cscmv por cultura de meristema associada a

RESUMO
19ªEXPANDIDO
RAIB
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275/400
ELIMINAÇÃO DO CASSAVA COMMON MOSAIC VIRUS - CSCMV POR
CULTURA DE MERISTEMA ASSOCIADA A TERMOTERAPIA
S.R.L. Palazzo1, T.L. Valle2, J.C. Feltran2, A. Colariccio1
Instituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal, Av. Cons. Rodrigues Alves,
1252, CEP 04014-002, São Paulo, SP, Brasil. E-mail: [email protected]
2
Instituto Agronômico, Campinas, SP, Brasil.
1
RESUMO
A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma espécie vegetativamente propagada, plantando-se
pequenos segmentos do caule denominados de manivas. Esse tipo de propagação apresenta
inconvenientes como a disseminação de doenças sistêmicas através das gerações sucessivas, tal
como ocorre com as causadas por vírus, que podem acarretar a degenerescência das manivas.
Sendo o Cassava common mosaic virus (CsCMV) o mais disseminado em todo mundo, a utilização
da cultura de meristemas, associada a termoterapia, é uma das técnicas utilizadas para proceder
à limpeza de vírus. Com o objetivo de indexar plântulas cultivadas in vitro, mantidas sob regime
de termoterapia, para a presença de CsCMV foi utilizado DAS-ELISA, empregando-se anti-soro
policlonal específico. As variedades de mandioca utilizadas neste trabalho foram aquelas do
programa de produção de sementes de mandioca do Instituto Agronômico, Campinas, SP. Para
a obtenção das plântulas, foram inicialmente coletadas, em condições de campo, manivas das
variedades ‘IAC 90’, ‘IAC 12’, ‘IAC 13’, ‘IAC 14’, ‘IAC 15’, ‘Fibra’, ‘Fécula Branca’, ‘Ouro do Vale’,
‘Olho Junto’ e ‘Espeto’, cultivadas na região Centro Sul do Brasil. Uma única planta de cada
variedade, com excelente aspecto e sem qualquer sintoma visual de vírus, foi coletada e cultivada, durante 30 dias, em câmara de termoterapia com 16h de luz a 40º C e 8h de escuro a 28º C.
Quando suas brotações atingiram cerca de 2 a 4 cm foram retiradas e cultivadas no mesmo
regime de luz e temperatura por, aproximadamente, 30 dias. Os meristemas retirados destas
brotações foram cultivados in vitro e após um período de crescimento de 30 dias, no estádio de 6
folhas verdadeiras in vitro, as plântulas foram submetidas ao teste sorológico. Através do procedimento adotado foi possível a obtenção de 16,6 a 50% de plântulas, das variedades ‘Fibra’, ‘IAC
13’, ‘IAC 90’ e ‘Olho Junto’, livres de CsCMV. Somente a variedade ‘Ouro do Vale’ não apresentou plântulas isentas do CsCMV. Do total de 61 clones de mandioca, obtidos pela técnica de
cultura de meristemas e submetidos a termoterapia para a limpeza clonal do CsCMV, aproximadamente 60% estavam livres de vírus.
PALAVRAS-CHAVE: Potexvirus, ELISA, propagação vegetativa.
ABSTRACT
ERADICATION OF CASSAVA COMMON MOSAIC VIRUS – CSCMV – BY IN-VITRO
CULTURE OF MERISTEM TIPS ASSOCIATED WITH THERMOTHERAPY. Cassava (Manihot
esculenta Crantz) is a vegetative species propagated by cuttings. This propagation favors the
dissemination of diseases by successive generations, especially viruses that can lead to
degeneration of the cuttings. The Cassava common mosaic virus (CsCMV) is the major cassava virus
disseminated worldwide. The use of in-vitro culture of meristem tips, associated with
thermotherapy, is one of the techniques used for eradicating plant viruses. With the aim of
indexing the CsCMV in cassava varieties from the seed program of the Instituto Agronômico,
Campinas, SP, Brazil, samples of cassava varieties including ‘IAC 90’, ‘IAC 12’, ‘IAC 13’, ‘IAC 14’,
‘IAC 15’, ‘Fibra’, ‘Fécula Branca’, ‘Ouro do Vale’, ‘Olho Junto’ and ‘Espeto’ were collected from
Southern Central Brazil. One plant of each variety was sampled, which presented an excellent
aspect in field conditions, without visual virus-like symptoms. The cuttings were cultivated for
30 days in a thermotherapy chamber under 16 hours light at 40º C and 8 hours darkness at 28º C.
