourquina e Vitis rotundifolia está restrito a poucas
zonas de cultivo limitando-se a poucas cultivares e seu cultivo comercial tem
importância apenas no Centro-Sul dos Estados Unidos (RIZZON, 2000)
No Brasil mais de 80% da produção nacional é obtida por uvas comuns de
grande importância econômica. Mais de 40 cultivares entre labruscas, bourquinas e
híbridas interespecíficas compõem o elenco varietal brasileiro. Segundo Sousa,
(1996) as principais cultivares tintas são Isabel, Bordô, Concord, pertencentes à
espécie V. labrusca, utilizadas para a produção de vinhos e sucos; as cultivares
Jacquez, Herbemont e Cynthiana, de V. bourquina, usadas para vinho e suco; e as
híbridas interespecíficas, Couderc Tinto e Seyve Villard Tinto, também usadas para
a produção de vinhos e suco.
Entre as uvas comuns brancas, destacam-se as cultivares Niágara Branca e
23
Niágara Rosada, ambas V. labrusca, Couderc 13, Moscato Embrapa, BRS Lorena e
Seyval, do grupo das híbridas interespecíficas. As cultivares de Vitis labrusca, são
utilizadas pela indústria vitivinícola, e como uvas de mesa, especialmente a Niágara
Rosada e a Isabel (CAMARGO et al., 2010).
2.2
CRESCIMENTO VEGETAL X CULTIVO DA VIDEIRA
2.2.1 Nutrição da videira – Macronutrientes e Micronutrientes
Carbono (C), oxigênio (O) e hidrogênio (H) compõem cerca de 90% do total
de elementos presente na biomassa seca dos vegetais, sendo a nutrição mineral um
componente chave da produção da videira e influencia diretamente na produtividade
e qualidade da uva, e está diretamente ligado ao controle biológico de doenças que
acometem a videira (FRÁGUAS; CZERMAINSKI, 2001).
Além do C, O, H, elementos estruturais da matéria orgânica, as plantas
necessitam de mais treze elementos (minerais) para o seu desenvolvimento: o
nitrogênio (N), fósforo (P), potássio (K), cálcio (Ca), magnésio (Mg), enxofre (S)
considerados macro nutrientes, pois a sua concentração exigida pelas plantas é
maior, 10 a 5.000 vezes em relação aos micronutrientes. Os micronutrientes boro
(B), cloro (Cl), molibdênio (Mo), cobre (Cu), ferro (Fe), manganês (Mn) e zinco (Zn),
são necessários em pequenas quantidades em partes por milhão (ppm), (Tabela 1)
(TECCHIO et al. 2011).
Esses elementos desempenham diversas funções nas plantas, incluindo as
estruturais, enzimáticas, regulatórias e iônicas. Por exemplo, o nitrogênio e o enxofre
são fundamentais na formação das enzimas e coenzimas, o cálcio é responsável
pela abertura e fechamento dos estômatos, o magnésio participa da estrutura da
molécula de clorofila (MENDONÇA, 2010).
De acordo com Tecchio et al. (2011) com a retirada de ramos e cachos da
videira, no período da poda e da colheita, ocorre a extração natural de nutrientes,
sendo a aplicação de fertilizantes no solo essencial para a produtividade da videira
24
no próximo ciclo (FAQUIN, 2005). As perdas devido às podas e a colheita variam
entre 57% do Nitrogênio e 32% do enxofre (S) em relação à adubação anual
recomendada, representando cerca de 10% do custo de produção (ALBUQUERQUE
e DECHEN, 2000).
TABELA 1 - Concentração média dos nutrientes minerais na matéria seca suficiente para
um adequado desenvolvimento das plantas.
Classificação
Nutriente
Concentração
µ moles/ g
Macronutrientes orgânicos
Macronutrientes
C
O
H
N
K
Ca
Mg
P
S
1000
250
126
80
60
30
Cl
B
Fe
Mn
Zn
Cu
Mo
3,0
2,0
2,0
1,0
0,30
0,10
0,001
Micronutrientes
%
42
44
6
1,5
1,0
0,5
0,2
0,2
0,1
ppm
100
20
100
50
20
6
0,1
Fonte: Adaptado de EPSTEIN, E. 1975.
O nível nutricional da videira é determinado pelo vigor vegetativo do portaenxerto e está atrelado a diversas exigências nutricionais da cultivar produtora além
das características físicas, químicas e biológicas do solo (LEÃO et al., 2009).
Brunetto, et al. (2008) observou que o percentual de Nitrogênio ao longo dos
ciclos vegetativo e produtivo da videira, além de aumentar a produção de uva
proporciona vinhos de qualidade, pois a quantidade de nitrogênio nas bagas
interfere na taxa e no tempo de fermentação do mosto. Este aumenta a capacidade
da planta em armazenar carboidratos e disponibiliza-lo mais rapidamente para
translocação para as vias metabólicas da videira, (TECCHIO et al., 2011).
25
O nitrogênio é o nutriente mais exigido pela cultura da videira, sendo
essencial no início do desenvolvimento dos brotos, na floração, na formação das
bagas e no desenvolvimento dos órgãos de armazenamento (raízes, tronco e
ramos). O nitrogênio é considerado um fator limitante do crescimento vegetal.
Embora presente em grande quantidade na atmosfera, precisa ser transformado em
formas disponíveis à absorção das plantas (REINHARDT et al., 2008).
O nitrogênio é facilmente perdido por volatilização ou lixiviação e apresenta
um custo elevado para realizar o suprimento necessário a planta, especialmente nos
primeiros dias após a sua emergência. Uma relação de simbiose estabelecida entre
bactérias fixadoras de nitrogênio e a planta realiza naturalmente este processo de
fixação biológica do nitrogênio (RUFINI et al., 2011).
Devido a sua mobilidade na planta, a carência de nitrogênio leva a redução no
tamanho da planta (nanismo). As folhas mais velhas tornam-se amareladas
ocorrendo a clorose seguida de necrose (TECCHIO et al., 2011), o excesso de N
provoca um
exagerado
e prolongado crescimento vegetativo, com maior
sombreamento dificultando o amadurecimento do fruto e consequentemente bagas
mais moles e aquosas e com maior acidez, causando variações no pH do mosto, no
teor de sólidos solúveis e polifenóis totais, comprometendo a produção final
(FAQUIN, 2005).
O fósforo é um dos principais macronutrientes para o desenvolvimento dos
seres vivos.
Depois do nitrogênio é o elemento mais importante para o
desenvolvimento inicial da ramificação da raiz e resistência a doenças nas plantas. A
deficiência deste nutriente reduz severamente o seu crescimento e tamanho
(SHARMA et al., 2013).
Esse elemento é constituinte essencial de fosfolipídios, ácidos nucléicos e
participa das vias metabólicas principalmente da adenosina trifosfato (ATP).
Desempenha um importante papel no processo da fotossíntese sintetizando amido,
proporcionando à uva uma melhor maturação, acentuando o sabor e aroma. Este
macronutriente apresenta mobilidade dentro da planta constituindo cerca de 0,2% de
massa seca (INUI, 2009). Segundo Souza (1996) os vinhos mais finos são ricos em
fósforo. Embora este elemento possa ser abundante no solo, nas formas orgânicas e
inorgânicas, em comparação com outros nutrientes, este não está disponível para as
plantas nas condições naturais da rizosfera (KHAN et al., 2013).
26
Apenas 0,1% de fósforo está disponível para a planta, devido a sua fixação no
solo, em forma de complexos minerais insolúveis, sendo necessária a aplicação de
fontes fosfatadas tornando a produção onerosa, além dos danos ambientais gerados
(SHARMA et al., 2013). O fósforo é absorvido principalmente por difusão na forma
de ânions monovalente – ortofosfato H2PO4-. Na videira a maior exigência é durante
a brotação (TECCHIO et al., 2011).
Uma das alternativas para aumentar a biodisponibilidade deste elemento no
solo é realizar o controle do pH do solo (controle físico-químico) ou mesmo o
emprego de microrganismos, que aumentam a solubilidade desse elemento, e
consequentemente promovem uma maior absorção pela planta (GIOVANNINI, 1999;
INUI, 2009).
Depois do fósforo o potássio é o nutriente mais utilizado como fertilizante pela
agricultura brasileira (FAQUIN, 2005). Sua carência traz prejuízos no rendimento
final da produção, devido à formação de sementes pequenas (GLICK et al., 1999).
O potássio é um dos macronutrientes considerado importantes na nutrição da
videira, por ser utilizado em maior quantidade. Este é absorvido na forma de íon K+.
No solo encontra-se na forma de rochas insolúveis e silicato associado a minerais
primários (TECCHIO et al., 2011).
Sendo o cátion mais abundante nas células da videira, o potássio é
responsável por funções vitais como a fotossíntese, a regulação da abertura e
fechamento dos estômatos, limitando as perdas de água pela planta. Apresenta
ação enzimática como ativador de enzimas que atuam no transporte de carboidratos
para a maturação dos cachos, interferindo diretamente no aroma do vinho
(DOMINGOS et al., 2015).
Bactérias dos gêneros Acidothiobacillus, Bacillus, Burkholderia, Paenibacillus
e Pseudomonas apresentaram capacidade de solubilizar potássio através da
produção e secreção de ácidos orgânicos na rizosfera vegetal, visando diminuir o
uso de agrotóxicos (GLICK et al., 1999).
Outro elemento de grande importância e limitante ao crescimento vegetal é o
Ferro. Este elemento participa na síntese da clorofila. Nos tecidos das plantas a
quantidade de Ferro é pequena. Devido a sua imobilidade nos tecidos, percebemos
a sua deficiência nas folhas e brotos novos deixando-os amarelados (SOUZA, 1996;
TECCHIO et al., 2011).
27
O ferro para ser absorvido pelas raízes das plantas, precisa ser reduzido do
Ferro férrico (Fe3+) para ferroso (Fe2+) na rizosfera. Esta redução está relacionada
com a capacidade das raízes em efetuar a redução do pH da solução ou excretar
substâncias redutoras capazes de reduzir o Fe3+ para Fe2+ (FAQUIN, 2005; GLICK,
et al., 1999).
Na Europa a escassez de ferro nos tecidos da videira origina a clorose
calcária, sem importância para os solos brasileiros ricos em ferro, porém a sua
deficiência está associada ao pH do solo tornando insolúvel para as plantas
(SOUZA, 1996).
O enxofre é um nutriente que participa de reações bioquímicas, sendo um
elemento essencial na síntese de proteína. Na planta, se encontra na forma orgânica
(cistina, cisteína, metionina, proteínas, glicosídeos e vitaminas). No solo, o enxofre é
absorvido pelas raízes das plantas na forma oxidada de sulfato (SO42+) mas pode ser
absorvida pelos estômatos das folhas na forma SO 2 (FAQUIN, 2005; TECCHIO et
al., 2011). A carência causa queda na produção dos frutos e biomassa seca de
planta. Devido à baixa mobilidade a sua deficiência aparece nas folhas novas. As
absorções de nitrogênio e enxofre estão relacionadas, ou seja, a deficiência de um
elemento reprime a assimilação do outro (DOMINGOS et al., 2015).
.
2.2.2 Fitormônios
Responsáveis pelo crescimento e desenvolvimento vegetal, os fitormônios
são substâncias orgânicas produzidas em pequena quantidade pelos vegetais.
Atuam em diferentes órgãos das plantas: raiz, caule, folhas, flores e frutos
(MENDONÇA, 2010). Os fitormônios podem ser classificados de acordo com sua
função em de crescimento, reguladores e hormônios de resistência (MENDONÇA,
2010; YANG SUIJUAN et al., 2014).
Fitormônios como auxina, ácido-indol-3-acético (AIA), sendo o mais
abundante das plantas (GLICK et al., 1999; PEAT et al. 2012), é responsável pela
divisão, diferenciação, e a expansão das células vegetais. Estes são produzidas
principalmente na gema apical do caule e da raiz e conduzidas por toda a planta a
28
partir das células meristemáticas, promovendo o crescimento das raízes e do caule
através do alongamento das células. O efeito da auxina depende da sua
concentração, quando esta é baixa pode estimular o crescimento e quando é
elevada pode ser inibitória, interferindo na promoção do crescimento e na
germinação de sementes (MENDONÇA, 2010; SZILAGYI-ZECCHIN et al., 2014).
Segundo Ahmad et. al. (2008), o L-triptofano é um aminoácido precursor da
AIA, atuando como um fator limitante no crescimento das plantas, induzindo a
divisão celular e a embriogênese, mas quando não disponível para a planta afeta os
processos fisiológicos das plantas e consequentemente a produção.
O Etileno é sintetizado nos diferentes tecidos vegetais. A enzima 1aminociclopropano-1-ácido carboxílico (ACC) é precursora da produção de etileno
(GLICK et al., 1999). Tem por função a maturação dos frutos e senescência das
folhas e flores (MENDONÇA, 2010). Foram analisados durante três anos o
amadurecimento de bagas de Vitis vinifera L. pelo método transcricional Affymetrix
Vitis Gene Chip. Como resultado foi encontrado 19% do conjunto de genes do
núcleo das bagas estão relacionados com o metabolismo hormonal, sendo a auxina
e o etileno os principais hormônios que influenciaram o desenvolvimento das
mesmas, (BÖTTCHER et al., 2013; PEAT et al., 2012; PILATI et al., 2007).
