estudo epidemiolgico da poxvirose bovina no estado do
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1 1. INTRODUÇÃO As poxviroses são doenças causadas por vírus da família Poxviridae, que acometem o homem e os animais. Tipicamente ocorre nas poxviroses a presença de lesões difusas na pele e mucosas que progridem de máculas para pápulas, vesículas e pústulas antes de formar crostas e cicatrizar (ACHA e SZYFRES, 1986). Nos últimos cinco anos, inúmeros casos de doença pústulo-vesicular ocorreram em diversas fazendas nos Estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Minas Gerais acometendo o gado bovino leiteiro e pessoas, principalmente retireiros e seus familiares, nos quais as características clínicas descritas favoreciam a possibilidade da doença ser causada por um vírus da família Poxviridae, posteriormente comprovada por diagnóstico laboratorial. Na ocasião, DAMASO et al. (2000) isolaram e caracterizaram molecularmente o vírus Cantagalo (CTGV) de espécimens clínicos de bovinos na cidade de Cantagalo no Estado do Rio de Janeiro, TRINDADE et al. (2003), isolaram o vírus Araçatuba na cidade de Araçatuba no Estado de São Paulo e LEITE (2003), o vírus Passatempo em Passatempo no Estado de Minas Gerais. A partir de 2002, têm sido observado surtos de doença pústulo-vesicular no gado leiteiro e pessoas de fazendas leiteiras no Sul do Estado do Espírito Santo, com características clínicas semelhantes aos casos descritos nos Estados do Rio de 2 Janeiro, São Paulo e Minas Gerais. Esses surtos vêm causando grandes prejuízos econômicos na agropecuária da região, onde em algumas propriedades 100% dos bovinos foram acometidos, bem como a importância na saúde pública, como uma zoonose, com ocorrência de casos humanos que necessitaram de hospitalização, justificando uma pesquisa de investigação mais detalhada do problema em pauta. Objetivou-se, neste trabalho, realizar um estudo epidemiológico dos surtos das poxviroses no gado leiteiro e casos humanos do Estado do Espírito Santo, identificando molecularmente o agente causador, bem como a adoção e divulgação das medidas de controle da doença junto aos órgãos responsáveis pela Sanidade Animal, Saúde Pública e aos proprietários de gado leiteiro. 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Família Poxviridae Os vírus DNA classificados na família Poxviridae são os maiores e mais complexos vírus conhecidos, os quais se replicam no citoplasma de células de hospedeiros vertebrados e invertebrados. A família abrange um grande grupo de patógenos de importância médica e veterinária (MOSS, 1996). A doença pústulo-vesicular típica de poxvírus é conhecida como “varíola” e se caracteriza clinicamente pelo aparecimento de lesões difusas na pele e mucosas, que progridem de máculas para pápulas, vesículas e pústulas antes de formar crostas e cicatrizar. A maioria das lesões contém células com múltiplas inclusões intracitoplasmáticas denominadas “pocks” que representam o local de replicação viral nas células infectadas (TRIPARTHY et al., 1981, ACHA e SZYFRES, 1986). A historia dos poxvírus tem sido predominada pelo Variola virus (VARV), o agente etiológico da varíola humana, que acompanhou o homem por muitos séculos causando mortes e lesões graves e irreversíveis (GUIDO e ESPER, 2002). Atualmente, o VARV vem tendo importância mundial, pelo temor do seu uso, como arma biológica (SCHATZMAYR, 2001, SILVA, 2001). 4 Um outro exemplo de poxvírus muito estudado é o Vaccinia virus, que vem sendo objeto de estudo intensivo como vetor para introdução de genes imunizantes ativos, como vacinas de vírus vivo para uma variedade de doenças em humanos e animais domésticos (BROOKS et al., 2000). 2.1.1. Classificação A família Poxviridae é subdividida em duas subfamílias, com base no espectro dos hospedeiros vertebrados ou insetos: Chordopoxvirinae (poxviroses de vertebrados) e Entomopoxvirinae (poxviroses de insetos) (Tabela 1). A subfamília Chordopoxvirinae é subdividida em oito (08) gêneros (Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Suipoxvirus, Molluscipoxvirus e Yatapoxvirus), e os membros de cada gênero exibem uma morfologia e uma gama de hospedeiros semelhantes, bem como alguma relação antigênica. As principais espécies de cada gênero, hospedeiro e distribuição geográfica estão apresentadas nas Tabelas 2 a 6. Existem outros poxvírus que ainda não estão bem classificados, incluindo os novos vírus que são descobertos constantemente, como os isolados de lagartos, rãs, cervos, cangurus, entre outros. (MURPHY et al., 1999). Tabela 1. Estrutura Taxonômica da família Poxviridae. Família Poxviridae Subfamília Chordopoxvirinae Gênero Orthopoxvirus Gênero Parapoxvirus Gênero Avipoxvirus Gênero Capripoxvirus Gênero Leporipoxvirus Gênero Suipoxvirus Gênero Molluscipoxvirus Gênero Yatapoxvirus Subfamília Gênero Gênero Gênero Entomopoxvirinae Entomopoxvirus A Entomopoxvirus B Entomopoxvirus C (ESPOSITO et al., 2005) 5 Tabela 2. Gênero Orthopoxvirus: Vírus, abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica. Vírus Abreviação Principais Hospedeiros Distribuição Geográfica Camelpox virus CMLV Camelo Ásia e África Cowpox virus CPXV Bovino, humano, felino e roedor Europa e Ásia Ectromelia virus ECTV Camundongo Europa Monkeypox virus MPXV Macaco, Roedor e Humano África Raccoonpox virus RCNV Guaxinim América do Norte Taterapox virus GBLV Gerbilo África Vaccinia virus VACV Humano, Bovino, Búfalo, suíno e Coelho Mundial Buffalopox virus BPXV Búfalo, Bovino e Humano Índia Rabbitpox virus RPXV Coelho EUA e Holanda Variola virus VARV Humano Erradicado Volepox virus VPXV Camundongo da Califórnia Califórnia Uasin Gishu virus UGV Cavalo África (Adaptado de ESPOSITO et al., 2005) Tabela 3. Gênero Parapoxvirus: Vírus, abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica. Vírus Abreviação Principais Hospedeiros Distribuição Geográfica Orf virus ORFV Ovino, Caprino, Humano Mundial Pseudocowpox virus ou Paravaccinia vírus PCPV Bovino e Humano Mundial Bovine papular stomatitis virus BPSV Bovino e Humano Mundial Parapoxvirus of red deer in New Zealand PVNZ Cervo vermelho Nova Zelândia Auzduk disease virus - Camelo África e Ásia Sealpox virus - Foca e Humano Mundial (Adaptado de ESPOSITO et al., 2005). 6 Tabela 4. Gênero Avipoxvirus: vírus, abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica. Vírus Abreviação Principais Hospedeiros Distribuição Geográfica Canarypox virus CNPV Canário, aves Mundial Fowlpox virus FWPV Aves Mundial Juncopox virus JNPV Aves Mundial Mynahpox virus MYPV Aves Mundial Pigeonpox virus PGPV Pombo, aves Mundial Psittacinepox virus PSPV Psitacídeos, aves Mundial Quailpox virus QUPV Codornizes, aves Mundial Sparrowpox virus SRPV Pardal, aves Mundial Starlingpox virus SLPV Aves Mundial Turkeypox virus TKPV Peru, aves Mundial (Adaptado de ESPOSITO et al., 2005) Tabela 5. Gênero Capripoxvirus: Vírus, Abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica. Vírus Abreviação Principais Hospedeiros Distribuição Geográfica Goatpox virus GTPV Cabra Ásia e África Sheeppox virus SPPV Carneiro Ásia e África Lumpy skin disease virus LSDV Bovino África (Adaptado de ESPOSITO et al., 2005) 7 Tabela 6. Gêneros Leporipoxvirus, Suipoxvirus, Molluscipoxvirus, Yatapoxvirus: Vírus, abreviações, hospedeiros e distribuição geográfica. Gênero Leporipoxvirus Vírus Principais Hospedeiros Distribuição Geográfica Hare fibroma virus FIBV Lebre (Lepus capensis) Europa Myxoma virus MYXV Lebre e coelho América do Sul e EUA Fibroma virus - Lebre e coelho EUA Squirrel fibroma virus SFV Esquilo (Sciurus sp) EUA Swinepox virus SWPV Suíno Mundial Molluscum contagiosum virus MOCV Humano Mundial Tanapox virus TANV Roedor e Humano África Yaba monkey tumor virus YMTV Macaco e Humano África Suipoxvirus Molluscipoxvirus Abreviação Yatapoxvirus (Adaptado de ESPOSITO et al., 2005) Os gêneros Orthopoxvirus e Parapoxvirus destacam-se como os principais causadores de poxviroses em humanos e animais domésticos, como demonstrado nas Tabelas 2 e 3. 2.1.2. Estrutura e composição dos poxvírus Os vírions dos poxvírus são os maiores, de importância médica e veterinária, descritos pela microscopia. As aparências das partículas virais variam de acordo com o método de preparação, mas a maioria dos poxvírus, quando observados por microscopia eletrônica, se apresentam como partículas em forma retangular medindo aproximadamente 250 X 200 X 200 nm. Em contraste, os vírus do gênero Parapoxvirus, Entomopoxvirus A e Entomopoxvirus B são ovóides e medem aproximadamente 260 X 160 nm (Tabela 7 e Figura 1). (MOSS, 2001) 8 Tabela 7. Família Poxviridae: Morfologia e tamanho do genoma. Subfamília Gênero Morfologia Tamanho aproximando Genoma Orthopoxvirus Retangular 200 Kbp Parapoxvirus Ovóide 140 Kbp Avipoxvirus Retangular 260 Kbp Capripoxvirus Retangular 150 Kbp Leporipoxvirus Retangular 160 Kbp Suipoxvirus Retangular 170 Kbp Retangular 180 Kbp Yatapoxvirus Retangular 145 Kbp Entomopoxvirus A Ovóide 260 -370 Kbp Entomopoxvirus B Ovóide 236 Kbp Retangular 250 -380 Kbp Chordopoxvirinae Molluscipoxvirus Entomopoxvirinae Entomopoxvirus C (Adaptado de MOSS, 2001) Figura 1. Micrografia eletrônica do Orthopoxvirus e Parapoxvirus A B A – Orthopoxvirus B – Parapoxvirus (SCHATZMAYR et al., 2000) 9 A estrutura dos poxvírus é complexa e carece de simetria icosaédrica ou helicoidal exibida por outros vírus, sendo envelopado por uma dupla membrana lipoprotéica. A maioria dos poxvírus é formada por uma camada externa de estruturas protéicas tubulares, arranjadas irregularmente, conferido uma aparência característica. Em contraste, os membros do gênero Parapoxvirus são cobertos por longos e finos túbulos protéicos que, por causa da superposição desses túbulos, parecem ser arranjados na forma cruzada, assemelhando-se a uma esfera de fios. A parte interior inclui um cerne bicôncavo e dois corpúsculos laterais de natureza desconhecida. O cerne contém o DNA viral e diversas proteínas virais (Figura 2). (MURPHY et al., 1999). Figura 2. Diagrama da estrutura do vírion dos gêneros Orthopoxvirus e Parapoxvirus. Corpúsculo Lateral Envelope Superfície Tubular Corpúsculo Lateral Membrana Externa Superfície Tubular Envelope Membrana Externa Cerne (DNA e Cerne (DNA e proteínas virais) proteínas virais) Membrana do cerne Membrana do cerne A – Gênero: Orthopoxvirus B – Gênero: Parapoxvirus (adaptado de FENNER, 1996) A composição química dos poxvírus assemelha-se a de uma bactéria. Os principais componentes dos vírions do Vaccinia virus, por exemplo, são proteínas, lipídeos e DNA, correspondendo 90%, 5%, 3,2%, respectivamente da composição dos vírions. Algumas das proteínas são glicosiladas ou fosforiladas, e os lipídios constituem em colesterol e fosfolipídios. (MOSS, 1996). O cerne contém um grande genoma viral de DNA de filamento linear duplo com tamanho variando de 130–380kbp, rico em bases de adenina e timina, com capacidade de codificar aproximadamente duzentas (200) proteínas, incluindo enzimas envolvidas no processo de síntese do ácido nucléico e componentes 10 estruturais dos vírus. A seqüência completa do genoma é conhecida em vários poxvírus como o VARV e o VACV (BROOKS et al., 2000). 