efeitos antineoplásicos induzidos in vitro por isoquinolino

EFEITOS ANTINEOPLÁSICOS INDUZIDOS IN VITRO POR
ISOQUINOLINO QUINONAS SINTÉTICAS EM LINHAGENS DE
CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS
WILLIAM RODRIGUES DE FREITAS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE – UENF
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ
FEVEREIRO DE 2011
ii
EFEITOS ANTINEOPLÁSICOS INDUZIDOS IN VITRO POR
ISOQUINOLINO QUINONAS SINTÉTICAS EM LINHAGENS DE
CÉLULAS TUMORAIS HUMANAS
WILLIAM RODRIGUES DE FREITAS
Dissertação apresentada ao Centro de
Biociências
e
Biotecnologia
da
Universidade
Estadual
do
Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Biociências e Biotecnologia.
CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ
FEVEREIRO DE 2011
ii
iii
iv
“Dedico esta tese aos meus pais, sem os quais eu não teria condições de alcançar a
realização deste feito”
v
AGRADECIMENTOS
A Deus por tudo.
Aos meus familiares, que sempre me apoiaram e depositaram votos de confiança e
motivação.
Ao professor Dr. Milton M. Kanashiro, pela orientação e oportunidade de desenvolver
os trabalhos apresentados nesta dissertação.
A Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro e ao Centro de
Biociências e Biotecnologia, pela oportunidade de realização deste trabalho de
pesquisa.
Aos Professores Dr. Paulo Miranda e Dr. Almir Andreão, pelo fornecimento das IQQ
cedidas para os experimentos.
Aos amigos do Laboratório de Biologia do Reconhecer: Layla, Thatiana, Monique,
Maíra, Andreza, Marlon, Isabela, Sanderson, Eduardo, Fabrício, Giliane, Marcela,
Lívia, Flávia, David, Cláudia Letícia, Bruno, Sara, Poliana, Marcelle e Simone, pela
amizade que foi erguida durante o mestrado e que levaram a momentos de
companheirismo, sugestões e ajudas experimentais, conselhos, e troca de
informações.
Aos técnicos do LBR: Juliana, Rita, Fernando, Núbia, Flávia e Verônica, pela
dedicação aos trabalhos do laboratório que permitiram a manutenção das condições
necessárias para o desenvolvimento das pesquisas.
A CAPES e pela bolsa de demanda social que foi cedida.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
vi
SUMÁRIO
TÍTULO
PÁGINA
1. Introdução ................................................................................................. 1
1.1. Câncer .................................................................................................... 1
1.1.1. Epidemiologia ....................................................................................... 1
1.1.2. Conceitos ............................................................................................. 1
1.1.3. Classificação ........................................................................................ 2
1.1.3.1. Carcinomas ....................................................................................... 2
1.1.3.2. Sarcomas .......................................................................................... 3
1.1.3.3. Leucemias ......................................................................................... 4
1.2. Mecanismos de morte celular ................................................................. 4
1.2.1. Necrose ............................................................................................... 5
1.2.2. Apoptose .............................................................................................. 5
1.3. Tratamentos antineoplásicos ............................................................... 10
1.3.1. Radioterapia ...................................................................................... 11
1.3.2. Quimioterapia .................................................................................... 12
1.3.2.1. Alquilantes ....................................................................................... 13
1.3.2.2. Antimetabólicos ............................................................................... 13
1.3.2.3. Antibióticos ...................................................................................... 13
1.3.2.4. Inibidores Mitóticos ..........................................................................14
1.4. Quinonas ............................................................................................... 14
1.4.1. Lapachol ............................................................................................. 16
1.5. Isoquinolino quinonas – IQQ ................................................................ 17
2. Objetivos .................................................................................................. 20
2.1 Objetivo geral ......................................................................................... 20
2.2 Objetivos específicos.............................................................................. 20
3. Justificativa ............................................................................................... 21
4. Metodologia .............................................................................................. 22
4.1. Culturas da linhagem celulares de origem tumoral ............................... 22
4.2. Culturas de células mononucleares do sangue periférico .................... 22
4.3. Quantificação e ajuste das culturas celulares ...................................... 23
4.4. Diluição e armazenamento das IQQ e do lapachol ............................... 23
4.5. Testes de viabilidade celular ................................................................. 23
vii
4.5.1. Determinação da liberação de Lactato Desidrogenase (LDH) ........... 23
4.5.2. Ensaio Metabólico do MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-brometo de
difeniltetrazolium) ..........................................................................................24
4.6. Testes de investigação do tipo de morte celular ....................................25
4.6.1. Microscopia de Fluorescência com coloração de Laranja de Acridina e
Brometo de Etíde ..........................................................................................25
4.6.2. Citometria de fluxo para análise de fragmen. e liberação de dna .......26
4.6.3. Eletroforese do DNA de baixo peso molecular ...................................26
4.7. Análises Estatísticas ............................................................................. 27
5. Resultados ............................................................................................... 28
5.1. Viabilidade e liberação de LDH das culturas de células tumorais ........ 28
5.2. Viabilidade das PBMC tratadas com o lapachol e as IQQ .................... 40
5.3. Análises do tipo de morte celular induzido por IQQ e lapachol ............ 43
5.3.1. Microscopias de Fluorescência ......................................................... 43
5.3.2. Citometrias de fluxo para quantificação do DNA celular ................... 49
5.3.3. Eletroforese do DNA celula ............................................................... 52
6. Discussão ................................................................................................. 54
7. Conclusão ................................................................................................ 60
8. Referências bibliográficas ........................................................................ 61
viii
RESUMO
O crescimento no número de casos de câncer tem preocupado as autoridades
internacionais de saúde, já que se trata de uma enfermidade de difícil tratamento e
corresponde por 12% de todos os óbitos. Na busca por novas drogas para o
tratamento do câncer, foram testados nesta dissertação os efeitos antineoplásicos
induzidos in vitro por doze isoquinolino quinonas (IQQ), sendo três Caulibugulonas e
outros nove análogos sintéticos. Os resultados obtidos foram comparados com o do
lapachol e indicaram que nove IQQ foram efetoras e reduziram a viabilidade de
células tumorais quando tratadas por 48 horas. Dessas nove IQQ, quatro não foram
ativas na redução da viabilidade de PBMC, sugerindo um possível mecanismo de
ação seletivo também sobre células cancerígenas. O tipo de morte celular que as
IQQ induzem foi investigado através de cinética de tempo por microscopia de
fluorescência, sendo possível verificar que as células U937 mortas apresentavam
majoritariamente morfologia de apoptose. Pela técnica de citometria de fluxo com
marcação por PI foi confirmado que 78,29% das células U937 submetidas ao
tratamento com a Caulibugulona A por 48 horas estavam em apoptose,
apresentando DNA fragmentado em
ladder e que foi facilmente extraído pelo
tampão de fosfato-citrato. As concentrações das IQQ utilizadas para a obtenção dos
efeitos antineoplásicos foram muito menores que as necessárias pelo lapachol para
obter os mesmos resultados. Os dados estatísticos de IC50 dos testes de viabilidade
mostram ser até 294 vezes menores para as IQQ quando comparados aos do
lapachol, demonstrando que estas substâncias são promissoras para a continuidade
dos estudos farmacológicos no contexto do câncer.
Palavras-chave: Caulibugulonas, Isoquinolino Quinonas, Antineoplásicos.
ix
ABSTRACT
The growth in the number of cases of cancer has been worrying the
international authorities of health, since it is an illness of difficult treatment and
correspond for 12% of all the deaths. In the search for new drugs for the treatment of
cancer, we tested in this work the antineoplastic effects induced in vitro for twelve
synthetic isoquinoline quinones (IQQ), being three Caulibugulones and other nine
similar. The obtained results were compared with the one of the lapachol and
indicated that nine IQQ was effective and reduced the viability of cancer cells when
treated for 48 hours and evaluated by MTT assay. Of those nine IQQ, four were not
capable to reduce the viability of PBMC cells, suggesting a selective action
mechanism on cancerous cells. The type of cellular death induced by IQQ was
evaluated by ethidium bromide/acridine orange cell stain and scored by fluorescence
microscope; by this method apoptosis was observed in U937 leukemia cell treated
with most of IQQ. The evaluation of apoptosis by flow cytometry in U937 cell treated
with Caulibugulone A for 48 hours and stained with PI confirmed that 78,29% of cells
were in apoptosis. Oligonucleossomal fragments of DNA was also observed in
agarose gel. The concentrations of IQQ used to induce apoptosis in all cell tested
was much smaller than the concentration used for the lapachol. The IC50 data
calculated for viability tests showed to be up to 294 smaller times for IQQ when
compared to the lapachol, demonstrating that these substances are promising for the
continuity of the pharmacology studies.
Keywords: Caulibugulones, Isoquinoline Quinones, Antineoplastic.
x
LISTA DE FIGURAS
TÍTULO
PÁGINA
Figura 1: Micrografias eletrônicas de células normais, apoptoses e necroses .......... 6
Figura 2. Vias de indução de apoptose ...................................................................... 8
Figura 3: Estruturas moleculares básicas: Orto-benzoquinona, Para-benzoquinona,
Quinona, Isoquinolina ............................................................................................... 15
Figura 4: Estruturas básicas dos medicamentos Quinoxalina, Quinaldina,
Quinazolina, Morfina, Prazosin ................................................................................. 16
Figura 5: Estrutura molecular do Lapachol ............................................................... 17
Figura 6. Estruturas moleculares das Isoquinolino quinonas - IQQ testadas ........... 19
Figura 7. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com lapachol ...................... 28
Figura 8. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a Caulibugulona A ...... 29
Figura 9. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a Caulibugulona C ...... 30
Figura 10. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a Caulibugulona D ...... 31
Figura 11. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-12 ........................ 32
Figura 12. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com a IQQ-18 ..................... 33
Figura 13. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-19 ........................ 34
Figura 14. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-21 ........................ 34
xi
Figura 15. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-22 ........................ 36
Figura 16. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-23 ........................ 37
Figura 17. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-24 ........................ 38
Figura 18. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-25 ........................ 39
Figura 19. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT e de liberação de LDH para o tratamento in vitro com IQQ-26 ........................ 39
Figura 20. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT com PBMC. IQQ seletivas ............................................................................... 41
Figura 21. Resultados dos experimentos de viabilidade celular por metabolização de
MTT com PBMC. IQQ não seletivas ........................................................................ 42
Figura 22. Micrografias das microscopias de fluorescência de células U937 tratadas
com caulibugulona A ................................................................................................ 46
Figura 23. Citometrias de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular das
células U937 ............................................................................................................. 50
Figura 24. Citometrias de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular das
células MOLT4 ......................................................................................................... 51
Figura 25. Citometrias de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular das
células COLO205 ..................................................................................................... 52
Figura 26. Perfil do DNA extraído das células COLO205 (A), U937 (B) e MOLT4 (C)
tratadas com IQQ e lapachol por 48 horas ............................................................... 53
xii
LISTA DE TABELAS
TÍTULO
PÁGINA
Tabela 1: IC50 dos experimentos de metabolização do MTT das células tumorais e
PBMC tratadas com as IQQ e lapachol....................................................................40
Tabela 2. Cinética do tratamento de células U937 com o lapachol ........................ 45
Tabela 3. Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona A ............ 45
Tabela 4. Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona D ............ 47
Tabela 5. Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-24 .......................... 48
Tabela 6. Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-26 .......................... 48
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
2N - Células em Diplóides
A1 - BCL2-Related Protein A1
ANOVA – Análise de Variância Entre Grupos
ANVISA – Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
APAF-1 - Apoptosis Protease Activating Factor-1
APO-1 - Apoptosis Antigen-1
ATCC - American Type Culture Collection
ATP – Adenosina Tri-Fosfato
BAD - BCL2 Antagonist of Cell Death
BAX - BCL2 Associated X Protein
BCL-2 - B-Cell Lymphoma/Leukemia-2
BCL-W – BCL2-Related Protein W
Bcl-XL - B-Cell Lymphoma/Leukemia-2 Related Protein X Large
BID - Interacting Domain Death Agonist
CA – Caulibugulona A
Ca++ - Cátion de Cálcio
CCT – Centro de Ciência e Tecnologia
CD - Caulibugulona D
CD95 - Cluster of Differentiation
Cis - Quando os Ligantes de Maior Massa Situam-se do Mesmo Lado da Molécula
CO2 – Dióxido de Carbono
COLO205 – Linhagem de Adenocarcinoma de Cólon Humano
CTL - Controle,
D-MEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
DMSO – Dimetilsulfóxido
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
DNAse - Desoxirribunuclease
Fase G1 – Fase de Gap 1
Fase G2 – Fase de Gap 2
Fase M – Fase de Mitose
Fase S – Fase de Síntese
H460 – Linhagem de Câncer de Pulmão Humano de Células Grandes
xiv
HCl – Ácido Clorídrico
HTLV-I - Vírus Linfotrópico dos Linfócitos T Humanos Tipo I
I24 – Isoquinolino Quinona 24
I26 – Isoquinolino Quinona 26
IC50 - Concentração Necessária Para Matar 50% das Células
IQQ - Isoquinolino Quinonas
LAP - Lapachol
LCQUI – Laboratório de Ciências Químicas
LDH - Lactato Desidrogenase
MAPK p38 - Mitogen-Activated Protein Kinases p38
Mcl-1 - Myeloid Cell Leukemia Sequence 1
MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo
MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo
MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo
MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo
MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste
MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste
min - Minuto
mL - Mililitro
MOLT4 - Human Acute Lymphoblastic Leukemia Cell Line 4
MTT - (3-(4,5-Dimetiltiazol-2-yl)-2,5-brometo de difeniltetrazolium)
NAD - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NADH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Reduzida
NCA= Número de Células em Apoptose
NCN=Número de Células em Necrose
NCNM=Número de Células Normais
ºC – Graus Celsius
OMS – Organização Mundial de Saúde
pb – Par de Base
PBMC – Células Mononucleares do Sangue Periférico
PBS - Phosphate Buffered Saline
pH – Potencial Hidrogeniônico
PI – Iodeto de Propidio
RNA – Acido Ribonucléico
xv
RNAse A – Ribonuclease A
rpm – Rotações por Minuto
RPMI - Roswell Park Memorial Institute medium
SEB - Enterotoxina B de Staphilococcus
Sub-G1 – Sub Gap 1
TA - Taxa de Apoptose
TLLDH = Taxa de Liberação de Lactato Desidrogenase
TNF – Fator de Necrose Tumoral
Trans - Quando os Ligantes de Maior Massa Não se Situam do Mesmo Lado da
Molécula
TVC - Taxa de Viabilidade Celular
U937 – Linhagem Celular Humana Estabelecida de um Linfoma Histiocítico
ug – Micrograma
VM-26 - Teniposídeo
VP-l6 - Etoposídeo
ηm - Nanometro
1.
