BACTÉRIAS COMPETENTES- média de tempo

BACTÉRIAS COMPETENTES- média de tempo total: 4,5-5 horas.
Material:
2 tubos de LB
Placa de LB-agar (sem antibiótico)
50ml SOB* em Erlenmeyer de 100ml ou mais
Papel quadriculado (para desenhar o gráfico de crescimento)
50mM CaCl2 gelado
Gelo
Centrífuga refrigerada
Dia -2
1) Descer no -80C e pegar uma “pontada de ponteira” do estoque congelado de
bactérias E. coli HB101/DH5-/JM109 num tubo com 200ul LB
2) Plaquear 100ul do LB na placa LB-agar
3) Deixar crescer overnight
Dia -1 (final do dia)
1) Pegar uma colônia da placa LB-agar e crescer em 2ml LB com agitação a 370C
na sala de multiusuários
Dia da Transformação
1) Repicar 0,5ml de bactéria na cultura overnight no Erlenmeyer com 50ml SOB
(sem antibiótico). A diluição é de 1:100;
2) Coletar 150ul para medir o OD600 do tempo zero. Usar SOB puro como branco
da leitura no espectrofotômetro;
3) Deixar tubos Eppendorfs no gelo (número de tubos = dobro do número de
amostras a serem transformados);
4) Coletar 150ul e ler o OD600 depois de 2,5 horas. Anote os valores no papel
quadriculado. Se OD600 >=0,2 ler a cada 15 min (veja gráfico-padrão de crescimento no
anexo- as bactérias devem ser coletadas em fase log com duplicação em intervalos regulares ).
5) Ligue a centrífuga para refrigerar;
6) Chegando no valor OD600 0,4-0,6 pare o crescimento e distribua 1,4ml da
cultura em cada tubo Eppendorf no gelo;
7) Deixe no gelo 10min;
8) Centrifugue a 1600RCF por 30min na centrífuga refrigerada
9) Recoloque no gelo e remova gentilmente o sobrenadante e ressuspenda
gentilmente em 1ml de CaCl2 50mM;
10) Deixe no gelo 5 min;
11) Centrifugue a 1600 RCF por 30min;
12) Ressuspenda muiiiito muiiiito gentilmente em 100ul de CaCl2 50mM cada tubo
13) Junte 2 tubos (total 200ul) em 1 só.
ANEXO
Composição do SOB (ajustar pH para 7,4)
2% w/v tryptone (20 g)
0.5% w/v Yeast extract (5 g)
8.56mM NaCl (0.5 g) ou10mM NaCl (0.584 g)
2.5mM KCl (0.186 g)
ddH2O q.s.p. 1000 ml
10mM MgCl2 (anhydrous 0.952 g) AND 10mM MgSO4 (heptahydrate 2.467 g)
LB-agar
5g NaCl
5g Tryptone
2.5g Yeast Extract
7.5g Agar
q.s.p dH2O to 500mL
TRANSFORMAÇÃO DAS BACTÉRIAS- média de tempo total 1,5 horas
Material
Tubo(s) com 2ml SOC (SOB+ 20mM Glicose- não autoclavar, que carameliza.
Placa LB-Agar com antibiótico de seleção
Gelo
Placa quente a 370C ou 420C
Filtre)
1) Misture gentilmente o DNA ou reação de ligação (no máximo 10ul) em 200ul de
bactérias competentes.
2) Deixe no gelo por 20minutos
3) Dê o choque térmico por 2min a 370C ou 420C
4) Transfira as bactérias gentilmente para o tubo com SOC
5) Cresça 40min-2h com agitação a 370C na sala de multiusuários
6) Centrifugue a 4000RCF sem refrigeração
7) Decante o sobrenadante. Sobrará cerca de 100ul de SOC, não remova .
8) Ressuspenda e plaqueie na placa com LB-agar. Se tiver reação de ligação de
pGEMT, pode cobrir a placa com solução de IPTG-XGAL
9) Envolva a(s) placa(s) com filme PVC e incube overnight na estufa 35-37C