2.1.3. Replicação dos poxvírus Os poxvírus são peculiares entre os vírus DNA, visto que todo ciclo de replicação ocorre no citoplasma das células infectadas. As células infectadas apresentam muitas inclusões intracitoplasmática denominadas “pocks”, que representam o local de replicação viral (TRIPARTHY et al., 1981). O ciclo de replicação dos poxvírus está esquematizado na Figura 3 e descrito abaixo nas alíneas a, b e c, sendo representado pelo Vaccinia virus, que é o protótipo dos poxvírus em termos de estrutura e replicação. Figura 3. Ciclo de replicação do Vaccinia virus. Cerne Envoltório Penetração Adsorção Replicação Desnudamento mRNA intermediário Fatores de transcrição tardios DNA-polimerase RNA-polimerase Fator de transcrição Enzima de formação do capsídeo Poli(A)-polimerase mRNA tardio Fatores de transcrição intermediários mRNA inicial RNA-polimerase Enzimas tardias Fatores de transcrição iniciais Proteínas estruturais Fatores nucleares ? Organização Envoltório de Golgi Maturação (EEV) Liberação (adaptado de MOSS, 1996) (IEV) (IMV) 11 a) Etapas 1, 2, 3 e 4 - Fixação, penetração e desnudamento do vírus: A partícula viral estabelece contato com a superfície celular e, a seguir, funde-se com a membrana celular, liberando o cerne no citoplasma. No interior dos poxvírus encontramos a RNA-polimerase viral que transcreve metade do genoma viral em mRNA precoce. Esses mRNAs após serem transcritos no interior do cerne do vírus são liberados no citoplasma da célula. A proteína de “desnudamento” produzida após a infecção viral libera o DNA viral dos cernes, finalizando a primeira parte do ciclo de replicação. b) Etapas 5, 6 e 7 – Replicação do DNA viral e síntese de proteínas virais: Entre as proteínas iniciais produzidas após a infecção pelo vírus, destacam- se a DNA-polimerase e a Timidina-quinase que são enzimas envolvidas na replicação viral. A replicação inicia-se logo após o processo de desnudamento, ocorrendo em regiões distintas do citoplasma, que aparecem como “fábricas” ou corpúsculos de inclusão em micrografias eletrônicas. Ocorre a transcrição de mRNAs intermediários, que cuja expressão precede temporariamente a dos mRNAs tardios. O mRNA viral tardio é traduzido em grandes quantidades de proteínas estruturais e em pequenas quantidades de outras proteínas e enzimas virais (BROOKS et al., 2000). c) Etapas 8, 9, 10, 11 e 12 - Maturação e liberação: As proteínas estruturais organizam-se para acondicionar o DNA, formando as partículas virais, chamadas de vírions maduros intracelulares infectivos (IMV), que são transportados pelos microtúbulos até o Complexo de Golgi, onde podem adquirir as membranas do Complexo, formando os vírus envelopados intracelulares (IEV); chegando à periferia da célula, fundem-se com a membrana citoplasmática da célula, resultando na liberação dos vírus envelopados extracelulares (EEV) (MOSS, 1996). 12 2.1.4. Mecanismos de evasão dos poxvírus Os poxvírus são especialmente adaptados para interferir na resposta imune do hospedeiro. Em primeiro, por possuírem um genoma com capacidade de codificar 150 – 200 proteínas, facilitando a codificação de proteínas que interfere na resposta imune do hospedeiro. E em segundo, por não dependerem dos mecanismos de transcrição da célula, pois codificam as enzimas e fatores necessários para a sua transcrição viral. Essas propriedades contribuem para a habilidade dos poxvírus de interferir na expressão dos genes do hospedeiro sem afetar a expressão dos genes virais (MOSS e SHISLER, 2001). Recentemente, descobriu-se que vários genes dos poxvírus assemelham-se a genes de mamíferos, que codificam proteínas semelhantes e/ou homólogas ao do hospedeiro, tornando-se passíveis de inibir os mecanismos de defesa do hospedeiro. Os exemplos incluem os homólogos com o receptor do fator de necrose tumoral, o receptor do interferon gama e o receptor de interleucina-1, que funcionam interrompendo as redes de complemento e outras citocinas importantes para resposta imune do hospedeiro (BOWIE et al., 2000). OIE e PICKUP (2001), descobriram que os poxvírus possuem a capacidade de interferir na regulação da ativação do NF-kB (Fator Nuclear kB) do hospedeiro, interferindo indiretamente na resposta imune inata e adquirida, pois o NF-kB abrange uma série de fatores de transcrição que regulam a expressão de numerosos genes que codificam proteínas que são elementos essenciais para resposta imune inata e adquirida do hospedeiro. 2.2. Poxviroses Bovina As lesões associadas as poxviroses ocorrem principalmente nas tetas e úbere de bovinos, apresentando-se principalmente nas formas proliferativas, ulcerativas e crostosas, abrindo porta para infecções secundárias. Essas lesões são dolorosas e geralmente não são diferenciadas de outras lesões nas tetas do bovino (TIMMS et al., 1998). O conhecimento sobre a epidemiologia e a história natural dos poxvírus e as suas conseqüências clínicas em bovinos tem evoluído nos últimos anos, mas continua sendo objeto de especulações. Roedores, felinos e bovinos são os 13 prováveis reservatórios desses agentes, servindo de fonte de infecção para outros animais e para o homem (WELBLEN, 2002). A transmissão geralmente ocorre pelas mãos dos ordenhadores ou pelo equipamento de ordenha, bem como pela inalação de partículas contaminadas. A penetração do vírus ocorre em lesões pré-existentes na pele, principalmente nas tetas e úbere (BLOOD e RADOSTITS, 1991). Os poxvírus geralmente são resistentes as condições ambientais, ao calor, dessecação, desinfetantes e são capazes de manter sua infectividade em restos celulares por muitos anos (MURPHY et al., 1999). As perdas econômicas resultam da inconveniência na hora da ordenha, por causa da sensibilidade das tetas, infecções secundárias como mastite, gastos com medicamentos e assistência veterinária (LIEBERMANN, 1999). No Brasil, poxviroses em bovinos foram descritas no Rio de Janeiro (SILVA e MORAES, 1960) e Minas Gerais (REIS et al.; 1970) e vários outros casos foram descritos ao longo dos anos (WELBLEN, 2002). Os mais recentes foram o que ocorreram no Estado do Rio de Janeiro acometendo o gado leiteiro e os ordenhadores (DAMASO et al., 2000, SCHATZMAYR et al., 2000, FERNANDES, 2003), Mato Grosso do Sul (FAGLIARI et al., 1999), São Paulo (TRINDADE et al., 2003) e Minas Gerais (LOBATO et al, 2004). 2.2.1. Varíola Bovina A varíola bovina ou varíola dos bovinos é uma doença de pele contagiosa e benigna de bovinos causada pelo Cowpox virus (CPXV), caracterizada pelo aparecimento de lesões pustulosas tipicamente nas tetas e úbere, raramente generalizada (MURPHY et al., 1999). A síndrome clínica ocorria de forma benigna e esporádica, restrita aos países da Europa e Ásia, mas a incidência parece ter diminuído, a ponto de ser rara nessas regiões. Em um rebanho atingido, a morbidade varia de acordo com as condições de higiene, cuidados com saúde e imunidade dos animais, causando perdas econômicas pela dificuldade no momento da ordenha, gasto com assistência veterinária, casos de mastite e assistência médica com os ordenhadores que geralmente são acometidos (WELBLEN, 2002). 14 A transmissão ocorre principalmente através das mãos dos ordenhadores e das ventosas das ordenhadeiras, sendo a transmissão por artrópodes uma opção ainda não confirmada. É uma zoonose quase que restrita aos ordenhadores, que são acometidos durante a ordenha e na manipulação com os animais doentes. A disseminação de um rebanho para outro ocorre provavelmente pela introdução de novos animais ou pelas mãos dos ordenhadores, onde os animais acometidos geram uma imunidade protetora, que pode permanecer por vários anos (MURPHY et al., 1999). A porta de entrada dos vírus são as soluções de continuidade nas tetas e úbere, onde após um período de incubação de 03 a 06 dias, há formação de um eritema roseolar, seguido de pápulas firmes e em relevo de cor clara, com uma zona de hiperemia em torno da base. Posteriormente ocorre a formação da vesícula e pústula amarelada com uma dura crosta, vermelha e aderida, medindo 1 a 2 cm, antes da cicatrização (BLOOD e RADOSTITS, 1991). Na fase inicial do desenvolvimento da doença pode ser observado febre prodrômica irregular e uma dor à pressão da teta e úbere, não permanecendo durante a cicatrização da lesão (LIEBERMANN, 1999). As lesões são principalmente observadas no período de vesícula, mas que logo se rompem pela ação mecânica da ordenha, formando uma úlcera que progride para o estágio de crosta, que geralmente são poucas por tetas, que podem não permanecer em vacas que estão sendo ordenhadas, sendo substituídas por uma ulceração profunda (MURPHY et al., 1999). As lesões normalmente estão localizadas nas tetas e úbere, podendo em casos mais graves, acometer partes interna da coxa e raramente o períneo, vulva e boca, abrindo porta para uma infecção secundária. O desenvolvimento da dor interfere na liberação do leite, dificultando a ordenha e facilitando o aparecimento de mastite (BLOOD e RADOSTITS, 1991). O prognóstico é bom, mas em geral as lesões permanecem de 3 a 10 semanas, de acordo com as medidas de controle das infecções secundárias (LIEBERMANN, 1999). No diagnóstico diferencial da varíola bovina deve-se levar em consideração as seguintes patologias: Pseudovaríola; Mamilite ulcerativa bovina; Impetigo do úbere; Fibropapiloma da teta; lesões pelo Vaccinia virus; Febre aftosa; Lesões traumáticas; Lesões químicas. (LIEBERMANN, 1999). 15 O CPXV pode causar infecções em bovinos, humanos, animais de zoológicos e animais domésticos, com distribuição dos casos nas regiões da Europa e Ásia (FENNER, 1996). No Brasil, ainda não temos relato de isolamento do CPXV de bovinos e humanos (TRINDADE et al., 2003). 2.2.2. Pseudovaríola A pseudovaríola bovina em bovinos, varíola mamária bovina ou “nódulos dos ordenhadores” em humanos é causada pelo Pseucowpox virus ou Paravaccinia virus (Vírus da Pseudovaríola-PCPV), do gênero Parapoxvirus, apresentando características morfológicas diferentes do gênero Orthopoxvirus (ESPOSITO et al, 2005). A forma de transmissão e disseminação são as mesmas apresentadas na Varíola bovina, diferindo no contexto de distribuição, na qual a Pseudovaríola tem distribuição mundial. A morbidade varia de 60 a 100% no gado bovino leiteiro, acometendo principalmente vacas recém paridas ou introduzidas no rebanho. O PCPV ocorre como infecções endêmicas em bovinos em muitos paises do mundo (MURPHY et al., 1999). O período médio de incubação é de seis dias, tendo como principal porta de entrada as soluções de continuidade na pele da teta e úbere. Inicialmente aparece um ligeiro edema ou eritema, ao qual segue a formação de uma película de exsudato brilhante que em 48 horas há formação de uma pápula. As pápulas formam finas escaras que cicatrizam, sem haver a formação de vesículas amareladas, como na varíola bovina. Os sintomas clínicos são variáveis, caracterizado por lesões crônicas ou agudas, podendo existir até 10 (dez) lesões por teta. (LIEBERMANN, 1999). As lesões agudas iniciam-se como eritema no local de replicação do vírus, progredindo para vesícula ou pústula que se rompem em 48h, formando finas escaras, que cicatrizam dando origem as crostas, que medem 0,5 a 2,5 cm de diâmetro. Após 10 dias elas se soltam deixando uma lesão anelada em forma de ferradura. A doença desaparece em média de 20 dias após os primeiros sintomas. As lesões crônicas também se iniciam como eritema, mas logo progridem para crostas cinza-amareladas, moles e escamosas, que são desgastadas pela ordenha, que podem persistir por meses. (BLOOD e RADOSTITS, 1991). 