INTRODUÇÃO
1.1.
CÂNCER
1.1.1. EPIDEMIOLOGIA
O câncer é uma doença crônica de importante repercussão na saúde pública
mundial. Levantamentos realizados pela organização mundial de saúde apontam
que no ano de 2008 foram registrados 12.662.554 casos novos de câncer, excluindo
os cânceres de pele não melanoma, com a ocorrência de 7.564.802 (WHO, 2008).
Os órgãos internacionais de pesquisa e levantamentos do câncer estimam a
incidência de novos casos de câncer com base no método proposto por Black et al.,
(1997). Esse método permite estimar a taxa de incidência de câncer para uma
determinada região, multiplicando-se a taxa observada de mortalidade da região
pela razão entre os valores de incidência e mortalidade da localidade, e assim,
traçam estratégias para o combate ao câncer. Usando-se dessa metodologia, a
Sociedade de Câncer Norte Americana projetou para os Estados Unidos 1.529.560
casos novos de câncer para o ano de 2010, com 569.490 registros de mortes, ou
seja, uma em cada quatros mortes nos USA devem-se ao câncer. Estes valores,
quando comparados aos obtidos por ano no período entre 2000 e 2006, são 1,3%
menores para homens e 0,5% menores para as mulheres. Mesmo assim, o câncer
responde por mais mortes do que as doenças coronarianas, em pessoas com idades
inferiores á 85 anos (Ahmedin, 2010). No Brasil, o processo de industrialização pela
qual o país passou após 1980 levou a um aumento no número de casos de câncer.
A isso, deve a uniformização das condições de trabalho, nutrição e consumo da
população mundial, bem como o aumento da expectativa de vida (Cervi, 2005).
Dados brasileiros do Instituto Nacional do Câncer apontam a incidência de 489.270
casos novos de câncer no ano de 2010, sendo os tipos mais incidentes, à exceção
do câncer de pele do tipo não melanoma, os cânceres de próstata e de pulmão no
sexo masculino e os cânceres de mama e do colo do útero no sexo feminino (INCA,
2009).
1.1.2. CONCEITOS
No âmbito da patologia, o câncer compreende mais de 100 doenças
caracterizadas por uma proliferação desordenada de células malignas, ou seja, que
apresentam alterações genéticas que lhes conferem a capacidade de proliferar
1
desordenadamente e invadir outros tecidos e órgãos. As células cancerígenas são
próprias do organismo, porém, as alterações genéticas pelas quais passaram,
resultam na perda da funcionalidade e assim, tais células prejudicam o
funcionamento normal do organismo. Dentre as várias características das células
cancerígenas, podemos citar a pouca diferenciação e a capacidade de proliferação
rápida (Kumar et al., 2005).
Devido a sua baixa diferenciação, as células cancerígenas migram para
diversos órgãos, sendo esse o fenômeno das metástases, que é caracterizado pela
disseminação das células tumorais malignas para sítios diferentes dos que lhes
deram origem (Kumar et al., 2005; Bacac e Stamenkovic, 2008).
Quando um tumor apresenta células que proliferam lentamente e possuem
alto grau de diferenciação, esses tumores não são considerados cânceres, sendo
denominados de tumores benignos, que raramente trazem riscos a saúde e por
apresentarem uma localização bem delimitada, podem ser removidos por excisão
cirúrgica sem haver recorrência (Domingo et al., 2008). Por outro lado, as
metástases são os principais entraves dos tumores malignos, pois as células
colonizam outros órgãos e com isto, as recidivas são freqüentes (Gavrilovic e
Darzynkiewicz, 2005; Bacac e Stamenkovic, 2008).
Os diferentes tipos de câncer advêm da grande variedade de células
existentes no corpo. Assim, para cada tipo de célula do organismo poderia ter um
tipo de câncer, bastando para tanto, que essa sofra mutações que venham a conferir
agressividade e malignidade (Kumar et al., 2005).
Os cânceres se classificam em três grupos: os de mucosas e células epiteliais
são denominados carcinomas, os de tecidos conjuntivos, como ossos, músculos ou
cartilagens são os sarcomas e o terceiro grupo de cânceres são os de tecido
sanguíneo, conhecidos como leucemias (Kumar et al., 2005).
1.1.3. CLASSIFICAÇÃO
1.1.3.1.
CARCINOMAS
Os carcinomas de pele apresentam maior distribuição na população de pele
clara. Estima-se que mais de 50% das pessoas de pele branca com mais de 60 anos
de idade apresentam algum carcinoma de pele e que nessa população, os cânceres
de pele são muito mais freqüentes que em outras. Além disso, os carcinomas de
pele apresentam distribuição mundial, variando pouco dentre os grupos étnicos
2
(From et al., 2007). Em estudo retrospectivo com 545 pacientes acometidos por
carcinoma basocelular, carcinoma espinocelular e melanoma atendidos no hospital
da faculdade de medicina do ABC, em São Paulo, Brasil, demonstrou-se uma maior
prevalência de câncer de pele entre mulheres (62,9%) e quanto aos grupos étnicos,
98,2% dos pacientes eram de pele branca, confirmando os achados mundiais e
relatados pela OMS. Quanto à distribuição do tipo de câncer de pele nestes
pacientes, foi encontrada a maior prevalência para o carcinoma basocelular e a de
menor freqüência foi para o melanoma (Machado-Filho et al., 1996).
Em relação aos cânceres de mucosa, segundo a organização mundial de
saúde, os mais freqüentes são: câncer de pulmão, cólon, reto e estômago. No Brasil,
dentre os sexos a maior prevalência entre os homens fica a cargo do câncer de
próstata, seguido pelos de pulmão, estômago, cólon, reto e esôfago. Já entre as
mulheres, a maior prevalência observada é para os cânceres de mama, colo uterino,
cólon, reto e estômago (Guerra et al., 2005).
1.1.3.2.
SARCOMAS
Os sarcomas são tumores raros de tecidos conjuntivos e são subdivididos em
sarcomas de tecidos ósseos e sarcomas de partes moles. Os sarcomas ósseos
(osteossarcomas) acometem principalmente os ossos dos braços e das pernas
(Lacerda, 2007). São formados pelo crescimento desordenado das células
mesenquimais que formam os tecidos ósseos, dando origem a massas tumorais. Os
tumores de partes moles acometem os vasos sanguíneos e linfáticos, os músculos,
os tecidos fibrosos e adiposos, o tecido de suporte aos epitélios e o tecido nervoso
periférico (Coindre, 2006), e assim como os osteossarcomas, advêm da proliferação
de células mesenquimais dos tecidos conjuntivos (Kumar et al., 2005; Coindre,
2006). Os sarcomas acometem principalmente as crianças e adultos jovens, com
pico em torno dos 15 anos de idade. No Brasil, a freqüência de distribuição dos
sarcomas é de 2,8 casos para cada grupo de 100.000 crianças e adolescentes. A
principal forma de tratamento consiste na quimioterapia e com suporte, admite-se a
radioterapia e a cirurgia para excisão das massas tumorais (Lacerda, 2007; Coindre,
2006).
3
1.1.3.3.
LEUCEMIAS
As leucemias são cânceres das células do sangue. Sua origem consiste de
alterações genéticas nas células das linhagens eritrocitárias, leucocitárias e
plaquetárias, ainda na medula óssea. As células tumorais das leucemias apresentam
como sítio inicial de proliferação a medula óssea, e em estágios avançados da
doença, as células passam a proliferar também no sangue (Vicent, 1990; Kumar et
al., 2005). A parte majoritária das leucemias é constituída de células das linhagens
leucocitárias
(Leal
e
Wunsch,
2002)
e
os
fatores
que
predispõem
ao
desenvolvimento das leucemias são os mesmos para os outros tipos de câncer,
basicamente radiações ionizantes, agentes químicos, como benzeno, e agentes
virais. Dentre os agentes virais, ressalta-se o vírus linfotrópico dos linfócitos T
humanos tipo I (HTLV-I), que está implicado na maioria dos casos de leucemia de
células T do adulto. Alguns tipos de alterações genéticas também têm sido
descobertas como possíveis causas de leucemias (Bernard, 2010).
Existem quatro tipos principais de leucemia leucocitária, e sua classificação
considera a rapidez de sua evolução e o tipo de leucócito afetado. As leucemias
agudas evoluem rapidamente enquanto que as leucemias crônicas evoluem
lentamente. Quanto ao tipo celular, as leucemias linfocíticas afetam os linfócitos
enquanto que as leucemias mielocíticas afetam os mielócitos, precursores dos
neutrófilos, eosinófilos, basófilos e monócitos. Assim, existem quatro tipos básicos
de leucemias leucocitárias: leucemias mielócíticas agudas, leucemias mielocíticas
crônicas, leucemias linfocíticas agudas e as leucemias linfocíticas crônicas (Kumar
et al., 2005; Leal e Wunsch, 2002).
1.2.
MECANISMOS DE MORTE CELULAR
Os mecanismos de morte celular são divididos em morte autofágica, necrose
e apoptose. Estímulos de injúrias sofridas pelas células desencadeiam reações que
as levam a perda da estrutura celular necessária para a manutenção da vida. Esses
estímulos podem ser internos ou externos. Dentre os estímulos externos pode ser
citado o calor, que em excesso promove a perda da integridade da membrana
plasmática e a célula se rompe. Um exemplo de extímulo interno é a perda da
integridade mitocôndrial, o que leva a liberação de mediadores pró-apotóticos e
desencadeiam o processo de apoptose. Na morte autofágica, um processo ainda
não muito bem entendido, as células passam a destruir suas próprias organelas,
4
levando a falência funcional e a ativação de caspases, deflagrando o estímulo de
morte (Alberts et al., 2009).
1.2.1. NECROSE
A necrose é o mecanismo pelo qual as células morrem de modo nãofisiológico, promovendo lesões tissulares e sintomatologia de várias doenças. A
morte é patológica ou "acidental" quando a célula é impedida de manter seus
processos vitais por lesões físicas ou químicas causadas por fatores externos, como
temperaturas extremas, radiação, traumas, produtos tóxicos e falta de oxigênio que
ocorre no infarto do miocárdio e na gangrena (Alberts et al., 2009; Kanduc et al.,
2002). As lesões podem ter ainda origem biológica, como nas infecções por
bactérias ou vírus. Esse tipo de morte celular foi o único conhecido pelos cientistas
mais antigos e é morfologicamente caracterizado por um inchaço celular e de
organelas do citoplasma, em particular as mitocôndrias, as quais são danificadas,
mas o núcleo não sofre alterações significativas. Tais lesões impedem o controle do
equilíbrio interno exercido pela água e alguns íons (em especial sódio e cálcio),
normalmente bombeados para fora, que passam a fluir livremente para dentro da
célula, que incha e se rompe. A ruptura libera, no próprio tecido, o conteúdo celular
que é rico em proteases e outras substâncias tóxicas, que atraem células do sistema
imune causando intensa reação inflamatória. Alguns tipos de glóbulos brancos
convergem para o tecido em necrose e fagocitam as células mortas. A inflamação,
típica da necrose, é importante para limitar infecções e remover restos de células,
mas a atividade e as secreções dos glóbulos brancos podem também danificar
tecidos normais vizinhos, às vezes de maneira devastadora (Kanduc et al., 2002).
