utilizado no diagnóstico laboratorial para Anemia

FESURV – UNIVERSIDADE DE RIO VERDE
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES IN VIVO EM TEMPO FIXO (TETF)
ALEXANDRE PROTO CONTE
Orientadora: Profª. Drª. VIVIAN ALONSO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Medicina Veterinária da
Fesurv - Universidade de Rio Verde, como
parte das exigências para obtenção do título
de Médico Veterinário.
RIO VERDE-GO
2010
FESURV – UNIVERSIDADE DE RIO VERDE
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES IN VIVO EM TEMPO FIXO (TETF)
ALEXANDRE PROTO CONTE
Orientadora: Profª. Drª. VIVIAN ALONSO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Medicina Veterinária da
Fesurv - Universidade de Rio Verde, como
parte das exigências para obtenção do título
de Médico Veterinário.
RIO VERDE-GO
2010
ALEXANDRE PROTO CONTE
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES IN VIVO EM TEMPO FIXO (TETF)
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Medicina Veterinária da
Fesurv – Universidade de Rio Verde como
parte das exigências para obtenção do título
de Médico Veterinário.
APROVADO EM: 15/06/2010.
Profª. MSc. Amanda Carla Acipreste
MSc. Paulo Vinícius da Costa Mendes
Galvão
Profª. Drª. Vivian Alonso
(Orientadora)
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a minha mãe Neide Proto dos Santos por ter me proporcionado
a oportunidade de realizar o meu maior sonho, ser Médico Veterinário.
Ao meu avô Adésio Ferreira dos Santos que me ensinou a ser a pessoa quem sou
hoje, minha avó Anelita Proto dos Santos que sempre me amou com todo seu amor e a meus
queridos e amados avós Benedita Zanoni e Irio Conte (in memorian).
Ao meu padrinho Ricardo Conte (in memorian), que apesar da distância sempre foi
um exemplo para minha vida.
A todos os meus familiares e amigos que sempre estiveram ao meu lado, me dando
forças para seguir em frente nos momentos de dificuldades.
Ao amor da minha vida, Taize Lúcia de Oliveira!
Meus sinceros agradecimentos a todos!
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus familiares por me proporcionarem a educação e caráter que
tenho para seguir minha caminhada.
A minha mãe Neide, meu pai Sergio e aos meus queridos avós Adésio, Anelita,
Benedita e Irio (in memorian).
A todos os meus professores que tiveram paciência, compreensão e dedicação para
passar um pouco de seu conhecimento, nos dando base para nos tornarmos Médicos
Veterinários.
Ao Fernando Proto Leão e a Ana Mônica, que ao final das tardes, sempre tinham
aquela cervejinha gelada para acabar com o estresse do dia a dia.
Aos meus amigos de alojamento da Sucupira Fazenda Show 2010/1 durante meu
estágio curricular, Osny (Delegado), José Felipe (Zé Mijão), Eleonora (Leo Locaaaa), Luiz
Fernando (Mineiro), Raimundo Nonato (Coca 600), Rafael Kerkhoff (BT), Andrei Fidelis
(meu Patrão), Heitor (Boca) e ao Oscar (Farofa e/ou Carcaça).
Ao Dr. Ricardo Alamino Figueiredo, por me proporcionar a oportunidade de estágio
na EMBRAPA.
Ao Médico Veterinário Paulo Vinícius.
A minha professora, coordenadora e orientadora Vivian Alonso.
Ao meu calouro eterno Caio (Tatu).
Ao quarteto fantástico, meus grandes amigos e irmãos Diego Neves Ribeiro, Juarez
Furtado Lima e Pedro Ferreira Leão Neto e a todos os meus amigos de faculdade, vulgo Feios
que não poderei escrever todos os nomes aqui porque a Vivian me disse que já tem muitos
nomes.
RESUMO
CONTE, Alexandre Proto. Relatório de estágio curricular supervisionado obrigatório na
área de reprodução animal. 2010. 46f. Monografia (Graduação em Medicina Veterinária) –
Fesurv - Universidade de Rio Verde, Rio Verde, 20101.
O presente relatório tem como objetivo descrever as atividades realizadas durante o Estágio
Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária realizado na Empresa Nacional de
Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) – Campo Experimental Sucupira Assis Roberto de Bem
(CES), localizado no Distrito Federal, cidade satélite Riacho Fundo II, na área de Reprodução
Animal. Dentre as atividades desenvolvidas foi colocada em destaque a transferência de
embrião in vivo em tempo fixo (TETF), onde a técnica tem como objetivo um maior
aproveitamento de fêmeas doadoras, de alto valor genético e de um macho reprodutor,
melhorando a dissipação de animais geneticamente melhorados além da preservação de
animais em extinção.
PALAVRAS-CHAVE
Bovinos, biotecnologia, reprodução, hormônio(s).
1
Banca Examinadora: Profª. Drª. Vivian Alonso (Orientadora); Profª. MSc. Amanda Carla Acipreste Galvão;
MSc. Paulo Vinícius da Costa Mendes.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
Estágios de desenvolvimento embrionário em bovinos..............................
27
FIGURA 2
Protocolo adotado para superovulação e sincronização de doadoras.......... 32
FIGURA 3
Protocolo adotado para sincronização de receptoras..................................
FIGURA 4
Coleta de embriões utilizando-se sistema fechado...................................... 33
FIGURA 5
Rastreamento dos embriões........................................................................
FIGURA 6
Palheta para transferência de embrião......................................................... 37
33
35
LISTA DE TABELAS
TABELA1 Biotécnicas reprodutivas em fêmeas da espécie bovina e eqüina........................ 14
TABELA 2 Biotécnicas reprodutivas em machos da espécie bovina e eqüina.......................
14
TABELA 3 Procedimentos cirúrgicos e pós-cirúrgicos nas espécies suína, ovina e
casqueamento de ovinos......................................................................................
15
TABELA 4 Protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF)...............................
15
TABELA 5 Hormônios utilizados para a indução do cio e da ovulação................................. 19
TABELA 6 Protocolo Ovsynch............................................................................................... 21
TABELA 7 Classificação dos embriões segundo a qualidade................................................
28
TABELA 8 Classificação dos embriões segundo estágio de desenvolvimento......................
28
LISTA DE ABREVIATURAS
BBGA – Banco Brasileiro de Germoplasma Animal.
BSA – Bovine Serum Albumin.
Bi – Blastocisto inicial.
Bl – Blastocisto.
Bx – Blastocisto expandido.
Bn – Blastocisto em eclosão.
Be – Blastocisto eclodido.
CES – Campo Experimental Sucupira.
CT – Centro Treinamento.
CENARGEN - Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia.
CL – Corpo Lúteo.
D0 – Dia 0.
D5 – Dia 5.
D6 – Dia 6.
D7 – Dia 7.
D8 – Dia 8.
D9 – Dia 9.
D14 – Dia 14.
D16 – Dia 16.
EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária.
EUA – Estados Unidos da América.
eCG/PMSG - Gonadotrofina sérica da égua prenhe.
FSH – Hormônio folículo estimulante.
GnRH – Hormônio liberador de gonadotrofinas.
IA – Inseminação artificial.
IATF – Inseminação artificial em tempo fixo.
IETS – International Embryo Transfer Society.
LH – Hormônio luteinizante.
Mo – Mórula.
Mc – Mórula compacta.
P4 – Progesterona.
PGF2α – prostaglandina.
PBS – phosphate-buffered saline.
S.B.T.E – Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões.
SP – São Paulo.
SOV – Superovulação.
SFB – Soro fetal bovino.
SVC – Soro de vaca em cio.
TE – Transferência de embrião.
US – Ultrassonografia e/ou Ultrasom.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 12
2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS.................................................................................. 14
3 REVISÃO DE LITERATURA: Transferência de embriões in vivo em tempo fixo
(TETF)................................................................................................................................... 16
3.1 Histórico..........................................................................................................................
16
3.2 Vantagens e desvantagens da TE....................................................................................
17
3.3 Seleção de doadoras........................................................................................................