16 No diagnóstico diferencial da Pseudovaríola bovina devem ser consideradas as seguintes patologias: Varíola Bovina; Mamilite ulcerativa bovina; Impetigo do úbere; Fibropapiloma da teta; lesões pelo Vaccinia virus; Febre aftosa; Lesões traumáticas; Lesões químicas. (MURPHY et al., 1999). 2.2.3. Doença causada pelo Vaccinia virus O Vaccinia virus (Vírus vaccínia-VACV) faz parte do gênero Orthopoxvirus, que se originou provavelmente em isolado do vírus da varíola bovina. Sendo utilizado inicialmente para produzir vacinas contra a varíola humana (GUIDO e ESPER, 2002). Nas décadas de 60 e 70, época de intensa vacinação com VACV, eram comuns os relatos de surtos do VACV em animais domésticos, como bovinos, porcos e búfalos que eram contaminados pelas pessoas recém vacinadas que, por sua vez, transmitiam o vírus às pessoas em contato com as lesões (LUM et al.,1967, TOPCIU et al.,1976). Com a interrupção da vacinação, os surtos desapareceram, confirmando a suposição consenso na literatura de que o VACV não teria um reservatório animal, não permanecendo dessa forma na natureza (FENNER et al., 1989). A exceção ocorreu na Índia, com aparecimento de surtos de Buffalopox virus (BPXV), agente causal de uma zoonose de grande importância econômica, detectada até os dias de hoje (KOLHAPURE et al., 1997). Os primeiros relatos foram descritos nas décadas de vacinação antivariólica no Egito e na Índia, onde criações de búfalos eram afetadas. As lesões nas tetas e úberes dos búfalos eram transmitidas para vacas e para mãos e braços de ordenhadores, de forma semelhante às lesões por CPXV e VACV. Nos anos 80 comprovou-se que o BPXV é uma cepa do VACV, derivada provavelmente de cepas vacinais utilizadas na profilaxia da varíola naqueles países e que, de alguma forma, o vírus se estabeleceu na natureza encontrando algum reservatório animal (DUMBELL e RICHARDSON, 1993). O BPXV era considerado apenas uma exceção à regra. Contudo, a caracterização do vírus Cantagalo (DAMASO et al., 2000) e do vírus Araçatuba (TRINDADE et al.,2003) no Brasil, como causadores de infecções em bovinos e 17 ordenhadores, reforçaram a idéia de que o VACV pode realmente se estabelecer na natureza. Através de métodos moleculares, foi traçada a origem do vírus Cantagalo, como uma cepa vacinal (VACV-IOC), produzida no Instituto Oswaldo Cruz-RJ e utilizada na campanha da Organização Mundial de Saúde (OMS) para a erradicação da varíola no Brasil nos anos 60 e 70 (DAMASO et al., 2000); e o vírus Araçatuba como uma nova cepa do VACV ou um desdobramento do vírus Cantagalo (TRINDADE et al.,2003) 2.2.4. Estomatite Papular dos Bovinos A estomatite papular dos bovinos ou estomatite papulosa dos bovinos é uma doença viral infecciosa benigna, com distribuição mundial, caracterizada por lesões ulcerativas ou erosivas da mucosa oral de bovinos. É causada pelo Bovine papular stomatitis virus (Vírus da estomatite papular dos bovinos - BPSV), pertencente ao gênero Parapoxvirus. A sua importância baseia-se no seu diagnóstico diferencial e como abertura de porta para infecções secundárias. (MOSS, 1996). O Bovine papular stomatitis virus tem distribuição mundial, acometendo bovinos, mas também podem acometer o homem. A transmissão ocorre através de contato direto ou através de alimentos contaminados, ocorrendo principalmente na primavera e no verão, após ação de fatores estressantes para os animais (MURPHY et al., 1999). A morbidade pode alcançar 100%, principalmente na faixa etária de duas semanas a dois anos de idade, induzindo uma imunidade baixa e pouco duradoura, podendo ocorrer recidivas da infecção (BLOOD e RADOSTITS, 1991) As lesões iniciam-se como pequenas pápulas no local de penetração do vírus, adquirem coloração vermelho escuro, expandindo-se para periferia, e com aspecto arredondado. À medida que a lesão se expande, o centro fica cinza-acastanhado, coberto por um tecido necrótico, que se apresentam em crostas quando as lesões são externas (LIEBERMANN, 1999). As lesões estão confinadas ao focinho, narinas, mucosa da boca e ocasionalmente na mucosa do esôfago. Na boca as lesões acometem toda superfície interna, sendo mais comum nos lábios e próximo aos dentes. As lesões individuais cicatrizam de 04 (quatro) a 07 (sete) dias, podendo permanecer por 18 várias semanas, além de favorecer a entrada para infecções secundárias. O animal pode apresentar febre baixa (39,5 °C), anorexia transitória, ptialismo e perda de peso (BLOOD e RADOSTITS, 1991). 2.2.5. Dermatose Nodular dos Bovinos A Dermatose Nodular dos Bovinos, Doença da Pele Granulosa ou “Lumpy Skin Disease” é uma doença de evolução aguda, subaguda ou inaparente que afeta os bovinos; caracterizada por febre e aparecimento de nódulos cutâneos circunscritos que podem necrosar. A musculatura esquelética e mucosa do aparelho digestivo e respiratório também podem ser acometidas (LIEBERMANN, 1999). O agente etiológico da dermatose nodular dos bovinos é o Lumpy skin disease virus (Vírus da dermatose nodular dos bovinos), pertencente ao gênero Capripoxvirus, com características morfológicas semelhantes ao Vaccinia virus (MURPHY et al.,1999). O hospedeiro natural da Lumpy skin disease virus é o bovino e os hospedeiros experimentais são os ovinos, caprinos, girafas e antílopes. A distribuição geográfica da doença esta restrita na África, Egito e Israel, com morbidade variando entre 5 a 85% e mortalidade entre 1 a 10% (MURPHY et al.,1999). A transmissão ainda é desconhecida, sendo os artrópodes os principais suspeitos. O vírus tem sido encontrado na pele, lesões cutâneas, crostas, saliva, secreção nasal, leite, sêmen, músculo e linfonodos de animais acometidos. O período de incubação médio é de 12 dias, febre (40 - 41 °C) com duração de 4 a 14 dias, e surgimento de tumorações ou nódulos na pele medindo entre 1 a 5 cm, generalizado em todo o corpo. (LIEBERMANN, 1999). 13 O animal apresenta abatimento, anorexia, 14 salivação excessiva, secreção oculonasal e agalaxia; nódulos na pele, no tecido subcutâneo e musculatura; o aumento significativo dos linfonodos, podendo atingir em até quatro vezes o tamanho normal. Podem-se observar complicações como mastite, tendinite, artrite, aborto, infecção intra-uterina. As lesões podem durar semanas. (LIEBERMANN, 1999). 19 2.3. Diagnóstico O diagnóstico das poxviroses é realizado clínico e laboratorialmente. O diagnóstico clínico geralmente não é suficiente, tornando-se necessário estabelecer um diagnóstico laboratorial específico (IKETANI et al., 2002). Os testes para o diagnóstico específico das poxviroses são geralmente de três princípios: 1) Através da demonstração da partícula viral, antígeno viral ou ácido nucléico; 2) Através da demonstração do anticorpo viral; 3) Visualização das inclusões intracitoplasmaticas.(MURPHY et al.,1999). 2.3.1. Isolamento Viral As lesões cutâneas e o líquido vesicular constituem as amostras de escolha para o isolamento do vírus. Os poxvírus são estáveis e permanecem viáveis em amostras clínicas durante várias semanas, mesmo sem qualquer refrigeração (BROOKS et al., 2000). O isolamento do vírus é efetuado por inoculação do líquido vesicular ou macerado de crostas na membrana corioalantóide de ovo embrionário (MCA) ou em cultura de células de origem humana e de primatas, que são as mais susceptíveis (WELBLEN, 2002). Fibroblastos de embrião de galinha (CEF), células epitelióides do carcinoma laríngeo humano (HEp-2), células fibroblastóides de rim de hamster baby (BHK-21), Células do glioma de rato (C6), células epitelióides do túbulo distal de rim canino (MDCK), células fibroblastóides de rim de macaco verde africano (Vero), células epitelióides de rim de macaco verde africano (BSC-40) e fibroblastos de embrião de camundongos normais NIH/3T3 são as principais linhagens de células utilizadas no isolamento dos poxvírus (DAMASO et al., 2000). 2.3.2. Microscopia Eletrônica A microscopia eletrônica é um instrumento utilizado na diferenciação dos agentes, levando-se em conta o tamanho e a morfologia viral, a qual pode ser realizada de material clínico direto ou de cultura celular (BROOKS et al., 2000). 20 Os Orthopoxvivus possuem a forma retangular, medem 220-450nm de comprimento por 140-260nm de largura, mas não podem ser distinguidos uns dos outros à microscopia eletrônica, devido a seu tamanho e morfologia semelhantes. Entretanto, podem ser facilmente diferenciados dos Parapoxvirus que são ovóides e medem 250-300nm de comprimento por 150-190nm de largura (SCHATZMAYR et al., 2000). 2.3.3. Sorologia O diagnóstico sorológico baseia-se na detecção de anticorpos através de técnicas laboratoriais como: Ensaio imunoenzimático (ELISA), Inibição da Hemaglutinação (HI), Imunofluorescência (IF) e Soroneutralização Viral (SN), distinguindo entre os gêneros, mas nenhum desses testes distingue os vírus do gênero Orthopoxvirus uns dos outros (FENNER, 1996, KURODA, et al., 1999). 2.3.4. Diagnóstico histopatológico É realizada uma incisão tomando como amostra a escara e o tecido subjacente, enviando ao laboratório em solução de formalina a 10%, onde após preparo das amostras serão observadas as inclusões intracitoplasmaticas, que são patognomônicas (MURPHY et al.,1999). 2.3.5. Técnicas Moleculares As técnicas de biologia molecular de diagnóstico são utilizadas para caracterizar molecularmente o agente etiológico. A reação em cadeia da polimerase (PCR), constitui uma das principais técnicas de diagnóstico molecular na determinação dos agentes etiológicos das poxviroses (ROPP et al.,1995, MEYER et al.,1997). A técnica de PCR, desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis, consiste na amplificação específica de um curto segmento definido de ácido desoxirribonucléico (DNA) in vitro usando uma DNA polimerase, um molde de DNA genômico, desoxinuclotídeos-trifosfatos (dNTP`s – adenina, guanina, citosina e timina) e iniciadores 21 (primers) ou oligonucleotídeos flanqueando o segmento a ser amplificado (MEYER et al.,1994). A técnica de PCR possibilita a reprodução de milhares de cópias de um determinado fragmento de DNA molde, a partir de amostras de diferentes materiais como líquido vesicular, crostas, escaras das lesões e do isolado da cultura celular (ROPP et al.,1995). 