Buds of approximately 2 and 4 cm were removed and cultivated for 30 days at 40ºC under the
same light regime. The meristems were cultivated in vitro. For screening the in-vitro CsCMVfree plantlets, DAS-ELISA was employed by using a polyclonal antiserum against CsCMV species.
The varieties ‘Fibra’, ‘IAC 13’, ‘IAC 90’ and ‘Olho Junto’ showed 16.6% to 50% of CsCMV-free
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plants, while the variety ‘Ouro Vale’ remained 100% CsCMV-infected. The efficiency of the
clonal eradication of CsCMV from the 61 different clones reached about 60% of the evaluated
varieties.
KEY WORDS: Potexvirus, ELISA, cuttings.
INTRODUÇÃO
A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma espécie domesticada, nas terras baixas e quentes da
América, pelas populações pré-colombianas. Foi, e
ainda é, o alimento básico de grande contingente de
populações americanas e de outras regiões tropicais,
notadamente entre as populações excluídas de mercados consumidores. A Nigéria e o Brasil são os maiores produtores do mundo de mandioca, com 38 e 27
milhões de toneladas produzidas em 2005 (FAO,
2006). Cultivada em todas as regiões brasileiras, a
mandioca é utilizada para a produção de farinha,
extração de amido e, uma pequena parte, consumo in
natura. Os Estados de São Paulo, Paraná, Santa
Catarina e Mato Grosso do Sul formam um complexo
agroindustrial que produz e processa cerca de 5 milhões de toneladas de raízes de mandioca para a produção de farinha e amido (IBGE, 2006).
A mandioca é vegetativamente propagada, plantando-se pequenos segmentos do caule. Esse tipo de
propagação apresenta inconvenientes como a disseminação de doenças sistêmicas através das gerações
sucessivas, tal como ocorre com as causadas por vírus, que podem acarretar a degenerescência das
manivas (COSTA & KITAJIMA, 1972; IWANAGA & IGLESIAS,
1994). Muitos são os vírus detectados na cultura da
mandioca, sendo que o mais disseminado em todo
mundo é o vírus do mosaico comum (Cassava common
mosaic virus, CsCMV). Outros importantes, porém de
distribuição regional são: African cassava mosaic virus
(ACMV) e Cassava brown streak virus (CBSaV) na África; Cassava green mottle virus (CGMV) nas ilhas do
Pacífico; Cassava virus X (CsVX) e Cassava colombien
virus na Colômbia; Cassava caribean mosaic virus
na América Central; Indian cassava mosaic virus (ICMV)
na Índia; Cassava vein mosaic virus (CsVMV) e Frogskin
virus no Brasil (COSTA & KITAJIMA, 1972).
No Brasil, o CsCMV está disseminado em todas as
regiões produtoras do Sul e do Sudeste, infectando todas as variedades cultivadas atualmente, embora aparentemente não provoque prejuízos substanciais na
produção. Observações de campo indicam que a manifestação severa da doença em variedades suscetíveis
pode causar perdas de produção que variam de 10 a
20%, prejudicando a qualidade do produto pela redução de 10 a 50% nos teores de amido (FUKUDA, 1993).
Para a limpeza de fitovírus, a técnica mais utilizada,
tem sido a cultura in vitro de meristemas associada à
termoterapia. Na Nigéria e na Índia a utilização dessas
técnicas resultou na obtenção de 80% e 60% de clones
de mandioca livres de ACMV e ICMV, respectivamente
(VASANTHI et al., 2001; ADEJERE & COUTTS, 1981). Para o
CsCMV nas condições avaliadas neste trabalho verificou-se que após o cultivo in vitro, ainda pôde ser constatada a presença do vírus em DAS-ELISA, mesmo nas
plantas assintomáticas. Porém, a indexação sorológica
do CsCMV possibilitou a identificação do material
infectado e sua eliminação o que agilizou o processo de
produção de plantas matrizes livres do vírus.