17
3.4 Seleção de receptoras......................................................................................................
18
3.5 Escolha do reprodutor/sêmen..........................................................................................
19
3.6 Sincronização do ciclo estral de receptoras..................................................................... 19
3.6.1 Sincronização de cio com PGF2α................................................................................
20
3.6.2 Ovsynch........................................................................................................................ 21
3.6.3 Sincronização de ovulação com GnRH, estrógeno, progesterona e eCG para TETF..
21
3.7 Superovulação de doadoras..........................................................................................
22
3.8 Inseminação das doadoras.............................................................................................
25
3.9 Coleta de embriões........................................................................................................
25
3.9.1 Classificação embrionária..........................................................................................
27
3.10 Inovulação.....................................................................................................................
29
4 RELATO DA ATIVIDADE E DISCUSSÃO: TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES IN
VIVO EM TEMPO FIXO (TETF)......................................................................................... 31
4.1 Seleção de doadoras........................................................................................................
31
4.2 Seleção de receptoras......................................................................................................
31
4.3 Superovulação e indução de ovulação múltipla..............................................................
32
4.4 Coleta de embriões..........................................................................................................
33
4.5 Manipulação dos embriões..............................................................................................
34
4.6 Exame e avaliação de embriões....................................................................................... 36
4.7 Lavagem dos embriões utilizando meio Holding............................................................ 37
13
4.8 Envase dos embriões.......................................................................................................
37
4.9 Inovulação.....................................................................................................................
38
5 CONCLUSÕES.................................................................................................................. 39
REFERÊNCIAS....................................................................................................................
40
1 INTRODUÇÃO
O presente relatório tem como objetivo descrever as atividades desenvolvidas
durante o estagio curricular supervisionado, onde sua primeira etapa foi realizada na
EMBRAPA – Campo Experimental Sucupira Assis Roberto de Bem (CES), localizado no
Distrito Federal, cidade satélite Riacho Fundo II, no período de 08 de março a 14 de maio de
2010, perfazendo um total de 296 horas, sob a orientação da Médica Veterinária Vivian
Alonso e supervisão do Médico Veterinário Ricardo Alamino Figueiredo.
Faz parte da fazenda o Banco Brasileiro de Germoplasma Animal (BBGA) que
possui cerca de 57 mil doses de sêmen e de embriões conservados em nitrogênio líquido, e
cerca de 192 animais de diversas espécies como bovinos, bubalinos, ovinos, caprinos, suínos,
asininos e eqüinos que estão alojados na fazenda devido ao risco de extinção, para
preservação das espécies e como fonte de pesquisa. Desde 1983 foi feito um trabalho no
sentido de identificar os núcleos de criação desses animais rústicos, onde as informações
foram coletadas por meio de contato com criadores desses animais sobre o meio em que
viveram e vivem. Muitos deles foram encontrados em lugares isolados. Os pesquisadores da
EMBRAPA estão coletando sêmen e embriões desses animais para serem congelados e
preservados para as gerações futuras. A biotecnologia neste caso é usada como uma
ferramenta de preservação, ao contrário das outras linhas de pesquisas que visam
principalmente, o melhoramento genético animal.
A fazenda Sucupira, conta com dois laboratórios, sendo um de biotécnicas
reprodutivas da fêmea, que conta com um Médico Veterinário responsável pela realização das
atividades, da EMBRAPA – CENARGEN, o Centro de Treinamento (CT) que é o laboratório
do macho onde são feitos experimentos relacionados ao macho como coleta, avaliação e
criopreservação de sêmen, sendo este de responsabilidade de um Técnico em Laboratório,
além dos alunos de mestrado, os quais desenvolvem projetos de pesquisa, estagiários de
várias partes do país e funcionários terceirizados pela empresa Planalto Service, os quais
realizam todas as atividades referentes ao manejo agrícola, zootécnico, veterinário e
administrativo. Junto ao CT encontra-se o laboratório do BBGA. As instalações contam com
três currais para manejo dos animais, sendo um próximo a cada laboratório de biotecnologia e
13
outro para treinamento e manejo geral dos animais. Outra parte do CES é a caprinocultura,
suinocultura e ovinocultura que se localizam na mesma área e contam com exemplares de
animais dessas espécies objetivando a preservação de animais em extinção e projetos de
pesquisa.
Na fazenda encontram-se três clones bovinos sendo eles a Vitória da raça Simental
que nasceu no dia 17 de março de 2001 com 50 quilos, gerada a partir da célula de um
embrião que não nasceu (primeiro clone brasileiro), a vaca Lenda da raça Holandesa nascida
em 4 de setembro de 2003, que representou mais um marco para a história da ciência no
Brasil: o desenvolvimento do primeiro clone no Brasil a partir de um animal que já estava
morto e Potira (in memorian) e Porã da raça Junqueira os últimos clones de sucesso da
Embrapa Recursos Genéticos que podem representar uma chance de salvação para a raça
Junqueira, hoje praticamente extinta no Brasil. Os seus descendentes ficam em vitrines
(piquetes). Na EMBRAPA foram produzidos também as éguas Branca e Neve que são as duas
primeiras potras nascidas no Brasil pela técnica de bipartição de embriões. Elas são gêmeas
idênticas geradas em úteros distintos, ou seja, foram desenvolvidas a partir de um único
embrião, dividido em duas partes iguais, que foram transferidos para duas éguas receptoras,
ou "mães de aluguel". "Branca" nasceu no dia 23 de dezembro de 2004 e "Neve" no dia 4 de
janeiro de 2005.
A escolha pela EMBRAPA-CENARGEN para realização do estágio curricular
supervisionado foi devido à existência de alta biotecnologia da reprodução animal e a
presença de profissionais qualificados.
A segunda etapa do estágio foi realizada na Empresa Juarez Furtado de Lima e Cia
afiliada a Lagoa da Serra LTDA, no período de 25 de maio a 14 de junho de 2010, perfazendo
105 horas, em Rio Verde – GO.
2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
Atividades desenvolvidas e/ou acompanhadas durante a realização do Estágio
Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, na área de reprodução animal voltada
para a área de biotecnologia da reprodução e práticas de manejo em bovinos, eqüinos,
caprinos, ovinos e suínos na EMBRAPA - Recursos genéticos e biotecnologia, no período de
08 de março a 14 de maio de 2010, estão descritas nas tabelas 1, 2 e 3.
TABELA 1 Biotécnicas reprodutivas em fêmeas da espécie bovina e eqüina.
Atividades desenvolvidas
Número
%
Coleta de ovários em abatedouro (número de ovários)
720
45,71
Punção (aspiração) folicular em ovários de abatedouros
60
3,81
Coleta de embriões bovinos por lavagem uterina (número de estruturas)
70
4,44
Coleta de embriões por laparotomia (número de animais)
02
0,13
Número de embriões coletados por laparotomia
16
1,02
Transferência de embriões cirúrgica
02
0,13
Classificação e manipulação de embriões
79
5,02
Coleta de sêmen (bovino) utilizando vagina artificial
87
5,52
Coleta de sêmen (bovino) utilizando eletroejaculador
19
1,21
Inseminação Artificial
37
2,35
Criopreservação de sêmen
73
4,63
Coleta (D7) e re-coleta (D14) de embriões
30
1,91
Superovulação (número de animais)
45
2,86
Protocolo de Sincronização de Receptoras de Embriões
60
3,81
Treinamento de inovulação de embriões em vacas/novilhas
51
3,24
Treinamento com US do aparelho reprodutivo de fêmeas bovinas
93
5,90
Treinamento com US do aparelho reprodutivo de fêmeas eqüinas
69
4,38
Diagnóstico de gestação por palpação retal em éguas
27
1,71
Avaliação de dinâmica folicular em éguas por US
35
2,22
TOTAL
1575
100%
TABELA 2 Biotécnicas reprodutivas em machos da espécie bovina e eqüina.