1.2.2. APOPTOSE
A apoptose é um tipo de "auto-destruição celular" que ocorre de forma
ordenada e demanda energia para a sua execução (diferentemente da necrose).
Está relacionada com a manutenção da homeostase e com a regulação fisiológica
do tamanho dos tecidos, mas pode também ser causada por um estímulo patológico
(como a lesão ao DNA celular). A apoptose é um processo com gasto energético,
marcado pela autodigestão controlada dos constituintes celulares, devido à ativação
de proteases endógenas e pode ser comparada metaforicamente a um "suicídio
celular" (Alberts et al., 2009; Elmore, 2007). A ativação dessas proteases
5
compromete a integridade do citoesqueleto, levando a perda na estrutura do
arcabouço celular. Em resposta à contração do volume citoplasmático, a membrana
celular forma bolhas e altera o posicionamento de seus lipídios constituintes, como
ocorre com a fosfatidilserina, que em células normais está presente na camada
interna de lipídios da membrana e nas células em apoptose apresenta-se na
camada externa, servindo como sinalizador para que células fagocíticas das
proximidades englobem os fragmentos celulares e completem o processo de
degradação. Durante a apoptose ocorrem alterações características no núcleo
celular graças à ativação de endonucleases que degradam o DNA. Como resultado,
o núcleo torna-se picnótico e a cromatina se condensa nas porções adjacentes à
membrana nuclear. Finalmente, o núcleo entra em colapso e se fragmenta (Figura
1-D).
Figura 1: Micrografias eletrônicas de células THP1 estimuladas para apoptose com
uma droga de coordenação de cobre. A e B - Célula Normal: Núcleo volumoso (N),
com presença de Mitocôndrias (M) e Retículo Endoplasmático Rugoso (RE). C –
Célula em apoptose, com cromatina condensada (CD) e ausência de mitocôndrias e
Retículo Endoplasmático Rugoso. D - Célula em apoptose: Célula picnótica, com
núcleo compactado e cromatina condensada (CD). (BORGES, 2009).
6
Simultaneamente, as bolhas que se formam no citoplasma separam a célula
em fragmentos circundados por membrana, contendo partes do núcleo e organelas
intactas (corpos apoptóticos). Os restos celulares são fagocitados pelos macrófagos
teciduais ou células adjacentes (Elmore, 2007).
A apoptose pode ser deflagrada por estímulos externos através de receptores
específicos na superfície celular chamados receptores de morte ou por estímulos
internos de estresse intracelular, tais como lesão do DNA ou perturbações no ciclo
celular ou nas vias metabólicas, conforme pode ser observado na Figura 2. Essas
diferentes vias culminam com a ativação de proteases conhecidas como caspases,
que possuem um papel fundamental neste tipo de morte celular. As caspases estão
presentes no citoplasma e já foram descritas em mamíferos 14 membros da família
que estão envolvidos no processo de inflamação e apoptose (Elmore, 2007).
Quando ativadas, as caspases ativam outros membros da família e
amplificam a cascata proteolítica. Alguns membros, tais como a caspase-8, ocupam
posição proximal na cascata e agem como reguladores e iniciadores, enquanto
outros como a caspase-3 são mais distais e agem como efetores da fragmentação
celular. Contrariamente às proteases armazenadas nos lisossomos ou ativadas no
citoplasma por íons como o cálcio, que têm espectro amplo de substratos
inespecíficos, as caspases têm substratos bem restritos, o que lhes asseguram
maior seletividade e especificidade no processo de proteólise. Tais substratos
incluem proteínas envolvidas no reparo de danos e na replicação do DNA, na
sinalização de transdução e na manutenção da integridade da estrutura celular
(Elmore, 2007; Alberts et al., 2009).
A ação sobre seus substratos promove a desestruturação do citoesqueleto e
do núcleo, levando a célula à morte. Um dos mecanismos que pode iniciar o
processo de apoptose é a ativação dos receptores de morte presentes na superfície
celular quando ligantes específicos se acoplam a essa. A maior parte dos receptores
de morte identificados é da família de receptores do TNF e são classificados assim
pela presença na porção extracelular rica em cisteína ("domínios de morte") que
transmite o sinal de morte para o meio intracelular. Entre esses receptores, um dos
mais estudados e melhor caracterizados é o receptor FAS (CD95 ou APO-1).
Quando o ligante-FAS se acopla ao receptor FAS, as moléculas individuais do
receptor se trimerizam formando agregado de cadeias da morte que se ligam a uma
7
proteína adaptadora presente no citosol, chamada cadeia da morte associada ao
FAS, que por sua vez se liga à pro-caspase-8 resultando na ativação dessa enzima
que atua como proteolítica ativando a caspase-3 (Tatsuya et al., 2001; Elmore,
2007).
Figura 2. Vias de indução de apoptose (Adaptado de GUPTA, 2006).
Citocinas inflamatórias, tais como a interleucina-1, ou a presença de estresse
oxidativo, que resulta na lesão de DNA e ativação da p53, podem aumentar a
expressão dos receptores-FAS, tornando as células mais suscetíveis a apoptose
pelo sistema FAS. Simultaneamente, o estresse oxidativo aumenta a expressão do
ligante-FAS, o que pode levar o processo conhecido como "fratricídio", no qual
células adjacentes podem destruir umas as outras pela indução de apoptose. Além
dos receptores de morte, a apoptose pode também ser deflagrada por sinais de
estresse intracelular que resultem em disfunção mitocondrial, tais como lesão do
DNA (via gene p53), alterações nas vias metabólicas, drogas, toxinas ou privação
dos fatores de crescimento (Figura 2). Na presença de sinais de estresse
intracelular ocorre a translocação das proteínas BAX e BID do citosol para a
mitocôndria. Essas proteínas são membros da família de proteínas BCL-2 que
exercem importante função reguladora de apoptose. A translocação das proteínas
pró-apoptóticas para a mitocôndria resulta na liberação para o citosol do citocromo-c,
presente no espaço existente entre a membrana mitocondrial externa e interna. No
8
citoplasma, o citocromo-c forma um complexo com o APAF-1, levando à ativação da
caspase-9, que ativa as caspases efetoras (Kanduc et al., 2002; Elmore, 2007).
Alguns genes têm sido identificados como capazes de influenciar o processo
de apoptose. Entre eles destacam-se os da família das proteínas BCL-2, que
desempenham papel importante na regulação de apoptose por vias fisiológicas ou
patológicas. Dos 15 membros já identificados, alguns como BCL-2 e BCL-XL, BCLW, MCL-1 e A1 são anti-apoptóticos, enquanto outros, tais como BAX, BAD e BID
são pró-apoptóticos (Harrison e Wunsch, 2006). Estas proteínas se distribuem por
várias partes da célula, como na membrana externa da mitocôndria, na membrana
nuclear e no retículo endoplasmático rugoso. Na mitocôndria, distribuem-se
focalmente, nos locais de contato entre a membrana interna e externa. Três funções
têm sido descritas para essas proteínas: dimerização, atividade formadora de poro
ou canal de íons e ligação a outras proteínas. Os principais antagonistas da
apoptose, BCL-2 e BCL-XL, localizam-se, principalmente, na membrana mitocondrial
e recentemente, demonstrou-se que a BCL-2 bloqueia a penetração nuclear de
perforina e granzima, substâncias liberadas pelos linfócitos T citotóxicos contra seus
alvos e que podem ser ativadoras de caspases (Mignotte e Vayssiere, 2001;
Morgan, 1997). Os membros pró-apoptóticos da família BCL-2 são normalmente
encontrados no citosol e quando ativados, se deslocam para a mitocôndria,
alterando a permeabilidade da membrana dessa organela e permitindo a liberação
de proteínas pró-apoptóticas, tais como o citocromo-c, o fator indutor da apoptose,
DNAse e pró-caspases 2 e 9 (Figura 2). A mitocôndria participa da manutenção de
funções celulares vitais, tais como respiração celular e síntese de ATP, modulação
do estado redox da célula, regulação osmótica, controle do pH, homeostasia do
cálcio no citosol e sinalização intracelular. Paradoxalmente, a mitocôndria guarda no
espaço intermembranoso substâncias letais, capazes de deflagrar o processo de
morte celular, entre as quais figura o citocromo-c. Quando liberado da mitocôndria, o
citocromo-c se associa a duas proteínas presentes no citosol, a APAF-1 e a prócaspase-9, e na presença de ATP ativa a caspase-9 que por sua vez, ativa as prócaspases-3 e 7, que executam o processo de apoptose. A caspase-3 pode amplificar
a cascata de proteólise pela ativação da caspase-8 e pela clivagem da proteína antiapoptótica BCL-2 que, normalmente, garante a integridade da membrana
mitocondrial. A caspase-8 ativada cliva a proteína pró-apoptótica BID presente no
citosol, gerando um fragmento que se liga à mitocôndria, permeabilizando as suas
9
membranas. Lesões do DNA celular ativam o gene p53 que favorece maior
expressão da proteína pró-apoptótica BAX que promove a abertura de poros na
membrana mitocondrial (Mignotte e Vayssiere, 2001, Mayer e Oberbauer, 2003).
A membrana mitocondrial interna, por apresentar várias pregas, pode
acomodar o aumento do volume da matriz, enquanto a membrana externa, que é
esférica, se rompe, liberando componentes pró-apoptóticos, como o fator indutor da
apoptose e o citocromo-c. A abertura de poros de permeabilidade na membrana
mitocondrial causa, simultaneamente, ativação das caspases e queda da síntese de
ATP que irá orientar a morte celular, seja por apoptose, seja por necrose. A disputa
pode ser vencida pelas caspases quando estas são diretamente ativadas pelos
receptores da superfície celular ou granzima B, processo que ocorre quando
algumas mitocôndrias continuam a funcionar enquanto outras liberam os mediadores
pró-apoptóticos, circunstância esta em que as células entram em apoptose. Por
outro lado, se o poro de permeabilidade é aberto rapidamente e a célula não pode
obter energia suficiente a partir da glicólise anaeróbia, a depleção do ATP impede
que a apoptose se inicie e a célula morre por necrose (Mayer e Oberbauer, 2003;
Wang, 2001).
1.3.
TRATAMENTOS ANTINEOPLÁSICOS
Os tratamentos aplicados aos pacientes com câncer visam sempre à
destruição das células tumorais. Como as células tumorais são próprias do
organismo, células normais do paciente também ficam suscetíveis a ação dos
fármacos. Buscando peculiaridades existentes entre as células tumorais e normais,
têm-se percebido que as primeiras proliferam-se muito mais rápido que as
segundas, sendo o ciclo celular o principal alvo de tratamento e combate as células
tumorais (Brasileiro-Filho, 2006; Casciato, 2008).
Os tecidos humanos normais que proliferam rapidamente, como as mucosas
e os anexos epidérmicos, passam a sofrer com as terapias aplicadas. Dentre as
terapias, existem as que utilizam feixes de radiação para promoverem a morte das
células tumorais (radioterapia) e as quimioterapias, onde são administrados
fármacos que interferem no funcionamento normal das células, impedindo sua
replicação e levando-as a morte (Casciato, 2006; Kumar et al., 2005; Brasileiro-Filho,
2006).
10
1.3.1. RADIOTERAPIA
Os principais tratamentos antineoplásicos têm por objetivo induzir a morte das
células cancerígenas por apoptose, evitando processos inflamatórios indesejáveis
advindos da necrose (Vermeulen e Ermeman, 2003; Kumar et al., 2005). A premissa
desse sucesso parte do princípio de que a grande maioria das células tumorais
apresenta danos em seu DNA, o que as tornam mais sensíveis a agentes externos,
como a radioterapia e a quimioterapia (Casciato, 2008; Lowe e Lin, 2000). Na
radioterapia, um feixe de radiação ionizante é regulado para incidir sobre uma região
pré-estabelecida em que se encontram as células cancerígenas. A quantidade de
radiação a ser empregada depende do tipo tumoral e do tecido em que irá incidir,
pois as células do organismo apresentam sensibilidades diferentes à radiação. O
sucesso desta terapia é obtido quando todas as células tumorais são erradicadas
(Janneke et al., 2010).
