Citologia Microbiana - (LTC) de NUTES
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Farmácia Noturno 2013 Citologia Microbiana Fernanda Abreu [email protected] Introdução 1. Descoberta dos micro-organismos: Madigan et al, 2010 (12º Ed) - Robert Hooke: microscópio e observação de bolores (1655) Microscópio de Robert Hooke Introdução 2. Descoberta de bactérias: - Antoni van Leeuwenhoek em 1676 Microscópio de Robert Hooke Madigan et al, 2010 (12º Ed) Pequenos animálculos Introdução 2. Descoberta de bactérias: Ferdinand Cohn (fundador da Bacteriologia) - Botânico - Interesse na resistência térmica de bactérias: descrição do ciclo de vida de Bacillus - Bactéria filamentosa Beggiatoa mirabilis - Introdução do sistema de classificação bacteriana Madigan et al, 2010 (12º Ed) • Introdução 2. Descoberta de bactérias: - O que motivou novas descobertas na Microbiologia? - Questionamento a respeito da geração espontânea; - Questionamento a respeito da natureza das infecções. Louis Pasteur Robert Koch Introdução 3. Desenvolvimento da Microbiologia • Desenvolvimento de técnicas e inúmeras descobertas: subdisciplinas da ciência básica da microbiologia (sistemática, fisiologia, bioquímica, genética, virologia, citologia microbiana...) Madigan et al, 2010 (12º Ed) Citologia Microbiana • Bacteria / Archaea • Eukarya Madigan et al, 2010 (12º Ed) Bactérias e Arqueas coco 1. Morfologia celular bacilo Morfologia comuns Arranjos de células (geralmente específicos para gêneros) espiroqueta hifa pedúnculo Bactérias com brotamento e apendiculadas filamentosas Madigan et al, 2010 (12º Ed) espirilo Bactérias e Arqueas 1. Morfologia celular Outras formas Corpos de frutificação de mixobactérias Stella Candidatus Magnetoglobus multicellularis Bactérias e Arqueas 1. Morfologia celular Alguns grupos são imediatamente reconhecidos pela morfologia celular Ex.: espiroquetas Ex.Caso clínico: Streptococcus No entanto, geralmente, é impossível prever propriedades das células procarióticas tendo como base somente a morfologia celular Bactérias e Arqueas 1. Morfologia celular Determinação na morfologia celular • • Parede celular: confere forma e rigidez a célula Citoesqueleto: MreB e crescentina Bactérias e Arqueas Madigan et al, 2010 (12º Ed) 2. Tamanho celular e implicações Há grande variação no tamanho das células Bactérias e Arqueas 2. Tamanho celular e implicações Maior procarioto conhecido • Thiomargarita – Ambientes aquáticos ricos em H2S – Não cultivada – Presença de glóbulos de enxofre Madigan et al, 2010 (12º Ed) Bactérias e Arqueas 2. Tamanho celular e implicações O que faz com que a célula seja tão grande? - Restrições na capacidade de captação de nutrientes; Em geral, células menores crescem mais rapidamente que maiores: maior troca de nutrientes por unidade de volume celular. Maior taxa de mutações e vantagem adaptativa. Bactérias e Arqueas 2. Tamanho celular e implicações Limites para tamanho da célula Mínimo: todos os componentes necessários a sobrevivência e divisão devem estar presentes na célula, biomoléculas essenciais. Máximo: limitada taxa de troca de nutrientes com ambiente Bactérias e Arqueas 3. Membrana citoplasmática - Definição: estrutura delgada que envolve a célula que separa o interior da célula de seu ambiente. - Definição: barreira de permeabilidade seletiva que permite a concentração de metabólitos específicos e excreção de dejetos. - Conclusão: barreira física e de permeabilidade. Bactérias e Arqueas Madigan et al, 2010 (12º Ed) 3.1. Composição da membrana: bicamada fosfolipídica Bactérias e Arqueas 3.1. Composição da membrana: porção lipídica Tipos de lipídeos: - Glicolipídeos -Glicoglicerolipídeo (mais abundantes – glicerolípídeos com unidades de açúcar); -Glicoesfingolípídeos (não tem glicerol, mas bases nitrogenadas de cadeia longa tipo esfingosina). -Hopanoides Madigan et al, 2010 (12º Ed) - Glirecolipídeos -Fosfolipídeos (estrutura básica da membrana); e outros Bactérias e Arqueas 3.1. Composição da membrana: Estabilização da membrana Pontes de H, interações hidrofóbicas, Mg2+ e Ca2+ (interações iônicas com a carga negativa dos fosfolipídeos). Fluidez da membrana Relativamente fluida Bactérias e Arqueas 3.1. Lipídeos da membrana arqueas: - Diferem dos encontrados em Bacteria e Eukarya; Bactérias e Arqueas 3.1. Lipídeos da membrana arqueas: - Não possuem ácidos graxos unidos por ligação éster ao glicerol; - Cadeias hidrofóbicas: unidades repetidas do hidrocarboneto de 5 carbonos isopreno; ligação éter com glicerol. 20 carbonos Bactérias e Arqueas 3.1. Lipídeos da membrana arqueas: - Arquitetura da membrana de arqueas Monocamada: resistente a separação. Ex.: hipertermófilas Bactérias e Arqueas 3.2. Composição da membrana: porção proteica - Proteínas de membrana: porções hidrofóbicas e hidrofílicas - Proteínas integrais: firmemente embebidas na membrana - Proteínas periféricas: não estão embebidas, mas associadas às superfícies da membrana. Ex.: lipoproteínas. Geralmente interagem com proteínas integrais de membrana. - Organização em segmentos: agrupadas de acordo com sua interação ou função celular Bactérias e Arqueas 3.3. Composição da membrana: carboidratos - Até 1970: glicosilação era considerado processo exclusivo de eucariotos; - Membrana: - Glicoproteínas - Glicolipídeos Bactérias e Arqueas 3.4. Funções da membrana celular Bactérias e Arqueas 3.5. Tipos de transporte através da membrana A. Difusão: pequenas moléculas hidrofóbicas Exceção: H2O: capaz de penetrar livremente aquaporinas: aceleram o processo Difusão facilitada Bactérias e Arqueas 3.5. Tipos de transporte através da membrana - Pq a necessidade de transportadores? Vida: Acúmulo de solutos contra gradiente de concentração - Propriedades das ptns transportadoras: - Efeito de saturação Bactérias e Arqueas 3.5. Tipos de transporte através da membrana - Propriedades das ptns transportadoras: - Alta especificidade: única molécula ou classe de moléculas (açúcares ou aa) - Regulação de sua biossíntese pela célula: em função tipo e concentração de nutrientes. Ex.: determinado nutriente em concentração muito baixa, necessita de transportador de maior afinidade. Bactérias e Arqueas 3.5. Transporte através da membrana - Proteínas transmembrana: • Possuem 12 domínios α-hélice que dobram-se através da membrana, formando um canal; • O evento de transporte envolve alteração conformacional da proteína transportadora após sua ligação ao soluto. Bactérias e Arqueas 3.5. Tipos de transporte através da membrana - portador Bactérias e Arqueas Ptn transmembrana 3.5. Tipos de transporte através da membrana Estrutura e função das ptns transportadoras Bactérias e Arqueas 3.5. Tipos de transporte através da membrana B. Transporte simples: Energia próton motiva Escherichia coli Bactérias e Arqueas 3.5. Tipos de transporte através da membrana C. Translocação de grupo: Sistema fosfotransferase -Glicose, manose ou frutose -Substancia transportada é quimicamente modificada -Fosforilações e desfosforilações em cascata até o transportador real, que fosforila o açúcar transportado Escherichia coli Bactérias e Arqueas 3.5. Tipos de transporte através da membrana D.Proteínas periplasmáticas de ligação e sistema ABC Transporte com a participação de: -Proteínas periplasmáticas de ligação; - Transportadora de membrana; - Proteínas que hidrolisam ATP. ABC: ATP-binding-cassete: cassete de ligação ATP Transporte de: açúcares, aa, sulfato, fosfato e metais traços. Em bactérias Gram-positivas: proteínas de ligação ao substrato estão ancoradas à superfície externa da membrana citoplasmática. Escherichia coli Bactérias e Arqueas 3.6. Secreção em procariotos Translocases: proteínas responsáveis pela exportação e inserção de outras proteínas na membrana citoplasmática procariótica. Ex.: Sistema translocase Sec: enzimas hidrolíticas Sistema de secreção do tipo III: secreção de toxinas por bactérias patogênicas Bactérias e Arqueas 4. Membranas internas - Formadas por invaginação da membrana celular - Possuem funções específicas envolvidas na geração de ATP - Ex.: - Bactérias Nitrificantes: amônia monooxigenase – oxidação da amônia - Bactérias Fotossintéticas: bacterioclorofilas e outros pigmentos Bactérias e Arqueas 5. Citoplasma - Contém: proteínas, nucleóide, ribossomos, pequenas moléculas orgânicas (aa, açúcares, vitaminas, coenzimas,...). - Possui alta concentração de solutos: gera pressão de 2 atm – equivalente a pressão de pneu de automóvel. Bactérias 5. Citoplasma - “Organelas”: estruturas com funções específicas - Clorossomos: estruturas que captam luz para fotossíntese em bactérias verdes sulfurosas e não sulfurosas. - Anamoxossomos: estrutura onde ocorre a oxidação da amônia; - Carboxissomos: estruturas poliédricas que contém a enzima ribulose-bisfosfato carboxilase oxigenase (RuBisCO); onde ocorre a fixação de Carbono; - Magnetossomos: por membrana. estrutura formada por cristal magnético envolto Bactérias e Arqueas 6. Inclusões celulares: - Atuam no armazenamento de energia ou reservatório de outro constituinte; - Vantagem do armazenamento de substâncias em forma insolúvel: redução do estresse osmótico que existiria se a substância fosse armazenada na forma solúvel. - Exemplos de inclusões: - Polímeros de armazenamento de carbono; - Polifosfato e enxofre; - Inclusões magnéticas (magnetossomos). Bactérias e Arqueas 6. Inclusões celulares: Polímeros de armazenamento de carbono: - Poliidroxialcanoatos são inclusões lipídicas comuns em bacterias; - Grânulos de glicogênio: forma comum de reserva de polissacarídeos; - Sintetizadas quando há excesso de carbono; -Utilizados como fonte de carbono e energia em condições de escassez. Bactérias e Arqueas 6. Inclusões celulares: Polifosfato e enxofre: - Polifosfato: grânulos de fosfato inorgânico PO42-. São utilizados como fonte de fosfato para síntese de ácidos nucleicos e lipídeos e também na produção de ATP. - Enxofre: produzidos durante a oxidação de H2S; utilizados na ausência de H2S, em que são oxidados a sulfato. São periplasmáticos e não citoplasmáticos. Bactérias e Arqueas 6. Inclusões celulares: Inclusões magnéticas (magnetossomos): Bactérias e Arqueas 6. Vesículas de gás: - Procariotos planctônicos possuem vesículas de gás que possibilitam a flutuação. - Função: posicionamento na coluna d’água em resposta a fatores ambientais. - Presentes em bactérias e arqueas. - Membrana da vesícula formada por proteínas (GvpA e GVpC): rigidez e impermeabilidade a água e solutos. Bactérias e Arqueas 7. Parede celular - Confere forma e rigidez a célula: impede lise devido a pressão interna; - Diferenças estruturais são utilizadas nas reações de coloração e classificação das bactérias; - Gram-positivas e Gram-negativas Bactérias 7. Parede celular Espessa e predomínio de único tipo de molécula Multicamadas e complexa Bactérias 7. Parede celular - peptidoglicano: camada rígida de polissacarídeo composto por dois derivados de açúcares, N-acetilglicosamina e ácido Nacetilmurâmico, unidos por ligação glicosídica β – 1,4. Bactérias 7. Parede celular - peptidoglicano: • Formado também por alguns aa (L-alanina, Dalanina, ácido Dglutâmico e lisina ou ácido diaminopimélico, que associam-se ao polissacarídeo, formando o tetrapeptídeo glicano. Bactérias 7. Parede celular - peptidoglicano: • Ligação β(1,4): estabilidade em apenas 1 eixo. • Ligações cruzadas são necessárias para garantir rigidez na direção X e Y. Bactérias 7. Parede celular - Ligações cruzadas: • Interligam as cadeias de polissacarídeos; • Ocorrem em graus diferentes nas espécies de bactérias; • Quanto maior o número de ligações cruzadas, maior a rigidez; Bactérias 7. Parede celular - Ligações