Este trabalho teve como objetivos: (i) indexar variedades de mandioca, amplamente cultivadas na Região Centro-Sul do Brasil, para a presença de CsCMV,
visando à obtenção de um estoque de mandioca-semente livre deste vírus; (ii) readaptar esse material ao
cultivo em campo, multiplicá-los em áreas isoladas e
substituir as plantas matrizes, atualmente utilizadas
no programa de produção de sementes de mandioca
por plantas com alta qualidade sanitária.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas 10 variedades de mandioca do
programa de produção de sementes do Instituto Agronômico, Campinas, SP. Uma única maniva de aproximadamente 20 cm de comprimento, com excelente
aspecto e sem qualquer sintoma visual de vírus, de
cada uma das 10 principais variedades de mandioca
cultivadas na região Centro-Sul do Brasil (‘IAC 90’,
‘IAC 12’, ‘IAC 13’, ‘IAC 14’, ‘IAC 15’, ‘Fibra’, ‘Fécula
Branca’, ‘Ouro do Vale’, ‘Olho Junto’ e ‘Espeto’) foi
coletada. Estas manivas foram, então, cultivadas,
durante 30 dias, em câmara de termoterapia com 16h
de luz a 40º C e 8h de escuro a 28º C. Quando suas
brotações atingiram cerca de 2 a 4 cm foram retiradas
e cultivadas no mesmo regime de luz e temperatura
por 30 dias. Após esse período, foram retirados os
meristemas apicais e cultivados in vitro. Cada plântula
originada de um único meristema foi multiplicada e
após um período de crescimento de 30 dias, uma amostra foi avaliada para a presença de vírus.
Para avaliar a presença do CsCMV nessas amostras cultivadas in vitro foi utilizado DAS-ELISA (CLARK
& ADAMS, 1977), empregando-se anti-soro policlonal
específico contra o CsCMV. O teste foi realizado empregando-se extrato bruto de plântulas de mandioca
na proporção de 1 g de folhas/5 mL de tampão fosfato
0,05 M pH 7,4. Os valores de absorbância a 405 nm
foram obtidos após 45min da adição do substrato.
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Foram considerados positivos os valores de
absorbância três vezes maiores do que os da planta
sadia. As amostras foram, também, mecanicamente
inoculadas em plantas de Chenopodium amaranticolor,
uma hospedeira experimental do CsCMV. O inoculo
foi preparado com 1 g de folhas de mandioca em 10
mL de solução de sulfito de sódio 0,5%.
As plântulas consideradas isentas de CsCMV foram selecionadas, multiplicadas e, parte delas,
mantidas in vitro para a formação de um estoque de
plantas matrizes; a outra parte foi aclimatada para
dar continuidade ao programa de produção de sementes de mandioca do Instituto Agronômico.
variedades não foi possível determinar se os clones
originais estavam sadios ou se o vírus foi eliminado
pela cultura de meristemas associada a termoterapia.
Constatou-se que o CsCMV pode permanecer
assintomático, uma vez que 52,46% das plântulas que
não apresentavam sintomas, reagiram positivamente
no DAS-ELISA. Convém mencionar que, a porcentagem de plântulas com sintomas nas folhas foi baixa
(8,2%) e estas foram encontradas nas variedades ‘Fibra’ e ‘Ouro Vale’. Este fato está amplamente relatado
na literatura, ou seja, apesar do método descrito possibilitar a obtenção de clones sadios, não é totalmente
eficaz na eliminação do vírus, sendo indispensável o
emprego de um teste complementar de indexação para
identificar as plantas matrizes sadias.
Segundo DUVAL et al. (1998), as viroses têm sido
eliminadas de plantas propagadas vegetativamente
com grande sucesso através do cultivo de meristemas,
técnica que se torna mais eficiente quando associada
a termoterapia. De acordo com GUO & LIU (1994), plantas de mandioca originadas do cultivo de meristemas
e indexadas como livres de vírus crescem mais
vigorosamente do que as plantas obtidas de manivas
selecionadas visualmente no campo.