Atividades desenvolvidas
Número
%
Coleta de sêmen (bovino) utilizando vagina artificial
87
39,37
Coleta de sêmen (bovino) utilizando eletroejaculador
19
8,60
Criopreservação de sêmen
73
33,03
Acompanhamento de monta natural por garanhão eqüino
42
19,00
TOTAL
221
100
15
TABELA 3
Procedimentos cirúrgicos e pós-cirúrgicos nas espécies suína, ovina e
casqueamento de ovinos.
Atividades desenvolvidas
Número
%
Casqueamento de ovinos (número de animais)
115
80,98
Necropsia em suínos e jumentos
04
2,83
Tratamento de linfadenite (ovinos)
15
10,56
Tratamentos pós-cirúrgicos
08
5,63
TOTAL
142
100
Atividades desenvolvidas e/ou acompanhadas durante a realização do Estágio
Curricular Supervisionado em Medicina Veterinária, na área de reprodução animal voltada
para a área de biotecnologia da reprodução na Empresa Juarez Furtado de Lima e Cia. afiliada
ao CRV Lagoa – Genética a toda prova, no período de 25 de maio a 14 de junho de 2010,
estão descritas na tabela 4.
TABELA 4 Protocolos de inseminação artificial em tempo fixo (IATF).
Atividades desenvolvidas
Número
Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF)
387
TOTAL
387
3 REVISÃO DE LITERATURA: Transferência de embriões in vivo em tempo fixo
(TETF)
3.1 Histórico
De acordo com VAN DE VELDE et. al. (2000), a busca pelo maior aproveitamento
dos gametas femininos impulsiona as pesquisas no âmbito das biotecnologias reprodutivas e
procuram desenvolver sistemas cada vez mais eficientes objetivando uma maior produção e
maior qualidade dos embriões.
A primeira transferência de embriões foi realizada com êxito em coelhas, no ano de
1890. Em bovinos, a primeira coleta de embriões se deu nos anos de 1930, só que, a primeira
transferência de embrião (TE) realizada foi relatada por Willet et al., em 1951, citada por
Hafez, 1988. Segundo BREVE (1988), sua exploração comercial foi intensificada no final dos
anos 70 e começo dos 80.
Para DE BEM et. al. (1995), nas últimas décadas a embriologia dos mamíferos
apresentou um enorme progresso científico em especial na espécie bovina. Pesquisas nos
campos celulares, moleculares e genéticos impulsionaram o desenvolvimento tecnológico da
pecuária, principalmente na área de reprodução animal. Dentre as biotécnicas destaca-se a
transferência de embriões como uma das mais modernas biotecnologias da reprodução
empregadas a campo.
De acordo com COSTA e SILVA (2004), a TE aliada à inseminação artificial (IA)
possibilita ganhos genéticos em grande escala em programas de melhoramento animal, onde a
seleção é mais rápida e precisa, diminuindo o intervalo entre gerações pela obtenção de várias
crias de doadoras de alto valor genético comprovado.
Para REICHENBACH et. al. (2002), a TE consiste na obtenção de embriões de uma
fêmea doadora que posteriormente serão transferidos para fêmeas receptoras, que levarão a
gestação a termo. Sua importância básica para a produção animal está na possibilidade de uma
fêmea de alto valor genético (doadora) produzir um número de descendentes muito mais
elevado ao que seria possível fisiologicamente durante sua vida reprodutiva.
17
3.2 Vantagens e desvantagens da TE
Para ANDRADE et. al. (2002), a TE oferece muitas vantagens para a seleção
zootécnica, a qual terá reflexo sobre a produção animal, como: seleção de mães de touros para
inseminação, melhor aproveitamento genético de doadoras e reprodutores (maior número de
descendentes por animal), redução do intervalo entre gerações, aumento da velocidade do
melhoramento, maior controle para problemas genéticos e sanitários, facilidade no transporte
e armazenamento do material genético, maior número de novilhas para reposição de plantel
sendo essas filhas de animais de elevado valor genético, melhor eficiência de programas de
melhoramento animal, sexagem embrionária, segurança no teste de progênie e o transporte de
embriões.
Segundo FERNANDES (2001), obteve-se grandes avanços na transferência de
embriões, mas ainda, a técnica é pouco difundida, devido ao custo relativamente elevado e
pela variação nos resultados.
De acordo com FONSECA et. al. (2001), em função do importante papel econômico
e social dos rebanhos zebuínos na pecuária brasileira e do interesse nacional e internacional
na aquisição e multiplicação de animais de elevado valor genético, o mercado de embriões
ampliou-se bastante nos últimos anos.
3.3 Seleção de doadoras
Para REICHENBACH et. al. (2002), a seleção de doadoras é um dos pontos mais
importantes no processo de transferência de embrião, onde deve-se utilizar animais que não
apresentem patologias reprodutivas, que estejam ciclando normalmente, em bom estado
nutricional e em boas condições de bem estar, pois em situações de estresse não respondem
bem ao tratamento superovulatório. As novilhas púberes devem ser incluídas num programa
de TE desde que tenham adquirido massa muscular próxima do seu peso adulto e apresentem
desenvolvimento corporal e fisiológico que permita resposta as estimulações hormonais e
procedimentos necessários para coleta de embriões. Para ANDRADE et. al. (2002), apesar
das novilhas mostrarem resposta satisfatória ao tratamento superovulatório, algumas vezes
existe dificuldade de introduzir o cateter por via transcervical, o que pode comprometer a
eficiência da TE em alguns casos, mesmo assim, a utilização de novilhas em programas de TE
é estimulado porque reduz o intervalo entre gerações e acelera o melhoramento genético.
18
De acordo com WILLIAMS (2001), a inclusão das doadoras num programa de TE
nunca deve ser inferior aos 60 dias pós-parto e mesmo assim, deve ser precedida de rigorosa
observação da regularidade de pelo menos dois ciclos estrais consecutivos.
Para RUMPF et. al. (2003), o controle sanitário é de fundamental importância e as
principais doenças que influenciam o sucesso da TE são: campilobacteriose, leptospirose,
brucelose, tricomonose, leucose, rinotraqueíte infecciosa bovina, diarréia bovina a vírus,
neosporose, parasitoses e outras consideradas exóticas de acordo com a legislação sanitária de
cada país.
3.4 Seleção de receptoras
Para WILLIAMS (2001), as receptoras são de fundamental importância em um
programa de TE, pois são elas que vão manter a gestação até o final. As fêmeas que
apresentam atividade cíclica regular, as primíparas e pluríparas que tenham parido há mais de
60 dias e que o puerpério tenha decorrido normalmente e que estejam livres de patologias ou
anomalias do trato reprodutivo, podem ser selecionadas como receptoras.
Para SCARPELLI (2003), o ideal é que sejam utilizadas fêmeas oriundas da mesma
propriedade, pois se sabe o histórico reprodutivo de cada indivíduo, evitando assim a
introdução de possíveis patologias dentro da propriedade.
Segundo PALHANO (2008), deve-se optar por novilhas púberes, que tenham
atingido peso adequado para conceber, ou vacas jovens.
De acordo com ANDRADE et. al. (2002), apesar de não ser exigida uma avaliação
zootécnica da receptora é fundamental que alguns critérios de seleção sejam estabelecidos,
como: possuir tamanho compatível com a raça do embrião a ser transferido, o que garantirá
gestação e parto normal, livre de auxílio obstétrico.
Para VALENTIM e GOFERT (2005), a fêmea deve apresentar boa habilidade
materna e rusticidade.
Para REICHENBACH et. al. (2002), a escolha final de uma fêmea receptora deve
ocorrer somente no dia da transferência do embrião, baseado nos sinais de estro após a
sincronização e a avaliação do corpo lúteo presente.
19
3.5 Escolha do reprodutor/sêmen
De acordo com RUMPF et. al. (2003), para o sucesso de um programa de TE, devese atentar para a seleção de uma fêmea considerada superior, a qual deverá ser coberta ou
inseminada com sêmen de um touro de alto valor genético direcionados para características
produtivas e reprodutivas, levando a combinação de genes que elevarão a qualidade da
geração futura. O touro é um componente multiplicativo de fundamental importância no
desempenho reprodutivo e produtivo.