2.3.6. Caracterização Molecular de Orthopoxvirus A caracterização molecular de um Orthopoxvirus pode ocorrer a partir de genes ou regiões subgenômicas conservadas do DNA viral, como os genes Timidina Quinase (TK), Corpúsculo de Inclusão do Tipo Acidofílico (ATI), Hemaglutinina (HA) (DA FONSECA, et al., 2002) O gene da hemaglutinina (HA) é um gene não estrutural que codifica uma glicoproteína do envelope viral na fase final da infecção por Orthopoxvirus. (DAMASO et al., 2000). A proteína do corpúsculo de inclusão citoplasmática do tipo acidofilíca é codificada pelo gene ATI, molecularmente caracterizada em várias espécies de Orthopoxvirus, porem alguns Orthopoxvirus podem não possuir esse gene (ULAETO, et al., 1996). O gene TK é um gene altamente conservado no genoma dos Orthopoxvirus, sendo responsável em codificar a timidina-quinase, uma enzima participante do metabolismo de ácidos nucléicos. Esse gene tem sido utilizado amplamente para caracterização molecular de Orthopoxvirus (TRINDADE, et al 2003). 2.4. Prevenção e Controle O tratamento das poxviroses bovina é sintomático, com uso de antibioticoterapia tópica ou sistêmica, e uso de soluções iodofórmicas para prevenção das infecções secundárias e agravamento das lesões (BLOOD e RADOSTITS, 1991). A prevenção e o controle consistem basicamente nas medidas de higiene na ordenha. Pois, não se dispõe de vacinas eficientes contra as poxviroses em bovinos e pouco se sabe sobre o papel do colostro ou imunidade passiva neste grupo de 22 enfermidades (ACHA e SZYFRES, 1986). A imunidade adquirida por uma infecção prévia com o Vaccinia virus ou Cowpox virus não protege os animais do Pseudocowpox virus (WELBLEN, 2002). A prevenção da disseminação é difícil, pois o vírus é transmitido por contato direto e indireto, entretanto para minimizar a disseminação deve-se: 1. Realizar a desinfecção correta das ordenhadeiras e antissepsia das mãos dos ordenhadores; 2. Evitar o trabalho de ordenhadores de outras propriedades; 3. Lavar as tetas com água e sabão, bem como a imersão em solução de tintura alcoólica de um desinfetante, antes da ordenha; 4. Ordenhar por último os animais com lesões, gerando uma linha de ordenha; 5. Examinar os tetos e o úbere antes da aquisição de animais de reposição; 6. Manter as tetas e úberes sadios; 7. Higienizar todas as instalações; 8. Não realizar o transporte dos animais doentes para outra propriedade; 9. Realizar a quarentena dos animais recém adquiridos; (Adaptado BLOOD e RADOSTITS,1991). 2.5. Infecção zoonótica humana por poxvírus Os vírus da família Poxviridae são epiteliotrópicos e comumente produzem lesões cutâneas no homem e animais. Dentre os oito (08) gêneros da família Poxviridae os Orthopoxvirus, os Parapoxvirus e os Yatapoxvirus são os mais conhecidos causadores de zoonoses humanas (Tabela 8). A maioria desses casos tem caráter ocupacional, esporádico, baixa morbidade e com lesões cutâneas. A exceção é o Monkeypox, com significante morbidade e mortalidade entre crianças. (JONES, 2004). 23 Tabela 8. Principais vírus da família Poxviridae causadores de infecção zooonótica. Gênero Vírus Cowpox virus Monkeypox virus Abreviação CPXV MPXV Buffalopox virus BPXV Vaccinia virus Cantagalo virus (Similar ao Vaccinia virus) Araçatuba virus (Similar ao Vaccinia virus) Passatempo virus (Similar ao Vaccinia virus) VACV - Orf virus ORFV Pseudocowpox virus ou Paravaccinia vírus Bovine papular stomatitis virus Sealpox virus PCPV - Estomatite papular dos bovinos Sealpox Tanapox virus TANV Tanapox Orthopoxvirus Parapoxvirus Yatapoxvirus Doença Cowpox ou Varíola Bovina Monkeypox ou Varíola dos macacos Buffalopox ou Varíola dos Búfalos Lesão localizada Lesão localizada Lesão localizada Lesão localizada BPSV Dermatite pustular contagiosa Pseudocowpox ou Nódulo dos ordenhadores Os casos de infecção zoonótica humana por poxvírus possuem em comum o aparecimento de lesões cutâneas após um período de incubação variável, com lesões que progridem de máculas para pápulas, podem desenvolver pústulas antes de formar crostas e cicatrizar. Geralmente observam-se poucas lesões cutâneas, usualmente associadas com febre, adenopatia e graus variáveis de prostração (BAXBY e BENNETT, 1997). 2.5.1. Monkeypox Monkeypox ou varíola dos macacos é causada pelo Monkeypox virus, uma poxvirose caracterizada por lesões pústulo-vesiculares na pele e mucosa, principalmente dos animais, podendo acometer os humanos, tendo como principais reservatórios os esquilos e outros roedores. A monkeypox humana é uma zoonose viral rara, endêmica na África Central e Ocidental, que recentemente emergiu nos 24 Estados Unidos da América, caracterizando a primeira ocorrência da monkeypox humana no hemisfério ocidental. (Di GIULIO e ECKBURG, 2004). Após 1997, o monkeypox humano atraiu pouca atenção mundial. Entretanto em maio de 2003, o CDC/Atlanta/EUA recebeu relatórios da região Central dos EUA, sobre 81 casos de pacientes que desenvolveram febre e rash cutâneo após o contato com cães da pradaria domesticados e outros mamíferos. Dos 81 casos, 32 foram confirmados laboratorialmente como Monkeypox humano, uma doença nunca relatada previamente no hemisfério ocidental (Di GIULIO e ECKBURG, 2004). As investigações identificaram uma remessa internacional de aproximadamente 800 pequenos mamíferos, como esquilos (Funisciurus spp, Heliosciurus spp), ratos gigantes da Gambia (Cricetomys spp), porcos-espinho (Atherurus spp) e ratos (Graphiurus spp, Hybomys spp) de Ghana para o Texas, como a fonte mais provável para a introdução de MPXV nos EUA, pois foram encontrados 06 animais infectados por MPXV. (CDC, 2003) 2.5.2. Varíola Bovina A varíola bovina ou cowpox é causa pelo CPXV, que acometem os bovinos e o homem, com característica zoonótica extremamente rara e restrita aos países da Europa e Ásia. Embora originalmente descrita como infecção adquirida pelos ordenhadores do gado bovino leiteiro, existem casos de infecção humana resultantes do contato com roedores (WOLFS et al, 2002). O período de incubação da varíola bovina no homem é de aproximadamente 07 (sete) dias. Inicialmente observa-se um abrupto aumento da temperatura, mal estar generalizado, associado com cefaléia, adenopatia regional, mialgia e algumas vezes náusea e vômito. As lesões cutâneas geralmente aparecem nas mãos e na face, iniciando com pápulas vermelhas, frequentemente solitárias que se transformam em pústulas com posterior formação de escaras enegrecidas, como observadas nas lesões do Antraz. Ocasionalmente desenvolvem-se lesões oculares, podendo causar cegueira, mas com baixa letalidade. (BAXBY et al, 1994). A infecção pelo Cowpox virus confere uma imunidade contra a varíola humana, fato explorado inicialmente por Edward Jenner em 1796 na Inglaterra, quando vacinou com sucesso uma criança contra varíola humana, utilizando material 25 da varíola bovina de um ordenhador. Contudo a imunidade decresce com o tempo, e uma segunda infecção pelo Cowpox vírus pode ocorrer (JONES, 2004). 2.5.3. Buffalopox O Buffalopox ou varíola do búfalo é uma doença endêmica no rebanho bufalino da Índia, ocasionada pelo BPXV, provavelmente uma subespécie do VACV. A doença nos búfalos, e por vezes nos bovinos, é indistinguível clinicamente da varíola bovina, podendo ser transmitida aos seres humanos, com aparecimento de lesões localizadas, semelhantes ao cowpox, mas menos severa (KOLHAPURE et al., 1997). Recentes surtos sugerem a existência de infecção subclínica, em que evidências sorológicas de anticorpos neutralizantes para BPXV têm sido encontradas em crianças que nunca tiveram contato com animais infectados. Algumas crianças têm desenvolvido lesões generalizadas quando em contato com familiares com BPXV, sugerindo a transmissão pessoa a pessoa (KOLHAPURE et al., 1997). 2.5.4. Cantagalo virus, Araçatuba virus e Passatempo virus Nos últimos cinco anos, inúmeros casos de doença pústulo-vesicular ocorreram em diversas fazendas nos Estados do Rio de Janeiro, São Paulo e Minas Gerais, acometendo o gado bovino leiteiro e pessoas, principalmente retireiros e seus familiares, nos quais as características clínicas e o diagnóstico laboratorial identificaram cepas de Vaccinia-like virus, da família Poxviridae como causador dos surtos. Na ocasião DAMASO et al. (2000), isolaram e caracterizaram molecularmente de lesões dos bovinos o Cantagalo virus (CTGV) na cidade de Cantagalo no Estado do Rio de Janeiro; TRINDADE et al. (2003), o Araçatuba virus na cidade de Araçatuba no Estado de São Paulo; LEITE (2003), o Passatempo virus em Passatempo no Estado de Minas Gerais e NAGASSE-SUGAHARA et al. (2004), o Vaccinia-like virus como causador de surtos de poxvirose em humanos nos Estados de Minas Gerais, São Paulo e Goiás. Como descrito no item 2.2.3. a origem do Cantagalo virus, através de métodos moleculares, foi traçada à cepa vacinal (VACV-IOC), produzida no Instituto 26 Oswaldo Cruz-RJ e utilizada na campanha da Organização Mundial de Saúde (OMS) para a erradicação da varíola no Brasil nos anos 60 e 70 (DAMASO et al., 2000). Determinou-se que tanto o Araçatuba virus e o Passatempo virus seriam novas cepa do VACV ou desdobramento do vírus Cantagalo (TRINDADE et al., 2003, LEITE, 2003), reforçando a idéia de que o VACV pode realmente se estabelecer na natureza, como observado com BPXV. As lesões cutâneas em humanos causadas pelos Cantagalo virus, Araçatuba virus, Passatempo virus e os outros Vaccinia-like virus são semelhantes às causadas pelo CPXV. (TRINDADE et al., 2003, LEITE, 2003, NAGASSESUGAHARA et al., 2004). 