As Giberelinas são produzidas nos tecidos jovens do caule e em sementes
em formação, atuando tanto na divisão quanto no alongamento celular do sistema
caulinar produzindo plantas altas, além da indução da germinação de sementes e
florescimento em plantas (MENDONÇA, 2010).
O ácido abscísico (ABA) é produzido nas folhas maduras e sementes, atua no
fechamento dos estômatos, favorece a síntese de reserva em sementes e pode
afetar a indução e a manutenção de dormência nas sementes e gemas de certas
espécies (MENDONÇA, 2010).
As citocininas e zeatina são produzidas nas raízes e promovem o
desenvolvimento das gemas laterais, a divisão celular e o crescimento de mudas e
transplantes (MENDONÇA, 2010; YANG et al., 2014). Alguns fatores, especialmente
o tipo, a concentração e a combinação de reguladores de crescimento, como
citocinina e a zeatina melhoram a quantidade e qualidade da produção (IVARSON
et.al., 2013).
29
As rizobactérias do gênero Azotobacter sp., Rhizobium sp., Pantoea
agglomerans, Rhodospirillum rubrum, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis e
Polymyxa paenibacillus, se destacam sendo excelentes produtoras de citocininas e
giberelinas, atuando como promotoras de crescimento (GLICK et al., 1999).
O ácido salicílico, um composto fenólico, muito importante devido às suas
diversas funções reguladoras nas plantas, participa diretamente dos níveis de
clorofila, pigmentos carotenóides e taxa fotossintética, influenciando no crescimento
das plantas (YANG SUIJUAN et al., 2014).
A utilização de microrganismos para melhorar a disponibilidade de nutrientes
vegetal é uma prática necessária para uma agricultura sustentável e tem aumentado
significativamente nas últimas décadas, resultando em uma elevação da produção
agrícola (FREITAS et al., 2011).
2.2.3 Fatores biológicos
As doenças fúngicas representam um dos maiores problemas para a
produção de uva. Nos últimos anos o número de casos de morte e declínio de
plantas de videira é grande ocasionou uma redução da área plantada e,
consequentemente redução da produtividade. Em regiões onde as condições
climáticas são favoráveis ao desenvolvimento das doenças fúngicas, os tratamentos
fitossanitários podem atingir 30% do custo de produção da uva, inviabilizando a
cultura (SONÊGO et al., 2005).
Entre as doenças que acometem a videira podemos destacar as de origem
bacteriana e fúngica. As principais espécies de fungos causadores da morte e
declínio da videira, na Região Sul, são Cylindrocarpon destructans, Fusarium
oxysporum
f.
sp.
herbemontis,
Phaeoacremonium
sp.,
Verticillium
sp.,
Botryosphaeria sp., Graphium sp., Cylindrocladium sp., sendo encontrados em
vários municípios do Rio Grande do Sul (GARRIDO et al., 2004; GARRIDO
SÔNEGO; VANDERLEI, 2004).
A fusariose é causada pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. herbemonts,
uma das principais doenças da Região Sul, foi verificada pela primeira vez no Rio
30
Grande do Sul, em 1954, no cultivar Herbemont. A doença continua ainda hoje
causando danos nos vinhedos do Rio Grande do Sul e de Santa Catarina, com a
morte de plantas, sobretudo em porta-enxertos oriundos do cruzamento de Vitis
riparia x V berlandieri e plantas de pé-franco (sem porta enxertos) (SONÊGO et al.,
2005; KUNIYUKI; AMORIM, 1997).
O Declínio da Videira vem apresentando um aumento nos últimos anos na
Região Sul. De acordo com SONÊGO et al., (2005) os principais agentes
identificados dessa moléstia no Brasil são: Eutypa lata, forma sexuada de Libertella
blepharis, encontrada em vinhedos de São Paulo e do Rio Grande do Sul;
Botryosphaeria sp., forma sexuada de Botryodiplodia theobromae, encontrada em
São Paulo e no Nordeste; Sphaeropsis sp. e Phomopsis vitícola, principalmente no
Rio Grande do Sul, os sintomas de declínio nas plantas surgem aproximadamente
de 2 a 4 anos após a infecção (KUNIYUKI; AMORIM, 1997). A doença se
desenvolve lentamente nas videiras, e consequentemente o impacto econômico é
sentido somente quando a videira atinge a fase adulta (SONÊGO et al., 2005).
O declínio da videira foi observado em Portugal, Espanha e Grécia é causada
pelo fungo Cylindrocarpon destructans. Apresenta ampla distribuição geográfica,
podendo ser encontrado em todos os continentes, presente desde a superfície até
as camadas mais profundas do solo. O Cylindrocarpon destructans acomete as
plantas jovens da videira causando um escurecimento interno do colo, redução dos
brotos jovens, murcha da parte aérea da planta e, finalmente, a morte da planta
(GARRIDO, et al., 2004).
Outro problema fitossanitário que vem se destacando é na Região Sul é a
pérola-da-terra Eurhizococcus brasiliensis (Hemiptera: Margarodidae) é um dos
principais agentes responsáveis pelo declínio da cultura da videira. Doença nativa da
Região Sul do Brasil tem dificultado o cultivo tanto pelos danos causados quanto
pela falta de controle devido a facilidade de dispersão da doença (FÁBIO; BOTTON;
DE ANDRADE, 2014). É uma cochonilha subterrânea, que se alimentam de grande
quantidade de seiva das plantas, provocando o decadência da videira, reduzindo
drasticamente a produção, causando a morte da videira. A disseminação da pérolada-terra ocorre principalmente pela Linepithema humile, espécie de formigas que se
associa aos cistos em busca dos resíduos açucarados, pois estas transportam as
ninfas eclodidas até as raízes das plantas hospedeiras (DE CÉSARO, 2008).
31
Entre as medidas preventivas de controle pode ser adotado o uso de material
vegetativo sadio, evitando a entrada do patógeno em áreas ainda não afetada, ou o
emprego de cultivares resistentes (NAVES et al., 2005). Outra alternativa é o
emprego de bioinoculantes que pode atuar de forma direta, disponibilizando
nutrientes ou hormônios, sendo que, os microrganismos podem inibir ou evitar o
crescimento de fitopatógenos a partir da secreção de enzimas e substâncias
antimicrobianas (CALVO, 2014).
Conforme Compant e colaboradores (2005) o emprego de bioinoculantes
pode contribuir de maneira significativa na produção vegetal, facilitando a
assimilação de nutrientes e proporcionando maior crescimento, qualidade e
produtividade, atuando também como um importante mecanismo de controle de
fitopatógenos. O conhecimento dos mecanismos de interação entre plantas e
microrganismos e estratégias de colonização representam um importante aspecto no
sucesso da interação (COMPANT et al., 2010).
2.3
BACTÉRIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO EM PLANTAS (BPCP)
As bactérias promotoras de crescimento em plantas (BPCP) colonizam a
rizosfera e os tecidos das plantas estabelecendo associações benéficas, atuando
direta ou indiretamente na promoção de crescimento, aumentando a produtividade e
diminuindo a necessidade de utilização de produtos químicos fertilizantes e
agroquímicos (COMPANT et al., 2013; GLICK et al., 2007; LUGTENBERG e
KAMILOVA, 2009; VACHERON et al., 2013).
Os estímulos diretos constituem aqueles que afetam o balanço de
reguladores de crescimento da planta, melhorando o estado nutricional da planta e
estimulando os mecanismos de resistência a doenças. Entre estes podemos
destacar a fixação biológica de nitrogênio, a produção de fitormônios, a síntese de
enzimas e a solubilização de fosfato. Os mecanismos indiretos por sua vez estão
relacionados à redução ou inibição da ação de microrganismos patogênicos,
incluindo a produção de antibióticos, sideróforos e enzimas extracelulares como
32
celulases e quitinases (ASGHAR et al., 2002; GLICK et al., 2007; KHALID et al.,
2004).
Bactérias do solo tem particular habilidade para crescer rapidamente e para
utilizar uma grande variedade de diferentes fontes de nutrientes. Enquanto que
muitas bactérias encontram-se dispersas no solo, algumas estão aderidas a
partículas, e interagem com as raízes.
Em virtude disso, a concentração de
bactérias nas regiões próximas as raízes, isto é, na rizosfera, é muito maior do que
na região não rizosférica (GLICK, 2012). A concentração de bactérias em solos
risosféricos pode variar de 107 a 109 UFC/g, enquanto que em solo não rizosférico a
concentração é inferior de 105 a 107 UFC/g (BAIS et al., 2006).
Segundo Viveros e colaboradores (2010) as bactérias promotoras de
crescimento podem ser classificadas como bactérias extracelulares (eBPCP) e
intracelulares (iBPCP). Os microrganismos presentes na superfície e no interior da
maior parte dos vegetais apresentam relações simbióticas com a planta hospedeira
sem causar dano, sendo as bactérias gram-positivas predominantes na rizosfera
vegetal,
principalmente
bacilos
formadores
de
esporos
por
apresentarem
capacidade de degradar biopolímeros (GIONGO et al., 2013).
As bactérias que habitam o interior da planta hospedeira são chamadas de
bactérias endofíticas, enquanto que as bactérias epifíticas crescem e vivem sobre a
superfície vegetal (região em torno da raiz). Existem algumas populações
bacterianas que apresentam a capacidade de se estabelecer entre a colonização
endofítica e epifíticas (dentro e fora do hospedeiro). Esses microrganismos
provocam alteração na composição da rizosfera levando a um aumento no
crescimento e na produtividade de diferentes culturas (FIGUEIREDO et al., 2010).
As raízes das plantas exsudam grande quantidade de nutrientes estimulando
as populações microbianas a metabolizar substâncias capazes de promover
diretamente o desenvolvimento do sistema radicular proporcionando crescimento da
planta e indiretamente a inibição a fitopatógenos por mecanismos de competição ou
a resistência sistêmica (VACHERON et al., 2013).
Muitas bactérias tem capacidade de sintetizar ácido-indol-acético que
apresenta efeito sobre o crescimento e desenvolvimento das plantas e do sistema
radicular de forma específica. As bactérias da rizosfera parecem ter maior potencial
para sintetizar e liberar AIA como metabólito secundário do que a microbiota não
33
rizosféricca devido ao rico suplemento de nutrientes dos exsudados das raízes.
Assim a produção varia grandemente entre diferentes espécies e da disponibilidade
de nutrientes (CHITRASELVI; KALIDASS; KANT, 2015)
O conhecimento das comunidades microbianas presentes na rizosfera
proporciona a descoberta de novos metabólitos e possibilita possíveis aplicações
desses microrganismos biotecnologicamente. É preciso avaliar os mecanismos de
ação desses microrganismo in vitro para selecionar as características desejadas,
como por exemplo, produção de quitinase, solubilização de fosfato, capacidade de
produzir ácido indol acético (AIA), produção de sideróforos e capacidade de
sobreviver em ambientes adversos com pouco nutriente (COMPANT et al., 2013;
FEDRIZZI, 2006).
Conforme Calvo (2014) os bioinoculantes são produtos derivados de fontes
naturais ou biológicas e quando aplicados em quantidades pequenas, estimulam um
melhor desenvolvimento da planta, através do aumento da absorção de nutrientes,
do desenvolvimento radicular, tolerância a estresse, facilitando a assimilação de
nutrientes e proporcionando maior crescimento, qualidade e produtividade. O termo
ganhou maior amplitude, como substâncias que contém microrganismos vivos que,
quando aplicados sobre a sementes, superfícies das plantas ou no solo, são
capazes de colonizar a rizosfera ou o interior dos tecidos vegetais e promover o seu
crescimento (VESSEY, 2003). Inoculantes microbianos vem demonstrando um
grande potencial não só na agricultura, mas como biorremediadores, na recuperação
de áreas degradadas.
2.3.1 Habilidade de disponibilizar fosfato
Encontrado no solo em ambas as formas orgânicas e inorgânicas o fósforo se
encontra na forma insolúvel, imóvel ou precipitado, tornando – se indisponível para
as plantas (GLICK et al., 1999).
Muitos microrganismos presentes no solo apresentam capacidade de
disponibilizar fosfato. Bactérias solubilizadoras de fosfato desempenham um papel
crucial na nutrição de fósforo por aumentar sua disponibilidade para as plantas
34
através da liberação a partir de formas orgânicas e inorgânicas via solubilização e
mineralização (RODRIGUES; FRAGA, 1999).
As plantas absorvem fosfato apenas em duas formas solúveis, a monobásica
(H2PO4) e o dibásica (HPO42-íons). As rizobactérias apresentam deferentes
mecanismos de solubilização de fosfato, como liberação de ânions, ácidos
orgânicos, prótons, íons e hidróxido da molécula mineral. A produção de enzimas
extracelulares e a liberação do fosfato durante a degradação de substrato (GLICK et
al., 1999).
A produção de ácidos pelos microrganismos torna o fosfato inorgânico,
anteriormente precipitado e “indisponível” em formas mais solúvel e assimilável pela
planta. Da mesma maneira, a produção de fosfatases hidrolisam as fontes orgânicas
(RODRIGUÉZ et al., 2000; SOBRAL, 2003). Frente à potencialidade destes
microrganismos são crescentes os estudos para aferir a capacidade de solubilização
de fósforo.
Os principais gêneros de rizobactérias solubilizadoras de fosfato utilizadas
para melhorar o rendimento e o crescimento vegetal são Arthrobacter, Bacillus,
Beijerinckia, Burkholderia, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Microbacterium
Pseudomonas, Rhizobium, Rhodococcus e Serratia (GLICK et al., 1999).