Segundo PALHANO (2008), em um programa de TE deve-se utilizar sêmen
proveniente de touros que demonstrem os melhores pedigrees, que tenham alta fertilidade e
que sejam melhoradores para as características fenotípicas e genotípicas em que as doadoras
sejam mais fracas.
3.6 Sincronização do ciclo estral de receptoras
De acordo com PALHANO (2008), para aperfeiçoar os resultados da TE, deve-se
sincronizar o estro das receptoras com as doadoras, para que as mesmas apresentem o mesmo
estágio do ciclo estral. A sincronização é importante para que o útero da receptora esteja em
condições adequadas e semelhantes em relação à doadora para que possa receber o embrião.
É importante observar, em relação à sincronia da doadora com a receptora que os
embriões apresentam uma pequena variação em seu estágio de desenvolvimento (24 – 36
horas), tendo um grau de sincronia de 24 horas em média da doadora em relação à receptora,
permitindo selecionar a receptora mais compatível com o estágio de desenvolvimento do
embrião (TECNOPEC, 2006).
De acordo com JAINUDEEN et. al. (2004), os principais hormônios utilizados para
indução do cio e da ovulação estão descritos na tabela 4.
TABELA 5 Hormônios utilizados para a indução do cio e da ovulação.
Tipo de Hormônio
Gonadotrofinas
Método de administração
eCG ou PMSG
Injeção única
FSH
Injeção única/múltipla
“...continua...”
Atividade biológica
Mimetiza o FSH e estimula o
crescimento folicular, meia vida
longa
Estimula o crescimento folicular,
meia-vida curta
20
“Cont...”
hCG
Injeção única
Mimetiza
ovulação
o
LH
e
induz
a
Injeção única
Induz à liberação de LH e FSH da
hipófise anterior, recrutamento e
seleção
do
novo
folículo
dominante
Agonista do hormônio
liberador de
Gonadotrofinas
aGnRH-buserilim
Progestágenos
Progesterona
Progestágenos sintéticos
Inibe a
secreção
do CL
Oral, implante subcutâneo, Inibe a
dispositivo
secreção
intravaginal/pessário
do CL
Injeções múltiplas
ovulação suprindo a
de LH; mimetiza a ação
ovulação suprimindo a
de LH; mimetiza a ação
Estrógenos
Conjugados estradiol
Injeção, implante
Prostaglandinas
PGF2α ou análogos
Injeção
sintéticos
Induz regressão prematura do CL
e intensifica a resposta aos
progestágenos
Induz a regressão do CL durante
fases responsivas
Fonte: JAINUDEEN et. al., 2004.
3.6.1 Sincronização de cio com PGF2α
Para SARTORI et. al. (2002), entre os protocolos mais utilizados e eficientes para
concentração de cio com PGF2α, consiste na aplicação de duas injeções de PGF2α com 11 a
14 dias de intervalo em fêmeas que estejam ciclando normalmente, com posterior observação
de cio após a segunda aplicação. Espera-se que a maioria das receptoras manifeste cio entre
dois a quatro dias após a aplicação da PGF2α. Ocorre, no entanto, uma dispersão com estro
ocorrido antes ou após esse estágio, onde alguns animais não apresentam sinais de cio.
Segundo WENKOFF (1987), uma das principais vantagens desta técnica é a
aceitável taxa de detecção de cio das receptoras, boas taxas de concepção e baixo custo com
hormônios, tendo como principal desvantagem a necessidade de observação de cio, ser
ineficiente em fêmeas anovulatórias (que não apresentem CL), não sincronizam fêmeas com
CL jovem (< 6 dias), pois estes não respondem a PGF2α.
21
3.6.2 Ovsynch
Para PURSLEY et. al. (1995), o protocolo Ovsynch consiste na aplicação de duas
doses de GnRH (D0 e D9) e uma dose de PGF2α (D7), como mostra a tabela 5, onde a
administração de GnRH induz a liberação de FSH e LH. O LH liberado irá induzir a ovulação
ou a luteinização de folículos presentes no ovário no momento do tratamento. Com a ovulação
do folículo dominante, tem-se a liberação de FSH, iniciando uma nova onda folicular, num
intervalo médio de dois dias. Com a administração de PGF2α sete dias após a primeira
aplicação do GnRH, ocorre a indução da luteólise. Após, dois dias, aplica-se outra dose de
GnRH com a intenção de induzir um pico de LH para promover a ovulação do folículo
dominante, sincronizando a onda folicular.
TABELA 6 Protocolo Ovsynch
D0
D7
D9
GnRH PGF2α GnRH
Fonte: PURSLEY et. al. (1995).
3.6.3 Sincronização de ovulação com GnRH, estrógeno, progesterona e eCG para TETF
Para BRAGANÇA (2007), o GnRH controla a secreção de gonadotrofinas (FSH e
LH). Sua freqüência e amplitude variam durante os estágios reprodutivos. Quando
administrado em estágios aleatórios do ciclo estral, o GnRH determina a ovulação do folículo
dominante com mais de 9 mm ou a sua atresia, e induz a emergência de uma nova onda de
crescimento folicular dentro de 2 a 3 dias em vacas e 1 a 2 dias em novilhas após o
tratamento.
Segundo MADUREIRA (2000), os implantes de progestágenos oferecem alta
porcentagem de animais em estro, num período bastante curto. Se isto ocorre é porque o
padrão folicular, no final do tratamento é bastante homogêneo entre os animais (doadoras e
receptoras), o que possibilita a sincronização da ovulação mediante a aplicação de drogas que
desencadeiam um pico pré-ovulatório de LH.
Para MOREIRA (2002), o tratamento com estrógeno e progestágeno tem sido cada
vez mais empregado em programas de sincronização do estro em bovinos. O tratamento
consiste na inserção de um dispositivo contendo progestágeno e na administração de
22
estrógeno no dia 0, para emergência de uma nova onda de crescimento folicular e prevenção
de folículos persistentes, na administração de PGF2α no momento da retirada do dispositivo
nos dias 7, 8 ou 9 para indução da luteólise, e subseqüente aplicação de reduzida dose de
estradiol (0,5 a 1,0 mg) após 24 horas ou de GnRH após 48 a 54 h para a sincronização da
ovulação. O estrógeno pode agir como um agente sincronizador da ovulação e induzir um
pico de LH através de um feedback positivo ao GnRH.
De acordo com HAFEZ (1995), tem sido utilizada para a sincronização da ovulação
a gonadotrofina coriônica eqüina (eCG/PMSG). Esta gonadotrofina está circulante na égua
prenhe entre 40º e o 130º dias da gestação e estimula o desenvolvimento de folículos
ovarianos. Este possui ações biológicas de LH e FSH sendo dominantes as ações do FSH. O
eCG/PMSG foi uma das primeiras gonadotrofinas disponíveis comercialmente sendo utilizada
para induzir superovulação. Segundo MOREIRA (2002), a vantagem de utilizar o
eCG/PMSG nos protocolos de sincronização, é que este hormônio é administrado no
momento da remoção do implante de progestágenos, evitando assim um trabalho a mais de
manipulação quando comparado a outros protocolos.
3.7 Superovulação de doadoras
Para RUMPF et. al. (2009), na produção in vivo de embriões é utilizada a técnica de
SOV ou indução múltipla da ovulação. A superovulação (SOB) é um dos pontos principais na
biotecnologia de embriões e o sucesso de um programa de produção de embriões está
intimamente ligado ao número e a qualidade dos embriões produzidos e coletados de uma
doadora.
De acordo com RUMPF et. al. (2003), a principal meta do programa de transferência
de embriões é a superovulação, obtendo-se um número alto e satisfatório de embriões viáveis
por doadora, através do aumento do número de oocistos liberados após administração de
hormônios exógenos, e posterior transferência dos embriões obtidos para o trato reprodutivo
de receptoras levarem a gestação a termo.