Os resultados obtidos, com relação ao efeito da temperatura na manifestação dos sintomas, apontam para
outra possibilidade, pois de acordo com aqueles descritos na literatura, temperaturas próximas a 30º C são
favoráveis a não manifestação dos sintomas
(COLARICCIO, 1988). Altas temperaturas podem reduzir
a movimentação das partículas virais, inativar ou inibir a multiplicação do vírus (KASSANIS, 1957). Assim, as
plantas propagadas in vitro, mesmo sem sintomas visíveis, podem estar infectadas por vírus (Tabela 1).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram obtidas in vitro plântulas de todas as variedades coletadas, perfazendo um total de 61 clones
oriundos de meristemas de manivas submetidas a
termoterapia (Tabela 1).
O resultado do teste biológico em C. amaranticolor
foi negativo para todas as amostras, talvez devido à
oxidação do inóculo no momento da inoculação. Os
resultados do teste sorológico nas variedades ‘Fécula’,
‘Espeto’, ‘IAC 12’, ‘IAC 14’ e ‘IAC 15’ indicaram que a
técnica de cultura de meristemas associada a
termoterapia foi suficiente para se obter plântulas de
mandioca isentas de CsCMV. Somente na variedade
‘Ouro do Vale’ não se obteve qualquer plântula sadia.
Em média, foram obtidas 60,66% de plântulas sadias.
Entre os materiais sabidamente infectados (‘Fibra’, ‘IAC
13’, ‘IAC 90’ e ‘Olho Junto’) obteve-se, 32,35% de clones
sadios, após o procedimento adotado. Para as demais
Tabela 1- Detecção do CsCMV por DAS-ELISA em variedades do Banco Ativo de Germoplasma-IAC de Manihot
esculenta, obtidas por cultura de meristemas associada a termoterapia.
Variedades de
Manihot esculenta
N° plantas
desenvolvidas in vitro
N° de plantas
com sintomas
DAS-ELISA
N° plantas
livres de vírus
Fécula Branca
Espeto
Fibra
IAC 12
IAC 13
IAC 14
IAC 15
IAC 90
Ouro Vale
Olho Junto
6
5
16
5
10
4
5
2
2
6
0
0
3
0
0
0
0
0
2
0
6
5
6
5
3
4
5
1
0
1
Total
61
5
37
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Porcentagem plantas
livres de vírus (%)
100
100
37.5
100
30
100
100
50
0
16.6
60,66
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As variedades ‘Fibra’, ‘IAC 13’, ‘IAC 90’ e ‘Olho
Junto’ apresentaram de 16,6% a 50% de plantas livres
de CsCMV, e somente a variedade ‘Ouro Vale’ não
apresentou plantas isentas desse vírus (Tabela 1). As
alterações causadas pela variação da temperatura nas
plantas dependem, principalmente, da interação vírus-planta-hospedeira tornando-se, portanto, impossível generalizar o efeito da temperatura nas diferentes interações desse sistema (KASSANIS, 1957). Estes
conceitos podem explicar os diferentes resultados
obtidos entre as diferentes variedades submetidas ao
mesmo tratamento.
Do total de 61 clones de mandioca, obtidos pela
técnica de cultura de meristemas associada a
termoterapia, 37 clones permaneceram livres de
CsCMV, ou seja, uma eficiência de aproximadamente
60% na eliminação do vírus (Tabela 1). Resultado semelhante ao obtido por VASANTHI et al. (2001) na Índia
para o ICMV. Porém, inferior ao resultado obtido por
ADEJERE & COUTTS (1981), na Nigéria, que foi de 80%
de material livre de ACMV empregando os mesmos
procedimentos.
CONCLUSÃO
O CsCMV foi eliminado de aproximadamente 60%
das plantas avaliadas. Nas variedades ‘Fécula’, ‘Espeto’, ‘IAC 12’, ‘IAC 14’, ‘IAC 15’e ‘IAC 108’, 100%
das plantas obtidas pela técnica de cultura de
meristemas associada a termoterapia estavam isentas de vírus.
É possível obter-se plantas de mandioca isentas
do vírus do mosaico comum (CsCMV) utilizando-se
termoterapia associada ao cultivo de meristemas. Porém, o método não dispensa a utilização de métodos
de indexação de plântulas para a presença de vírus.
AGRADECIMENTO
Os autores agradecem ao CIAT (Colômbia) pelo
fornecimento do anti-soro para o Cassava commom
mosaic virus – CsCMV.
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