cruzadas: Gram-negativas: Grupo amino do DAP de uma cadeia + grupo carboxil da Dalanina de outra cadeia. Gram-positivas: Ponte interpeptídica: natureza e número de aminoácidos da ponte variáveis. Bactérias 7. Parede celular - peptidoglicano: Apresentam grande diversidade (+ de 100 tipos em 2009). Diversidade relacionada a química das ligações cruzadas e pontes interpeptídicas. Bactérias 7. Parede celular - Bactérias Gram-positivas: - 90% da parede formada por peptidoglicana; Possuem até 25 camadas interconectadas; Possuem ácidos teicoidos; Possuem ácido lipoteicoico; Possuem Proteínas associadas a parede. Ácidos teicoicos: são todos os polímeros de parede celular, de membrana citoplasmática ou capsulares que contêm resíduos de glicerol-fosfato ou ribitol fosfato. Bactérias e Arqueas 7. Parede celular - Lisozima protoplastos: - - e Lisozima: Enzima que cliva as ligações glicosídicas β -1,4, enfraquecendo a parede. Protoplasto Esferoplasto Bactérias 7. Parede celular - Bactérias que não possuem parede celular - Micoplasmas: bactérias patogênicas; possuem esteróis na membrana citoplasmática, o que a deixa rígida . - Thermoplasma: arquea (lipídeos diéter e tetraéter) Bactérias 7. Parede celular - Bactérias Gram-negativas: - 10% da parede formada por peptidoglicano; - Possuem periplasma - Possuem membrana externa; Bactérias 7. Parede celular - Bactérias Gram-negativas: Membrana externa -Formada por lipopolissacarídeos (LPS); e fosfolipídeo em uma camada; -Camada interna possui lipotroteínas que ligam a membrana externa ao peptidoglicano -Composição variada dependendo da espécie; -Componentes do LPS: polissacarídeo O, p. cerne, lipídeo A; 7. Parede celular Bactérias - Bactérias Gram-negativas: Membrana externa - Impede a difusão de proteínas localizadas externamente a membrana citoplasmática; - É tóxica aos animais; - Propriedades tóxicas relacionadas a porção do lipídeo A: endotoxina; - Relacionada aos sintomas de infecções por patógenos (Salmonella, Shigella e Escherichia, ...; gases, diarreia e vômito,...); - ME é relativamente permeável a moléculas pequenas: porinas - Porinas: canais que permitem a entrada e saída de substâncias hidrofílicas de baixa massa molecular; - Porinas: - Inespecíficas: canais preenchidos por água - Específicas: possui sítio de ligação para substâncias estruturalmente relacionadas Associação de 3 subunidades idênticas Bactérias 7. Parede celular - Bactérias Gram-negativas: Periplasma - É o espaço situado entre a superfície externa da membrana citoplasmática e a superfície interna da membrana externa; - Contém alta concentração de diversas proteínas (quimiotaxia, transporte, ptns hidrolíticas...), resultando em uma consistência semelhante a gel. 7. Parede celular Bactérias - Micobactérias - Gênero de actinobactérias patogênicas. Ex.: Mycobacterium tuberculosis. - Parede formada por 3 tipos de moléculas interligadas: - peptidoglicano - arabinogalactana - ácido micólico (60%) - Coram mal por Gram - Técnica de Ziehl-Neelsen: - técnica de coloração para bactérias álcool-ácido resistentes. Arqueas 7. Parede celular - Arqueas: - Não possuem peptidoglicano; - Não possuem membrana externa; - Algumas possuem pseudomureína Methanobacterium Arqueas 7. Parede celular - Arqueas: - Algumas possuem outros polissacarídeos Carregado negativamente: ligação a íons Na+ do ambiente, o que resulta na estabilização da parede. Halococcus 7. Parede celular - Arqueas: - - Camada S: tipo mais comum de parede em arqueas; Também chamada de camada superficial paracristalina; Formada por proteínas ou glicoproteínas que apresentam aspecto ordenado quando observadas ao TEM; Também presente em bactérias; Corresponde sempre a camada mais externa; Funções: rigidez para evitar ruptura osmótica; barreira seletiva (passagem de substância de baixa massa molecular- ex.: evitar vírus no ambiente); retenção de proteínas próximo