Para REICHENBACH et. al. (2002), nos bovinos o desenvolvimento folicular
consiste de duas ou de três ondas de crescimento folicular, onde cada é onda formada por um
grupo de folículos com diâmetro maior ou igual a 4mm. Destaca-se que a emergência da
terceira onda folicular está associada a uma fase luteínica mais prolongada. O aproveitamento
mais racional desses folículos que posteriormente se tornariam atrésicos pode ser obtido por
meio da superovulação. A superovulação pode ser definida, portanto, como um método de
23
estimular diversos folículos terciários desenvolverem até o estágio de pré-ovulação, com
subseqüente ovulação.
De acordo com BÓ (2002), o tratamento superovulatório deve ser realizado no
começo de uma onda folicular, antes da seleção do folículo dominante, para obter-se a melhor
resposta possível.
Antes de iniciar o tratamento hormonal para induzir a superovulação é recomendável
verificar a identificação correta da doadora e obter uma amostra de sangue para tipificação,
necessária para uma posterior comprovação da descendência. Nesse sentido é necessário
inseminar as doadoras somente com sêmen de touros comprovados (REICHENBACH et. al.,
2002).
De acordo com MAPLETOFT et. al. (2002), em um protocolo de SOV, busca-se a
estimulação de um maior número possível de folículos em uma mesma onda folicular,
garantindo, pela aplicação de hormônios, o desenvolvimento e a ovulação dos folículos que
foram recrutados. Então, é importante que a SOV seja iniciada antes da dominância folicular
estar estabelecida.
Segundo ALVAREZ et. al. (1998), dois fatores muito importantes agem na variação
da resposta ovariana: tratamento com gonadotrofinas por protocolo e condição ovariana e
tempo de tratamento com gonadotrofinas.
Para JAINUDEEN et. al. (2004), injeções de FSH exógeno ou eCG são amplamente
utilizadas em programas de ovulação múltipla para transferência de embriões, aumentando o
fornecimento de embriões de animais de qualidade genética. Aplicações intramusculares de
eCG ou FSH estimulam o crescimento de folículos adicionais. O hormônio mais utilizado
atualmente para tratamentos superovulatórios em bovinos é o FSH.
O hormônio FSH tem função essencial para o desenvolvimento dos folículos. A
administração de FSH exógena induz a superovulação. Normalmente, encontram-se folículos
em vários estágios de desenvolvimento nos ovários e diferentes estágios de evolução. Grupos
consecutivos de folículos emergem, maturam e se degeneram e/ou ovulam. Atualmente o
hormônio mais utilizado para estimulação do crescimento ovariano é o FSH. O FSH exógeno
evita a atresia de folículos acima de 1,7mm (BÉNYEI & BARROS, 2000).
Segundo BARROS et. al. (2008), resultados preliminares de estudos recentes em
vacas da raça Nelore demonstraram a possibilidade do uso com êxito e até de um incremento
na produção embrionária com a associação de FSH e eCG na SOV em relação à SOV
somente com FSH, onde são administradas seis doses de FSH seguidas de duas aplicações de
200 UI de eCG com 12 horas de intervalo.
24
De acordo com JAINUDEEN et. al. (2004), injeções intramusculares de eCG ou FSH
estimulam o crescimento de folículos adicionais, os quais ovulam espontaneamente sem a
necessidade de LH ou hCG. Como a meia vida do FSH é mais curta do que o eCG,
geralmente é necessário dividir a dose total e injetar com intervalos de 12 horas em 12 horas
por três a quatro dias, para que os níveis séricos dessa gonadotrofina sejam mantidos para
permitir a ação superovulatória desejada.
Para VISINTIN et. al. (1999), animais de raças zebuínas são mais sensíveis aos
medicamentos, ou seja, apresentam melhores respostas em menores concentrações em
comparação com os das raças européias. Animais zebuínos possuem ovários, folículos e
corpos lúteos menores, o que pode estar relacionado à exigência de menor concentração de
FSH para a indução da superovulação.
A maioria dos protocolos de superovulação empregando FSH indica oito aplicações
de 12 em 12 horas por quatro dias em doses decrescentes por via intramuscular. No quarto dia
do tratamento, necessita-se administrar PGF2α, visando regredir o corpo lúteo presente, sendo
que as doadoras evidenciam estro, em média 48 a 72 horas após a aplicação. Nas doadoras
sincronizadas com dispositivos intravaginais ou auriculares, os mesmos devem ser retirados
no quarto dia do tratamento do FSH, sendo recomendada à aplicação de PGF2α ao mesmo
tempo, para um melhor efeito de sincronização. Nesse caso as doadoras mostram sinais de
estro em média 12 horas antes, ou seja, 36 a 60 horas após a retirada do implante e
administração de PGF2α (REICHENBACH et. al., 2002).
Para THATCHER et. al. (2001), o emprego de progestágenos em doses elevadas
pode suprimir o suporte de LH para o folículo dominante, induzindo assim atresia do folículo.
De acordo com BÉNYEI & BARROS (2000), o LH excessivo durante o tratamento
de superovulação causa a ativação prematura dos oocistos. Em vacas superovuladas com
FSH, a alta concentração de LH resultou em baixa taxa de fecundação.
Segundo DINIZ et. al. (1999), o tratamento superovulatório não promove o
desenvolvimento folicular e sim fornece para aqueles folículos que normalmente se tornariam
atrésicos, um meio hormonal adequado para que continuem o processo de crescimento e
maturação, culminando com a ovulação.
25
3.8 Inseminação das doadoras
Não existem padrões de qualidade de sêmen para uso em TE, por isso em muitos
programas com doadoras utiliza-se no mínimo duas doses por inseminação, a cada 12 horas
(ASBIA, 2006).
Segundo REICHENBACH et. al. (2002), as doadoras são inseminadas duas a três
vezes em intervalos de aproximadamente 12 horas. Aquelas fêmeas que não expressarem os
sinais de estro também devem ser inseminadas, preferencialmente, após 48 e 60 horas da
aplicação de PGF2α ou 36 e 48 horas depois da retirada do dispositivo intravaginal ou
implante auricular de P4.
3.9 Coleta de embriões
De acordo com PALHANO (2008), a coleta de embriões geralmente é realizada entre
o 6° e o 8° dia após a IA e é realizada por três métodos diferentes:
•
Coleta cirúrgica;
•
Coleta semi-cirúrgica ou transvaginal;
•
Coleta não-cirúrgica ou transcervical;
Os dois primeiros métodos não são mais utilizados a nível comercial, por
apresentarem risco de contaminação e posterior ocorrência de aderências devido ao pósoperatório (PALHANO, 2008).
Segundo JAINUDEEN et. al. (2004), para muitas aplicações, as técnicas nãocirúrgicas de colheita de embriões são desejáveis, uma vez que as técnicas cirúrgicas
possivelmente levam à formação de aderências e, além disso, há um menor risco de vida e de
saúde para a doadora quando se utiliza métodos não-cirúrgicos.
De acordo com GAMBARINI (2004), antes da coleta, a resposta ovariana ao
estímulo superovulatório deve ser avaliada por palpação retal através do auxílio de US, a
coleta deve ser iniciada com a preparação da doadora, inicialmente com a limpeza do reto,
posteriormente lavagem cuidadosa da região perineal com água e sabão neutro, em seguida
realiza-se o bloqueio anestésico epidural com lidocaína a 2% de 3 à 6ml no 1° ou 2° espaço
intervertebral das vértebras coccídeas com prévia tricotomia e anti-sepsia com álcool iodado.
Em caso de animais muito nervosos, pode ser feito uma leve sedação com acepromazina.
A coleta pelo método transcervical é realizada através de dois métodos (PALHANO,
2008):
26
•
Sistema aberto: consiste na introdução do líquido através do cateter com
auxilio de uma seringa que posteriormente será retirado pela mesma abertura através de
massagem uterina e gravidade.
•
Sistema fechado: consiste na introdução de um cateter com duas vias, onde o
líquido será introduzido por uma via e retirado por outra, ambos por gravidade.