2.5.5. Dermatite pustular contagiosa, Nódulo dos Ordenhadores, Estomatite papular bovina A Dermatite pustular contagiosa é uma doença que acomete os ovinos e caprinos e o Nódulo dos Ordenhadores e a Estomatite papular bovina acomete principalmente os bovinos, mas o vírus pode ser transmitido ao homem através do contato direto com os animais infectados. É considerada uma doença humana ocupacional, onde a transmissão pessoa a pessoa ocorre raramente. O período de incubação varia de 03 a 07 dias, com aparecimento de pápulas eritrematosas que progridem para formação de escaras, que cicatrizam após 06 a 08 semanas. As características clínicas são similares, com aparecimento de lesões solitárias e em poucos casos generalizadas, usualmente na mão ou braço, facilmente reconhecidas em trabalhadores de áreas endêmicas. Contudo, lesões atípicas podem ser confundidas com antraz, cowpox, lesões herpéticas, granuloma piogênico e carcinoma de células escamosas. A cegueira tem sido relatada como complicação da Dermatite pustular contagiosa. (BOWMAN et al,1981; HANSEN et al, 1997; YIRREL e VESTEY, 1994) 2.5.6. Sealpox Sealpox ou varíola das focas é uma poxvirose que acomete principalmente as focas, podendo ser transmitidas ao homem, causando lesões semelhantes as da Dermatite Pustular Contagiosa. Os casos humanos descritos na literatura são de 27 tratadores de focas agredidos por animais infectados como as focas do porto (Phoca vitulina) e as focas acinzentadas (Halichoerus grypus). Recentemente um técnico em animais marinhos da costa da Escócia apresentou o desenvolvimento de lesões semelhantes a da dermatite pustular contagiosa, após a mordida de uma foca acinzentada. O diagnóstico laboratorial pelo PCR confirmou a presença do Sealpox virus como o agente causador do sealpox, descartando o Orf virus (JONES, 2004) 2.5.7. Tanapox Tanapox é uma infecção cutânea muito comum em regiões da África, sobretudo no Quênia e no Zaire, causada pelo Tanapox virus, um vírus que foi isolado pela primeira vez em 1962 no Quênia. É uma doença febril e está associada com uma ou duas lesões muito semelhante a do monkeypox, o que a torna importante no diagnóstico diferencial. Ocorre em todas as idades, principalmente entre os tratadores de animais, mas acredita-se que a transmissão por artrópodes contaminados seja possível. (JEZEK et al, 1985) O tanapox começa com um período febril de 3 a 4 dias, podendo incluir cefaléia intensa, prostração e adenopatia regional. Em geral, as lesões iniciam-se como pápulas que evoluem para uma necrose central, sem a formação de pústula, que cicatrizam em 4 a 7 semanas. Um recente caso foi relatado na Europa em um turista que retornara de uma viagem à África. (STICH et al, 2002) 28 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Distribuição das amostras Os espécimens clínicos foram coletados em 28 propriedades de gado de leite, com notificação de casos de doença pústulo-vesicular em bovinos e/ou pessoas, distribuídas em oito (8) municípios (Alegre, Atílio Vivacgua, Cachoeiro do Itapemirim, Castelo, Itapemirim, Piúma, Presidente Kennedy e Rio Novo do Sul) todos localizados no Sul do Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Os dados referentes às propriedades, aos animais e aos humanos foram anotados em planilhas de dados (em anexo). 3.2. Coleta dos espécimens clínicos Todas as amostras foram identificadas quanto à procedência, data, origem animal ou humana, tipo e local da lesão, idade, sexo, raça, sadio ou doente. Após a identificação, as amostras foram transportadas refrigeradas ao Laboratório de Sanidade Animal (LSA)/CCTA/UENF, e armazenadas a –20 oC. 29 3.2.1. Crostas das lesões As crostas das lesões de animais e ordenhadores foram coletadas com auxílio de uma pinça e acondicionadas em recipientes estéreis para posterior transporte. Foram coletadas um total de 50 amostras de crostas, sendo 3 de ordenhadores e 47 de bovinos de leite. 3.2.2. Sangue As amostras de sangue de bovinos e ordenhadores (adultos e jovens), doentes e sadios, foram coletadas em tubos vacuette (Greiner Bio-one) com ativador de coágulo e gel separador para posterior obtenção do soro no Laboratório de Virologia Veterinária LSA/CCTA/UENF. Foram coletadas um total de 200 amostras de sangue de bovinos (100 bovinos clinicamente doentes e 100 clinicamente sadios) e 91 amostras de sangue humana, sendo 89 de ordenhadores (67 clinicamente doentes e 22 clinicamente sadios) e 2 doentes não ordenhadores 3.3. Isolamento viral O isolamento viral, a partir das crostas, foi realizado no Laboratório de Vírus do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, em Belo Horizonte/MG. 3.3.1. Suspensão de crostas Cada amostra de crosta foi macerada em Solução Salina Tamponada (PBS) 0,01M pH 7.2 acrescido com gentamicina (100mg/L), anfotericina B (5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (400.000 U/L). A maceração ocorreu com auxílio de um gral e areia fina lavada e autoclavada. A suspensão obtida foi coletada e centrifugada a 2790 x g a 4 °C por 5 minutos em Microcentrífuga EPPENDORF, para coleta do sobrenadante e armazenamento em freezer -70 °C. 30 3.3.2. Multiplicação viral em membrana corialantóide de ovos embrionados Um volume de 100 µL do sobrenadante obtido do macerado de cada crosta, com auxílio de uma seringa de 1 mL e agulha 13 x 0,4 mm, foi inoculado na membrana corialantóide de ovos embrionados de galinha (MCA) com 10 dias de vida. Para a inoculação em membrana corialantóide realizou-se o deslocamento da câmara de ar dos ovos com auxílio do ovoscópio; os ovos encontravam-se previamente limpos e desinfectados com tintura de iodo 2%. Os ovos foram acondicionados em estufa umedecida a 37 °C durante 72 horas e transferidos para câmara fria a 4 °C por 12 horas. As MCA`s foram retiradas assepticamente dos ovos, coletando-se a região com presença de lesões do tipo “pocks”, e armazenadas a -70 °C. 3.3.3. Multiplicação viral em células Vero Cada amostra de MCA com lesão do tipo “pocks” foi macerada em Solução Salina Tamponada (PBS) 0,01M pH 7.2 acrescido com gentamicina (100mg/L), anfotericina B (5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (400.000 U/L). A maceração ocorreu com auxílio de um gral e areia fina autoclavada. A suspensão obtida foi coletada e centrifugada a 2790 x g a 4 °C por 5 minutos em Microcentrífuga EPPENDORF para obter a suspensão viral. Células Vero cultivadas em monocamada nas garrafas de cultivo celular de 50 mL (75 cm2)foram infectadas com 100 µL da suspensão viral diluída em 1 mL de meio Auto-pow (MEM – Meio mínimo de Eagle autoclavável da GibcoBRL), acrescido de gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (200.000 U/L). Após o período de 1 hora de adsorção em estufa a 37 °C, acrescentou-se 4 mL de meio Auto-pow (MEM – Meio mínimo de Eagle autoclavável da GibcoBRL), suplementado com 1% de soro fetal bovino (SFB) e com antibióticos gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (200.000 U/L). A garrafa foi mantida em estufa 37 °C até o aparecimento de efeito citopático (ECP) em forma de placa de lise. Após o aparecimento do ECP, o meio foi descartado da garrafa e as células desprendidas com auxilio de um raspador. As células desprendidas foram diluídas em Solução Salina Tamponada (PBS) 0,01M pH 7.2 e centrifugadas a 251 x g a 4 °C 31 por 5 minutos em Microcentrífuga EPPENDORF. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento (extrato celular) foi armazenado a -70 °C. 3.4. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para Orthopoxvirus A técnica de PCR para Orthopoxvirus, a partir do DNA viral extraído do extrato celular, foi realizada no Laboratório de Vírus do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, em Belo Horizonte/MG. 3.4.1. Extração de DNA viral As extrações de DNA viral foram realizadas através da técnica do Fenol/Clorofórmio a partir dos extratos celulares (item 3.3.3) como descrito por FONSECA (1998). 3.4.2. Amplificação dos genes ATI e TK As regiões codificadoras do gene ATI e TK foram amplificadas por meio da reação de polimerase em cadeia (PCR), utilizando uma mistura padrão, contendo 30ng de DNA viral extraído, 20 pmoles de iniciadores específicos, 20 mM de nucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 µL de tampão Taq polimerase 10X, 1,5 mM de MgCl2, 2,5 U de Taq polimerase (Promega, USA) e H2O Mili Q estéril, em um total de 20 µL de reação. As amostras foram cobertas com óleo mineral estéril e o processamento foi realizado em aparelho Perkin Elmer Cetus (Perkin, USA) modelo N 801-150 conforme descrito por LEITE (2003). Os oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a reação de PCR do gene ATI foram desenhados por MEYER et al (1997), a partir da região codificadora do gene ATI do Cowpox vírus: • ATI up: 5’ AATACAAGGAGGATCT 3’ • ATI low: 5’ CTTAACTTTTTCTTTCT 3’ As reações de PCR do gene ATI foram programadas com base na metodologia descrita por MEYER et al (1997): 32 • 01 ciclo de 94 °C por 5 minutos, 43 °C por 1 minuto e 72 °C por 2 minutos; • 30 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 43 °C por 1 minuto e 72 °C por 2 minutos; • 01 ciclo de 94 °C por 1 minuto, 43 °C por 1 minuto e 72 °C por 15 minutos. Os oligonucleotídeos utilizados como iniciadores para a reação de PCR para o gene TK foram desenhados por FONSECA et al (1998): • TK up: • TK low: 5’ GCAGAAGCTTTGAGTCGATGTAACAC 3’ 5’ GCGAGGATCCAACGGCGGACATATTCAG 3’ As reações de PCR do gene TK foram programadas com base na metodologia descrita por MARQUES et al (2001): • 01 ciclo de 95 °C por 5 minutos, 45 °C por 1 minuto e 72 °C por 2 minutos; • 30 ciclos de 95 °C por 1 minuto, 45 °C por 1 minuto e 72 °C por 2 minutos; • 01 ciclo de 94 °C por 1 minuto, 45 °C por 1 minuto e 72 °C por 15 minutos. Os fragmentos amplificados foram fracionados eletroforeticamente em gel de agarose 1%, acrescido de 0,5 µg/mL de brometo de etídio, sob voltagem de 110 V. Os fragmentos foram analisados e fotografados. 3.5. Soroneutralização para Orthopoxvirus A neutralização utilizando os soros inativados a 56 °C por 1 hora dos bovinos, ordenhadores e não ordenhadores clinicamente doentes e sadios foi realizada em placas de 6 poços, sendo que para cada soro utilizou-se um poço com 500.000 células VERO implantadas. O vírus utilizado foi o Vaccinia virus WR, diluído a 10-6 em meio Auto-pow (MEM – Meio mínimo de Eagle autoclavável da GibcoBRL), acrescido de gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (200.000 U/L). Os soros foram diluídos em meio Auto-pow, acrescido de gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (200.000 U/L), nas diluições de 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640. Para cada diluição de soro utilizou-se 300 µL do soro e 300 µL do vírus diluído a 10-6, preparando um mistura de 600 µl que foi mantida sob agitação a 37 °C por 1 hora, para posterior inoculação em células. As placas contendo células inoculadas, foram incubadas a 37 °C por 01 hora para a adsorção viral, em seguida acrescentou-se meio Auto-pow (MEM – Meio mínimo de Eagle autoclavável da GibcoBRL), suplementado com 1% SFB e 33 acrescido de gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (200.000 U/L), retornando a estufa a 37 °C até o aparecimento de ECP. Após o aparecimento de ECP as placas foram retiradas da estufa, o meio foi desprezado e as células foram fixadas em solução de formol 10% por 30 min e corados com solução de cristal violeta por 15 min. O titulo de cada soro foi obtido a partir da maior diluição onde houve redução de 50% do número de placas de lise com relação as placas produzidas no controle de vírus. O controle de vírus consistiu na utilização de uma placa inoculada com 300 µL do vírus diluído a 10-6 e 300 µL de meio Auto-pow (MEM – Meio mínimo de Eagle autoclavável da GibcoBRL) com 1% de SFB e acrescido de gentamicina (50mg/L), anfotericina B (2,5mg/L) e penicilina potássica ou sódica (200.000 U/L). 