Empregadas como inoculantes, as bactérias solubilizadoras de fósforo vêm
despertando um crescente interesse do setor agrícola, pois sua utilização como
biofertilizantes propicia aumento da produtividade. A estirpe Burkholderia cepacia
tem sido utilizada como biofertilizante, promovendo crescimento nas principais
culturas de Cuba (RODRIGUEZ et al., 2000).
2.3.2 Produção de Sideróforos
Sideróforos são moléculas de baixo peso molecular (< 10 KD) quelantes de
ferro sintetizados por bactérias como Pseudomonas, Azotobacter, Bacillus,
Enterobacter, Serratia, e Azospirillum. Já foram reportados mais de 500 sideróforos
produzidos por microrganismos. Entre estes há três principais, conhecidos como
hidroxamato, catacolato e carboxalato (SAJEED, 2013).
35
Os sideróforos são moléculas orgânicas que tem função de sequestrar o Fe +3
presente no solo e torná-lo disponível para as células na forma de complexo
sideróforo
Fe+2(AHMED;
HOLMSTRÖM,
2014).
Produzidos
por
diferentes
organismos vivos, estes quelantes podem representar um fator limitante para alguns
microrganismos e vantajoso para outros, podendo torna-se um importante
mecanismo antagônico (NEILANDS, 1995; VIANA et al., 2013).
Os microrganismos aeróbicos utilizam o ferro para várias funções, como por
exemplo, a constituição do heme, a redução de oxigênio para a síntese de ATP, a
redução de precursores ribótido de DNA e muitas outras atividades metabólicas
(NEILANDS, 1995).
Os sideróforos apresentam capacidade de se ligar a outros metais além do
ferro apresentando uma variedade de propriedades, atuando como biocontrole,
biossensores e agentes de bioremediação além de promover o crescimento de
plantas, (AHMED; HOLMSTRÖM, 2014).
2.3.3 Produção de Fitormônios
O AIA é um importante fitormônio, pois estimula o alongamento das células
vegetais, modificando certas condições, como, o aumento do teor osmótica das
células, aumento na permeabilidade de água para dentro da célula, redução na
pressão da parede celular, induzindo a síntese de proteínas. Promove a inibição ou
atraso e a abscisão das folhas, induzindo a floração e frutificação (ZHAO, 2010).
Bactérias promotoras de crescimento produzem fitormônios, auxinas,
citocinas e giberelinas que promovem o crescimento das raízes e aumento do
número de pelos radiculares. O AIA pode ser sintetizado a partir de três vias
biossintéticas: duas vias dependente do triptofano, a via indole-3-acetamida (IAM) e
a via indole-3-piruvato (IpyA), e outra via que não depende do triptofano, sendo o
precursor desconhecido (RADWAN, 2004).
Em uma das vias, a enzima necessária a biossíntese da auxina é a ipdC
(indole-3-pyruvate decarboxylase-EC4.1.1.74), sendo o aminoácido L-triptofano (LTrp) o precursor fisiológico deste fitormônio em microrganismo e plantas (LEBUHN;
36
HARTMANN, 1993). Biossíntese microbiana do IAA no solo pode ser reforçada por
triptofano de exsudatos radiculares. A aplicação do fertilizante orgânico pode
aumentar os níveis de triptofano no solo e em resíduos orgânicos e os fertilizantes
podem ser produzidos por transformação microbiana aeróbia ou anaeróbia
(ARKHIPCHENKO et al., 2006).
Segundo Vacheron et al. (2013) espécies como Azospirillum brasilense
durante a colonização da rizosfera produzem óxido nítrico, um sinalizador da auxina,
2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG), hormônio responsável pelo desenvolvimento das
raízes laterais. Concentrações baixas deste hormônio levam à inferência a
resistência sistêmica.
2.3.4 Bactérias Fixadoras de Nitrogênio
O nitrogênio encontra-se em abundância na atmosfera, no entanto, a forma
assimilada pelas plantas é a forma de nitrato (NO3-), ou amônio (NH4+) (TECCHIO et
al., 2011).
Entre os principais processos responsáveis pela disponibilidade de N 2
atmosférico às culturas são a fixação industrial, fixação atmosférica e fixação
biológica (DOMINGOS et al., 2015).
A fixação industrial trata-se da obtenção de fertilizantes nitrogenados
industrialmente, a partir da molécula de N2 e a produção da amônia (NH3). O uso
deste tipo de adubação é considerado poluente e reduz a eficácia da fixação
simbiótica em leguminosas por bactérias, além de apresentar um custo elevado na
produção final (FAQUIN, 2005).
A fixação atmosférica, não depende da ação de microrganismos, são
processos naturais, como a reação de descargas elétricas com o N 2, a combustão e
o vulcanismo (DOMINGOS et al., 2015).
Conforme Reinhardt e colaboradores (2008) o processo de fixação biológica
de nitrogênio realizado pelas bactérias diazotróficas fornece uma grande quantidade
desse nutriente para as plantas. Esse processo de transformação do N 2 atmosférico
em NH3 pelas bactérias é catalisado pela enzima nitrogenase. Esse processo
37
depende da expressão de um conjunto de genes conhecidos como genes nif
(nitrogen fixation) que codifica a proteína.
As bactérias promotoras de crescimento têm habilidade de fixar nitrogênio da
atmosfera e fornecer a planta por dois mecanismos, simbiótica e não simbiótico. A
fixação simbiótica de nitrogênio é uma relação mutualística entre microrganismo e
planta. Na forma não simbiótica, a fixação é carreada por microrganismos de vida
livre, diazotróficos como pertencentes aos gêneros Azobacter, Acetobacter,
Azospirillum, Burkolderia e Enterobacter (AHMED e KIBRET, 2004; GUPTA et al.,
2015).
A Fixação Biológica do Nitrogênio (FBN) realizada por Bactérias diazotróficas
pertencentes ao gênero Bradyrhizobium, é a fonte mais viável de fixação N2
atmosférico ao solo. Diazotróficas simbióticas em contato com as raízes das plantas
formam um nódulo e a presença da enzima nitrogenase transforma o nitrogênio
(NH3) não assimilável pela planta em amônia (NH+4) disponível pela planta
(DOMINGOS et al., 2015).
Bactérias do gênero Rhizobium são reconhecidas pela capacidade de fixar
nitrogênio em leguminosas, mas segundo Souza, et al., (2015) bactéria isolada da
rizosfera de arroz Rhizobium sp. UR51a, demonstrou capacidades de produção de
ácido indol acético, de solubilizar fosfato, e fixar nitrogênio, estimulando o
crescimento, a absorção de nutrientes em plantas de arroz.
2.3.5 Atividade Antimicrobiana
Metabólitos secundários envolvidos no biocontrole são conhecidos por
conferir a bactéria produtora uma vantagem competitiva e seletiva, contra outros
organismos contribuindo para sua colonização (COMPANT et al., 2010). Segundo
Haas e Défago (2005) algumas bactérias podem secretar um ou mais metabólitos
garantindo a elas uma maior competitividade com a microbiota natural da rizosfera e
rizoplano.
Um dos mecanismos mais estudados na inibição de fitopatógenos é a
antibiose, que consiste na produção de metabólitos, como por exemplo, antibióticos
38
pelo microrganismo antagonista controlando as atividades metabólicas e o
crescimento do patógeno (SARAF et al., 2014).
Bactérias promotoras de crescimento de plantas podem atuar de forma
indireta quando diminui ou impede os efeitos deletérios de patógenos por diferentes
mecanismos (GLICK, 2012). De maneira indireta a inibição de fungo fitopatogênicos
pode ocorrer através da produção de enzimas como celulase, hemicelulose e
quitinases, o que contribui significativamente para a supressão de patógenos em
plantas (SARAF et al., 2014). Bactérias quitinolíticas apresentam características que
envolvem a lise da parede celular das células fúngicas por ação de enzimas
hidrolíticas (BERG et al., 2001).
As bactérias do gênero Bacillus sp. se destacam em relação à capacidade
para produzir celulase e são encontradas em grande quantidade no solo (GAUR;
SONI, 2015). Essas bactérias promovem o crescimento vegetal, pois colonizam as
raízes da planta atribuindo resistência a patógenos, melhora a produtividade e altera
a morfologia radicular através da exsudação de metabolitos (ZARRAONAINDIA, et
al., 2015; YANG, SUIJUAN et al., 2014).
As doenças fúngicas causadas por patógenos do solo representam perdas
econômicas reduzindo a produtividade e a qualidade dos produtos, assim o controle
biológico representa uma alternativa para minimizar as perdas e o uso de produtos
químicos como fertilizantes e fungicidas (GRIGOLETTI, 1993).
Estudos realizados sobre o mecanismo de promoção de crescimento vegetal
mediaram uma ampla compreensão das formas de supressão de doenças por esses
agentes de biocontrole (COMPANT et al., 2005). As bactérias promotoras do
crescimento secretam metabólitos, como enzimas que desempenham um importante
mecanismo no controle biológico de fitopatógenos incluindo Botrytis cinerea,
Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum,Phytophthora sp., Rhizoctonia solani e
Pythium ultimum (GLICK et al., 1999). Enzimas como a celulase são capaz de
hidrolisar diferentes tipos de açúcar como por exemplo a glicose e desperta
interesse à décadas principalmente na produção de biocatalisadores. (DE CASTRO
e PEREIRA JR., 2010).
No experimento realizado por Walker e colaboradores (2011) três estirpes de
Azospirillum foram inoculadas em duas cultivares de milho e promoveram
modificações dos metabólitos especialmente benzoxazinonas, modificando as vias
39
biossintéticas da benzoxazina nas plantas de milho. Estes compostos estão
relacionados com a defesa da planta contra fitopatógenos.
2.4
IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS
2.4.1 Caracterização Genotípica das Bactérias
A caracterização taxonômica sempre apresentou limitações quanto à
abordagem fenotípica, fisiológica e que está baseada em análises bioquímicas,
principalmente devido à alta variabilidade metabólica das diferentes espécies
(DAHLLÖF; BAILLIE; KJELLEBERG, 2000). Para corroborar com técnicas
bioquímicas clássicas, caracterização morfológica e característica fenotípicas, as
técnicas de biologia molecular têm sido amplamente utilizadas para facilitar e
aprimorar a identificação correta destes microrganismos e sua aplicação
biotecnológica (FELIS; DELLAGLIO, 2007).
A reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) é
uma das técnicas importantes da biologia molecular na atualidade, devido a sua
facilidade de execução e versatilidade de aproveitamento nas diferentes áreas do
conhecimento.
Esta técnica baseia-se na multiplicação in vitro de segmentos do material
genético, presentes em espaço intergênico do genoma bacteriano (BRUCE et al.,
1999). Obtendo a formação de várias cópias de uma região específica do DNA,
devido a utilização oligonucleotideos iniciadores de primers (MULLIS, 1990).
Segundo Jorgensen e Cluster (1989), a técnica de PCR ARDRA apresenta
grande potencialidade pela simplicidade e rapidez nas respostas de comparação
diferencial entre vários grupos filogenéticos, o que possibilita que sejam efetuadas
análises em distintos níveis de classificação.
A ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis) tem demostrado
bons resultados para a caracterização de diferentes tipos de microrganismos, sendo
40
viável em relação a custo benefício se comparada a outras técnicas para fins
similares (LAGUERRE et al., 1994).
A rDNA apresentam uteis cronômetros moleculares, altamente conservada
entre diferentes grupos de organismos. Os rDNA são raramente afetados pela
transferência horizontal de genes e apresenta regiões polimórficas que são capazes
de distinguir filogeneticamente mesmo táxons relacionados (ABREU et al., 2008).
A diferenciação de espécies ou linhagens de muitos grupos de bactérias
(CHENOLL; MACIÁN; AZNAR, 2003), é feita através da análise polimórfica de
fragmentos da região intergênica 5 S, 16S e 23S do RNA ribossomal (KLEIN et al.,
1998). E apresenta uma enorme variação, o que possibilita a sua utilização na
diferenciação de grupos bacterianos (NOUR, 1998).
Embora o gene rDNA 16s seja o marcador molecular ainda mais utilizado
para determinar a variabilidade interespecífica em relação a filogenética bacteriana,
o gene rpoB (gene codificador da sub-unidade â da RNA polimerase) vem se
destacando como marcador molecular para a distinção das variações genotípicas
entre as espécies, devido a melhor capacidade de mutação e homogeneidade nos
padrões de banda (KHAMIS; RAOULT; LA SCOLA, 2005).
De acordo com Durak et al., 2006 os genes rpoB são mais polimórficos que
os 16s rDNA, permitindo maior diferenciação entre espécies com grande similares,
sendo um método rápido para a caracterização de bacillus ssp. Devido a uma certa
limitação na sequência do gene 16s rDNA ser baixa na maioria das espécie sugerese que o rpoB proporciona maior sensibilidade na sequência do DNA. Ainda
segundo o mesmo autor as análises filogenéticas permitiram diferenciar linhagens
monofiléticas de espécies que apresentaram semelhança dentro de cada gênero.
A utilização do rpoB gene permite diferenciar facilmente espécies diferentes
dentro do mesmo gênero, sendo que isso não seria possível com utilização de
genes 16s DNA, devido à similaridade fenotípica de certas espécies, sendo uma
ferramenta alternativa para identificação de microrganismos, além de permitir
detectar sítios de mutação que confere, por exemplo resistência a determinados
antibióticos (KIM et al., 1999).