Para RUMPF et. al. (2003), a coleta propriamente dita consiste na perfusão uterina
com PBS (phosphate-buffered saline), com adição de 1% de soro fetal bovino (SFB) ou soro
de vaca em cio (SVC) em uma temperatura média de 37°C. O cateter é introduzido na vagina
e atravessa a cérvix onde o balão é inflado com PBS ou ar no corpo do útero ou em um dos
cornos uterinos. O líquido é introduzido por gravidade variando de 50 a 150ml, onde o
volume irá variar devido ao tamanho do útero. Deve-se utilizar um volume total de 500 a
1.000ml e a recuperação também será feita por gravidade.
Segundo JAINUDEEN et. al. (2004), no método transcervical de coleta de embriões,
feita com o catéter de Foley e com o mandril no seu interior é guiado através do cérvix por
palpação retal, onde o cateter pode ser posicionado no corpo uterino ou em um dos cornos. De
acordo com GAMBARINI (2004), após o posicionamento da sonda em um dos cornos, o
balão é inflado injetando-se 10 a 20ml de ar, quantidade suficiente para fechar a abertura
cervical e fixar a sonda. Por conseguinte, o mandril é retirado e inicia-se a coleta dos
embriões através da lavagem uterina. Para REICHENBACH et. al. (2002), o meio de lavagem
introduzido no corno uterino é recolhido através de um sistema composto por dois tubos de
plástico flexíveis, sendo que um é o recipiente contendo o meio de coleta e o outro, um filtro
para a obtenção dos embriões. Esse meio de coleta deve fluir por gravidade através do tubo
acoplado ao recipiente, bem como através do cateter em direção ao corno uterino, sendo
necessário que o recipiente seja posicionado cerca de um metro acima da garupa do animal.
Após a lavagem dos cornos uterinos, o meio de coleta retorna através do outro tubo para o
filtro acoplado nesse tubo retendo os embriões juntamente com o meio de lavagem.
Segundo GAMBARINI (2004), após a lavagem, o balão é desinflado e a sonda é
retirada. Ao término de cada coleta recomenda-se a aplicação de PGF2α para se evitar
gestação indesejada.
De acordo com SARTORI et. al. (2003), a taxa de coleta, ou seja, o número de
embriões produzidos em relação ao número de CL presente é em média de 60%.
27
3.9.1 Classificação embrionária
Para PALHANO (2008), os embriões são avaliados e classificados através de exame
morfológico que é realizado através do auxílio de uma lupa (no aumento de 50 a 100x), que
segue padrões impostos pela IETS (International Embryo Transfer Society), como mostra a
figura 2. Os embriões são classificados de acordo com grau de qualidade em: I (excelente ou
bom), II (regular), III (pobre) e IV (degenerado ou não fecundado) e grau de desenvolvimento
como: mórula (M), mórula compacta (Mc), blastocisto inicial (Bi), blastocisto (Bl),
blastocisto expandido (Bx) e blastocisto eclodido (Bec). De acordo com BEM et. al. (1995),
essa classificação é feita avaliando o grau de desenvolvimento do embrião no dia da coleta.
Fonte: http://www.mcguido.vet.br
FIGURA 1 - Estágios de desenvolvimento embrionário em bovinos, considerando-se os
códigos recomendados pela Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS)
(1998). Código 1: célula (dia 1) - Pró núcleos feminino e masculino (zigoto); Código 2: 2
células (dia 2); Código 2: 4 células (dia 3); Código 3: Mórula inicial (dia 4-5) -13 a mais de
32 blastômeros - até 16 células consegue-se boa separação mecânica; Código 4: Mórula (dia
6); Código 5: Blastocisto inicial (dia 7): Código 6: Blastocisto (dia -7-8): Código 7:
Blastocisto expandido (dia 8-9); Código 8: Blastocisto eclodido (dia 9); Código 9: Blastocisto
eclodido/expandido (dia 9-10).
28
Segundo MAPLETOFT e STOOKEY (1999), os embriões não devem ser mantidos
em meio original de coleta por um tempo maior que o necessário, em média de 20 a 30
minutos, pois, podem existir substâncias presentes no líquido de lavagem uterina, que podem
inibir o desenvolvimento do embrião.
Segundo REICHENBACH et. al. (2002), o rastreamento dos embriões deve ser feito
com auxílio de uma micropipeta de vidro, onde os embriões encontrados vão sendo
transferidos para placa de Petri com diâmetro de 3,5 cm contendo o PBS acrescido de 10 a
20% de SFB ou Bovine Serum Albumin (BSA) (200 mg/50 ml de PBS), para posteriormente
serem separados em viáveis e não viáveis.
De acordo com RUMPF et. al. (2003), a avaliação morfológica dos embriões ou a
classificação embrionária determina padrões morfológicos que avaliam a forma, porém não
avalia a vitalidade do embrião, como está descrito nas tabelas 6 e 7.
TABELA 7 Classificação dos embriões segundo a qualidade.
Classificação
Características morfológicas
Embriões simétricos e esféricos, com blastômeros apresentando
I (excelente ou tamanho, coloração e densidade uniformes. Presença de poucas células
de extrusão no espaço perivitelínico, com cerca de 85% do material
bom)
celular intacto
Embriões apresentando irregularidades moderadas no formato ou
tamanho, na cor e densidade dos blastômeros. No míniimo 50% do
II (regular)
material celular devem estar intactos
Grandes irregularidades no formato ou tamanho do embrião, com
alterações evidentes na coloração e densidade dos blastômeros. No
III (pobre)
mínimo 25% do material celular devem estar intactos
IV (degenerado ou Sem forma definida, com estágio de desenvolvimento pouco evidente e
grande desorganização celular ou oócitos não fecundados.
não fecundado)
Fonte: Manual de transferência e Micromanipulação de embriões nas espécies Bovina e Eqüina.
TABELA 8 Classificação dos embriões segundo estágio de desenvolvimento.
Estágios
Mórula (M)
Características morfológicas
Massa com no mínimo 16 células ocupando quase todo o espaço
perivitelínico
Mórula compacta Massa compacta de blastômeros ocupando 60 a 70% do espaço
perivitelínico
(Mc)
Blastocisto inicial Início da blastocele e da diferenciação entre trofoblasto e embrioblasto,
com o zigoto ocupando 70 a 80% do espaço perivitelínico
(Bi)
Diferenciação entre trofoblasto e embrioblasto, embrioblasto
Blastocisto (Bl)
compactado, blastocele proeminente, com o zigoto ocupando a
totalidade do espaço perivitelínico
“...continua...”
29
“Cont...”
Blastocisto
expandido (Bx)
Blastocisto
eclodido (Bec)
O embrião aumenta 1,2 a 1,5 o seu diâmetro e a zona pelúcida diminui
sua largura 1/3
O embrião inicia sua eclosão ou já está totalmente fora da zona pelúcida
Fonte: IETS.
Para GAMBARINI (2004), o filtro coletor deve ser lavado em jatos de PBS oriundo
de uma agulha acoplada a uma seringa de 20ml até a tela filtrante ficar limpa e livre de muco.
O conteúdo do filtro é transferido para uma placa de Petri com diâmetro de 12 cm. Para
MAPLETOFT e STOOKEY (1999), deve-se usar um conjunto individual de placas e pipetas
para manipulação dos embriões de cada doadora, prevenindo a mistura errônea e a
contaminação dos embriões. A identificação criteriosa das placas e pipetas ajudará a manter
esta individualização.
Os embriões considerados viáveis são classificados de um a três e devem ser lavados
dez vezes no meio de cultivo impedindo a transmissão de agentes infecciosos. Os banhos
podem ser realizados em dez placas de Petri com diâmetro de 35 mm, ou em dez gotas
colocadas em uma só placa ou em placas multi-cavas utilizando um micropipetador e pipetas
de vidro descartáveis de 20µl, as quais devem ser substituídas entre cada lavagem do embrião
(REICHENBACH et. al., 2002).
De acordo com STRINGFELLOW (1999), existem alguns princípios essenciais para
lavagem adequada dos embriões, como: lavar juntos apenas embriões de uma mesma doadora,
lavar de uma só vez dez ou menos embriões, lavar somente embriões com zona pelúcida
intacta, lavar apenas embriões isentos de material aderente, realizar no mínimo dez lavagens,
utilizar uma nova micropipeta estéril cada vez que os embriões são passados de um banho
para outro.