3.6. Divulgação e controle do surto Estabeleceu-se uma parceria técnica entre a Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), Instituto de Defesa Agropecuário e Florestal do ES (IDAF-ES) e Secretaria de Estado da Saúde, possibilitando, desta forma, a distribuição das informações sobre o surto e a identificação dos casos, envolvendo os produtores, a comunidade rural, os Postos de Saúde e os órgãos de Defesa Sanitária e Sanidade Animal do Estado do Espírito Santo. 34 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos a partir do estudo do surto de poxvirose bovina e humana no Estado do Espírito Santo estão sendo apresentados e discutidos em tópicos. 4.1. Distribuição geográfica dos casos de poxvirose bovina e humana Os casos de poxvirose bovina e humanas notificados e estudados no Estado do Espírito Santo ocorreram no período de agosto de 2002 a maio de 2005 em 28 propriedades de gado de leite de oito municípios (Alegre, Atílio Vivacqua, Cachoeiro do Itapemirim, Castelo, Itapemirim, Piúma, Presidente Kennedy e Rio Novo do Sul), localizados no Sul do Estado, como mostra a Tabela 9 e a Figura 4. Todos os oito (8) municípios encontram-se localizados na região Sul do Estado, próximos aos Estados do Rio de Janeiro e Minas Gerais, onde foram notificados surtos de poxviroses bovina e humana, como descrito por DAMASO et al (2000) e LOBATO et al (2004). Essa proximidade favorece o acometimento, nos outros 29 municípios do Sul do Espírito Santo, principalmente os 17 municípios que se encontram sob risco iminente da doença, por terem divisas com os municípios já acometidos, uma vez que a principal forma de disseminação da doença baseia-se na 35 comercialização informal de bovinos sem o acompanhamento dos órgãos fiscalizadores, como o IDAF-ES, prática essa comum entre as propriedades visitadas. Além disso, a utilização da mesma mão-de-obra (ordenhador) entre propriedades vizinhas, certamente contribuiu na disseminação da doença, tornadose necessário à aplicação imediata de ações de controle e profilaxia da doença, restringindo-se ao máximo a sua disseminação. Figura 4. Distribuição geográfica dos casos de poxvirose bovina e humana nos municípios do Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002 a maio de 2005. BA Casos de Poxvirose Bovina e Humana Municípios A. B. C. D. E. F. G. H. Alegre Atílio Vivacqua Cachoeiro de Itapemirim Castelo Itapemirim Piúma Presidente Kennedy Rio Novo do Sul MG Oceano Atlântico RJ 36 Tabela 9. Localização geográfica dos municípios do Estado do Espírito Santo com casos de poxvirose bovina e humana, no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Coordenadas Município Latitude Longitude Altura Alegre -20:45:49 Sul -41:31:59 Oeste 254 Atílio Vivacqua -20:54:51 Sul -41:11:54 Oeste 85 Cachoeiro de Itapemirim -20:50:56 Sul -41:06:46 Oeste 36 Castelo -20:36:13 Sul -41:11:05 Oeste 100 Itapemirim -21:00:40 Sul -40:50:02 Oeste 20 Piúma -20:50:16 Sul -40:43:19 Oeste 2 Presidente Kennedy -21:05:56 Sul -41:02:48 Oeste 55 Rio Novo do Sul -20:51:45 Sul -41:56:11 Oeste 70 Fonte: IBGE Ao comparamos a Tabela 10 com os dados do IBGE (2000) sobre produção de leite nos municípios e no Estado do ES, observamos que umas das principais regiões produtoras de leite do Espírito Santo, responsável por mais de 42% da produção de leite do Estado, já se encontra acometida pela doença, principalmente os municípios de Alegre, Cachoeiro de Itapemirim e Presidente Kennedy, que foram os mais acometidos, e que juntos representam mais de 33% da produção de leite do Sul do Espírito Santo. 4.2. Características epidemiológicas da poxvirose bovina Observa-se, na Tabela 10, que 28 propriedades de 08 dos 78 municípios localizados no Estado do Espírito Santo foram acometidas com a poxvirose bovina, onde as porcentagens da incidência clínica da poxvirose no gado leiteiro, variaram entre 10,2 e 100% com média de 52,7%, demonstrando a alta morbidade do vírus e o caráter epidêmico da doença, mesmo em propriedades com diferentes sistemas de manejos, como na fazenda G04, possuidora de um grande rebanho leiteiro. Os municípios mais acometidos foram Alegre, Cachoeiro de Itapemirim e Presidente Kennedy, possuindo 78,6% (n=22) das 28 propriedades acometidas no Estado do Espírito Santo. 37 Tabela 10. Incidência clínica da poxvirose no gado leiteiro em propriedades localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Município Propriedade Leiteira A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 N° Bovino de leite 58 40 45 30 13 34 12 50 60 40 25 N° bovinos clinicamente doentes 44 35 35 28 12 23 12 30 50 30 10 *Incidência Clínica - % 75,9 87,5 77,8 93,3 92,3 67,6 100 60 83,3 75 40 B01 08 04 50 C01 C02 C03 C04 C05 C06 C07 212 70 60 30 40 26 60 80 35 20 27 36 03 10 37,7 50 33,3 90 90 11,5 16,6 Castelo D01 30 30 100 Itapemirim E01 32 28 87,5 Piúma F01 30 06 20 Presidente Kennedy G01 G02 G03 G04 48 80 256 170 30 40 103 80 62,5 50 40,2 47 Rio Novo do Sul H01 H02 49 12 05 08 10,2 66,7 Total 28 1620 854 52,7 Alegre Atílio Vivacqua Cachoeiro de Itapemirim * Os cálculos das incidências foram realizadas no momento da visita em cada propriedade. An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul. 38 Tabela 11. Incidência clínica x sistema de higienização e antissepsia das tetas e das mãos dos ordenhadores nas propriedades com poxvirose no gado leiteiro no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Propriedade *Sistema de Higienização e Antissepsia das tetas A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 B01 C01 C02 C03 C04 C05 C06 C07 D01 E01 F01 G01 G02 G03 G04 H01 H02 não não não não não não não não não não sim não sim sim sim não não sim sim não não não não não não não sim não *Sistema de Higienização e Antissepsia das mãos dos ordenhadores não não sim não não não não não não não sim não sim sim sim não não sim sim não não não não não sim não sim não Incidência Clínica - % 75,9 87,5 77,8 93,3 92,3 67,6 100 60 83,3 75 40 50 37,7 50 33,3 90 90 11,5 16,6 100 87,5 20 62,5 50 40,2 47 10,2 66,7 * Informações obtidas a partir dos responsáveis pelas propriedades. An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul. Essa variação dos valores de incidência clínica observada em nosso estudo entre as propriedades, pode estar diretamente relacionada às medidas de higiene durante a ordenha. As propriedades que possuíam um sistema de higienização, antissepsia das tetas e das mãos dos ordenhadores, antes e após a ordenha, como na fazenda H01, tiveram uma das menores taxas de incidência, como mostrado na Tabela 11. Esses dados corroboram com a descrição de WELBLEN (2002), sobre a 39 transmissão das poxviroses bovinas, ocorrer principalmente por contato direto com as mãos do ordenhador e os equipamentos de ordenha. Tabela 12. Distribuição mensal do início da poxvirose no gado leiteiro nas propriedades no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Município Alegre Atílio Vivacqua Cachoeiro de Itapemirim Castelo Itapemirim Piúma Presidente Kennedy Rio Novo do Sul Propriedade A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 B01 C01 C02 C03 C04 C05 C06 C07 D01 E01 F01 G01 G02 G03 G04 H01 H02 Mês maio abril maio maio maio maio maio setembro setembro dezembro janeiro maio agosto agosto agosto setembro agosto outubro setembro outubro setembro outubro agosto setembro agosto agosto setembro outubro Ano 2003 2003 2003 2003 2003 2003 2003 2002 2002 2002 2003 2005 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2003 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2002 2002 An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul. Ao analisarmos a Tabela 12, detectamos que as primeiras propriedades acometidas pela poxvirose foram as localizadas em Presidente Kennedy e Cachoeiro de Itapemirim, e que a maioria dos casos de poxvirose bovina no gado leiteiro no Sul do Espírito Santo teve início entre os meses de maio e setembro, sugerindo um caráter sazonal da doença, principalmente no período seco no Estado. 40 A rápida disseminação da doença dentro da propriedade e para outras propriedades, os altos valores de incidência clínica e o possível caráter sazonal da doença no gado leiteiro do Espírito Santo, estão de acordo com o que fora relatado por LOBATO et al (2004), no gado leiteiro de Minas Gerais. 4.3. Quadro clínico da poxvirose no gado leiteiro. O quadro clínico da poxvirose no gado leiteiro do Sul do Espírito Santo consistiu-se basicamente de lesões pústulo-vesiculares cutâneas dolorosas, geralmente múltiplas, localizadas principalmente nas tetas, com 94,85% dos animais apresentando lesões restritas nas tetas, como mostra a Tabela 13. Tabela 13. Distribuição dos casos de poxviroses segundo localização das lesões no gado leiteiro nas propriedades localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Localização da lesão Teta Úbere e Teta Face Total N° de bovinos 810 43 01 854 % 94,85 5,03 0,12 100 Na fase inicial do desenvolvimento da doença, observou-se uma febre prodrômica irregular e uma dor à pressão da teta e úbere, as vesículas eram facilmente observadas, mas logo se rompiam, provavelmente pela ação mecânica da ordenha, formando uma ulceração que progredia para crosta, que cicatrizava em média de 20 dias após os primeiros sinais. As Figuras 5.A., 5.B., 5.C, 5.D. e 5.E., demonstram as etapas de desenvolvimento das lesões da poxvirose bovina, em que as lesões progrediam de pápula para pústula-vesicular, e rapidamente se transformavam em ulceração de borda irregular, com contornos eritemato-edematoso, formando crostas antes de cicatrizar. O quadro clínico da poxvirose bovina do gado leiteiro no Espírito Santo é compatível com outras poxviroses bovinas, como descrito por TIMMS et al. (1998) e MURPHY et al. (1999), mas com rápida disseminação. 41 Figura 5.A. Pápula Figura 5.B. Vesícula Figura 5.C. Múltiplas Úlceras Figura 5.D. Formação de crosta Figura 5.E. Lesão Cicatrizando Figura 5. Lesões pústulo-vesiculares ulcerativas nas tetas do gado leiteiro com poxvirose no Sul do Espírito Santo. 5.A. Formação de pápula; 5.B. Formação de vesícula; 5.C. Múltiplas úlceras irregulares nas tetas; 5.D. Formação de crosta; 5.E. Lesão em processo de cicatrização. 