Mollet e colaboradores (1997) comparou o gene rpoB e 16s rDNA de
bactérias da família Enterobacteriaceae durante a identificação molecular e
percebeu que em 85 dos 91 microrganismos o rpoB apresentou maior resolução das
41
sequencias na distinção entre as espécies, apresentando entre 1 e 15,4 % maior
variabilidade em relação ao gene 16s rDNA em 82 microrganismos, confirmando a
sua eficiência na identificação de espécies.
42
3 MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi desenvolvida nos laboratórios do Núcleo Biotecnológico da
Universidade do Oeste de Santa Catarina e no campo experimental da Empresa de
Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Videira - SC (EPAGRI).
3.1
ÁREA DE COLETA
As amostras de solo, são provenientes de vinhedos localizados na Epagri no
município de Videira e no sítio Irakitan, interior do município de Tangará, ambos
situados no Vale do Rio do Peixe, Meio Oeste de Santa Catarina (Figura 1).
No sítio, encontra-se uma pequena propriedade de agricultura familiar, onde a
viticultura é presente por mais de 10 anos, sendo o parreiral de pequena extensão,
com aproximadamente 8.000 m2 (Figura 2).
FIGURA 1:
Mapa indicando localização dos municípios de Videira e Tangará.
43
FIGURA 2:
3.2
Vista do parreiral na área de coleta no sítio Irakitan, em Tangará-SC
OBTENÇÃO DOS MATERIAIS BIOLÓGICOS
3.2.1 Isolamentos de microrganismos de amostras da rizosfera
Para o isolamento dos microrganismo foram coletadas amostras de 3 solos,
dois provenientes de vinhedos localizados na Epagri, e um no sítio Irakitan, no
período de junho a dezembro de 2013. As bactérias provenientes do solo Bordô,
Isabel, Niágara e Isabel respectivamente B, I, N, J são provenientes do banco de
amostra da Universidade do Oeste de Santa Catarina (Tabela 2).
TABELA 2 - Amostras de solo de diferentes cultivares.
Amostras Solo
Propriedade Município Localização Geográfica
1C
Convenc. Epagri
Videira
27º02’01,8” Lat. Sul / 51º08’08,1” Lon. Oeste
2O
Orgânico Epagri
Videira
27º02’16,1” Lat. Sul / 51º07’51,9” Lon. Oeste
6A
Niágara Particular
Tangará
27º07’57,4” Lat. Sul / 51º03’56,8” Lon. Oeste
3B
Bordô
Unoesc
Videira
26°59’32,4” Lat. Sul / 51°10’34,5” Lon.Oeste
4I
Isabel
Unoesc
Videira
26°59’32,4” Lat. Sul / 51°10’34,5” Lon.Oeste
5N
Niágara Unoesc
Videira
26°59’32,4” Lat. Sul / 51°10’34,5” Lon.Oeste
7J
Isabel
Unoesc
Videira
26°59’32,4” Lat. Sul / 51°10’34,5” Lon.Oeste
1 C= solo convencional, 2 O= solo orgânico, 3 B= Bordô; 4 I= Isabel; 5 N= Niágara, 6 A= Niágara, 7
J= Isabel.
44
Em pontos aleatórios, dos vinhedos, foram coletas 500g de amostras de solo,
rizosférrico e não rizosférrico, de cada local, armazenadas em recipientes plásticos e
transportadas para o Laboratório de Microbiologia, do Núcleo Biotecnológico da
Universidade do Oeste de Santa Catarina, Campus Videira.
Para o isolamento das bactérias, 10 g de solo foram pesados e transferidos
para 90 mL de solução salina (NaCl 0,85 %), mantidas a 25ºC por 30 min, sob
agitação de 250 rpm. Após incubação foram realizadas diluições seriadas decimais
de 10-5, 10-6, 10-7 a seguir uma alíquotas de 100 uL das diluições que foram
semeadas, com auxílio de alça de Drigalsky, no meio ágar nutriente (AN). As placas
foram incubadas a temperatura de 27 ± 1°C por 24-72 horas. Após período de
incubação as colônias foram purificadas, preservadas e mantidas sob refrigeração,
contendo ágar nutriente inclinado, a temperatura de 4°C durante a realização dos
ensaios in vitro. Os mesmos isolados foram preservados em tubos criogênicos de
2,0 mL contendo 20% de glicerol em freezer a -10 °C. Todas as bactérias foram
empregadas nos ensaios de promotores de crescimento. O delineamento
experimental dos ensaios in vitro, foram realizados em triplicata e mais o controle.
3.3
ENSAIOS IN VITRO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA, FISIOLÓGICA E ANTIFÚNGICA
3.3.1 Solubilização de fosfatos inorgânicos (Ca3(PO4)2)
Para avaliar a capacidade dos isolados em solubilizar fosfato inorgânico
utilizou-se o método descrito por Nautiyal et al. (1999) (Anexo 1). O meio obtido foi
distribuído em placas de petri.
Os isolados foram repicados pela técnica da picada em locais equidistantes,
sobre o meio de cultura, com auxílio de uma alça de platina. As placas foram
incubadas durante sete dias a temperatura entre 28 e 30°C.
45
Após o período de incubação, foi observada a presença ou ausência de halo
de solubilização. Foram considerados positivos os isolados que apresentaram halos
transparentes ao redor da colônia.
3.3.2 Produção de Sideróforos
Os ensaios foram realizados em meio King B, (KING et al., 1954) (Anexo 2),
adicionado ao meio a solução indicadora de cromo azurol (CAS) (Anexo 3). Segundo
a metodologia descrita por Schwyn e Neilands (1987), adaptado por Cattelan (1999).
Os isolados foram cultivados em tubos de ensaio contendo 5 mL de meio King
B, mantidos por 24h à 30°C sob agitação constante. Uma alíquota de 100 µL foi
transferida para placas contendo o mesmo meio. As placas foram incubadas a 30°C
por 72 horas. A presença de halos amarelo/laranja ao redor das colônias representa
resultado positivo para produção de sideróforos. O cálculo do Halo de produção de
sideróforos foi adaptado de Berraquero et al. (1976), a partir da soma do diâmetro do
halo (mm) e do diâmetro das colônias (mm), temos o Halo total de produção.
3.3.3 Produção de Ácido Indol Acético (AIA)
Cada isolado de bactérias foi cultivado em tubos de ensaio com 3 mL de meio
King B (Anexo 2) suplementado com 5 mM de L-triptofano, segundo metodologia de
Bric et al. (1999), adaptado por Cattelan (1999) e incubados no escuro a
temperatura de 30°C, sob agitação constante de 150 rpm (rotação por minuto)
durante 48h.
Uma alíquota de 2 mL da cultura foi centrifugada a 2000 rpm durante 10 min,
1mL do sobrenadante foi transferido para um novo tubo e, acrescentado a este, 1mL
da solução Salkowski (FeCl3 0,5 mol L-1 e 49 mL de HClO4 (35%) segundo Gordon e
Werber (1951) e incubou-se por 30 minutos no escuro. A concentração de AIA foi
determinada em espectrofotômetro a 540 nm (comprimento de onda). O resultado
46
positivo foi demonstrado pela formação de uma coloração rósea. A concentração de
AIA no meio de cultura foi determinada com base em uma curva padrão de AIA (0, 5,
10, 20, 40 e 60 mg/mL-1), preparada com meio de cultura.
3.3.4 Capacidade das bactérias em fixar nitrogênio
As bactérias isoladas foram transferidas para tubo de ensaio contendo 5 mL
do meio de cultura livre de nitrogênio MLN (Anexo 4) e incubadas a 28°C, por 10
dias. Este procedimento foi repetido mais duas vezes utilizando o mesmo meio de
cultura. A reinoculação sucessiva dos isolados ocorreu para certificar-se que o
crescimento não está ocorrendo devido a reservas de nitrogênio nas células. Após
sucessivos repiques, uma alíquota 200 uL foi transferida para placas de Petri
contendo o meio ágar nutriente (AN), incubadas à 28°C por 72 horas para confirmar
a viabilidade dos isolados. Os isolados que cresceram nas placas são considerados
positivos e fixadores de nitrogênio, de acordo com Rennie (1981), adaptado por
Cattelan (1999).
3.3.5 Produção de celulase
A produção de celulase foi avaliada cultivando-se os isolados em meio
Tripticaseína de soja ágar (TSA) (Anexo 5), suplementado com 5% de carboximetil
celulose (CMC), como única fonte de carbono. Os isolados foram inoculados pela
técnica da picada, distribuídos de forma equidistantes. As placas foram incubadas
em estufa a 28°C por 72 horas. A atividade da celulase foi indicada com adição de
lugol na placa de Petri, após período de incubação. Não ocorreu a mensuração do
halo, as colônias que apresentaram halo incolor, foram consideradas positivas para
produção de celulase.
47
3.3.6 Avaliação do potencial de biocontrole a Fusarium oxysporum
Em cada placa de Petri contendo meio ágar Müeller Hinton foram inoculados
cinco isolados, separados de forma equidistante. As placas foram incubadas a
temperatura 28°C por 7 dias. Após, as colônias apresentarem crescimento, cada
placa recebeu uma sobre camada do meio de cultura ainda fundente, contendo
esporos do fitopatógeno. O volume de 1 mL de uma suspensão de esporos
contendo 106 esporos/mL foi misturado com 9 mL de meio Batata-Dextrose-Ágar
(BDA) fundente (temperatura de 45°C). A suspensão homogeneizada foi vertida
sobre as placas com o crescimento das bactérias. Após, as placas foram incubadas
a temperatura de 28°C para permitir o crescimento dos fungos fitopatogênicos por
até sete dias. Após o período de incubação foi observada a presença de halos de
inibição. Os microrganismos que formaram halo de inibição foram considerados com
atividade antifúngica contra Fusarium oxysporum.
3.4
ENSAIOS
EM
CASA
DE
VEGETAÇÃO
DE
PROMOTORES
DE
CRESCIMENTO DE PLANTAS
A partir dos resultados obtidos nos ensaios de caracterização enzimática e
fisiológica in vitro, foram selecionados microrganismos para proceder o ensaio em
casa de vegetação.
3.4.1 Ensaios in vivo de Promoção de Crescimento de Plantas
O experimento foi conduzido com estacas enraizadas de porta-enxertos de
videira da variedade Paulsen 1103. As estacas foram padronizadas e plantadas em
caixa de areia até iniciar brotamento das mesmas, após brotamento foram lavadas
em água corrente e transplantadas para vasos plásticos contendo substrato de fibra
48
de coco inerte e vermiculita, na proporção de 3 para 1, autoclavados a 121ºC, por 60
minutos). Foram mantidas em casa de vegetação aclimatizadas, a temperatura de
25°C, com umidade relativa de 75%, por um período de 30 dias. Após foram
empregados 150 vasos para o ensaio de promoção de crescimento.
Dos 46 isolados avaliados quanto à produção de sideróforos, solubilização de
fosfato, produção de ácido-indol-acético, fixação assimbiótica de nitrogênio
atmosférico, produção de celulase. Quatro isolados bacterianos foram selecionados,
o principal critério utilizado foi o potencial fisiológico e enzimático das bactérias em
produzir metabólitos que promovam o crescimento vegetal.
As bactérias selecionadas formam cultivadas separadamente em Erlenmeyers
contendo meio líquido Brain Heart Infusion (BHI), a temperatura de 28ºC, por um
período de 18 horas, sob agitação constante de 120 rpm. Decorrido o tempo de
incubação, 20 mL de uma suspensão bactéria contendo 1,8 UFC/mL de bactérias foi
transferido para os vasos contendo as estacas enraizadas.
O delineamento experimental foi constituído de 5 tratamentos e um grupo
controle: T1 controle; T2 Bactéria C12; T3 Bactéria O7; T4 Bactéria B3; T5 Bactéria
I3; T6 Bactérias C12, O7, B3 e I3 (consórcio), com 5 repetições. Para cada
tratamento foram empregados 25 vasos com uma estaca enraizada cada. Os vasos
foram distribuídos e organizados em cinco blocos, com seis tratamentos por blocos
totalizando 30 plantas por bloco. O controle constituiu de plantas sem a adição da
suspensão bacteriana, somente 20 mL de meio de cultura (Figura 3).
As plantas foram mantidas a temperatura de 25°C, com um fotoperíodo de 16
horas de luz e 8 horas de escuro, umidade relativa de 75% sendo adicionado,
semanalmente 50 mL de solução nutriente (Anexo 6) a cada vaso.
A avaliação da promoção de crescimento em Vitis foi realizada por meio dos
parâmetros: índice de clorofila foliar, comprimento do ramo, número de folhas,
biomassa fresca e seca da raiz, do ramo e das folhas, concentração de carbono,
nitrogênio, enxofre e hidrogênio.
Em intervalos regulares foi mensurado o comprimento do caule, contado o
número de folhas e determinado o índice de clorofila, na segunda folha totalmente
desenvolvida com clorofilômetro SPAD 502 da empresa Minolta. A avaliação do
número de folhas, comprimento do ramo e índice de clorofila ocorreu no 1o, 15 o, 31
o,
45 o e 59 o dia.
49
FIGURA 3: Plantas de Vitis em desenvolvimento em casa de vegetação, sob as mesmas
condições climáticas.