A radioterapia pode ser utilizada também como suporte a quimioterapia ou a
cirurgia para excisão da massa tumoral (Janneke et al., 2010). O princípio de ação
da radioterapia está relacionada às ondas eletromagnéticas aplicadas aos tecidos
que possuem grande quantidade de energia, promovendo a ionização de moléculas
intracelulares, como a água e as cadeias de DNA (Lowe e Lin, 2000). Um efeito
importante da radiação, de relevância clínica para a radioterapia, é a indução da
morte celular por falência reprodutiva ou morte clonogênica, que se caracteriza pela
perda da capacidade de divisão celular. Neste caso, a célula irradiada permanece
morfologicamente íntegra, às vezes conseguindo até processar algumas divisões,
mas perde a capacidade de se dividir por inúmeras vezes e morre. Considerando o
ciclo celular, a fase de divisão celular ou mitose (M) é extremamente sensível à
radiação, pois existe grande possibilidade de que os danos provocados pela
radiação fiquem permanentemente no DNA, provocando aberrações cromossômicas
e morte celular (Jones, 2001; Ross, 1999). Isso acontece devido à grande
compactação da cromatina durante a mitose tornando as lesões inacessíveis às
enzimas reparadoras. Quando os danos sofridos pelo DNA são percebidos e o
sistema de reparo não os consegue recuperar, é deflagrado um sinal de morte
celular que culmina em apoptose, pela ativação de caspases (Alberts et al., 2009).
11
1.3.2. QUIMIOTERAPIA
O primeiro quimioterápico antineoplásico foi desenvolvido a partir do gás
mostarda, usado nas duas Guerras Mundiais como arma química. Após a exposição
de soldados a este agente, observou-se que eles desenvolveram hipoplasia medular
e linfóide, o que levou ao seu uso no tratamento dos linfomas malignos (Fuchs e
Wannmacher, 2010). A partir da publicação, em 1946, dos estudos clínicos feitos
com o gás mostarda e das observações sobre os efeitos do ácido fólico em crianças
com leucemias, verificou-se um avanço crescente no combate ao câncer. O
conhecimento acerca do funcionamento da maquinaria celular abriu um leque de
opções a serem exploradas para a busca de novas drogas antineoplásicas. A
maioria dos agentes utilizados atualmente no tratamento do câncer afetam
diretamente o DNA celular, promovendo danos tanto as células normais como as
neoplásicas, porém, acarretam maior dano às células malignas do que às dos
tecidos normais, devido às diferenças quantitativas entre os processos metabólicos e
ao ciclo de divisões celulares dessas duas populações celulares (Leen et al., 2005).
Por esses motivos a quimioterapia obtém sucesso no tratamento do câncer.
A maioria das drogas utilizadas na quimioterapia antineoplásica interfere de
algum modo nesses mecanismos celulares, e a melhor compreensão do ciclo celular
normal levou à definição clara dos mecanismos de ação da maioria das drogas. Foi
a partir dessa definição que Bruce em 1969 classificou os quimioterápicos conforme
sua atuação sobre o ciclo celular:
• Ciclo-inespecíficos - Aqueles que atuam nas células que estão ou não no
ciclo proliferativo, como, por exemplo, a mostarda nitrogenada.
• Ciclo-específicos - Os quimioterápicos que atuam somente nas células que
se encontram em proliferação, como é o caso da ciclofosfamida.
• Fase-específicos - Aqueles que atuam em determinadas fases do ciclo
celular, como, por exemplo, o metotrexato (fase S), o etoposídeo (fase G2) e a
vincristina (fase M).
Os agentes antineoplásicos mais empregados no tratamento do câncer
incluem
os
alquilantes
polifuncionais,
os
antimetabólitos,
os
antibióticos
antineoplásicos e os inibidores mitóticos (Fuchs e Wannmacher, 2010). Novas
drogas estão sendo permanentemente isoladas e aplicadas experimentalmente em
modelos animais antes de serem usadas no homem (Casciato, 2008).
12
1.3.2.1.
ALQUILANTES
Os compostos alquilantes são capazes de substituir em outra molécula um
átomo de hidrogênio por um radical alquil. Eles se ligam ao DNA de modo a impedir
a separação dos dois filamentos do DNA de dupla fita espiralar, fenômeno este
indispensável para a replicação. Os alquilantes afetam as células em todas as fases
do ciclo celular de modo inespecífico (Kostova, 2006). Apesar de efetivos como
agentes isolados para inúmeras formas de câncer, raramente produzem efeito
clínico ótimo sem a combinação com agentes fase-específicos do ciclo celular. As
principais drogas empregadas dessa categoria incluem a mostarda nitrogenada, a
mostarda fenil-alanina, a ciclofosfamida, o bussulfam, as nitrosuréias, a cisplatina e o
seu análago carboplatina, e a ifosfamida (Bruce e Lin, 1969; Almeida, 2005).
1.3.2.2.
ANTIMETABÓLICOS
Os antimetabólicos afetam as células inibindo a biossíntese dos componentes
essenciais do DNA e do RNA. Deste modo, impedem a multiplicação e função
normais da célula (Fuchs e Wannmacher, 2010). Esta inibição da biossíntese pode
ser dirigida às purinas (como é a ação dos quimioterápicos 6-mercaptopurina e 6tioguanina), à produção de ácido timidílico (5-fluoruracil e metotrexato) e à outras
etapas da síntese de ácidos nucléicos (citosina-arabinosídeo C) (Almeida, 2005).
Essas drogas são particularmente ativas contra células que se encontram na fase de
síntese do ciclo celular (fase S). A duração da vida das células tumorais suscetíveis
determina a média de destruição dessas células, as quais são impedidas de entrar
em mitose pela ação dos agentes metabólicos que atuam na fase S (Fuchs e
Wannmacher, 2010).
1.3.2.3.
ANTIBIÓTICOS
Os antibióticos antineoplásicos formam um grupo de substâncias com
estrutura química variada que, embora interajam com o DNA e inibam a síntese
deste ácido ou de proteínas, não atuam especificamente sobre uma determinada
fase do ciclo celular (Fuchs e Wannmacher, 2010). Apesar de apresentarem tal
variação, possuem em comum a presença de anéis insaturados que permitem a
incorporação de excesso de elétrons e a conseqüente produção de radicais livres
reativos. Podem apresentar outro grupo funcional que lhes acrescentam novos
mecanismos de ação, como alquilação (mitomicina C), inibição enzimática
13
(actinomicina D e mitramicina) ou inibição da função do DNA por intercalação
(bleomicina, daunorrubicina, actinomicina D e adriamicina e seus análogos
mitroxantona e epirrubicina) (Almeida, 2005). Como todos os quimioterápicos, os
antibióticos atuam tanto sobre as células normais como sobre as malignas. Por isso,
também apresentam efeitos colaterais indesejáveis (Almeida, 2005, Casciato, 2008).
1.3.2.4.
INIBIDORES MITÓTICOS
Os inibidores mitóticos podem paralisar a mitose na metáfase, devido à sua
ação sobre a proteína tubulina, formadora dos microtúbulos que constituem o fuso
espiralar, pelo qual migram os cromossomos. Deste modo, os cromossomos,
durante a metáfase, ficam impedidos de migrar, ocorrendo à interrupção da divisão
celular. Esta função tem sido útil na "sincronização" das células quando os inibidores
mitóticos são combinados com agentes específicos da fase S do ciclo. Devido ao
seu modo de ação específico, os inibidores mitóticos devem ser associados a outros
agentes para maior efetividade da quimioterapia (Almeida, 2005). Neste grupo de
drogas estão incluídos os alcalóides da vinca rósea (vincristina, vimblastina e
vindesina) e os derivados da podofilotoxina (o VP-l6, etoposídeo; e o VM-26,
teniposídeo) (Fuchs e Wannmacher, 2010).
Algumas drogas não podem ser agrupadas em uma determinada classe de
ação farmacológica (Bruce e Lin, 1969). Entre elas, destacam-se a dacarbazina,
indicada no tratamento do melanoma avançado, sarcomas de partes moles e
linfomas; a procarbazina, cujo mecanismo de ação não foi ainda completamente
explicado, e que é utilizada no tratamento da doença de Hodgkin; a L-asparaginase,
que hidrolisa a L-asparagina e impede a síntese protéica, utilizada no tratamento da
leucemia linfocítica aguda (Fuchs e Wannmacher, 2010; Casciato, 2008).
1.4.
QUINONAS
Na busca para minimizar os danos provocados ao material genético e os
efeitos colaterais que os fármacos antineoplásicos de uso corrente promovem,
diversas linhas de pesquisas baseadas principalmente nas vias de apoptose buscam
em moléculas indutoras de tal tipo de morte celular protótipos que possam ser
aprimorados para o uso no tratamento do câncer (Casciato, 2008). Dentre as
moléculas pesquisadas chamam a atenção os derivados da quinona (Figura 3).
Essas moléculas são isômeros de posição da ciclohexanodiona e possuem a
14
fórmula molecular C6H4O2 e nomes orto-benzoquinona (benzoquin-1,2-ona) e a
para-benzoquinona
(benzoquin-1,4-ona)
(antitumorais,
leischmanicida,
anti-
inflamatória, antifúngica e tripanomicida (Marsik et al., 2005).
As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de
distribuição natural.
As orto-quinonas metídios estão presentes numa grande
variedade de compostos bioativos que têm sido objeto de interesse durante muitos
anos. Estes compostos têm sido estudados para atividades antineoplásicas,
antinflamatórias e antiparasitárias (Steinberg et al., 2003).
A Quinolina ou 1-azanaphthalene é um composto aromático azotado
caracterizado por uma dupla estrutura que contém um anel de benzeno fundido a
uma piridina em dois átomos de carbono adjacentes. De característica higroscópica,
amarelada e pouco polar, está presente no alcatrão. Para a indústria farmacêutica,
sua síntese é feita partindo-se de uma reação entre a anilina e o ácido sulfúrico
(Sedic et al., 2008). A isoquinolina difere da quinolina pela posição do heteroátomo
que na primeira molécula está presente na posição 2. Ambos os compostos são
muito empregados na indústria farmacêutica como estruturas orgânicas bases para
a síntese de fármacos e na modelagem e aprimoramento de compostos já
existentes. Dentre as drogas comercializadas, encontram-se anti-maláricos,
fungicidas, anti-sépticos e antipiréticos (Martirosyan et al., 2003).
Figura 3: Estruturas moleculares básicas: Orto-benzoquinona, Para-benzoquinona,
Quinolina, Isoquinolina.
A Quinaldina, 2-metilquinolina (Figura 4), é utilizada como um anti-malárico e
está sendo testado como suporte para a produção de anti-maláricos mais potentes.
A quinazolina é utilizada como intermediário para a produção de alguns antihipertensivos periféricos, como o prazosin e doxazosina (Figura 4). Já as
15
quinoxalinas são intermediários na síntese de fungicidas (Figura 4). A síntese de
outras drogas importantes também passam pela estrutura básica das isoquinolinas,
como é feito para a obtenção da morfina. A atividade destes compostos sugere uma
ação na via das quinases celulares, mas ainda não estão bem esclarecidos os
mecanismos de ação (Sedic et al., 2008).
Figura 4: Estruturas básicas
Quinazolina, Morfina, Prazosin.
dos
medicamentos
Quinoxalina,
Quinaldina,
1.4.1. LAPACHOL
O lapachol é uma naftoquinona de conhecida atividade biológica (Figura 5). A
presença do anel de quinona na porção central da molécula é a responsável pela
atividade biológica exibida pelo composto. O mecanismo de ação do lapachol devese a capacidade de gerar radicais semiquinônicos, através da biorredução da
molécula e estes radicais irão atuar então nas rotas celulares (Hussain et al., 2007).
O emprego do lapachol tem sido relatado no combate às doenças tropicais. Esse
emprego é feito indiretamente, pois há relatos da utilização popular do extrato ou
infusões de plantas que sintetizam altas concentrações dessa molécula (Almeida,
2009).
O lapachol foi isolado pela primeira ver por Paterno em 1882 da planta
Tabebuia avellanedae, conhecida popularmente como Ipê-Rosa. A planta também é
popularmente conhecida no Brasil como “Pau d'arco”, e seu extrato é empregado
quando se deseja ações analgésicas, anti-inflamatórias, antineoplásicas e diuréticas.
Os efeitos anti-inflamatórios, antineoplásicos e antimicrobianos devem-se a
saponinas, flavonóides, cumarinas e outros antibióticos derivados do lapachol ou
que se encontram no extrato da planta. Os extratos aquosos e metanólico da T.
16
avellanedae mostraram atividades antifúngica, antinociceptiva e antiedematogênica
(Hussain et al., 2007; Almeida, 2009).
Figura 5: Estrutura molecular do Lapachol, uma Naftoquinona.
Os primeiros relatos científicos da atividade antineoplásica do lapachol datam
de 1974, quando um estudo mostrou a atividade antitumoral contra tumores de
ratos, porém, estudos posteriores não resultaram em significantes atividades
antineoplásicas em testes clínicos. Em 1978, foi feita uma nova tentativa, desta vez,
utilizou-se de nove pacientes com vários tipos de cânceres e o lapachol exibiu efeito
antineoplásico considerável, reduzindo os tumores e as dores sentidas pelos
pacientes (Hussain et al., 2007).
Os principais entraves nas terapias com lapachol é a obtenção de
concentrações plasmáticas terapêuticas, pois apesar da tolerância, as doses
administradas são elevadas devido ao metabolismo acelerado que reduz a
biodisponibilidade do lapachol (Said, 2003).