42 Tabela 14. Produção de leite x Incidência clínica da poxvirose no gado leiteiro em propriedades localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Município Propriedade Leiteira Incidência Clínica % * Queda na Produção de Leite - % A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 75,9 87,5 77,8 93,3 92,3 67,6 100 60 83,3 75 40 50 40 40 50 50 30 60 50 50 30 30 B01 50 40 Cachoeiro de Itapemirim C01 C02 C03 C04 C05 C06 C07 37,7 50 33,3 90 90 11,5 16,6 20 30 20 60 60 5 20 Castelo D01 100 60 Itapemirim E01 87,5 60 Piúma F01 20 10 Presidente Kennedy G01 G02 G03 G04 62,5 50 40,2 47 30 30 30 30 Rio Novo do Sul H01 H02 10,2 66,7 5 30 Total 28 52,7 36,4 Alegre Atílio Vivacqua *: A porcentagem de queda na produção de leite foi obtida a partir das informações dos responsáveis pelas propriedades. An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul. 43 Os dados apresentados na Tabela 14, baseiam-se nas informações da queda da produção leiteira fornecidas pelos responsáveis pelas propriedades, os quais mostram a queda na produção de leite das propriedades leiteiras acometidas com a poxvirose bovina, gerando grandes perdas econômicas, uma vez que as mesmas vivem da produção e comercialização do leite. Além da perda econômica com a queda na produção de leite, as propriedades tiveram prejuízos econômicos com gastos com medicamentos, honorários de médicos veterinários e dificuldade na contratação de ordenhadores, pois os mesmos estavam receosos com a doença ou já estavam acometidos pela mesma. Tabela 15. Distribuição dos casos de poxviroses do gado leiteiro, segundo idade e raça, em propriedades localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Faixa Etária em anos 05-07 08-10 02-04 Raça n° % Mestiça 139 100 Holandesa - Girolanda % n° % 343 94,23 215 83,98 59 62,10 756 88,52 - 10 2,75 24 9,38 22 23,16 56 6,56 - - 05 1,37 17 6,64 10 10,53 32 3,75 Parda Suíça - - 06 1,65 - - - - 06 0,70 Patuá - - - - - 04 4,21 04 0,47 95 11,12 854 100 139 16,28 % n° % Total n° Total n° 11-14 364 42,62 256 29,98 Considerando os dados da Tabela 15, 42,62% dos animais acometidos estavam dentro da faixa etária de 05 a 07 anos de idade, e 88,52% dos animais eram animais mestiços, mas com acometimentos nas várias faixas etárias e raças de bovino de leite. Esses dados estão de acordo com o padrão zootécnico do gado leiteiro do Sul do Espírito Santo, que segundo o IBGE (2000) e o IDAF-ES (Instituto Estadual de Defesa Agropecuária e Florestal do Espírito Santo) a faixa etária predominante é a de 05 a 10 anos, predominando animais mestiços e da raça holandesa. Com isso não podemos afirmar que exista diferenças de acometimento da doença entre as raças leiteiras e as faixas etárias acometidas, e sim com relação ao seu tipo de exploração, em que todos os animais eram bovinos leiteiros, destinados à produção de leite. 44 4.4. Características epidemiológicas da poxvirose humana Foram notificados e estudados 69 casos de poxvirose humana no Estado do Espírito Santo, onde todos ocorreram no mesmo período e nas mesmas propriedades dos casos de poxvirose bovina, como descritas no item 4.2. Dos 69 casos, 97,1% (67 indivíduos) exerciam trabalho pecuário e rural, com a função principal de ordenhador do gado bovino leiteiro, como mostrado na Tabela 16. Os outros dois casos foram de familiares dos ordenhadores. No primeiro caso, a de uma senhora de 34 anos, do lar e esposa de ordenhador. Relatou que não teve contato com os animais doentes e que contraiu a doença durante a lavagem das roupas do marido que estava clinicamente doente. No segundo caso, uma menina de 05 anos, filha de ordenhador doente, contraiu a doença ao perfurar a mão com a agulha utilizada pelo pai para romper a vesícula da sua mão, segundo relato dos pais. Esses dados demonstram que essa poxvirose é uma doença ocupacional com caráter zoonótico, como em outras infecções zoonóticas humanas por poxvírus descritas por JONES (2004). Tabela 16. Distribuição dos casos de poxvirose humana, segundo ocupação, nas propriedades leiteiras localizadas no Sul do Estado do Espírito Santo, visitadas no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Principal Ocupação N° % Ordenhador do gado bovino leiteiro 67 97,10 Do lar e esposa de ordenhador 01 1,45 Filha de ordenhador 01 1,45 69 100 Total Quando se observa a Tabela 17, verifica-se que os valores de incidência clínica da poxvirose entre os ordenhadores variaram de 0 a 100% com média de 75,28%, valores que demonstram a alta morbidade do vírus e o caráter epidêmico da doença entre ordenhadores, com valores maiores que nos bovinos, justificado pelo caráter ocupacional da doença, levando o homem a um contato maior e em mais vezes com os animais doentes, aumentando as possibilidades de transmissão. Observa-se também que somente as propriedades A03 e G03, das 28 propriedades com casos de poxvirose bovina, não apresentaram casos humanos, isso pode ser 45 explicado em parte pelo uso de luvas pelos ordenhadores no momento da ordenha dos animais doentes, e pela sistematização de antissepsia e assepsia durante e após a ordenha, como demonstrado na Tabela 11. Tabela 17. Incidência clínica da poxvirose nos ordenhadores de gado leiteiro no Sul do Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Município Propriedade Leiteira N° ordenhadores N° ordenhadores clinicamente doentes Incidência Clínica - % A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 03 04 03 02 02 01 04 06 03 01 02 03 02 0 02 02 01 04 03 03 01 01 100 50 0 100 100 100 100 50 100 100 50 B01 03 03 100 C01 C02 C03 C04 C05 C06 C07 04 05 04 04 03 02 05 04 04 02 04 01 02 05 100 80 50 100 33,3 100 100 Castelo D01 04 04 100 Itapemirim E01 02 02 100 Piúma F01 06 04 66,6 Presidente Kennedy G01 G02 G03 G04 02 02 02 02 02 01 0 02 100 100 0 100 Rio Novo do Sul H01 H02 04 04 01 04 25 100 Total 28 89 67 75,28 Alegre Atílio Vivacqua Cachoeiro de Itapemirim * Os cálculos das incidências foram realizadas no momento da visita em cada propriedade. An°:Propriedades localizadas em Alegre; Bn°:Propriedade localizada em Atílio Vivacqua, Cn°:Propriedades localizadas em Cachoeiro de Itapemirim, Dn°:Propriedade localizada em Castelo, En°:Propriedade localizada em Itapemirim, Fn°:Propriedade localizada em Piúma, Gn°:Propriedades localizadas em Presidente Kennedy, Hn°:Propriedades localizadas em Rio Novo do Sul. 46 4.5. Quadro clínico da poxvirose em humanos Lesões na pele, febre (igual ou superior 39°C), linfoadenomegalia regionalizado e mialgia foram os sinais e sintomas apresentados em 100% dos doentes. Com relação às lesões na pele, 100% dos indivíduos referiram ter tido vesículas com posterior formação de crostas. Segundo relato dos doentes, a fase inicial do desenvolvimento da doença apresentava-se uma febre prodrômica irregular igual ou superior 39°C, que durava de 03 a 07 dias, com mialgia, fraqueza muscular e linfoadenomegalia regional. As lesões iniciavam-se com prurido, dor e formações pústulo-vesiculares principalmente nas mãos, como demonstra a Tabela 18 e as Figuras 6.A., 6.B., 6.C., 6.D., 6.E., 6.F. Formavam crostas e cicatrizavam 15 a 30 dias após o seu aparecimento. Alguns casos necessitaram de hospitalização, mas todos evoluíram para cura, em torno de 20 a 30 dias. O quadro clínico dessa poxvirose é compatível com o quadro clínico do Cowpox virus em humanos, descrito por BAXBY et al (1994), mas com maior virulência, como os ocasionados por Vaccinia-like virus, em surtos de poxviroses, descritos por (DAMASO et al., 2000, TRINDADE et al., 2003, LEITE, 2003 e NAGASSE-SUGAHARA et al., 2004). Tabela 18. Distribuição dos casos de poxviroses, segundo localização das lesões nos ordenhadores do Sul do Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Localização da lesão Mão Mão e Braço Mão e Perna Mão e Boca Mão e Escroto Total N° de ordenhadores 57 06 02 01 01 67 % 85,01 8,95 3,02 1,51 1,51 100 Na Tabela 18 verifica-se, que 100% apresentaram lesões nas mãos. Dentre esses, 85,01% apresentaram lesões somente na mão. O restante apresentava além das lesões nas mãos, lesões no braço, na perna, boca e escroto; indicando a mão como local inicial e disseminador do vírus para as outras partes do corpo. 47 Figura 6.A. Lesão 10 dias Figura 6.C. Lesão 20 dias Figura 6.E. Lesões 20 dias Figura 6.B. Lesão 15 dias Figura 6.D. Lesão 20 dias Figura 5.F. Lesão 20 dias Figura 6. Lesões pústulo-vesiculares ulcerativas nas mãos de ordenhadores com poxvirose no Sul do Espírito Santo. 6.A. Lesão com 10 dias ; 6.B. Lesão com 15 dias vesícula; 6.C. Lesão com 20 dias; 6.D. Lesão com 20 dias; 6.E. Lesões com 20 dias; 6.F. Lesão com 20 dias 48 Comparando as Tabelas 13 e 18, pode-se observar que a região mais acometida dos animais é a teta e dos ordenhadores as mãos, evidenciando que essa seria a principal forma de disseminação do bovino ao homem e do homem aos animais, uma vez que o ordenhador trabalha em contato direto com a teta. Esses dados corroboram com os dados de TIMMS et al. (1998) e WELBLEN (2002), para as outras poxviroses bovinas do gado leiteiro e zoonoticas para homem. Tabela 19. Distribuição dos casos de poxviroses, segundo idade e sexo dos ordenhadores do Sul do Estado do Espírito Santo, no período agosto de 2002 a maio de 2005. Sexo Masculino n° % Feminino n° % n° 10 - 14 15 - 19 20 - 24 25 - 29 30 - 34 35 - 39 40 - 44 45 - 49 50 - 54 55 - 59 60 - 64 07 07 09 12 06 13 05 01 01 01 02 10,94 10,94 14,06 18,75 9,38 20,32 7,81 1,56 1,56 1,56 3,12 00 01 01 00 00 01 00 00 00 00 00 33,33 33,33 33,33 - 7 8 10 12 6 14 5 1 1 1 2 10,45 11,94 14,92 17,91 8,96 20,89 7,46 1,49 1,49 1,49 3,00 10,45 22,39 37,31 55,22 64,18 85,07 92,53 94,02 95,51 97 100 Total 64 95,52 03 4,48 67 100 100 Faixa etária Total % % acumulada Quando se observa a Tabela 19, verifica-se que os casos ocorreram em indivíduos de 10 a 64 anos, sendo que 92,53% concentraram-se em indivíduos com menos de 44 anos, principalmente na faixa etária de 35 a 39 anos correspondente a 20,89% dos casos. Quanto ao sexo, 95,52% se deram em indivíduos do sexo masculino. Esses dados refletem e estão de acordo com o perfil do trabalhador pecuarista do Espírito Santo, que em sua maioria são homens na faixa etária de 25 a 39 anos, segundo censo demográfico do IBGE em 2000. 4.6. Isolamento viral em MCA e células Vero Coletou-se um total de 50 amostras de crostas, nos diferentes municípios acometidos, sendo 03 de ordenhadores e 47 de bovinos de leite. Todas as 50 amostras foram maceradas e inoculadas na membrana corialantóide de ovos 49 embrionados de galinha (MCA) com 10 dias de vida (MCA`s), onde, após 72 horas, todas as MCA`s apresentaram lesões brancas e opacas, não hemorrágicas, característica de infecção por Orthopoxvirus, como descrito por FENNER et al, (1989) e observados por TRINDADE et al, (2003) e FERNANDES (2003), conforme ilustrado na Figura 7. A visualização deste efeito característico não só nos permitiu a confirmação da presença de um agente viral no material obtido, como também a identificação inicial deste agente como um membro do gênero Orthopoxvirus, como responsável do surto de poxvirose bovina e humana no Sul do Estado do Espírito. Figura 7. Membranas Corioalantódes de embriões de galinha (MCA) com múltiplas lesões brancas e opacas, não hemorrágicas, com 72h de incubação após inoculação com macerados de crostas dos bovinos e humanos com poxvirose. As 50 suspensões virais obtidas em MCA foram utilizadas para infecção em células Vero em monocamada, sendo que 15 amostras dos diferentes municípios (03 humanas e 12 do gado leiteiro) demonstraram ECP característico de vírus da Família Poxviridae. 4.7. Amplificação por PCR dos genes ATI e TK Realizou-se a extração de DNA viral das 15 amostras que demonstraram ECP na monocamada das células Vero, para realização da técnica de PCR dos genes ATI e TK. Todas as amostras foram amplificadas para ambos os genes, como mostra a Tabela 20 e visualizado com o gene TK na Figura 08. Esses resultados confirmando que o agente etiológico da poxvirose bovina e humana do Sul do Estado do Espírito Santo é do gênero Orthopoxvirus, provavelmente um Vaccinia- 50 like virus, como o vírus Cantagalo (CTGV) isolado por DAMASO et al.