3.10 Inovulação
Segundo RUMPF et. al. (2003), inovulação consiste na deposição do embrião no
útero de uma fêmea receptora, onde a inovulação transcervical deve seguir os seguintes
passos: conter bem o animal, avaliação do ovário contendo CL, realizar anestesia epidural,
introdução no corno uterino delicadamente, deposição do embrião o mais próximo da junção
útero-tubárica.
30
Para BEM et. al. (1995), para realização da transferência de embriões pelo método
transcervical, utiliza-se um aplicador semelhante ao de IA, conhecido como inovulador, que
será o instrumento utilizado para depositar o embrião em um dos cornos uterinos. Este
método requer realização de anestesia epidural. Em ambas as técnicas, o embrião deve ser
depositado no terço inicial do corno uterino, ipsilateral ao corpo lúteo.
Para ser feita a transferência, o embrião precisa ser colocado no centro de uma
palheta de 0,25 ml, mergulhado no meio de cultivo. O envasamento do embrião na palheta é
feito de modo que fique uma coluna central contendo o embrião e que esta, encontra-se
separada das colunas nas extremidades por duas colunas de ar. As palhetas devem ser
identificadas para se evitar transtornos no momento da transferência. Devem ser transferidos
para as receptoras somente embriões de graus um e três (REICHENBACH et. al., 2002).
4 RELATO DA ATIVIDADE E DISCUSSÃO: TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES IN
VIVO EM TEMPO FIXO (TETF)
4.1 Seleção de doadoras
A seleção de doadoras é de fundamental importância em um programa de TE e deve
ser realizada baseando-se nos seguintes parâmetros:
•
Genéticos: acasalamentos devem ser feitos para que os produtos sejam melhorados;
•
Clínico-reprodutivos: idade de doadoras entre três e dez anos, bom desempenho
reprodutivo, animais com fertilidade confirmada, cíclicas e ausência de patologias
nos sistemas locomotor, digestivo, urinário, circulatório e reprodutivo como
alterações uterinas, ovários e ovidutos, deve ser realizado rigoroso controle sanitário
e escolha de touros geneticamente superiores para que seus produtos sejam melhores
que seus progenitores.
O teste de progênie tem sido um dos principais enfoques para escolha de
reprodutores e matrizes para um programa de TE, onde são avaliadas características
zootécnicas como peso ao nascer, peso a desmama, ganho de peso, rendimento de carcaça,
habilidade materna e produção.
4.2 Seleção de receptoras
São de fundamental importância em um programa de TE, pois são as receptoras quem
levarão a gestação até o final. Deve ser feita a seleção de fêmeas que apresentem bom estado
de desenvolvimento corporal, porte compatível com doadoras, atividade cíclica regular,
primíparas ou pluríparas que puerpério tenha ocorrido normalmente e a mais de 60 dias
estejam livres de patologias ou anomalias do trato reprodutivo e que apresentem boa
habilidade materna.
32
4.3 Superovulação e indução de ovulação múltipla
A SOV é uma das principais ferramentas na biotecnologia de embriões e o sucesso
de um programa de TE está diretamente relacionado ao número e a qualidade dos embriões
obtidos.
Para BÓ et. al. (2006), os resultados com SOV tem muita variação, relacionado ao
hormônio utilizado, sua dose, nutrição e a variação individual entre doadoras. Com uma
mesma fêmea superovulada, não ocorre ovulações de todos os folículos ao mesmo tempo,
onde há um intervalo de até 20 horas para ovulação de todos os folículos, por este motivo
recomenda-se duas IA em uma mesma fêmea doadora, com intervalo de 12 horas.
Segundo RUMPF et. al. (2003), dentre as gonadotrofinas mais utilizadas para
estimulação de crescimento folicular, destacam-se o FSH o eCG.
O protocolo adotado para superovulação e sincronização de doadoras consiste na
administração de 120mg de FSH por doadora, onde no D0 será colocado implante de
progesterona (P4) mais 2ml (2mg/animal) de benzoato de estradiol (Be) pela manhã, no D5
administrar 4ml de FSH pela manhã e pela tarde, no D6 3ml de FSH pela manhã e pela tarde,
no D7 2ml de FSH pela manhã e pela tarde e retirar o implante de P4 a tarde, no D8 1 ml de
FSH pela manhã e pela tarde, no D9 2ml LH pela manhã e primeira inseminação artificial
pela tarde, no D10 segunda inseminação artificial pela manhã. A coleta será realizada no D16,
conforme mostra a figura 2.
Fonte: Arquivo pessoal, 2010.
FIGURA 2 – Protocolo adotado para superovulação e sincronização de doadoras.
O protocolo adotado para sincronização de receptoras consiste em colocar implante de
progesterona (P4) mais 2ml (2mg/animal) de Be no D0 pela manhã, no D5 2ml de eCG com o
objetivo de produzir um folículo maior e conseqüentemente um CL de melhor qualidade mais
2ml de PGF2α pela manhã para lisar o possível CL existente, no D8 retirar o implante pela
manhã, no D9 1ml de Be pela manhã para induzir a ovulação do folículo existente, no D10 a
receptora manifestará o cio. A coleta será realizada no D17, conforme mostra a figura 3.
33
Fonte: Arquivo pessoal, 2010.
FIGURA 3 – Protocolo adotado para sincronização de receptoras.
4.4 Coleta de embriões
Para coleta dos embriões será utilizado sistema fechado com sonda de 16, 18 ou
20mm dependendo do porte da doadora. A sonda deve ultrapassar o cérvix onde será fixada
no corpo do útero, o balão será inflado com ar ou PBS. O meio de lavagem uterina (PBS) será
introduzido por gravidade em volumes variáveis de 50 a 150ml, relacionado ao tamanho do
útero e tendo ao final um volume médio de 1.000ml. A recuperação do líquido também será
feita por gravidade, com o auxilio do filtro de coleta, como mostra a figura 4.
Fonte: Arquivo pessoal, 2010.
FIGURA 4 – Coleta de embriões utilizando-se sistema fechado.
Para se ter um maior aproveitamento na recuperação dos embriões deve-se atentar a
alguns detalhes, como:
• Contenção adequada da doadora;
• Realizar anestesia epidural – 2 a 5ml de cloridrato de lidocaína a 2%;
• Uso do expansor cervical;
• Posicionamento correto do balão;
• Regular preenchimento dos cornos por palpação;
34
• No início da coleta, segurar a junção útero-tubárica entre os dedos e evitar que se
encha muito os cornos, evitando assim, que os embriões sejam empurrados para a
tuba e não possam ser recuperados;
• Massagear bem os cornos uterinos;
• Ter tranqüilidade e segurança na execução de todos os procedimentos;
• Ter um bom auxiliar.
Os materiais utilizados para coleta de embriões bovino são sonda acoplada ao
mandril, sistema fechado em Y, filtro de coletor, cloridrato de lidocaína, seringas, agulhas,
expansor cervical, álcool 70% e álcool iodado10% e seringa de 20/10ml.
4.5 Manipulação dos embriões
Para iniciar a manipulação dos embriões, antes deve-se preparar o ambiente e todo o
material que será utilizado para realizar o procedimento de manipulação de embriões.
Caso a realização do procedimento de coleta e transferência de embriões não seja
realizado em um laboratório específico de TE, deve-se dispor de um espaço mais restrito,
limpo, sem excesso de umidade, bem iluminado e ventilado.
Para RUMPF et. al. (2003), a temperatura ideal para manipular os embriões antes da
transferência é em torno de 20 a 30°C, evitando temperaturas extremas. A bancada deve estar
bem limpa e deve ser desinfetada com álcool 70% ou utilizar tecido autoclavado ou papel
toalha sobre a mesa.