à superfície celular. Arqueas Bactérias e Arqueas 8. Outras estruturas de superfície - Camadas da superfície; - Pili e fímbrias; Bactérias e Arqueas 8. Outras estruturas de superfície: - Camadas da superfície: formados por polissacarídeos e proteínas secretados pela célula. - Cápsula: camada formada por composto em matriz compacta que exclui pequenas partículas como tinta nanquim. - Camada limosa: camada não tão compacta, facilmente deformável, frouxamente ligada a superfície da célula. Bactérias e Arqueas 8. Outras estruturas de superfície: Funções das camadas de superfície : - Adesão a superfícies sólidas; - Inibição do reconhecimento e destruição da célula bacteriana pelas células fagocitárias do sistema imune; - Resistência a dessecação. Bactérias e Arqueas 8. Outras estruturas de superfície: - Pili e fímbrias: são estruturas filamentosas proteicas que são projetadas a partir da superfície da célula. - Fímbrias são mais curtas e estão presentes na célula em elevado número; os pili são semelhantes às fímbrias, porém mais longos e presentes em menor número (uma ou poucas cópias). Bactérias e Arqueas 8. Outras estruturas de superfície: - Funções: - Fímbrias: adesão - Pili: adesão, troca genética entre células na conjugação, motilidade celular (motilidade pulsante), secreção. Pilus P de E.coli Pilus T de Agrobacterium tumefaciens Bactérias e Arqueas 8. Outras estruturas de superfície - Prosteca ou pedúnculo: - São extensões verdadeiras da célula, contendo citoplasma, peptidoglicano e membrana celular. Funções: -Adesão, agrupamento; -Melhor aquisição de absorção de nutrientes. Bactérias 9. Endosporos: - Células diferenciadas de resistência produzidas durante o processo de esporulação. - Resistência: calor, dessecamento, carência nutricional, radiação... Bactérias 9. Endosporos: - Forma de dispersão de algumas bactérias; - Bacillus e Clostridium; * esporo germinação Sinal ambiental: célula cessa o crescimento Refringência do esporo ativação extrusão Bactérias 9. Endosporos: - Estrutura: Apresenta camadas que não são observadas na célula vegetativa: • Exospório • Capa do esporo • Parede do cerne • Córtex (peptidoglicano com ligaçãoes cruzadas frouxas) • Cerne (membrana citoplasmática, citoplasma, ribossomos, nucleóide, e outros constituintes celulares). Bactérias 9. Endosporos: - Cerne: - Rico em acido dipicolínico (DPA)e Ca2+ - Complexo (DPA) e Ca2+ representa 10% do peso seco do esporo. - Função do complexo: - redução da disponibilidade de água (aumento da termoresistência, maior resistência a agentes químicos como H2O2 e inativação de enzimas); - estabilização do DNA contra desnaturação térmica (intercala-se entre as bases). DPA Bactérias 9. Endosporos: - Cerne: - Rico em pequenas proteínas ácido-solúveis (PPASs); - PPASs: - São sintetizadas durante o processo de esporulação - Funções: - Ligam-se ao DNA do cerne, compactando-o e protegendo-o contra danos causados pela radiação U.V., dessecamento e calor seco; - Atuam como fonte de carbono e energia na extrusão de uma nova célula vegetativa a partir do endósporo em germinação. Bactérias Estágio 0: Célula vegetativa 9. Endosporos: - O processo esporulação: de Compactação do DNA Estágio 1 - Série de eventos de diferenciação celular Divisão celular assimétrica - Ex.: subtilis Septo do endósporo cresce ao redor do protoplasto Estágio 2 Bacillus (8 horas) Estágio 3 Formação do pré-esporo Bactérias Estágio 3 9. Endosporos: Síntese do exospório e córtex Desidratação Estágio 4 Incorporação de Ca2+ Desidratação Produção de DAP e PPAS Formação da capa Estágio 5 Maturação Estágio 6 Lise celular Estágio 7 Endósporo livre Bactérias e Arqueas Momento Jurassic Park • Por quanto tempo um endósporo pode sobreviver? – Amostra de 25-40 milhões de anos. Endósporo do intestino da abelha extinta. Conclusão dos trabalhos: Acredita-se que os endósporos podem durar milhões de anos.