(2000), das lesões de bovinos na cidade de Cantagalo no Estado do Rio de Janeiro, o vírus Araçatuba isolado por TRINDADE et al. (2003), na cidade de Araçatuba no Estado de São Paulo, o vírus Passatempo por LEITE (2003), em Passatempo no Estado de Minas Gerais e o Vaccinia-like virus em humanos em Minas Gerais, São Paulo e Goiás por NAGASSE-SUGAHARA et al. (2004). Tabela 20. Dados sobre a caracterização molecular das amostras virais isoladas a partir do surto de poxvirose bovina e humana no Sul do Espírito Santo Amplificação por PCR Gene TK Gene ATI Humana 01 + + Humana 02 + + Humana 03 + + Bovina 01 + + Bovina 02 + + Bovina 03 + + Bovina 04 + + Bovina 05 + + Bovina 06 + + Bovina 07 + + Bovina 08 + + Bovina 09 + + Bovina 10 + + Bovina 11 + + Bovina 12 + + * amostras de DNA viral extraídos dos extratos celulares infectados *Amostra Essa confirmação de mais um Estado do Brasil, esta sendo acometido por surto de Orthopoxvirus, com disseminação entre animais e humanos, sustenta a necessidade de mais pesquisas sobre o assunto, principalmente na identificação de possíveis reservatórios animais e da Filogenética desses vírus. 51 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 530 pb 500 pb Figura 8. Amplificação por PCR do fragmento de DNA do gene TK das amostras de DNA viral extraídos dos extratos celulares infectados. Os produtos obtidos foram fracionados eletroforeticamente em gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo. Canaletas: M: Marcador de peso molecular; (1): Controle negativo; (2): Extrato celular infectado com amostra VV WR; (3): Extrato celular infectado com amostra humana; (4): Extrato celular infectado com amostra humana; (5): Extrato celular infectado com amostra humana; (6): Extrato celular infectado com amostra bovina; (7): Extrato celular infectado com amostra bovina; (8): Extrato celular infectado com amostra bovina; (9): Extrato celular infectado com amostra bovina; (10): Extrato celular infectado com amostra bovina; (11): Extrato celular infectado com amostra bovina; (12): Extrato celular infectado com amostra bovina; (13): Extrato celular infectado com amostra bovina; (14): Extrato celular infectado com amostra bovina; (15): Extrato celular infectado com amostra bovina; (16): Extrato celular infectado com amostra bovina; (17): Extrato celular infectado com amostra bovina; 4.8. Soroneutralização para Orthopoxvirus Os resultados dos testes de soroneutralização, para detectar a presença de anticorpos neutralizantes contra Orthopoxvirus, no sangue de 200 bovinos e 91 humanos, estão apresentados nas Tabelas 19 e 20. Na Tabela 21, verifica-se que somente 5% dos animais clinicamente doentes testados não apresentaram títulos de anticorpos neutralizantes contra o vírus do gênero Orthopoxvirus. 52 Esse resultado, provavelmente ocorreu, devido a coleta do sangue ter sido realizada no inicio da infecção. Observa-se que 50% dos animais clinicamente sadios no momento da coleta e sem historia de sintomatologia clínica, apresentaram títulos de anticorpos neutralizantes, demonstrando a alta ocorrência de animais assintomáticos. Isso certamente, diminuirá os efeitos esperados das ações de medidas de controle, tornando-se necessário a implementação de um controle sorológico para detectar esses animais, testes esses ainda não disponíveis comercialmente. Tabela 21. Porcentagem dos títulos de anticorpos neutralizantes para Orthopoxvirus, das amostras de soros bovinos de leite, coletados nas propriedades com surto de poxvirose no Sul do Estado do Espírito Santo, no período agosto de 2002 a maio de 2005. *Titulo do Soro **Estado Clínico Doente Sadio negativo 05% (n= 5) 50% (n=50) 1:20 02% (n= 2) 05% (n= 5) 1:40 17% (n=17) 10% (n=10) 1:80 27% (n=27) 35% (n=35) 1:160 25% (n=25) 1:320 20% (n=20) ≥ 1:640 04% (n= 4) Total 100% (n=100) 100% (n=100) * O titulo de cada soro foi obtido a partir do inverso da maior diluição na qual houve redução de 50% do número de placas de lise com relação as placas produzidas no controle de vírus ** Estado clínico: Doente (presença de lesões pustulo-vesicular); Sadio (ausência de lesões pustulo-vesicular) Quando se observa a Tabela 22, verificamos que mais de 90% dos ordenhadores clinicamente doentes apresentaram títulos altos de anticorpos neutralizantes para Orthopoxvirus, e somente dois ordenhadores foram negativos, fato esse devido, provavelmente, aos baixos níveis de anticorpos neutralizantes no momento da coleta do sangue. Ao analisar os clinicamente sadios, observa-se que 50% apresentaram anticorpos neutralizantes, isso pode ser explicado em parte por uma infecção subclínica nesses indivíduos. Outra possibilidade seria a memória imunológica induzida pela vacina contra Varíola humana, em alguns desses indivíduos. A vacina deixou de ser aplicada após a sua erradicação em 1980, segundo Organização Mundial da Saúde. 53 Realizou-se a soroneutralização dos 02 casos humanos clinicamente doentes, mas não ordenhadores relatados no item 4.4. Tanto a esposa de ordenhador quanto a filha de ordenhador, foram positivas na soroneutralização, com títulos de 1:320 e 1:80, respectivamente. Tabela 22. Porcentagem dos títulos de anticorpos neutralizantes para Orthopoxvirus das amostras de soros dos ordenhadores, coletados nas propriedades com surto de poxvirose no Sul do Estado do Espírito Santo, no período agosto de 2002 a maio de 2005. *Titulo do Soro negativo 1:20 1:40 1:80 1:160 ≥ 1:320 Total **Estado Clínico Doente 2,98% (n= 2) 2,98% (n= 2) 1,49% (n= 1) 28,36% (n=19) 23,88% (n=16) 40,31% (n=27) 100% (n=67) Sadio 50,00% (n=11) 18,18% (n=04) 4,54% (n= 1) 9,09% (n= 2) 4,54% (n= 1) 13,65% (n= 3) 100% (n=22) * O titulo de cada soro foi obtido a partir do inverso da maior diluição na qual houve redução de 50% do número de placas de lise com relação as placas produzidas no controle de vírus ** Estado clínico: Doente (presença de lesões pustulo-vesicular); Sadio (ausência de lesões pustulo-vesicular) A soroneutralização confirma que o Orthopoxvirus foi o agente etiológico do surto de poxvirose bovina e humana no Espírito Santo. 4.9. Fluxograma de notificação, identificação e controle do surto Estabeleceu-se uma parceria técnica entre a Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Universidade Federal do Espírito Santo, o Instituto de Defesa Agropecuário e Florestal do Espírito Santo (IDAF-ES) e Secretaria de Estado da Saúde, em que os casos suspeitos de poxvirose bovina e/ou humana fossem notificados e encaminhados ao Laboratório de Sanidade Animal/CCTA/UENF para visita e constatação do caso, conforme Fluxograma 01. . 54 Fluxograma 01. Fluxo das notificações de casos suspeitos de poxvirose bovina e/ou humana no Estado do Espírito Santo, no período de agosto de 2002 a maio de 2005. Casos humanos suspeitos de poxvirose Unidade Municipal de Saúde Casos bovinos suspeitos de poxvirose CCA/UFES Médicos Veterinários Secretaria Municipal de Saúde IDAF-ES Secretaria Estadual de Saúde LSA/CCTA/UENF CCA/UFES: Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo. IDAF-ES: Instituto de Defesa Agropecuária e Florestal do Espírito Santo. LSA/CCTA/UENF: Laboratório de Sanidade Animal do Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Essa parceria possibilitou uma maior abrangência, na notificação e detecção dos novos casos de poxvirose humana e bovina no Estado do Espírito Santo, facilitando e melhorando a distribuição das informações e do controle da disseminação da doença. Contamos com o envolvimento dos Produtores, da Comunidade Rural, dos Postos de Saúde, das Secretarias Municipais e Estadual de Saúde, bem como os órgãos de Defesa Sanitária e Sanidade Animal do Estado do Espírito Santo. A parceria contribuiu para a divulgação das informações sobre a doença e a implantação das ações de controle, que se basearam nos seguintes itens: 1. Implementação da linha de ordenha nas fazendas, bem como a realização da desinfecção das ordenhadeiras e antissepsia das tetas e das mãos dos ordenhadores; 2. Lavagem das tetas com água e sabão, e a imersão em solução de tintura alcoólica iodada a 2%, após a ordenha; 3. Evitar o trânsito na propriedade de pessoas, principalmente trabalhadores de outras propriedades; 55 4. Examinar as tetas e o úbere antes da aquisição de animais de reposição; 5. Proibição da comercialização dos animais das propriedades positivas; 6. Implementação da quarentena dos animais recém adquiridos 7. Manter as tetas e úberes sadios; 8. Promover a higiene de todas as instalações; 9. Orientação aos funcionários e proprietários das propriedades sobre a doença e as suas medidas de controle; 10. Divulgação da doença e do fluxograma de notificações, via comunicado através da Secretaria de Estado da Saúde e as Secretarias Municipais de Saúde. 56 5. CONCLUSÕES E SUGESTÕES O surto de poxvirose bovina e humana foi causado por um Orthopoxvirus, provavelmente um Vaccinia-like virus, com alta morbidade; A poxvirose bovina causada pelo Orthopoxvirus no Espírito Santo apresentou caráter epidêmico e com tendência a sazonalidade nos períodos mais secos, entre maio e setembro; A poxvirose humana causada pelo Orthopoxvirus no Espírito Santo é uma doença ocupacional e com caráter zoonótico; As propriedades de gado de leite dos municípios localizados na região Sul do Espírito Santo encontram-se sob risco iminente do surto de Orthopoxvirus; Essa poxvirose humana e bovina representa uma doença de importância econômica e de saúde pública. Medidas de controle devem ser implementadas pelos órgãos responsáveis pela Sanidade Animal e Humana, visando o controle da doença, impedindo sua disseminação para outras regiões. Estudos devem ser implementados, no intuito de descobrir possíveis reservatórios animais, e no estudo Filogenético desses vírus; 57 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACHA, P.N., SZYFRES, B. (1986) VIROSIS. IN: Zoonosis y enfermedades transmisibles comunes al hombre y a los animales. Organizacion Panamericana de la Salud, Publicación Científica n. 503, p. 297-551. BAXBY, D., BENNETT, M., GETTY, B. (1994) Human cowpox 1969-93: a review base don 54 cases. Br. J. Dermatol. 113:598-607. BAXBY, D., BENNETT, M. (1997) Poxvirus zoonoses. J. Med. Microbiol, 46:17-20. BLOOD, D.C., RADOSTITS, O.M. (1991) Doenças causadas por vírus e clamídias. In: Clínica Veterinária. 7. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p. 795-801. BOWIE, A., KISS-TOTH, E., SYMONS, J.A., SMITH, G.L., DOWER, S.K., O’NEILL, L.A.J. (2000) A46R e A52R from vaccinia virus are antagonistis of host IL-1 and tolllike receptor signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 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