Assim, tem-se feito estudos de modelagem molecular na busca de compostos
análogos ao lapachol que tenham elevada atividade antitumoral e que a sua
biodisponibilidade seja aumentada. Seguindo esta linha de pesquisa, foram
sintetizados muitos análogos, com atividades contra células de câncer de mama,
pulmão, próstata, ovário, leucemias e melanomas (Hussain et al., 2007; Almeida,
2009).
1.5.
ISOQUINOLINO QUINONAS - IQQ
As IQQ são moléculas orgânicas que apresentam em suas estruturas tanto as
funções de isoquinolina quanto a de quinonas. A indústria farmacêutica tem
despertado interesse nos estudos com essas moléculas, pois seu esqueleto serve
de suporte para a síntese de novas drogas (Kouznetsov et al., 2005). Segundo
17
Kouznetsov (2005), o interesse nessas substâncias deve-se ao fato de que elas
apresentam uma grande variedade de atividades biológicas.
Recentemente, estudos com IQQ obtidas do Bryozoan marinho Caulibugula
intermis revelaram uma ação destes compostos diretamente sobre a via das MAPK
P38, com conseqüente indução de apoptose em várias linhagens de células
cancerígenas. As moléculas isoladas deste animal são conhecidas como
caulibugulonas e são em número de seis, denominadas pelas seis primeiras letras
do alfabeto (A-F) (Brisson et al., 2007; Milanowski et al., 2004).
Um projeto de pesquisa, desenvolvido no Laboratório de Ciências Químicas
(LCQUI) do Centro de Ciências Tecnológicas (CCT) da UENF, coordenado pelo
Professor Dr. Paulo César Muniz de Lacerda Miranda resultou no desenvolvimento
de uma rota inédita para a síntese de três caulibugulonas e nove análogos. As
estruturas das moléculas foram confirmadas por ressonância Magnética-Nuclear e
por espectros de radiação ultravioleta, e estão apresentadas na Figura 6. As
moléculas sintetizadas foram gentilmente cedidas e testadas nos experimentos
dessa dissertação de mestrado. Foram investigados os efeitos antineoplásicos das
doze IQQ cedidas e do lapachol contra linhagens de células tumorais humanas.
Através de ensaios de viabilidade celular foi possível identificar nove IQQ que foram
biologicamente ativas e induziram morte em células tumorais. Em seguida, foi feita
uma avaliação da toxicidade das drogas sobre células humanas normais do sangue
periférico, onde quatro IQQ obtiveram dados de IC50 superiores aos das células
tumorais, indicando a existência de seletividade. Essas substâncias foram testadas
então para investigar o tipo de morte celular induzido. Por microscopia de
fluorescência com coloração por laranja de acridina e brometo de etídeo foi possível
verificar que as células tratadas apresentavam morfologia de apoptose e que a
necrose era rara. As mortes por apoptose foram confirmadas por citometria de fluxo
para picos de DNA Sub-G1 e por eletroforese do DNA celular.
18
Figura 6. Estruturas moleculares das isoquinolino quinonas - IQQ testadas.
19
2.
OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
•
Avaliar in vitro o efeito antineoplásico de doze isoquinolino quinonas
sintéticas sobre células tumorais humanas e comparar com os efeitos do lapachol,
que é uma droga aprovada para uso contra o câncer e que possui estrutura
molecular semelhante às IQQ.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Avaliar e comparar in vitro a capacidade redutora da viabilidade celular
e promotora de danos das células de câncer humano tratadas com as IQQ e com o
lapachol.
•
Selecionar as IQQ efetivas em reduzir a viabilidade das células
tumorais humanas e investigar seus efeitos sobre a viabilidade de PBMC de
indivíduos sadios.
•
Identificar o tipo de morte celular e quantificar a cinética de morte em
culturas celulares tratadas por IQQ e lapachol utilizando técnicas de microscopia de
fluorescência, citometria de fluxo Sub-G1 e eletroforese do DNA celular.
20
3.
JUSTIFICATIVA
O Câncer é a segunda doença que mais causa mortes em todo o mundo.
Segundo estimativas da organização mundial de saúde, 13% de todas as mortes
ocorridas no ano de 2008 foram provocadas pelo câncer, dimensionando assim o
seu impacto econômico, que vem crescendo juntamente com o surgimento de novos
casos (WHO, 2008). Associados ao câncer surgem também outras doenças que
impossibilitam o trabalhador de exercer suas atividades e que mesmo após a
terapia,
alguns
pacientes
podem
ficar
mutilados,
e
impossibilitados
permanentemente de terem uma vida normal (Guerra, 2005).
As atuais drogas antitumorais são muito agressivas, promovendo diversos
efeitos colaterais e colocando inclusive, a vida dos pacientes em risco. Quedas de
cabelos, degeneração da mucosa do trato digestivo, vasculites, nefrotoxicidade e
hepatotoxicidade figuram entre os efeitos colaterais que tornam as atuais terapias
muito penosas (Casciato, 2008). A descoberta de drogas que possam atuar
seletivamente sobre células tumorais, levando-as a morte e que possam trazer
poucos efeitos colaterais, interferindo o mínimo possível na qualidade de vida do
paciente, são os objetivos das pesquisas que visam o desenvolvimento de novos
fármacos antineopláscos.
As caulibugulonas são biomoléculas de ocorrência natural, encontradas no
Bryozoan marinho Caulibugula intermis. Esse animal vive a grandes profundidades
no Oceano Índico, o que dificulta a obtenção dessas biomoléculas em quantidades
suficientes para a realização de estudos farmacológicos (Milanowski et al., 2004). O
grupo de pesquisa coordenado pelo Dr. Paulo Cesar Muniz de Lacerda Miranda,
pesquisador de química e síntese de produtos naturais e colaborador do grupo de
pesquisa do Dr. Milton Masahiko Kanashiro, dispõe de uma rota de síntese inédita
que permite a obtenção de grandes quantidades das caulibugulonas naturais A, C e
D e mais nove análogos sintéticos.
Dessa forma, a existência de quantidades suficientes das IQQ para a
realização dos estudos farmacológicos, bem como das linhagens celulares
cancerígenas justificaram a realização desse trabalho de pesquisa, embasado na
avaliação da atividade antineoplásica dessas três IQQ naturais e nove IQQ
sintéticas.
21
4.
METODOLOGIA
4.1. CULTURA DAS LINHAGENS CELULARES DE ORIGEM TUMORAL
As células U937, MOLT4, H460 e COLO205 foram adquiridas da American
Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas de acordo com seus respectivos
protocolos. As células leucêmicas humanas de linhagem pró-monocítica U937 e de
linhagem linfocítica MOLT4 foram cultivadas em meio DMEM/F12 (Gibco, BRL). As
células cancerígenas humanas de linhagens epitelióides pulmonar e de cólon
intestinal, H460 e COLO205, respectivamente, foram cultivadas em meio de cultura
RPMI (Gibco, BRL). Ambos os meios de cultura foram suplementados com 20ug/mL
de gentamicina (Gibco, BRL) e 10% de soro fetal bovino (Gibco, BRL) e as culturas
celulares foram mantidas em garrafas de cultura de 40mL em estufa (Forma
Scientific Inc., modelo 3159) a 37º C, com 5% de CO2 e unidade controlada, com
troca do meio de cultura ocorrendo a cada dois dias.
4.2.
CULTURA
DE
CÉLULAS
MONONUCLEARES
DO
SANGUE
PERIFÉRICO
As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram
obtidas a partir de 30mL de sangue de indivíduos saudáveis quanto a neoplasias
malignas do sangue. A separação foi processada conforme a metodologia descrita
por Bennett e Breit (1994) utilizando centrifugação em gradiente de FICOLL (GE,
PM400). Em tubos cônicos de 50mL foram adicionados 7,5mL de FICOLL e em
seguida, 15mL do sangue foi adicionado lentamente sobre o FICOLL. O material foi
então centrifugado (Centrifuga Sorval, RT7) à 1500rpm por 40min a 20ºC e o anel de
células mononucleares foram removidas e lavadas três vezes com meio de cultura
DMEM/F12 gelado, sendo a lavagem processada por ciclos de 1500rpm por 10min,
a 4ºC. Após as lavagens, as PBMC foram quantificadas e ressuspendidas em meio
DMEM/F12 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 20ug/mL de gentamicina e
0,25ug/mL Enterotoxina B de Staphilococcus (SEB) (Sigma, S0812). Em seguida,
foram plaqueadas em placas de culturas de células de 96 poços (TPP, 92096), onde
foram distribuídos 100uL da cultura celular na concentração de 1,0x106células/mL.
22
4.3. QUANTIFICAÇÃO E AJUSTE DAS CULTURAS CELULARES
A quantificação celular foi feita em câmara de Neubauer (Boeco) com
coloração vital por Trypan Azul (Sigma, T6146) na concentração de 0,4mM. Uma
alíquota das células de cada cultura foi quantificada e as células ressuspendidas em
meio de cultura DMEM/F12 completo, de modo a obter-se a concentração final de
1,0x106 células/mL de cultura.
4.4. DILUIÇÃO E ARMAZENAMENTO DAS IQQ E DO LAPACHOL
As IQQ sintetizadas no Laboratório de Ciências Químicas (LCQUI) da
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF) sob coordenação
do prof. Dr. Paulo César Muniz de Lacerda Miranda foram cedidas gentilmente para
os testes, enquanto o lapachol (Sigma, 142905) foi adquirido da Sigma-Aldrich. As
alíquotas, após pesagem, foram diluídas em 100µL de DMSO (Sigma, D1650) e
armazenadas em freezer (Freezer Forma Scientific) à temperatura de -70ºC até o
momento de montagem dos experimentos. Para a realização dos testes os
compostos eram
re-diluídos,
desta
vez em meio
de
cultura
DMEM/F12
suplementado, de modo a obter as seguintes concentrações: 8µg/mL, 4µg/mL,
2µg/mL, 1µg/mL e 0,5µg/mL.
4.5. TESTES DE VIABILIDADE CELULAR
4.5.1. DETERMINAÇÃO DA LIBERAÇÃO DE LACTATO DESIDROGENASE
A determinação da taxa de liberação de lactato desidrogenase (LDH) foi feita
segundo a metodologia descrita por Racher (1990). O volume de 100µL/poço das
culturas de células tumorais na concentração de 1,0x106células/mL foi distribuído em
placas de cultura com 96 poços, seguidos de mais 100µL/poço das IQQ diluídas no
meio de cultura DMEM/F12 suplementado, nas concentrações de 8µg/mL, 4µg/mL,
2µg/mL, 1µg/ml e 0,5µg/mL ou do lapachol, também solubilizado em meio
DMEM/F12 e nas concentrações de 80µg/mL, 40µg/mL, 20µg/ml e 10µg/mL. Como
controles negativos e positivos, as células foram incubadas somente no meio de
cultura. Após 48 horas de incubação, foram acrescentados 10µL de uma solução de
Triton 10X (Vetec, 777) aos poços do controle positivo de liberação de LDH ou
negativos para a viabilidade celular por metabolização do MTT e em seguida, 50µL
do sobrenadante de todas as culturas foi transferido para outra placa de 96 poços.
Os 150µL restantes foram reservados para o ensaio metabólico do MTT. A
23
quantidade da enzima LDH foi mensurada pelo Kit Deidrogenase Láctica
Colorimétrico, fabricado pela Doles. A densidade óptica das amostras foi medida em
espectrofotômetro multicanal (Labsystems Multiskan) com comprimento de onda
ajustado para 492ηm. A taxa de liberação de LDH foi calculada pela fórmula a
seguir:
TLLDH = ((MDOT – MDOCN) x 100) / (MDOCP – MDOCN)
Onde:
TLLDH = Taxa de Liberação de Lactato Desidrogenase
MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste
MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo
MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo
4.5.2. ENSAIO METABÓLICO DO MTT (3-(4,5-DIMETILTIAZOL-2-YL)-2,5BROMETO DE DIFENILTETRAZOLIUM)
O teste de viabilidade celular utilizando a metabolização do MTT (Sigma,
M2128) foi feito de acordo com a metodologia de Mosmann (1983). Para os testes
com as PBMC, processou-se o plaqueamento de 100µL das células com mais 100µL
das IQQ e do lapachol em placas de cultura de 96 poços, de modo que a
concentração final das isoquinolino quinonas fosse de 4µg/mL, 2µg/mL, 1µg/mL,
0,5µg/mL e 0,25µg/ml e do lapachol de 40µg/mL, 20µg/mL, 10µg/mL e 5µg/mL. As
PBMC foram submetidas ao tratamento por 48 horas e a seguir a viabilidade foi
avaliada pelo teste de metabolização do MTT. Para as células de linhagens
tumorais, utilizaram-se os 150µL das culturas reservados dos ensaios para a
determinação de liberação da enzima Lactado Desidrogenase e a esses,
acrescentados 15µL de uma solução de MTT em PBS na concentração de
5,0mg/mL nas culturas de células tumorais e 20µL foi acrescentado às culturas de
PBMC. Após 4 horas de incubação, foram retirados 100µL do sobrenadante das
culturas de células tumorais e 150µL das culturas de PBMC e os cristais púrpuras
precipitados de MTT foram solubilizados em 100µL de solução de isopropanol
(Merck, 1009781000) com 0,0014% de HCl fumegante. Para separar o precipitado,
as placas foram submetidas à centrifugação por 10min a 1500rpm e 100µL do
sobrenadante foi transferido para outra placa de cultura de 96 poços e lida na
24
seqüência em espectrofotômetro multicanal com comprimento de onda ajustado para
570ηm. A taxa de viabilidade celular foi calculada de acordo com a fórmula a abaixo:
TVC = ((MDOT – MDOCN) x 100))/ (MDOCP – MDOCN)
Onde:
TVC = Taxa de Viabilidade Celular
MDOT = Média das Densidades Ópticas de Cada Teste
MDOCN = Média das Densidades Ópticas do Controle Negativo
MDOCP = Média das Densidades Ópticas do Controle Positivo
4.6. TESTES DE INVESTIGAÇÃO DO TIPO DE MORTE CELULAR
Para avaliação do tipo de morte celular induzida pelos tratamentos, às células
tumorais foram submetidas aos tratamentos com as IQQ que demonstraram
seletividade e mataram as células tumorais em concentrações menores que as
necessárias para matar as células PBMC.