Fonte: O autor
50
Decorridos os 60 dias as plantas foram coletadas e a raiz, o caule e as folhas
foram separadas para determinação da massa (mg) da matéria fresca. Após estas
foram acondicionadas em sacos de papel previamente secos e pesados. Para
avaliar a massa (mg) da matéria seca, as plantas foram mantidas a 60ºC em estufa
até estabilização da massa e pesadas novamente. A massa da matéria seca e
fresca foi determinada em balança analítica.
As amostras foram maceradas e encaminhadas a EPAGRI de Caçador –SC
para análise do percentual do carbono, hidrogênio, nitrogênio e enxofre.
3.5
IDENTIFICAÇÃO DAS BACTÉRIAS
A identificação molecular foi realizada para duas bactérias, o isolado O7 que
apresentou resultados positivos em todos os ensaios in vitro e o isolado C12, que
apresentou os melhores resultados nos ensaios in vivo.
3.5.1 Extração Molecular de DNA
As bactérias foram cultivadas em caldo BHI (infuso de cérebro e coração) por
8 horas, a temperatura de 30 °C. Após este período procedeu-se a extração
conforme protocolo de (Sambrook et al., 1989). Após crescimento as amostras foram
centrifugadas por 10 minutos a 10000 rpm. O sobrenadante foi desprezado e as
células lavadas com água estéril. As células depois de centrifugadas foram
ressuspendidas em tampão, qual sendo adicionados, SDS a uma concentração final
de 1 % e lisozima a uma concentração de 0,6 %. A solução foi incubada em banho
de água a temperatura de 37 °C por uma hora. Após, foi adicionada proteinase K
(0,6 mg/mL) e a solução novamente incubada a 37 °C por mais uma hora. Um
volume de fenol foi adicionado à mistura, homogeneizado e centrifugado por 20
minutos. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e uma nova extração
com fenol: duas com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (24:24:1) e uma com
51
clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Isopropanol 0,7 volumes foi adicionado e após
16 horas a temperatura de - 20 °C, o isopropanol foi desprezado e o DNA
ressuspenso novamente em TE. Após foi realizada migração eletroforetica para
garantir a integridade do material extraído e posterior utilização na Reação em
Cadeia da Polimerase.
3.5.2 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Para a amplificação parcial do gene rpoB, foi empregado o par de
oligonucleotídeos iniciadores AAR YTI GGM CCT GAA GAA AT e TGI ART TTR
TCA TCA ACC ATG TG (DRANCOURT and et al., 2004). As condições de
amplificação foram as mesmas empregadas pelo autor. Após amplificação, o
produto foi purificado e encaminhado ao Departamento de Microbiologia da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, para sequenciamento. As sequências
obtidas foram alinhadas utilizando o programa ChromaPro 1.5 sendo a sequência
comparada com a sequência de nucleotídeos de espécies de referência obtidos
EMBL/GenBank database, usando NCBI BLAST.
3.5.3 Análise estatística
Após os experimentos em casa de vegetação, os dados formam submetidos a
análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Scott Knott
(p<0,05).
52
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1
AVALIAÇÃO DOS MATERIAIS BIOLÓGICOS OBTIDOS
A partir de sete amostras de solo, foram isoladas 46 bactérias, destas, 27
(58,6%) são Gram positivas e 19 (41,3%) Gram negativas (Tabela 3). Estes
resultados corroboram com os encontrado por Marasco e colaboradores (2013)
onde, isolaram 769 bactérias a partir de amostras de solo/planta de videiras
provenientes da Itália, Tunísia e Egito, e detectaram a prevalência de bactérias
Gram negativas (66%), sendo identificado de forma mais abundante os gêneros
Pseudomonas, Enterobacter, Pantoea, Bacillus e Arthorobacter.
TABELA 3 - Perfil das bactéria em relação ao gram.
GRAM
GRAM
GRAM
Bactéria
Bactéria
Bactéria
+
+
A10
C11
J7
+
+
A11
C12
N3
+
A12
C2
N4
+
A14
C32
N7
+
+
A15
C33
O11
+
A2
C35
O14
+
+
+
A3
CX
O15
+
+
A4
I2
O16
+
A5
I3
O2
+
+
+
A6
I4
O3
+
+
+
A7
I5
O4
+
+
A9
J1
O7
+
+
B1
J2
O8
+
B2
J3
O9
+
B3
J4
+
B7
J6
(-) bactéria gram negativa; (+) bactéria gram positiva; C= solo convencional, O= solo orgânico,
B= Bordô; I= Isabel; N= Niágara, A= Niágara, J= Isabel.
Das 46 bactérias isoladas, todos os isolados produziram ácido-indol-acético,
29 isolados (63.04%) solubilizaram fosfato, 30 isolados (65,21%) produziram
sideróforos, 16 isolados (34,78%) produziram celulase, 14 isolados (30,43%) fixaram
nitrogênio, e somente 4 (8,67%) isolados apresentaram atividade contra o fungo
fitopatogênico (Tabela 4).
53
TABELA 4 - Perfil dos isolados frente aos ensaios in vitro da atividade enzimática, fisiológica e antifúngica.
AIA
Sol.
AIA
Sol.
Isolado (mg/ml)
Nit.
Fosf.
Sid.
Cel.
Ativ. Ant.
Isolado (mg/ml)
Nit.
Fosf.
+
+
A10
+
I2
+
+
A11
+
+
+
+
I3*
+
+
+
A12
+
I4
+
+
A14
+
+
I5
+
+
J1
+
+
+
A15
+
+
+
+
+
A2
+
+
+
J2
A3
+
+
+
+
+
+
J3
+
+
+
A4
+
J4
+
+
+
A5
+
+
J6
+
+
A6
+
+
+
+
+
+
J7
+
+
+
A7
+
+
+
N3
+
+
+
A9
+
N4
+
+
+
B1
+
+
+
N7
+
+
+
+
B2
+
O11
+
+
+
B3*
+
+
+
O14
+
+
+
B7
+
+
+
O15
+
+
+
C11
+
+
O16
+
+
+
C12*
+
+
+
O2
+
+
C2
+
+
+
O3
+
+
+
C32
+
O4
+
O7*
+
+
+
C33
+
+
+
+
C35
+
+
O8
+
+
CX
+
+
O9
+
Sid.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Cel.
+
+
+
+
-
Ativ.
Ant.
+
-
* Isolados selecionados para o ensaio in vivo em casa de vegetação; (-) não produziu a enzima/metabolito; (+) produziu a enzima/metabolito; AIA (mg/ml) =
produção de ácido-indol-acético; Nit. = fixação assimbiótica de nitrogênio atmosférico; Sol. Fosf. = solubilização de fosfato; Sid. = produção de sideróforos;
Cel. = produção de celulase; Ativ. Ant. = atividade antagônica contra o Fusarium oxysporum.
54
Na tabela 4 podemos observar o perfil dos 46 isolados frente aos ensaios de
atividade enzimática, fisiológica e antifúngica. Podemos verificar que muitos dos
isolados apresentaram resultado positivo para mais de um teste avaliado.
O isolado O7 se destacou apresentando resultado positivo para todos os
ensaios. Outros três isolados, A3, A6 e J1 apresentaram resultados positivos para
cincos dos ensaios, sendo que A6 e J1 apresentaram capacidade de produzir
atividade enzimática e fisiológica para todos os ensaios a que forma submetidos. No
entanto não apresentaram atividade antifúngica. Enquanto que o isolado, A3 não foi
eficiente na fixação de nitrogênio, mas foi um dos 4 isolados a apresentar atividade
antifúngica. Doze (26,09%) isolados foram positivos para quatro ensaios, doze
(26,09%) isolados foram positivos para três ensaios, quinze (32,60%) foram
positivos para dois ensaios e três (6,5%) isolados foram positivos para somente um
ensaio.
De acordo com Marasco e colaboradores (2013) produção de AIA,
solubilização fosfato, produção de amônia, protease e produção de sideróforos foi
avaliada para 175 isolados (93 isolados de rizosfera e 82 endofiticos). A maioria
(95%) dos isolados apresentou múltiplas habilidades, a produção de AIA foi
observada em 82% dos isolados, a solubilização de fosfato em 61% e a produção de
sideróforos em 47%. Portanto podemos perceber que a produção de AIA foi
igualmente detectada tanto em bactérias endofíticas (84%) quanto rizosféricas
(80%). Estes resultados corroboram com os resultados encontrados neste trabalho,
onde 93,5% dos isolados foram positivos para dois ou mais ensaios.
No estudo realizado por Ribeiro e colaboradores (2012), foram isoladas 97
bactérias da raiz de Araucária angustifólia e todos os isolados apresentaram pelo
menos uma característica positiva quanto ao potencial biotecnológico de promoção
de crescimento. A partir do sequenciamento parcial do gene de DNAr 16S dos
isolados, os que se destacaram como promissores foram os pertencentes as famílias
Bacillaceae, Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. Destes 18 isolados
produziram ácido indole-3-acético (IAA), 27 foram capazes de solubilizar fosfato
inorgânico, 21 isolados fixaram nitrogênio, 37 foram positivas para sideróforos. Estes
resultados corroboram com este estudo. Sendo que, todos os isolados apresentaram
pelo menos uma característica.
55
Passos e colaboradores (2014) verificaram a capacidade de bactérias
isoladas da rizosfera de pomares de maçã em produzir sideróforos das 300
bactérias isoladas, 214 (71,3%) apresentaram essa característica. Em relação à
capacidade de solubilizar fosfato apenas 36 (12%) dos isolados apresentaram essa
habilidade. A maioria dos isolados (94,33%) apresentou capacidade de produzir
compostos indólicos.
No ensaio de solubilização de fosfato 63,04% das bactérias avaliadas
apresentaram capacidade de solubilizar fosfato inorgânico em meio de cultura
(Tabela 4). Os microrganismos que apresentaram halo Transparente ao redor da
colônia foram considerados positivos e os que não apresentaram halo foram
considerados negativos para a solubilização de fosfato (Figura 4).
A
B
FIGURA 4: Ensaio de solubilização de fosfato em meio sólido. A = Isolados C11; I2; N3; e
J6; B = C33; C12, são positivas para solubilização de fosfato; B2 é negativo para
solubilização de fosfato.
Karagöza e colaboradores (2012) isolaram bactérias da rizosfera de videiras
selvagens nativa de três regiões diferentes da Turquia, sendo identificados 27
gêneros e 44 espécies totalizando 95 isolados. Destes 12 (12,6%) são fixadoras de
nitrogênio e 12 (12,6%) apresentaram capacidade de solubilizar fosfato. Resultado
este, inferior ao encontrado no presente estudo, o que demonstra o potencial dos
isolados em solubilizar fosfato. Outros trabalhos ainda apontam percentuais
inferiores a este estudo em relação à solubilização de fosfato como os reportados
56
por Islam e colaboradores (2006) onde, 30 endofíticos foram isolados e apenas 6
demonstraram com capacidade de solubilizar fosfato.
Das sete amostras diferentes de solo todas apresentaram isolados positivo
para solubilização de fosfato demonstrando que o solo da rizosfera de videira pode
ser um deposito de bactérias com genes para promotoras de crescimento de plantas
(ZARRAONAINDIA et al., 2015).
Bactérias solubilizadoras de fosfato associadas a microrganismos benéficos
ao solo promovem o crescimento das plantas e aumentam a produtividade. No solo
um dos principais mecanismos de solubilização de fosfato está relacionado com a
diminuição do pH do meio, devido a produção de ácidos orgânicos pelas
rizobactérias (KARAGÖZA et al., 2012).
Dawwam e colaboradores (2013) verificaram que dos sete isolados de
bactérias da rizosfera de Ipomoea batatas L. somente quatro solubilizaram fosfato.
Moreira e Araujo (2013) verificaram que os isolados de Bacillus sp demonstraram
pouca atividade na solubilização de fosfatos.
No trabalho reportado por Marasco e colaboradores (2013) foram isoladas
bactérias associadas ao sistema radicular de diferentes cultivares de videira e
verificaram que mais de 60% dos isolados sintetizaram auxinas e solubilizaram
fosfato, metabolitos importantes que enriquecem a rizosfera, promovendo,
resistência a fatores ambientais como seca, solo árido e atividade antagônica.
Segundo Dias e colaboradores (2009) o vigor vegetativo está relacionada com
a capacidade das bactérias de sintetizar auxina e solubilizar fosfato, sendo um fator
relevante para promover o desenvolvimento de mudas durante a aclimatização.
A produção de sideróforos foi observada em 30 (65,21%) microrganismos. Na
figura 5 é possível visualizar a formação do halo no ensaio de produção de
sideróforos. Segundo Benite e Machado (2002), nas últimas três décadas mais de
uma centena de sideróforos de ocorrência natural têm sido isoladas e
caracterizadas, estes incluem de origem bacteriana (Streptomyces, E. coli,
Pseudomonas, Bacillus, Micobacterium) e fúngica (Aspergillus, Penicillium).
A produção destes quelantes de ferro apresentam uma grande diversidade,
mas tem especial importância como agentes de biocontrole, biossensores e agentes
de bioremediação além de promover o crescimento de plantas (AHMED e
HOLMSTRÖM, 2014).
57
A
B
FIGURA 5:
Leitura do ensaio de produção de sideróforos (A) Isolado A7 (B) Isolado J4.