Os materiais que devem estar disponíveis para que seja realizada a manipulação dos
embriões são:
• Meios de manipulação (PBS e holding) de boa qualidade e estéril;
• Filtros com poros de 0,22µ e de procedência conhecida;
• Seringa (20ml) e agulhas novas ou esterilizadas (12x8mm);
• Placas de Petri 100x20mm e 35x10mm (esterilizadas);
• Álcool 70%;
• Lamparina com álcool;
• Isqueiro;
• Pipetas de manipulação e bulbos;
• Papel toalha;
• Caneta para escrita em vidraria;
35
• Fichas de anotações;
O filtro contendo os embriões e meio de lavagem uterina deverá ser identificado com
nome e/ou número da doadora e será lavado somente com PBS aquecido em média 35 a 37°C
com uma seringa de 20ml acoplada a uma agulha, retirando-se todo o muco presente no filtro
de coleta como mostra as figuras 7, 8 e 9 que será transferido para uma placa de Petri
devidamente identificada (placa/tampa), para evitar que embriões de receptoras diferentes
sejam misturados. A placa de Petri terá o fundo riscado com uma agulha, para facilitar no
processo de rastreamento dos embriões com auxílio de uma micropipeta para localização dos
embriões na placa aos quais serão imediatamente transferidos para uma placa de cinco/quatro
poços contendo meio de manutenção holding, como mostra as figuras 10 e 11. O rastreamento
dos embriões será feito utilizando um estereomicroscópio (lupa).
Para GAMBARINI (2004), o filtro coletor deve ser lavado em jatos de PBS oriundo
de uma agulha acoplada a uma seringa de 20ml até a tela filtrante ficar limpa e livre de muco.
O conteúdo do filtro é transferido para uma placa de Petri com diâmetro de 12 cm. Para
MAPLETOFT e STOOKEY (1999), deve-se usar um conjunto individual de placas e pipetas
para manipulação dos embriões de cada doadora, prevenindo a mistura errônea e a
contaminação dos embriões. A identificação criteriosa das placas e pipetas ajudará a manter
esta individualização.
Fonte: Arquivo pessoal, 2010.
FIGURA 5 – Rastreamento dos embriões.
36
4.6 Exame e avaliação de embriões
Somente a prática e o trabalho diário com embriões que fornecerá ao técnico o
discernimento da sua real qualidade.
A classificação proposta pela Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões
(S.B.T.E) para julgamento dos embriões é dividida em sete categorias, sendo elas:
1. Mo – Mórula: apresenta-se como uma massa de células com separação nítida entre os
blastômeros ocupando a quase totalidade do espaço perivitelínico (EPV);
2. Mc – Mórula compacta: os blastômeros estão agregados entre si, formando uma
massa compacta e ocupam 60 a 70% do EPV;
3. Bi – Blastocisto inicial: início da formação da blastocele e início da diferenciação
entre trofoblasto e botão embrionário. O embrião ocupa 70 a 80% do EPV;
4. Bl – blastocisto: no blastocisto existe uma evidente diferenciação entre células do
trofoblasto e do botão embrionário. As células do botão embrionário estão
compactadas, a blastocele é predominante e o embrião ocupa a totalidade do EPV;
5. Bx – Blastocisto expandido: nesta fase do desenvolvimento, o embrião aumenta 1,2 a
1,5 vezes o seu diâmetro, distendendo a zona pelúcida, a qual diminui em 1/3 em sua
espessura. É bem evidente a pressão do líquido da blastocele que pressiona o
trofoblasto contra a membrana pelúcida;
6. Bn – blastocisto em eclosão: o embrião está iniciando o processo de saída da zona
pelúcida;
7. Be – blastocisto eclodido: o embrião está completamente livre da zona pelúcida e
ainda é nítida a presença da blastocele;
8. Estrutura não fecundada: sem nenhum contorno celular, somente pigmentado.
Dentro dos padrões descritos e de acordo com sua integridade, os embriões recebem
uma identificação, que segundo a S.B.T.E esta relacionado em cinco categorias:
1. Embrião I (excelente): embrião esférico com blastômeros apresentando forma bem
definida, cor e textura uniformes e nenhuma extrusão celular;
2. Embrião II (bom): embrião com imperfeições sem importância, com pouca extrusão
celular. Ocasionalmente há uma pequena distinção na forma e cor dos blastômeros
e/ou presença de poucas vesículas;
3. Embrião III (regular): embrião que apresenta alguns blastômeros com forma e cor
heterogênea, porém coesos. Presença de células no EPV e blastocele com algumas
vesículas;
37
4. Embrião IV (pobre): embrião com forma e cor heterogênea entre vários blastômeros,
confusa diferenciação celular, extrusão evidente com degeneração e grande número de
vesículas;
5. Dg – estrutura degenerada: estrutura que não apresenta uma forma definida, sendo
impossível determinar o estágio de desenvolvimento. É evidente a desorganização
celular;
Segundo RUMPF et. al. (2003), embriões classificados como I, II e III são aptos para
transferência e os resultados, expressos em porcentagem de números de gestação variam de
30 a 60% e geralmente não diferem entre embriões classificados como excelentes e bons.
4.7 Lavagem dos embriões utilizando meio Holding
A lavagem dos embriões será realizada no laboratório, com o máximo de higiene
onde serão realizados dez banhos nos embriões, sendo que durante os banhos na busca dos
embriões retira-se meio da próxima gota para captação do embrião na gota anterior.
Os embriões considerados viáveis são classificados de um a três e devem ser lavados
dez vezes no meio de cultivo impedindo a transmissão de agentes infecciosos. Os banhos
podem ser realizados em dez placas de Petri com diâmetro de 35 mm, ou em dez gotas
colocadas em uma só placa ou em placas multi-cavas utilizando um micropipetador e pipetas
de vidro descartáveis de 20µl, as quais devem ser substituídas entre cada lavagem do embrião
(REICHENBACH et. al., 2002).
4.8 Envase dos embriões
Os embriões são envasados sob condições assépticas em palhetas de 0,25ml que,
como mostra a figura 6.
Fonte: Arquivo pessoal, 2010.
FIGURA 6 – Palheta para transferência de embrião.
Para ser feita a transferência, o embrião precisa ser colocado no centro de uma
palheta de 0,25 ml, mergulhado no meio de cultivo. O envasamento do embrião na palheta é
38
feito de modo que fique uma coluna central contendo o embrião e que esta, encontra-se
separada das colunas nas extremidades por duas colunas de ar. As palhetas devem ser
identificadas para se evitar transtornos no momento da transferência. Devem ser transferidos
para as receptoras somente embriões de graus um e três (REICHENBACH et. al., 2002).
4.9 Inovulação
A inovulação é realizada pelo método transcervical com a deposição do embrião no
terço final do corno uterino ipsilateral ao CL, com o auxílio de anestesia epidural baixa,
usando de 2 a 5ml de Cloridrato de lidocaína 2%. As palhetas são montadas no aplicador
usando-se “camisa sanitária” que revestirá o inovulador, evitando levar contaminações da
vagina para o útero, onde a mesma será rompida antes de se transpor o primeiro anel cervical.
Em seguida, a cérvix será atravessada e o embrião será depositado no corno uterino o mais
cranial possível.
Para BEM et. al. (1995), para realização da transferência de embriões pelo método
transcervical, utiliza-se um aplicador semelhante ao de IA, conhecido como inovulador, que
será o instrumento utilizado para depositar o embrião em um dos cornos uterinos. Este
método requer realização de anestesia epidural. Em ambas as técnicas, o embrião deve ser
depositado no terço inicial do corno uterino, ipsilateral ao corpo lúteo.
5 CONCLUSÕES
A EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologias consta com tecnologias de
primeiro mundo, fornecendo base para prática em biotecnologias da reprodução. A
biotecnologia da reprodução é uma área da Medicina Veterinária em destaque no mercado,
sendo considerada de grande status devido ao uso das tecnologias utilizadas para
aprimoramento do rebanho e obtenção de animais de alto valor genético.
O estudo realizado na EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologias é uma área
que fornece bases para obtenção de melhores resultados a campo, melhorando a produção dos
produtores rurais.
O estágio curricular na EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologias foi de
suma importância, proporcionando a prática e aperfeiçoamento da parte teórica, adquirida no
período de graduação, bem como o estágio realizado na Empresa Juarez Furtado de Lima e
Cia.
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