4.6.1. AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR POR APOPTOSE EM CÉLULAS
CORADAS COM LARANJA DE ACRIDINA E BROMETO DE ETÍDEO
As células U937 foram submetidas ao tratamento com as IQQ nas
concentrações finais de 4µg/mL, 2µg/mL, 1µg/ml, 0,5µg/mL e 0,25µg/mL e do
lapachol de 40µg/mL, 20µg/mL, 10µg/mL e 5µg/mL e avaliadas por microscopia de
fluorescência com coloração de laranja de acridina (5µg/mL, Sigma, A6529) e
brometo de etídio (10µg/mL, Sigma E8751) nos tempos de 12, 24 e 48 horas de
incubação. Como controles negativos, as células foram cultivadas apenas em meio
de cultura DMEM/F12 completo, não sofrendo assim qualquer estimulo de morte.
Para a coloração, 60µL das culturas de células foram corados com 10µL da solução
de laranja de acridina e brometo de etídeo e em seguida, 10µL foram depositados
em lâmina de microscópica e foram cobertos com uma lamínula para serem
analisados no microscópio de fluorescência (Nikon Labophot), onde foram contadas
300 células por lâmina e em campos aleatórios, com diferenciação entre células
normais, apoptose e necrose de acordo com as características morfológicas. Foram
obtidas micrografias das células tratadas com a caulibugulona A na concentração de
4µg/mL, sendo capturadas no microscópio Zeiss Axioplan através do software
Axiovision 4.6. As taxas de apoptose para cada experimento foram obtidas de
acordo com o a seguinte fórmula:
25
TA = NCA x 100 / NCA + NCN + NCNM
Onde:
TA= Taxa de apoptose
NCA= Número de células em apoptose
NCN=Número de células em necrose
NCNM=Número de células normais
4.6.2. CITOMETRIA DE FLUXO PARA ANÁLISE DE FRAGMENTAÇÃO E
LIBERAÇÃO DE DNA
Para a quantificação de células em apoptose, foi utilizada a metodologia
descrita por Gong (1994). As células U937, MOLT4, COLO205 foram submetidas ao
tratamento com as IQQ pelo período de 48 horas e nas concentrações de 4µg/mL e
do lapachol na concentração de 40µg/mL. Como controles negativos de indução de
apoptose, as células foram cultivadas em meio de cultura DMEM/F12 ou RPMI
completos. Após o período de incubação, as células foram lavadas em PBS e
centrifugadas por 5min a 1500rpm. O pellet foi fixado com a adição lenta de etanol
70% gelado, a -20ºC e sob agitação constante por vórtex. As células ficaram fixando
por 30min a 4ºC. Depois de fixadas, as células foram sedimentadas com
centrifugação a 1500rpm por 5min, sendo lavada com tampão de fosfato-citrato 0.2M
e pH=7.8 Ao pellet foi acrescentado 50µL de RNAse A (100µg/mL Sigma, R4875) e
incubado a temperatura ambiente por 15min. A seguir, foi adicionado de 400µL de
iodeto de propidium (concentração final 50µg/mL; Sigma, P4170). As células foram
avaliadas, então, para a marcação do conteúdo de DNA por PI, em citômetro FACS
Calibur, sendo contados 10.000 eventos, por amostra. Os histogramas foram
gerados através das analises dos resultados pelo software WinMDI versão 2.9.
4.6.3. ELETROFORESE DO DNA DE BAIXO PESO MOLECULAR
Os perfis do DNA encontrado no núcleo das células, após o tratamento de 48
horas com as IQQ na concentração de 4µg/mL e do lapachol na concentração de
40µg/mL por 48 horas, foi investigado por eletroforese em gel de agarose (Sigma,
A9539), seguindo a metodologia proposta por Gong (1994). Para tanto, 2,0x106
células U937, MOLT4 e COLO205 foram tratadas e em seguida, lavadas duas vezes
em PBS, com centrifugação de 1500rpm por 10min. Após a segunda centrifugação,
o PBS foi descartado e o pellet de células foi fixado com 1mL de etanol 70% gelado,
26
por 24 horas. Após a fixação, as células foram centrifugadas a 1500rpm por dez
minutos e o etanol descartado. Para cada amostra foi acrescentada 50µL de tampão
fosfato-citrato de concentração 0,2M e com PH=7,8. As células foram incubadas por
30min a 37ºC e depois foi feita uma centrifugação a 1500rpm por 5min. Foi coletado
em seguida, 40µL do sobrenadante, que foi transferido para outro ependorff estéril,
onde foi acrescentado 5µL de RNAse A, na concentração de 1mg/mL. As amostras
foram incubadas por mais 30 minutos a 37ºC e depois, foi acrescentado mais 5µL de
proteinase K (Sigma, P8044) na concentração de 1mg/mL, e as amostras foram
novamente incubadas por 30min a 37ºC. Por fim, 20µL de cada amostra foram
recolhidos para o processamento da eletroforese. Os géis utilizados continham
agarose na concentração de 1,0% e brometo de etídeo na concentração de 5µg/mL.
As eletroforeses foram corridas em fontes BIO-RAD (164-5070), com voltagem de
60V pelo período de 2 horas. Após, os géis foram registrados em câmara Gel DocXR+ BioRad, e analisadas com o software Image Lab.
4.7. ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os gráficos representam os valores médios e foram obtidos através do
software Microsoft Excel 2007 aplicando-se das fórmulas descritas na metodologia e
as barras representam os desvios padrões dos experimentos, que foram realizados
em triplicata. Aos resultados obtidos foi aplicado o teste estatístico ANOVA e o pósteste de Tukey, sendo empregado o software GraphPad Prism Versão 5.0 para gerar
os dados. Os resultados de p<0,05 foram considerados estatisticamente
significantes.
Os resultados obtidos para a inibição da viabilidade de 50% das células
corresponde ao IC50, que foi calculado pelo software GraphPad Prism Versão 5.0,
através do teste de regressão não-linear.
27
5.
RESULTADOS
5.1. VIABILIDADE E LIBERAÇÃO DE LDH DAS CULTURAS DE CÉLULAS
TUMORAIS
Os dados obtidos para o lapachol estão apresentados na Figura 7. Nessa
figura podemos observar que as células U937 (Figura 7-A), MOLT4 (Figura 7-B) e
COLO205 (Figura 7-C) foram sensíveis aos tratamentos com a maior concentração
de lapachol testada, onde se observa uma baixa taxa de viabilidade celular. As
células H460 (Figura 7-D) mostraram-se resistentes aos tratamentos, exibindo uma
taxa de viabilidade celular superior a 40% quando tratadas com a maior
concentração do lapachol, sendo a redução da taxa de viabilidade seguida por um
aumento proporcional na taxa de liberação de LDH.
Figura 7. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com lapachol. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com lapachol. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
Os dados obtidos para o tratamento das células de COLO205 (Figura 7-C)
com a maior concentração testada sugerem um processo de morte por
apoptose.Nota-se que a liberação de LDH foi baixa (12,5%) enquanto que a
28
viabilidade da cultura foi inferior a 10%, ou seja, em torno de 90% das células
morreram, porém, permaneceram com a membrana plasmática integra e não
liberaram LDH. O fato dos tratamentos das células U937 (Figura 7-A) e MOLT4
(Figura 7-B) apresentarem elevadas taxas de liberação de LDH pode ser explicado
pela manutenção por muitas horas de células em apoptose em meio de cultura,
onde não existem fagócitos para remover as células em apoptose, evoluindo assim
para um processo de necrose secundária.
Figura 8. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a caulibugulona A. As células U937 (A), MOLT4 (B),
COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com a caulibugulona A. O símbolo *
representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles
cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com
P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a
viabilidade de 50% das células tratadas.
Quando são observados os resultados obtidos pelo tratamento com a
caulibugulona A (Figura 8), nota-se que nenhuma das linhagens celulares mostrouse resistente ao tratamento e em relação ao lapachol, as concentrações necessárias
para a indução de morte foram inferiores. A linhagem MOLT4 (Figura 8-B) foi a mais
sensível ao tratamento, exibindo taxa de viabilidade zero na concentração de
1µg/mL, enquanto que todas as células U937 (Figura 8-A), COLO205 (Figura 8-C)
e H460 (Figura 8-D) tiveram suas taxas de viabilidade reduzidas à zero apenas com
a concentração de 4µg/mL. Quando são observados os dados obtidos para as
células H460 (Figura 8-D), nota-se que na máxima concentração há ausência de
29
viabilidade enquanto que nem todas as células liberaram LDH, o que se sugere um
processo de morte por apoptose.
Os resultados obtidos para as células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) tratadas com a caulibugulona C estão apresentados na Figura 9. Nessa
figura observa-se que assim como o obtido para o lapachol, as células H460
mostraram-se resistentes ao tratamento nas concentrações testadas. Novamente, a
célula MOLT4 foi a mais sensível, apresentando ausência de viabilidade quando
tratadas com a concentração de 2µg/mL, enquanto que as células U937 e COLO205
obtiveram reduções significativamente grandes das viabilidades apenas na
concentração máxima testada de 4µg/mL. Os tratamentos aplicados as células
cancerígenas com essa caulibugulona são sugestivos de um processo de morte
celular por apoptose, pois se observa que apesar da ausência (Figura 9-B) ou da
elevada redução de viabilidade (Figuras 9-A e C), as taxas de liberação de LDH não
foram proporcionais.
Figura 9. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a caulibugulona C. As células U937 (A), MOLT4 (B),
COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com caulibugulona C. O símbolo *
representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles
cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com
P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a
viabilidade de 50% das células tratadas.
Na Figura 10 estão apresentados os resultados obtidos dos experimentos de
viabilidade e liberação de LDH aplicados as células U937 (Figura 10-A), MOLT4
30
(Figura 10-B), COLO205 (Figura 10-C) e H460 (Figura 10-D) quando foram
submetidas ao tratamento com a caulibugulona D pelo tempo de 48 horas. Essa
caulibugulona foi muito efetiva, induzindo morte celular em todas as linhagens
testadas, sendo a célula U937 a menos sensível, apresentando uma discreta
viabilidade na concentração de 4µg/mL (Figura 10-A). Os resultados obtidos para as
células U937 (Figura 10-A), COLO205 (Figura 10-C) e H460 (Figura 10-D) são
sugestivos de morte celular por apoptose. Nesses testes, pode-se observar que
apesar da redução da taxa de viabilidade celular na concentração de 4µg/mL, a
liberação de LDH não indica uma proporcionalidade de células rompidas com a
redução da viabilidade apresentada. Uma observação interessante quanto aos
dados obtidos para a caulibugulona D é que diferente do lapachol e da
caulibugulona C, as células H460 não mostraram resistência e apresentaram
resultados sugestivos de indução de apoptose (Figura 10-D).
Figura 10. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a caulibugulona D. As células U937 (A), MOLT4 (B),
COLO205 (C) e H460 (D) foram tratadas por 48 horas com caulibugulona D. O símbolo *
representa os valores estatisticamente significantes em relação às células controles
cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com
P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a
viabilidade de 50% das células tratadas.
Os resultados obtidos para a IQQ-12 demonstraram que essa substância foi
capaz de reduzir totalmente a quantidade de células vivas nas culturas de U937,
31
MOLT4, COLO205 e H460 (Figura 11). A linhagem celular mais sensível a essa IQQ
foi a U937 (Figura 11-A), em que a viabilidade celular estava praticamente ausente
na concentração de 0,5µg/mL, e com uma taxa de liberação de LDH não
proporcional a redução da taxa de viabilidade. Estes resultados são sugestivos de
morte celular por apoptose. As células MOLT4 (Figura 11-B), COLO205 (Figura 11C) e H460 (Figura 11-D) também não resistiram ao tratamento, obtendo-se uma
redução total ou quase total das taxas de viabilidades na concentração de 4µg/mL.