O diâmetro do halo (Diam. Halo - Diam. Colônia) de produção variou de 2,33
mm a 22 mm (Tabela 5). Entre os isolados avaliados, A12, C2, O8, C33 e J3
apresentaram os valores mais elevados sendo o diâmetro do halo de 22 mm, 20,6
mm, 20,3 mm e 20 mm respectivamente (Figura 6).
TABELA 5 - Média do Diâmetro do halo de produção de sideróforos das bactérias isoladas
a partir de amostras de solo.
Bactérias
A12
A14
A15
A2
A3
A5
A6
A7
B1
B3
B7
C11
C12
C2
C32
Média
22,00
10,00
4,33
9,67
9,67
2,33
8,00
3,33
19,67
6,33
9,67
10,00
10,33
20,67
6,33
Desvio Padrão
± 2,02
± 1,15
± 1,76
± 1,20
± 0,88
± 0,88
± 0,88
± 3,51
± 1,45
± 0,88
± 2,30
± 0,33
± 1,15
± 0,88
± 1,20
Bactérias
C33
C35
I2
I3
I4
J1
J3
J4
J6
N3
O14
O15
O16
O7
O8
Os dados são médias de três repetições; ± = desvio padrão.
Média
20,00
12,33
15,00
10,33
3,67
6,00
20,00
4,33
7,67
13,33
10,33
16,33
3,33
8,00
20,33
Desvio Padrão
± 1,15
± 1,15
± 1,20
± 1,15
± 0,88
± 0,88
± 2,02
± 3,00
± 0,66
± 1,45
± 1,20
± 0,33
± 0,57
± 0,88
± 0,33
58
24,00
22,00
Diâmetro do halo (mm)
20,00
18,00
16,00
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
O8
O7
O16
O15
O14
N3
J6
J4
J3
J1
I4
I3
I2
C35
C33
C32
C2
C12
C11
B7
B3
B1
A7
A6
A5
A3
A2
A15
A14
A12
Isolados
FIGURA 6:
Diâmetro do halo de produção de sideróforos.
Tian e colaboradores (2009) realizaram um trabalho com objetivo de analisar
a diversidade de bactérias produtoras de sideróforos na rizosfera de tabaco por meio
de análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA), os resultados
relataram que 85% dos isolados produzem sideróforos, destes 75% pertenciam ao
gênero Pseudomonas e apresentaram a produção de carboxilato um tipo de
sideróforos antagônico a Phytophthora parasitica var. nicotianae.
Segundo Radzki e colaboradores (2013) as bactérias Chryseobacterium spp.
e Pseudomonas fluorescens, isoladas da rizosfera demonstraram – se eficazes na
produção de sideróforos. Inoculada em plantas de tomate com doze semanas,
apresentaram um aumento significativo na massa seca e absorção de nutrientes
pelas plantas.
Nas condições do experimento todos os isolados avaliados foram capazes de
produzir AIA (em mg/mL-1 de cultura). Os níveis de produção de AIA variaram de
0,36 mg/mL-1 a 14,7 mg/mL-1 (Tabela 6). Conforme Dobbelaere e colaboradores
(2003) a habilidade de sintetizar fitormônios é amplamente distribuída entre
bactérias associadas com plantas. A auxina estimula o crescimento e o aumento da
59
área radicular, permitindo melhor absorção de nutrientes do solo. No trabalho
reportado por Kuss e colaboradores (2007) todos os isolados foram capazes de
produzir AIA. Resultado este que corrobora com os encontrados em nosso estudo.
TABELA 6 - Média da produção de ácido-Indol-acético (mg/mL-1) pelos isolados
bacterianos após cultivo com meio suplementado com L triptofano.
Bactéria AIA (mg/mL-1) Desvio Padrão Bactéria AIA (mg/mL-1) Desvio Padrão
± 0,001
± 0,002
A10
I2
0,91
1,84
± 0,002
± 0,003
A11
I3
2,82
14,77
± 0,000
± 0,002
A12
I4
0,42
1,51
± 0,001
± 0,001
A14
I5
2,76
0,91
± 0,003
± 0,000
A15
J1
5,49
0,45
± 0,005
± 0,006
A2
J2
4,62
10,62
± 0,002
± 0,004
A3
J3
0,85
5,49
± 0,002
± 0,005
A4
J4
4,07
3,64
± 0,005
± 0,001
A5
J6
6,69
0,69
± 0,001
± 0,002
A6
J7
0,53
9,09
± 0,001
± 0,004
A7
N3
0,69
1,89
± 0,001
± 0,002
A9
N4
1,56
1,18
± 0,002
± 0,001
B1
N7
1,51
0,69
± 0,001
± 0,001
B2
O11
0,47
0,69
± 0,005
± 0,006
B3
O14
3,47
4,51
± 0,002
± 0,002
B7
O15
1,18
0,63
± 0,002
± 0,001
C11
O16
3,15
0,47
± 0,002
± 0,001
C12
O2
5,22
0,74
± 0,001
± 0,004
C2
O3
0,42
3,47
± 0,000
± 0,001
C32
O4
0,36
0,91
± 0,001
± 0,003
C33
O7
0,63
2,44
± 0,001
± 0,001
C35
O8
1,02
0,53
± 0,001
CX
O9
3,25
0,003
0,63
Os dados são médias de três repetições; ± = desvio padrão.
De acordo com Dawwam e colaboradores (2013) das sete bactérias isoladas
da rizosfera de Ipomoea batatas L. todas produziram AIA sendo que a maior
concentração foi de 10,73 ug/mL e a menor de 0,6 ug/mL resultado menor do que o
nosso.
Dos 46 isolados, 20 isolados (43,48%) produziram valores inferiores a 1
mg/mL-1, 19 isolados (41,30%) produziram valores entre 1 e 5 mg/mL-1, cinco
60
isolados (10,87%) produziram valores entre 5 e 10 mg/mL -1. E os isolados I3 e J2 se
destacaram quanto a capacidade fisiológica de sintetizar AIA
produzindo
respectivamente 14,77 e 10,62 mg/mL-1 de AIA.
Em contrapartida os 33 isolados da espécie Azospirillum amazonense obtidos
a partir de amostras de raízes de três espécies de Brachiaria, foram capazes de
produzir fitormônios tipo AIA (ácido 3-indol acético) em meio de cultivo. A quantidade
de AIA produzida variou de 35 a 110 µM (JUNIOR et al., 2004).
Teixeira e colaboradores (2007), isolaram microrganismos endofíticos,
pertencentes aos gêneros Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Stenotrophomonas e
Pseudomona e todos os isolados foram capazes de produzir AIA e fixação de
Nitrogênio atmosférico.
Nos ensaios de fixação de nitrogênio, das 46 bactérias isoladas, 14 (30,4 %)
apresentaram resultados positivos para esta atividade fisiológica, ainda podemos
perceber que todas as sete amostra diferentes de solo apresentou bactérias com
esta característica (Tabela 7). Segundo Beneduzi e colaboradores (2010), os
microrganismos isolados da rizosfera apresentam boa capacidade de assimilar
nitrogênio.
TABELA 7 - Bactérias que apresentaram atividade fisiológica quanto a fixação de
nitrogênio.
Bactéria
Nitrogênio
Bactéria
Nitrogênio
A10
+
CX
+
A11
+
I5
+
A6
+
J1
+
B1
+
J6
+
B3
+
N7
+
B7
+
O16
+
C12
+
O7
+
(+) para a fixação de nitrogênio; N2 = nitrogênio.
No trabalho reportado por Kuss e colaboradores (2007) todos os 58 isolados
da rizosfera de arroz, foram capazes de fixar nitrogênio, sendo Azospirillum
brasilense e A. lipoferum os que apresentaram os maiores valores, 41,08 e 46,82 µg
mL-1, respectivamente. Segundo Janarthine e Eganathan (2012) apenas uma
pequena proporção de bactérias endofíticas demonstram capacidade de fixar
nitrogênio.
61
Das bactérias isoladas, 34,8% produziram celulase. A produção de celulase
foi observada em 16 isolados (Tabela 8). Segundo Asghar (2002) e Glick (1995), a
promoção de crescimento vegetal pode ser proporcionada, indiretamente, pela
redução ou inibição da ação de microrganismos patogênicos, devido à produção
enzimas como celulases e quitinases, à produção de antibióticos e a produção de
sideróforos por parte das bactérias promotoras de crescimento.
Berg e colaboradores (2001) isolaram bactérias do solo e da rizosfera e
avaliaram a produção e atividade de quitinase e celulase e atividade antagônica a
Verticillium: Ps. Putida, Ps. chlororaphis e Ser. Plymuthica. Três cepas foram
selecionadas e mostraram-se mais eficientes do que agentes de biocontrole
comerciais.
TABELA 8 - Capacidade das bactérias Isoladas em produzir celulase e antagonismo ao
fungo Fusarium oxysporum.
Bactérias
Celulase
Antagonismo
Bactérias
Celulase
A10
I2
+
A11
+
+
I3
A12
I4
A14
I5
A15
+
J1
+
A2
+
J2
A3
+
+
J3
+
A4
+
J4
A5
+
J6
A6
+
J7
A7
+
N3
A9
N4
B1
+
N7
B2
+
O11
B3
O14
B7
+
O15
C11
+
O16
C12
O2
C2
+
O3
C32
O4
C33
O7
+
C35
O8
CX
O9
(-) não produziu a enzima/metabolito; (+) produziu a enzima/metabolito.
Antagonismo
+
-
Entre as 46 bactérias isoladas da rizosfera de Vitis sp., somente quatro A11,
A3, B7, e O7 ou seja (9%) dos isolados apresentaram atividade contra o fungo
62
Fusarium oxysporum (Tabela 7). No estudo de Araujo e colaboradores (2010), onde
foram isoladas 14 bactérias pertencentes ao gênero Bacillus, somente 4 dos
isolados apresentou atividade antagônica contra o fungo Fusarium oxysporum.
No trabalho de Ribeiro e colaborador (2012), foram isoladas 97 bactérias da
raiz de Araucária angustifólia. Destes, 45 isolados foram antagônicos ao Fusarium
oxysporum.
Bactérias e rizobactérias promotoras do crescimento vegetal podem estimular,
direta ou indiretamente, o crescimento de plantas, aumentando a produção de
biomassa, e reduzindo os danos causados por fitopatógenos (LUGTENBERG e
KAMILOVA, 2009; VAN LOON e BACKKER, 2005).
4.2
AVALIAÇÃO DOS ENSAIOS EM CASA DE VEGETAÇÃO DE POTENCIAIS
PROMOTORES DE CRESCIMENTO VEGETAL
Os resultados apresentados aqui demonstram o potencial biotecnológico das
bactérias como agentes de promoção do crescimento vegetal. Foram selecionadas
quatro bactérias O7, I3, C12, B3 (Tabela 4) para avaliar o efeito destes
microrganismos e seus metabólicos em ensaios in vivo em casa de vegetação. O
isolado O7 apresentou resultado positivo para todos os ensaios. O isolado I3 se
destacou na produção de AIA com maior índice de 14,768 (mg/ML-1), as bactérias
C12 e B3 foram positivas para produção de sideróforos, solubilização de fosfato e a
produção de AIA, apresentando potencial como agentes de promoção de
crescimento vegetal. O experimento foi conduzido em casa de vegetação e as
estacas foram submetidas as mesmas condições edafoclimáticas, por um período de
59 dias.
Para os parâmetros avaliados neste estudo, foram observadas diferenças
estatísticas significativas no comprimento do ramo, embora houve uma tendência de
aumento na massa fresca e seca, está não foi significativa. Avaliando o comprimento
do ramo das plantas de videira observamos que no decorrer dos 59 dias do
experimento em casa de vegetação, o tamanho variou de 33,52 (T5, 1º dia) a 102,88
(T2, 59º dias).
63
Quando avaliamos o vigor vegetativo entre os diferentes tratamentos dos
porta-enxertos de videira, a variável comprimento do ramo se destacou
apresentando diferenças significativas. Portanto verificou-se uma variação na média
por tratamento de 58,288 (tratamento 4) a 76,704 cm (tratamento 2) (Tabela 9).
TABELA 9 - Média do número de folhas, comprimento do ramo, índice de clorofila, nos
diferentes tratamentos em Vitis sp.
Tratamento 1
Bactéria
Controle
Comp. Ramo (cm)
66,880 B
Clorofila
24,9736 A
Nº Folhas (unid.)
28,840 NS
Tratamento 2
C12
76,704 A
22,9924 B
30.824 NS
Tratamento 3
O7
69,200 B
24,1208 B
29,624 NS
Tratamento 4
B3
58,288 C
24,7944 A
28,736 NS
Tratamento 5
I3
63,688 C
24,3028 B
27,112 NS
Tratamento 6
Cons.
68,328 B
24,0056 B
28,232 NS
42.24%
14.9%
33.61%
CV
Nº Folhas=número de folhas; Comp. Ramo =comprimento do ramo; consorcio = as bactérias C12 +
O7 + B3 + I3; NS = não significativo; CV = Coeficiente de variação; As médias seguidas da mesma
letra não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Scott Knott (p<0,05).
Observando a média geral de todos os tratamentos verificou-se que no
primeiro dia foi de 36,74, e no 59 dia de 85,73 ocorrendo um crescimento normal dos
ramos (Tabela 10). O tratamento T2 se sobressaiu apresentando um maior
crescimento em relação aos outros no decorrer do experimento, obtendo um
aumento de 57% do tamanho inicial. Seguidos pelos tratamentos T3, T6 e T1
(controle). Os tratamentos T5 e T4 foram os que menos cresceram, em média 63 cm
e 58 cm, respectivamente.