Assim como o observado para as células U937 (Figura 11-A), as células COLO205
(Figura 11-C) e H460 (Figura 11-D) também não apresentaram taxas de liberações
de LDH compatíveis com a redução das taxas de viabilidade, sustentando a
indicação de morte celular por apoptose.
Figura 11. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a IQQ-12. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-12. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
Quando as células tumorais foram tratadas com a IQQ-18 (Figura 12), as
linhagens de células epitelióides COLO205 (Figura 12-C) e H460 (Figura 12-D)
demonstraram resistência, com uma discreta redução da taxa de viabilidade celular
e ausência de liberação de LDH. Já as células de origem leucêmica foram sensíveis
ao tratamento, sendo as células MOLT4 (Figura 12-B) mais sensíveis que as células
32
U937 (Figura 12-A). Na Figura 12-A, referente ao tratamento aplicado as células
U937, nota-se que apesar da taxa de viabilidade celular ser nula na concentração de
4µg/mL, a taxa de liberação de LDH não é total, indicando que nem todas as células
mortas sofreram rompimento da membrana plasmática. A mesma observação pode
ser verificada na Figura 12-B, onde se pode notar que na concentração de 1µg/mL
não ocorre uma proporcionalidade entre a perda da taxa de viabilidade e a taxa de
liberação de LDH. Esses achados sugerem que essa IQQ também induz morte
celular por apoptose.
Figura 12. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a IQQ-18. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-18. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
Das IQQ testadas a IQQ-19 foi a menos ativa, com pode ser observado na
Figura 13. Nessa figura, os resultados obtidos pelo tratamento das linhagens de
células U937 (Figura 13-A), MOLT4 (Figura 13-B), COLO205 (Figura 13-C) e H460
(Figura 13-D) não indicam taxas de liberação de LDH. Quanto às taxas de
viabilidade celular, ocorre uma discreta redução apenas nas culturas de células
H460 (Figura 13-D) sendo considerada estatisticamente significante.
33
Figura 13. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a IQQ-19. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-19. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
Figura 14. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a IQQ-21. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-21. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
34
Os resultados dos testes de viabilidade celular por metabolização de MTT e
as taxas de liberação de LDH das células tratadas com a IQQ-21 estão
apresentados na Figura 14. Nessa figura, podemos observar que essa IQQ também
foi pouco ativa. As células U937 (Figura 14-A), MOLT4 (Figura 14-B) e COLO205
(Figura 14-C) mostraram-se resistentes aos tratamentos, não sendo identificadas
reduções nas taxas de viabilidade e liberação de LDH. Por outro lado, as células da
linhagem
H460
foram
sensíveis
ao
tratamento,
apresentando
redução
estatisticamente significante na taxa de viabilidade, assim como uma elevação
também significante na taxa de liberação de LDH (Figura 14-D).
As análises dos resultados obtidos para os experimentos de viabilidade e de
liberação de LDH, aplicados as culturas celulares tratadas com a IQQ-22 estão
expressos na Figura 15, onde se pode observar que todas as quatro linhagens
celulares foram sensíveis aos tratamentos. A linhagem de células leucêmicas U937
(Figura 15-A) e MOLT4 (Figura 15-B) foram as mais sensíveis, não exibindo células
viáveis quando o tratamento utilizado tinha 2µg/mL da IQQ-22. A viabilidade foi
reduzida drasticamente também nas culturas de célula COLO205 (Figura 15-C) na
concentração de 4µg/mL. As células H460 exibiram considerável resistência,
apresentando quase 50% das células viáveis com o tratamento na concentração de
4µg/mL. Quanto à liberação de LDH, as taxas não foram proporcionais com a
redução das viabilidades. Quando se comparam as taxas de liberação de LDH e as
taxas de viabilidade pela metabolização do MTT nas culturas de células MOLT4
(Figura 15-B), observa-se na concentração de 2µg/mL uma ausência de viabilidade
e de liberação de LDH, um forte indicativo de morte por apoptose. Não tão
proeminente, pode-se observar também nas culturas de células COLO205 (Figura
15-C) e H460 (Figura 15-D) que as liberações de LDH também não são
proporcionais a viabilidade perdida pelas culturas, sendo a liberação de LDH pelas
culturas de H460 (Figura 15-D) não estatisticamente significantes.
A IQQ-23 mostrou-se fracamente ativa nas concentrações testadas (Figura
16). As reduções nas taxas de viabilidade foram discretas, sendo que as culturas de
células COLO205 (Figura 16-C) e H460 (Figura 16-D) não apresentaram reduções
das taxas viabilidades e nem elevações das taxas de liberação de LDH
estatisticamente significantes (p>0,05). Por outro lado houve elevação da taxa de
liberação de LDH e redução da taxa de viabilidade estatisticamente significante para
os experimentos com as células U937 (Figura 16-A) na máxima concentração
35
testada. Nessa concentração, essa IQQ foi capaz de matar todas as células MOLT4
(Figura 16-B), enquanto que a taxa de liberação de LDH ficou próxima de 50%,
resultado esse, sugestivo de indução de apoptose.
Figura 15. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a IQQ-22. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-22. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
A IQQ-24 é um isômero da IQQ-23. Apesar de possuírem a mesma fórmula
química, o rearranjo molecular é diferente e essa diferença conferiu a IQQ-24 uma
maior efetividade, como pode ser observado na Figura 17. Os resultados dos
experimentos de viabilidade celular demonstram que essa IQQ foi ativa nas células
das linhagens U937 (Figura 17-A), MOLT4 (Figura 17-B) e H460 (Figura 17-D),
com uma intensa redução da taxa de viabilidade e uma discreta liberação de LDH,
sugerindo que essa IQQ também induz morte celular por apoptose. Diferente das
outras células, a linhagem COLO205 (Figura 17-C) foi resistente a todas as
concentrações testadas, sem reduções significativas das taxas de viabilidade. Uma
observação interessante é com relação aos dados obtidos do tratamento das células
H460 (Figura 17-D), em que essa linhagem celular teve sua viabilidade totalmente
reduzida com o tratamento na concentração de 2µg/mL e com uma discreta taxa de
liberação de LDH.
36
Figura 16. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a IQQ-23. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-23. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
A IQQ-25 é um isômero de posição da IQQ-19. Diferente do que ocorreu
com os isômeros IQQ-23 e IQQ-24, a IQQ-25 apresentou resultados semelhantes
aos de seu isômero. Os resultados dos experimentos de viabilidade celular e de
liberação de LDH demonstram uma discreta redução nas taxas de viabilidade dos
testes feitos com as células U937 (Figura 18-A) e MOLT4 (Figura 18-B). Através de
análises estatísticas, foi possível verificar que nas culturas de U937 a redução da
taxa de viabilidade na maior concentração testada foi estatisticamente significante,
assim como uma taxa de liberação de LDH de 7,5%, ambos os resultados com
p<0,05. Nos testes com as células MOLT4, apesar de não haver liberação de LDH, o
resultado das taxas de viabilidade obtido demonstram uma redução da viabilidade
estatisticamente significante (P<0,05), sem liberação de LDH, o que sugere a
existência de morte celular por apoptose. As células COLO205 (Figura 18-C) e
H460 (Figura 18-D) não apresentaram nem reduções das taxas de viabilidade e de
liberação de LDH estatisticamente significantes.
37
Figura 17. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a IQQ-24. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-24. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
A IQQ-26 também foi muito ativa, sendo capaz de interferir na viabilidade e
induzir a liberação de LDH em todas as células tratadas, como pode ser isto na
Figura 19. A linhagem MOLT4 (Figura 19-B) foi a mais sensível, demonstrando
ausência total de viabilidade já na concentração de 0,25µg/mL, e com uma pequena
taxa de liberação de LDH nos experimentos com as células COLO205 e H460,
resultado esse sugestivo de apoptose. As células U937 (Figura 19-A) sofreram
reduções drásticas na taxa de viabilidade de suas culturas quando tratadas com a
concentração de 0,5µg/mL, também acompanhada de uma discreta liberação de
LDH. As células de linhagens epitelióides COLO205 (Figura 19-C) e H460 (Figura
19-D) sofreram reduções consideráveis nas suas taxas de viabilidade nas
concentrações de 1µg/mL, sempre acompanhadas de uma discreta taxa de
liberação de LDH, que são indicativos de morte celular por apoptose.
38
Figura 18. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a IQQ-25. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-25. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
Figura 19. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT e de liberação de LDH
para o tratamento in vitro com a IQQ-26. As células U937 (A), MOLT4 (B), COLO205 (C) e
H460 (D) foram tratadas por 48 horas com IQQ-26. O símbolo * representa os valores
estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em condições
ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey,
e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células
tratadas.
39
5.2. VIABILIDADE DAS PBMC TRATADAS COM O LAPACHOL E IQQ
As nove IQQ ativas contra as células tumorais foram testadas para a
viabilidade por metabolização do MTT com as PBMC, e os resultados dos IC50 estão
expressos na Tabela 1.
Tabela 1: IC50 (µg/mL) dos experimentos de metabolização do MTT das células
tumorais e PBMC tratadas com as IQQ e lapachol.
Isoquinolino Quinona PBMC
U937
MOLT4
COLO205
H460
IQQ-12
0,6
<0,25
0,5
0,7
0,6
IQQ-18
2,3
2,0
0,9
>4,0
>4,0
IQQ-22
1,6
1,1
0,5
2,1
4,0
IQQ-23
>4,0
>4,0
2,3
>4,0
3,3
IQQ-24
>4,0
2,0
1,8
>4,0
0,8
IQQ-26
1,1
<0,25
<0,25
0,5
0,2
Caulibugulona A
>4,0
1,1
0,3
3,0
0,6
Caulibugulona C
3,2
3,0
1,1
3,2
>4,0
Caulibugulona D
>4,0
3,5
2,6
2,5
1,4
Lapachol
>40,0
29,4
18.8
13,4
22,9
As células tumorais e PBMC foram tratadas por 48 horas com as IQQ e com o lapachol. Os
valores de IC50 foram calculados pelo software Graphpad Prism versão 5.0, pelo método de
regressão não linear. As linhas sombreadas representam as IQQ que apresentaram IC50
para as PBMC maiores que para as células tumorais.
Das nove IQQ testadas, quatro reduziram menos a viabilidade das PBMC
quando comparadas com as células tumorais, e os resultados estão apresentados
na Figura 20. Enquanto o tratamento com lapachol na concentração de 40µg/mL foi
capaz de reduzir para menos de 50% a viabilidade de todas as quatro linhagens
celulares (Figura 7), nos testes de MTT com as mesmas concentrações e para as
PBMC (Figura 20-A), a taxa de viabilidade reduziu menos de 20%, não sendo essa
redução estatisticamente significante (p>0,05). Das quatro IQQ que demonstraram
seletividade, a única que reduziu de forma estatisticamente significante a viabilidade
das células PBMC foi a 26 (Figura 20-C). As toxicidades apresentadas pelo lapachol
e pelas IQQ estão representadas na forma da concentração necessária para matar
50% das células (IC50), sendo que este índice encontrado para o lapachol e para
essas quatro IQQ foi menor que o necessário para matar as linhagens celulares
tumorais (Figura 20). Esse resultado demonstra que essas IQQ foram seletivas, e
mataram as células tumorais em concentrações menores que as necessárias para
promover a morte das PBMC.
Os testes com PBMC revelaram também que cinco IQQ não foram seletivas,
reduzindo a viabilidade dessas células em concentrações inferiores às necessárias
40
para matar as células tumorais (Figura 21), ou seja, num tratamento conjunto,
espera-se que as células tumorais permaneçam vivas em concentrações em que as
células humanas normais já não apresentem mais viabilidade. Como pode ser
observada nos resultados obtidos para a caulibugulona C (Figura 21-A), na
concentração de 4µg/mL a viabilidade das culturas de PBMC era praticamente nula
e o valor de IC50 obtido para as PBMC indica que a concentração necessária para
reduzir 50% da viabilidade das PBMC supera, com uma diferença razoável, apenas
a obtida para as células MOLT4, sendo praticamente o mesmo obtido para as
células U937 e COLO205 e é menor que o obtido para as células H460.
Figura 20. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT com PBMC tratadas
com as IQQ seletivas e o lapachol. As PBMC foram tratadas por 48 horas com as IQQ e
com o lapachol e os resultados obtidos indicam as taxas de viabilidade celular quanto à
metabolização de MTT. A: lapachol, B:IQQ-24, C:IQQ-26, D:caulibugulona A,
E:caulibugulona D. O símbolo * representa os valores estatisticamente significantes em
relação às células controles cultivadas em condições ideais (100% de células viáveis e 0%
de liberação de LDH), com P<0,05 no teste de Tukey, e IC50 representa a concentração
necessária para reduzir a viabilidade de 50% das células tratadas.