No entanto, para o crescimento dos ramos, verificou-se que o comportamento
das curvas foi quadrático e a maior diferença entre o comprimento dos ramos
ocorreu no primeiro mês, evidenciando um aumento até o 31º dia seguido de
redução, conforme a equação de regressão y = -0,0145x2 + 1,7052x + 35,127 R² =
0,9972 (Figura 7).
64
TABELA 10 - Média geral do comprimento do ramo, índice de clorofila e número e folhas a
partir do primeiro dia após a inoculação das bactérias com Vitis sp.
Dia após inoculação
1
Comp. Ramo (cm)
36,74000
Clorofila
23, 27500
Nº Folhas (unid.)
9,293333
15
57,19333
25,84733
26,560000
31
75,35333
25,07633
36,086667
45
80,88667
24,93867
36,133333
59
85,73333
22,68733
36,400000
CV
42.24%
14.9%
33.61%
Nº Folhas=número de folhas; Comp. Ramo =comprimento do ramo; CV = Coeficiente de variação.
120
Comprimento médio dos ramos (cm)
y = -0,0145x2 + 1,7052x + 35,127
R² = 0,9972
100
80
T1
T2
60
T3
T4
40
T5
T6
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Dias após a inoculação
FIGURA 7: Curva de crescimento dos ramos de porta-enxertos de videira em casa de
vegetação.
O crescimento inicial pode ser atribuído às substâncias metabólicas
produzidas após a inoculação das bactérias. Segundo Dias et al. (2009) sob as
condições de estufa os microrganismos Bacillus spp e Sphingopyxis sp.
demonstraram potencial para desenvolvimento radicular, comprimento, peso seco,
número de folhas, o comprimento do pecíolo e peso seco da parte aérea.
65
No tratamento dois, foi inoculado a bactéria C12 que apresentou halo de 29
mm para sideróforors, produziu 5,22 mg/mL-1 de AIA e apresentou resultado positivo
no ensaio de fixação de nitrogênio e solubilização de fosfato. No ensaio in vivo, o
isolado C12 promoveu um aumento de 14,7% no comprimento dos ramos se
comparado ao controle, apresentando-se promissora para estimular o crescimento
vegetal enfatizando os resultados in vitro. Kim e colaboradores (2014) isolaram
bactérias pertencentes ao gênero Enterobacter sp. produtora de AIA e verificaram o
crescimento vegetativo de mudas de tomates expostos ao estresse salino. Em outro
estudo bactérias como a Azadirachta e Pseudomonas, produzem ferrioxamines, um
sideróforo essencial na disponibilidade do Fe para as plantas promovendo assim o
crescimento das raízes e parte aérea, sendo uma alternativa como biofertilizantes
(AHMED, E; HOLMSTRÖM, 2014).
Apesar de constatar diferença no comprimento do ramo, o índice relativo de
clorofila (IRC) não apresentou diferenças estatísticas entre os tratamentos. Podemos
observar uma pequena variação entre o valor médio de cada tratamento, variando
de 22,9924 a 24,9736 (Tabela 9). O comportamento geral deste IRC mostra um
aumento nos primeiros dias seguido de redução conforme equação de regressão: y
= -0,0031x2 + 0,1695x + 23,364 R² = 0,8811 (Figura 8).
30
Índice de clorofila (SPAD)
25
20
y = -0,0031x2 + 0,1695x + 23,364
R² = 0,8811
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Dias após a inoculação
FIGURA 8: Curva do índice de clorofila (IRC) de porta-enxertos de videira em casa de
vegetação.
66
O IRC variou de 22, 116 (T2 primeiro dia avaliado) a 26,984 (T1, 17º dia)
conforme tratamento e tempo. Foi observada pequena variação, sendo atingidos os
valores mais elevados a partir do 14º dia após a primeira determinação, portanto
percebemos a maior atividade da fotossíntese neste período. A média geral do IRC
durante o tratamento foi de 23,275 no primeiro dia, e de 22, 687 nos 59 o dia (Tabela
10). Estes resultados contrastam com os estudos de Tecchio e colaboradores (2011)
que observaram relações significativas entre o índice relativo de clorofila (IRC) e o
teor de Nitrogênio e potássio na folha e pecíolo da videira 'Niagara Rosada.
Com relação ao número de folhas avaliados, embora não tenha sido
observada diferença estatística significativa, houve distinção para produção de
folhas entre os tratamentos. Com base na média estimada o tratamento T5 mostrouse menos promissor com média de 27,112 uni., enquanto os demais oscilaram entre
28,232 uni. a 30,824 unid., (Tabela 9). Dentre os tratamentos com maior número de
folhas, verificou-se uma tendência de maior produção para o tratamento T2 com
média de 30,824 uni., sendo promissor para crescimento vegetal.
Contudo,
mesmo
sob
condições
edafoclimáticas
controladas
o
desenvolvimento do número de folhas foi baixo, este variou de 8,84 (T4 primeiro dia)
a 40,12 (T2, 59 dia), onde percebemos um aumento somente no primeiro mês, o que
pode indicar uma eficiente atividade fisiológica das bactérias inoculadas, sendo que
após esse período, a capacidade de adaptação e sobrevivência da população
bacteriana determinou a colonização da rizosfera o que pode ter influenciado esta
etapa.
A média geral do número de folhas foi de 9,29 no primeiro dia, e de 36, 40
nos 59º dia de experimento (Tabela 10), onde podemos observar um aumento do
número de folhas somente no primeiro mês de tratamento seguido de redução
conforme equação de regressão: y = 0,0002x3 - 0,0361x2 + 1,7939x + 7,4138 R² =
0,9983 (Figura 9).
No trabalho reportado por Yang Suijuan e colaboradores (2014) após 90 dias
da inoculação da bactéria Sphingomonas paucimobilisZJSH1, a planta medicinal
officinale Dendrobium, constatou se o crescimento significativo das mudas da D.
officinale, com aumentos de 8,6% do tamanho do ramo e de 7,5% da massa fresca.
A promoção de crescimento segundo o autor foi conferida devido à produção de
fitormônios e fixação de nitrogênio pela bactéria.
67
40
35
Número de folhas
30
y = 0,0002x3 - 0,0361x2 + 1,7939x + 7,4138
R² = 0,9983
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Dias após a inoculação
FIGURA 9:
Curva da produção do número de folhas de videira em casa de vegetação.
Após 59 dias as plantas foram coletadas, separadas, a raiz, o caule e as
folhas e determinado o peso (mg) da matéria fresca, após acondicionadas em sacos
de papel. Os índices de massa seca foram realizados através de processo de
dessecação em estufa de secagem de planta com temperatura controlada de 60ºC.
A média da massa fresca total variou de 39,532 mg a 47,527 mg e de massa
seca total de 12,660 a 15,791 mg (Tabela 11). Embora tenha sido observada
diferença entre os valores médios, esta não foi estatisticamente significativa. Estes
resultados são similares aos resultados encontrados por Passos e colaboradores
(2014) que inocularam cinco isolados de bactérias provenientes da rizosfera, em
mudas de maçã e não obtiveram resultado significativo em relação à massa seca de
raízes.
68
TABELA 11 - Média da massa seca (mg)e massa fresca (mg) da raiz, folha e ramo nos
diferentes tratamentos, após 60 dias do experimento.
MSRz
MSF
MSRm
MFRz
MFF
MFRm
MFT
MST
Trat. 1
5,482
4,532
3,383
19,386
15,652
7,999
43,037
13,398
Trat. 2
5,312
5,495
3,987
19,195
18,400
8,888
46,484
14,795
Trat. 3
6,524
5,335
3,931
22,477
16,614
8,434
47,527
15,791
Trat. 4
5,093
4,708
2,858
18,159
14,852
6,521
39,532
12,660
Trat. 5
5,258
5,112
3,632
19,887
16,744
8,088
44,720
14,004
Trat. 6
6,285
4,874
3,500
22,348
15,158
7,766
45,273
14,660
MSRz: massa seca de raiz; MSF: massa seca de folha; MSRm: massa seca de ramo; MFRz: massa
fresca de raiz; MFF: massa fresca de folha; MFRm: massa fresca de ramo; MFT: massa fresca total;
MST: massa seca total; Trat. 1 = controle; Trat. 2 = Bactéria C12; Trat. 3 = Bactéria O7; Trat. 4 =
Bactéria B3; Trat. 5 = Bactéria I3; Trat. 6 = Bactérias C12, O7, B3 e I3.
A biomassa fresca e seca total foi mais elevada no tratamento 2 e 3, sendo a
massa fresca total (MFT) de 46,484 mg, 47,527 mg e a massa seca total (MST) de,
14,795 mg, 15,791 mg respectivamente, se compararmos ao controle percebemos
um aumento de 9,45% na MFT e de 15,15% na MST, enquanto que a menor
produção de biomassa foi encontrada no tratamento 4 (inferiores ao controle), sendo
39,532 mg de MFT e 12,660 de MST (Tabela 11).
Além disso, verificou-se que o tratamento T2 se sobressaiu em relação aos
outros tratamentos na massa seca da folha e do ramo e na massa fresca da folha e
do ramo, portanto a média foi de 5,495 mg, 3,987 mg e 18,400 mg, 8,888 mg,
respectivamente, enfatizando que a bactéria C12 apresenta potencial atividade
fisiológica e enzimática (Figura 10).
69
A
B
FIGURA 10: Média total da biomassa de Vitis sp. após 60 dias de experimento submetido
a diferentes tratamentos; A = Massa Fresca; B = Massa seca.
70
Segundo Albuquerque e Dechen (2000) a produção da biomassa está
diretamente relacionada com a quantidade de nutrientes acumulada. Quanto maior
absorção de nutrientes maior a biomassa acumulada. Embora não tenham sido
encontradas diferenças significativas quanto à massa fresca e seca, a análise de C,
N e S, mostrou-se estatisticamente significativa, conforme tabela 12.
TABELA 12 - Percentual médio de carbono, hidrogênio, nitrogênio e enxofre na biomassa
vegetal submetida a diferentes tratamentos, após 60 dias de experimento.
Tratamento
T1
T2
T3
T4
T5
T6
CV
C (%)
35,16 B
38,88 A
40,08 A
39,20 A
38,94 A
30,34 C
7.49 %
H%
3,56
4,38
4,50
4,38
4,82
4,16
18.62 %
N%
0,58 C
0,94 B
1,24 A
1,28 A
1,40 A
1,28 A
23.54%
S%
0,42
0,70
0,70
0,48
0,82
0,60
44.06%
C= carbono; H= hidrogênio; N= nitrogênio; S= enxofre; CV = Coeficiente de variação. As médias
seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente entre si, pelo teste de Scott Knott (p<0,05).
O teor de macronutrientes na biomassa vegetal apresentou diferentes
variações. O percentual de carbono variou de 24,7% (T6) a 49,4% (T3), de
hidrogênio H de 1,8% (T1) a 6,6% (T5), de nitrogênio N, 0,3% (T1) a 1,7% (T3, T4) e
o de enxofre S de 0,2% (T1) a 1,3% (T2). Maior variação foi observada em relação
aos teores de enxofre.
Em relação ao percentual médio de nutrientes observamos pequena variação
variando de 30,34 % a 40,8 %para o elemento carbono, 3,56 % a 4,82 % para o
elemento hidrogênio, de 0,58 % a 1,40 % para o elemento nitrogênio, de 0,42 % a
0,82 % para o enxofre (Tabela 12). Diferença significativa entre os tratamentos foi
observada em relação aos elementos carbono e nitrogênio.
Se avaliarmos o percentual de carbono, verificamos que o tratamento controle
(T1) e o tratamento com o consorcio (T6) apresentaram os valores mais baixos se
comparados aos demais tratamentos. A inoculação com as bactérias C12; O7; B3; e
I3 levou a um incremente de percentual de carbono de 10%, 14%, 11,5 e 10,8%
respectivamente. Conforme estudos de Fernandez et al. (2012) a bactéria
Burkholderia phytofirmans PsJN, que coloniza videira, tem capacidade de aumentar
71
a tolerância ao estresse causado pelo frio, modificando o metabolismo dos hidratos
de carbono em plantas de videira.
Se avaliarmos o percentual de nitrogênio, verificamos que no tratamento
controle o percentual foi mais baixo se comparado aos demais, o incremento no
percentual de nitrogênio variou de 61,7% (Tratamento controle) a 140%,
(Tratamento T5), conforme tratamento avaliado. O que demonstra que a inoculação
de bactérias pode de alguma forma ter contribuído para uma melhor absorção deste
elemento.
O nitrogênio compõe aproximadamente 2% da biomassa seca da planta,
sendo um componente de macromoléculas essenciais, tais como proteínas, ácidos
nucléicos e metabolitos secundários (KRAPP et al., 2011).
Dawwam e colaboradores (2013) observaram aumento de 50,5% do teor de
N, e 48,3%, de P, da massa seca de Ipomoea batatas L. em relação ao controle.
Passos e colaboradores (2014) analisaram a absorção de N, P e K em mudas de
maçã, somente as plantas inoculadas com Burkholderia sp. apresentaram níveis
elevados de absorção de fósforo.
Neste trabalho a maioria dos isolados apresentaram múltiplas habilidades nos
ensaios in vitro, o que aponta para um potencial uso destes em promover o
crescimento vegetal. De acordo com os resultados apresentados verificamos que a
inoculação de bactérias a cultura de Vitis, apresentou um potencial promissor no
crescimento vegetal quando avaliados os parâmetros comprimento do ramo, índice
de clorofila, teor de carbono e nitrogênio.
No entanto, para os parâmetros como massa fresca, massa seca, número de
folhas não foi detectada diferença significativa.
Para a promoção do crescimento
vegetal é de crucial importância uma eficiente colonização da rizosfera, pelas
bactérias. Além disso a capacidade de adaptação e sobrevivência da população
microbiana. Diferentemente do que acontece em condições de laboratório, onde há
um a otimização das condições de crescimento (disponibilidade de nutrientes,
temperatura e pH e sem agentes competidores) a condição a campo os fatores
ambientais, bem como a característica do próprio substrato pode influenciar esta
etapa.
72
4.3
ANALISE DE SEQUENCIAMENTO DO GENE rpoB DAS BACTÉRIAS
Das 46 bactérias isoladas do solo foram selecionadas duas bactérias O7 e
C12, para sequenciamento do gene rpoB (fragmento de 740 pb) e identificação das
espécies. Sendo que o isolado O7 se destacou apresentando resultado positivo para
todos os ensaios e o isolado C12 apresentou os melhores resultados “in vivo” em
relação ao comprimento do ramo, proporcionando um maior crescimento vegetal em
relação a plantas não inoculadas.
O produto da amplificação do gene rpoB do isolado O7 foi de 627 pb, esta
sequência apresentou 99% de similaridade com Bacillus amyloliquefaciens, para o
isolado C12 foi obtido um produto de amplificação de 669 pb, a sequência
apresentou 98% de similaridade com Bacillus thuringiensis.
Pertencente à família Bacillaceae, B. thuringiensis e B. amyloliquefaciens são
bactérias Gram-positivas com elevada taxa de crescimento, a maioria destes
bastonetes são formadores de esporos e apresentam uma ampla capacidade de
excretar metabólitos enzimáticos para o meio extra celular o que lhe confere
potencial aplicação aos setores industriais (ANGELO; VILAS-BÔAS; CASTROGÓMEZ, 2010).
Bactérias pertencentes ao gênero Bacillus são encontradas naturalmente no
solo próximas ao ambiente rizosférico ou endofíticos (GUIMARÃES et al., 2013).
Diversos estudos tem reportado o potencial deste gênero como promotores de
crescimento vegetal. Estudos com bactérias promotoras de crescimento vegetal tem
demonstrados que as rizobaterias do gênero Bacillus são frequentemente
encontradas no solo, dentre elas B. amyloliquefaciens vem se destacando na
promoção de crescimento em plantas e no controle a fitopatógenos (NAUTIYAL et
al., 2013; FAN et al. 2015). Resultados estes que colaboram com os encontrados
neste estudo. Estudos demonstraram que bactérias endofíticas do gênero Bacillus,
Burkholderia, e Pseudomonas, foram encontradas em diferentes tecidos da videira,
sementes, bagas e flores (COMPANT, et al., 2011).
MARASCO e colaboradores (2013) analisaram o sistema radicular de
diferentes cultivares de videira em três ambientes mediterrânicos, no Egito, na
Tunísia e norte da Itália, identificando cinco filos, Acidobacteria, Actinobacteria ,
73
Firmicutes, proteobactérias, e Bacteroidetes confirmando a capacidade das
bactérias de colonizar diferentes ambientes. Em outro estudo Dias et al (2009)
isolaram vinte bactérias endofíticas de tecidos meristemáticos de três variedades de
morango com predomínio dos gêneros Bacillus e Sphingopyxis.
No estudo reportado por Ahamad e colaboradores (2008) foram isoladas 72
bactérias
pertencentes
aos
gêneros
Mesorhizobium (6) e Bacillus (10).
Azotobacter
(47),
Pseudomonas
(9),
Mais de 80% dos isolados de Azotobacter,
Pseudomonas e Mesorhizobium produziram IAA, e somente 20% dos isolados de
Bacillus foram positivos para este ensaio. A solubilização de fosfato foi observada
em 80% Bacillus, 74,47% Azotobacter, 55.56% Pseudomonas (55.56%) e 16.67%
Mesorhizobium, ou seja 56,68% dos isolados foram positivos, resultados estes
similares ao encontrado neste estudo. Por sua vez, menor percentual de isolados
foram capazes de produzir sideróforos e apresentar atividade antifúngica (10–
12,77%).
Vários estudos confirmam a capacidade das bactérias do gênero Bacillus em
promover o crescimento vegetal, resultados estes encontrados em nosso trabalho
onde, Bacillus thuringiensis apresentou resultado significativo em relação ao
comprimento do ramo. Corroborando com este estudo Dias et al. (2009) isolou
microrganismos do gênero Bacillus spp e Sphingopyxis sp. que demonstraram
potencial para desenvolvimento radicular, comprimento e peso seco, número de
folhas, o comprimento do pecíolo e peso seco da parte aérea em morangos.
De acordo com de Guimarães et al. (2013) a utilização de Bacillus
amyloliquefaciens proporcionou o aumento do diâmetro da parte aérea e da
biomassa fresca em plantas de alface atuando sobre o crescimento vegetal. Em
contrapartida Bobrowski et al., (2003) afirma que Bacillus thuringiensis apresenta
genes que confere as plantas resistência a insetos, sendo uma alternativa
biotecnológica no combate aos insetos-pragas das lavouras. O mesmo autor cita a
importância da utilização de Bacillus thuringiensis como biopesticidas, pois este
diminuindo o impacto ambiental e não apresenta prejuízo ao ser humano.
74
5 CONCLUSÕES
O solo da rizosfera de videira apresenta um grande número de bactérias com
perfis multivariados em relação à produção de metabolitos, o que confere a planta
melhor desenvolvimento e influencia diretamente na qualidade e produtividade da
uva.
As bactérias selecionadas da rizosfera apresentaram diversas características
relacionadas a mecanismos diretos de promoção de crescimento. Foram isoladas 46
bactérias e todos os isolados foram capazes de produzir AIA, 63% demonstraram
habilidades em solubilizar fosfato, e 30, % foi capaz de fixar nitrogênio,
apresentando-se como promotoras de crescimento vegetal.
As rizobactérias também demonstraram mecanismos indiretos de promoção
de crescimento 65% produziram sideróforos, 34% produziram celulase e 9%
apresentaram antagonismo ao fungo Fusarium oxysporum, reduzindo a ação dos
fitopatógenos e aumentando a produção.
Considerando a eficiência das bactérias na promoção de crescimento da
videira a aplicação de bactérias isoladas ou em combinação, pode ser utilizada, pois
o isolado C12 apresentou os melhores resultados em relação ao comprimento do
ramo, proporcionando um maior crescimento vegetal em relação a plantas não
inoculadas.
A identificação, empregando técnicas de biologia molecular, identificou dois
isolados, C12 e O7 como Bacillus amylofaciens e B. thuringiensis.
75
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Novas pesquisas devem ser realizadas visando confirmar a capacidade dos
isolados em promover o crescimento vegetal, como potencial alternativa para
redução de insumos agrícolas, principalmente em culturas perenes com alta
exigência nutricional e de importância econômica para a região Sul:
 Ensaio em casa de vegetação com inoculação em diferentes tempos;
 Ensaio a campo para observar a adaptação a microbiota existente;
 Testar a atividade antifúngica in vitro e in vivo para o Cylindrocarpon destructans
e Eurhizococcus brasiliensis;
 Testar isolados em outras culturas;
 Ensaio in vitro com explantes.
76
REFERÊNCIAS
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pseudotuberculosis de caprinos e ovinos do sertão de Pernambuco. Pesquisa
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87
ANEXOS
88
Anexo 1: Meio de cultura utilizado para seleção de bactérias com potencial para
solubilização de fosfato.
Meio de cultura descrito por Nautiyal et al. (1999).
Composição
g/L
Glicose
10g
Ca5(OH) (PO4)3
5g
MgCl2 6H2O
5g
MgSO4 7H2O
0,25g
KCl
0,2g
(NH4)2SO4
0,1g
Ágar
15g
Água destilada
1000mL
pH final
7,0
Anexo 2: Meio de cultura utilizado para seleção de bactérias.
Meio King B
Composição
Peptona
K2 HPO4,
MgSO4 .7H20,
Glicerol
Ágar
Água destilada
g/L
20g
1,5g
1,5g
15mL
15g
1000mL
89
Anexo 3: Solução utilizado para seleção de bactérias com potencial para produção de
sideróforos.
Solução Cromo Azurol S (CAS)
Solução A
Cromo Azurol S
Água Deionizada
12,2 mg
10 mL
Solução B
HCl (concentrado)
Água Deionizada
FeCl3 6H2O
84uL
100mL
27 mg
Solução C
HDTMA
Água Deionizada (morna)
21,9 mg
25 mL
Solução D
Piperazina Anidra
Água Deionizada
4,307 g
40 mL
Ajustar vagarosamente o pH com HCl (12 M) para 5,6.
Adicionar 7,5 mL da solução B. Em seguida, acrescentar a mistura vagarosamente
ao conteúdo da solução C. Passar o conteúdo para um balão volumétrico de 100mL.
Adicionar a solução D ao balão volumétrico e completar o volume para 100ml com
agua deionizada. Armazenar a solução colorida em geladeira.
90
Anexo 4: Meio de cultura utilizado para seleção de bactérias com potencial para fixação
assimbiótica de nitrogênio.
Reagentes
CC
Sacarose (g L-1)
5,0
Manitol (g L-1)
5,0
Lactato de sódio (mL, 50%, v/v)
-1
MLN
0,6
K2HPO4 (g L )
0,8
0,6
KH2PO4(g L -1)
0,2
1,8
MgSO4-7H2O(g L-1)
0,2
0,2
NaCl (g L-1)
0,1
0,1
CaCl2-2H2O (g L-1)
0,06
0,02
Extrato de levedura (mg L-1)
100
20
CuSO4-5H2O (mg L-1)
0,08
ZnSO4-7H2O (mg L-1)
2,4
H3bo3 (mg L-1)
2,8
Na2MoO4-2H2O (mg L-1)
25
MnSO4-H2O (mg L-1)
Na2FeEDTA (mg L-1)
2
2,35
28
65,6
Biotina (mg L )
Pyridoxol – HCL (mg L-1)
0,005
0,1
O,2
PABA(ácido p- aminobenzóico) (mg L-1)
0,01
-1
KOH (g L-1)
Ph
Ágar (g L-1)
cc= concentração; MLN= meio livre de nitrogênio.
4,5
7
2,2
6,8
2,2
91
Anexo 5: Meio de cultura utilizado para seleção de bactérias com potencial para produção
de celulase.
Tripticaseína de soja ágar (TSA)
Composição
g/L
Digestão pancreática de caseína:
Cloreto de sódio
Digestão papáica de farinha de soja
Celulose em pó
Agar
Água destilada
pH Final
15 g
5g
5g
5g
15g
1000mL
7,3
Anexo 6: Solução nutritiva
Macro nutrientes
Reagentes
Solução
Sol. Nutritiva
(“stock” (g/L)
(mL a pipetar por L)
Nitrato de cálcio - Ca(NO3)2.4H2O
236,2
5
Nitrato de potássio - KNO3
101,1
5
Dihidrogenofosfato de potássico -
136,1
1
246,5
2
KH2PO4
Sulfato de magnésio – MgSO4.7H2O
Micronutrientes
A solução de micronutrientes, com exceção do Fe, é preparada em conjunto
conforme indicado na seguinte tabela. Pesam-se as quantidades de cada um dos
reagentes e dissolvem-se em conjunto para um volume final de 1000 ml.
92
Reagentes
Solução
“stock”(g/L)
Ácido bórico - H3BO3
2,86
Cloreto de manganês - MnCl2.4H2O
1,81
Sulfato de zinco - ZnSO4.7H2O
0,22
Sulfato de cobre - CuSO4.5H2O
0,08
Molibdato
de
amónio*
-
Sol. Nutritiva
(ml a pipetar por L)
1
0,02
(NH4)6Mo7O27.H2O.
* O molibdato de amónio pode ser substituído por MoO3 e nesse caso pesar 0,016g/L
Solução de Ferro - preparar uma solução “stock” de Fe dissolvendo 1,67 g de
Hampiron 654 Gs (composto que contem 6% de Fe na forma quelatada de FeEDDHMA) em 1 litro de água destilada.
Todas as soluções “Stock” deverão ser armazenadas no frio em frascos escuros,
devidamente identificados.
Preparação da solução nutritiva de Hoagland:
Por litro de solução nutritiva adicionar 5 ml da solução “stock” de
Ca(NO3)2.4H2O, 5 ml de KNO3, 1 ml de KH2PO4, 2ml de MgSO4.7H2O, 1 ml da
solução de micronutrientes (sem ferro) e 1 ml da solução de ferro perfazendo o
volume até 1 litro com água deionizada.
Acertar o pH da solução nutritiva para 6-6.5 e anotar o valor de condutividade.
Nota 1: Aferir o garrafão onde é preparada a solução nutritiva a 4 litros.
Nota 2: Para que não ocorra a precipitação de alguns dos reagentes é necessário
que antes da adição dos nutrientes sejam colocados cerca de 2 litros de água no
respectivo garrafão e que seja respeitada a ordem de adição dos nutrientes acima
indicada.