41
A IQQ-12 foi muito ativa, reduzindo a viabilidade das células tumorais em
concentrações inferiores a 1µg/mL (Figura 21-B). Porém, reduziu muito a viabilidade
das células PBMC, apresentando IC50 elevado apenas quando comparado ao
encontrado para as células U937. Os IC50 obtidos para as células MOLT4, COLO205
e H460 são muito próximos ao obtido com as PBMC, indicando uma ausência de
seletividade quanto à indução de morte nas células tratadas in vitro. Os dados
obtidos para a IQQ-18 (Figura 21-C) dão conta de que essa substância também
exibiu uma baixa seletividade, atuando apenas nas células leucêmicas. Mesmo
assim, o IC50 obtido foi de 2,3µg/mL, muito próximo ao obtido para a célula U937,
que foi de 2µg/mL.
Figura 21. Avaliação da viabilidade celular por metabolização de MTT com PBMC tratadas
com as IQQ não seletivas. As PBMC foram tratadas por 48 horas com as IQQ e os
resultados obtidos indicam as taxas de viabilidade celular quanto à metabolização de MTT.
A: Caulibugulona C, B:IQQ-12, C:IQQ-18, D:IQQ-22, E:IQQ-23. O símbolo * representa os
valores estatisticamente significantes em relação às células controles cultivadas em
condições ideais (100% de células viáveis e 0% de liberação de LDH), com P<0,05 no teste
de Tukey, e IC50 representa a concentração necessária para reduzir a viabilidade de 50%
das células tratadas.
42
A IQQ-18 exibiu seletividade somente quando comparado com a célula
MOLT4, apresentando IC50 mais de duas vezes maior do que o da célula tumoral.
Quanto a IQQ-22 (Figura 21-D), essa também foi pouco seletiva e assim como a
IQQ-18, demonstrou seletividade apenas quando comparada com a célula MOLT4,
exibindo IC50 menor do que os apresentados pelas células COLO205 e H460,
próximo ao da célula U937 e três vezes maior que o apresentado pelas células
MOLT4. Outra IQQ que não demonstrou seletividade foi a 23 (Figura 21-E). Essa
substância não foi capaz de reduzir significantemente a viabilidade das células
PBMC e o IC50 obtido não permitiu concluir a existência de seletividade.
5.3. ANÁLISES DO TIPO DE MORTE CELULAR INDUZIDO POR IQQ E
LAPACHOL
A indução de morte celular por apoptose é muito importante quando se tratam
de alvos terapêuticos com drogas antitumorais, devido ao fato que o processo de
apoptose não é seguido de autólise e assim, consegue-se evitar a liberação de
mediadores pró - inflamatórios. Tendo em vista que quatro das IQQ demonstraram
seletividade quanto à redução da viabilidade celular em células tumorais, foi
investigado então o tipo de morte celular por elas induzido. Os resultados obtidos
dos testes de viabilidade celular pela metabolização do MTT e da liberação de LDH
davam indícios de que o principal mecanismo de morte celular observado seria a
apoptose. Para confirmar essa hipótese, foram realizados testes de análises
morfológicas por microscopia de fluorescência, testes de citometria de fluxo para
conteúdo de DNA celular e eletroforeses do perfil de DNA das células após o
tratamento com as IQQ.
5.3.1. MICROSCOPIAS DE FLUORESCÊNCIA
Os testes de microscopia de fluorescência foram realizados com a célula
leucêmica U937. As células foram submetidas ao tratamento com as IQQ que
demonstraram seletividade em atuarem sobre as células tumorais. O tratamento
durou 48 horas, e nos tempos de 12, 24 e 48 horas as culturas foram analisadas e
as células contabilizadas e diferenciadas em normais, apoptose ou necrose, de
acordo com a morfologia e os padrões de fluorescência exibidos, conforme podem
ser observados na Figura 22, referente a micrografias de fluorescência das células
U937 submetidas ao tratamento com a caulibugulona A na concentração de
43
4,0µg/mL. As células normais emitiam fluorescência verde, com núcleo volumoso e
cromatina frouxa (Figura 22-A2) e citoplasma nítido e emitindo fluorescência verde,
com pequenas inclusões basófilas emitindo uma discreta fluorescência laranja
(Figura 22-A1). As micrografias de células em apoptose (Figura 22 – B, C e D)
foram obtidas do tratamento com a caulibugulona A na concentração de 4µg/mL,
onde foi possível avaliar toda a etapa de evolução no processo de apoptose. No
primeiro ponto de avaliação, com observação celular após 12 horas de tratamento,
puderam ser observadas as características morfológicas de apoptose, com o
aparecimento de núcleo picnótico e com cromatina condensada (Figura 22-B1),
sendo possível observar as etapas iniciais de fragmentação nuclear (Figura 22-B3)
e até mesmo, o aparecimento de pequenos fragmentos nucleares (Figura 22-B2),
sempre emitindo intensa fluorescência verde devido à condensação da cromatina.
Após 24 horas de tratamento, tornaram-se evidentes a fragmentação nuclear
(Figura 22-C1), com a presença de múltiplos fragmentos nucleares dentro das
células. No tempo final de observação, já com 48 horas de tratamento, as células
apresentavam sinais da perda da integridade da membrana plasmática, sendo
possível observar que a membrana celular já estava permeável ao fluorocromo
brometo de etídeo e os fragmentos nucleares mesclavam as fluorescências verde e
laranja (Figura 22-D1). Etapas de necrose secundárias ao processo de apoptose
também foram observadas, sendo visível a emissão de fluorescência laranja intensa
pelos fragmentos nucleares (Figura 22-D2). Em todos os tempos e concentrações
analisados, a necrose (Figura 22-E) era rara, e sua identificação era feita pela
identificação de núcleos túrgidos emitindo intensa fluorescência laranja (Figura 22E1) e a ausência de fluorescência citoplasmática
Nas tabelas a seguir podem ser visualizados os resultados das cinéticas do
tratamento das células U937 com as quatro IQQ seletivas em comparação com o
lapachol.
Na Tabela 2 estão os dados da cinética obtidos para o lapachol. Nessa
tabela, podemos observar que a necrose foi escassa. Assim como no controle, em
que as células foram cultivadas apenas em meio de cultura DMEM/F12 completo, as
células tratadas com as concentrações de 5µg/mL, 10µg/mL e 20µg/mL não
sofreram aumento na porcentagem de apoptose com o decorrer do tempo. Apenas
a concentração de 40µg/mL promoveu um aumento significativo nas porcentagens
de células em apoptose, já se observando 45% de apoptose nas primeiras 12 horas
44
e chegando a 100% de células em apoptose no tempo de 48 horas. Proporcional a
elevação das porcentagens de apoptose ocorria à redução das porcentagens de
células normais, já que as porcentagens de necrose foram insignificantes e não
contribuíram para a porcentagem de células mortas.
Tabela 2. Análises das microscopias de fluorescências das células U937 tratadas com o lapachol
% Normais
% Apoptose
% Necrose
Concentração
12 horas
24 horas
48 horas
12 horas
24 horas
48 horas
12 horas 24 horas 48 horas
Controle
96+/-0,06
97+/-0,12
96+/-0,13
4+/-0,00
2+/-0,24
2,8+/-0,71
0+/-0,24 1+/-0,48 1+/-0,48
5,0µg/mL
89+/-0,00
85+/-0,21
90+/-0,19
10+/-0,52
14+/-0,67
9,2+/-1,56
0+/-0,00 2+/-0,80 0+/-0,74
10,0µg/mL
88+/-0,00
89+/-0,13
92+/-0,00
12+/-1,87
11+/-0,04
8,0+/-2,08
0+/-0,00 0+/-0,50 0+/-0,00
20,0µg/mL
91+/-0,06
91+/-0,06
89+/-0,07
8+/-1,84
9+/-0,22
11,1+/-1,75
0+/-0,25 0+/-0,25 0+/-0,26
40,0µg/mL
53+/-0,08
40+/-0,01
0+/-0,00
45+/-1,77
59+/-0,92
100,0+/-0,00
2+/-0,30 1+/-0,03 0+/-0,00
Cinética do tratamento de células U937 com o lapachol. As porcentagens de células foram
obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração por
laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas aleatoriamente
300 células.
Na Tabela 3 estão apresentados os resultados das análises de microscopia
de fluorescência dos tratamentos com a caulibugulona A aplicados as células U937.
Nessa tabela, podemos observar que a apoptose começou a ser observada a partir
da concentração de 1,5µg/mL, atingindo 57% das células contabilizadas no tempo
de 48 horas. No entanto, na concentração de 2,0µg/mL, 66% das células já estavam
em apoptose nas 12 primeiras horas de tratamento, e todas as células analizadas já
estavam em apoptose com 24 horas, assim como na maior concentração testada,
em que 100% das células já estavam em apoptose nas primeiras 12 horas de
tratamento. A necrose foi insignificante.
Tabela 3.Análises das microscopias de fluorescências de células U937 tratadas com a caulibugulona A
% Normais
Concentração 12 horas
24 horas
% Apoptose
% Necrose
48 horas
12 horas
24 horas
48 horas
12 horas 24 horas 48 horas
Controle
97+/-0,00 97+/-0,06 95+/-0,11
3+/-0,25
2+/-1,47
4+/-0,48
0+/-0,00 0+/-0,23
1+/-0,44
0,25µg/mL
95+/-0,11 93+/-0,05 96+/-0,06
4+/-0,53
7+/-0,87
4+/-0,03
0+/-0,44 0+/-0,18
0+/-0,22
0,5µg/mL
96+/-0,06 94+/-0,11 92+/-0,06
4+/-1,98
6+/-0,78
8+/-0,55
0+/-0,22 0+/-0,42
0+/-0,22
1,0µg/mL
92+/-0,16 93+/-0,05 89+/-0,06
8+/-0,54
7+/-3,0
10+/-2,79
0+/-0,65 0+/-0,22
0+/-0,23
1,5µg/mL
72+/-0,07 69+/-0,00 43+/-0,00
28+/-1,43
31+/-0,00
57+/-7,5
0+/-0,28 0+/-0,00
0+/-0,00
2,0µg/mL
33+/-0,56
0+/-0,00
0+/-0,00
66+/-2,36
100+/-0,00
100+/-0,00
1+/-2,03 0+/-0,00
0+/-0,00
4,0µg/mL
0+/-0,00
0+/-0,00
0+/-0,00
100+/-0,00 100+/-0,00
100+/-0,00
0+/-0,00 0+/-0,00
0+/-0,00
Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona A. As porcentagens de células
foram obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração
por laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas
aleatoriamente 300 células.
45
Figura 22. Micrografias das microscopias de fluorescência de células U937 tratadas com a
caulibugulona A nos períodos de 12, 24 e 48 horas. As células foram coradas com laranja
de acridina e brometo de etídeo e observadas em microscópio de fluorescência. A- Células
controles (normais), com citoplasma emitindo fluorescência verde e com poucas inclusões
basófilas emitindo discreta fluorescência laranja (1) e núcleos volumosos, com cromatina
frouxa e com emissão intensa de fluorescência verde. B- Células após 12 horas de
tratamento, exibindo núcleo picnótico (1), com cromatina condensada na periferia (3) e
iniciando o processo de fragmentação nuclear (2). Nota-se também a intensa emissão de
fluorescência verde, devido a condensação da cromatina. C- Células após 24 horas de
tratamento, com núcleo intensamente fragmentado e emitindo fluorescência verde (1). DCélulas após 48 horas de tratamento, com permeabilização da membrana plasmática (1) em
estágios de necrose secundária, com fragmentos nucleares emitindo intensamente a
fluorescência laranja. E- Necrose, onde nota-se a ausência de fluorescência emitida pelo
citoplasma e núcleos túrgidos (1), emitindo fluorescência laranja.
46
A caulibugulona D não foi tão efetiva em induzir apoptose quanto a
caulibugulona A. Os resultados apresentados na Tabela 4 indicam que houve
considerável indução de apoptose apenas a partir da concentração de 3,0µg/mL,
onde alcançou 44% de apoptoses após 24 horas, e esse percentual se manteve
após 48 horas de tratamento. Na concentração de 4,0µg/mL já se encontravam em
apoptose 33% das células analisadas em 12 horas, e com 24 horas, 86% das
células estavam em apoptose. Este percentual se manteve também em 48 horas de
tratamento. A necrose observada foi escassa e na maioria das análises estavam
ausentes, não superando 2% do total de eventos considerados.
Tabela 4.Análises das microscopias de fluorescências de células U937 tratadas com a caulibugulona D
% Normais
Concentração
12 horas
24 horas
% Apoptose
48 horas
12 horas
% Necrose
24 horas
48 horas
12 horas 24 horas 48 horas
Controle
96+/-0,00
97+/-0,06
98+/-0,04
4+/-0,55
2+/-1,18
2+/-0,43
0+/-0,00
1+/-0,22 0+/-0,17
0,25µg/mL
95+/-0,00
96+/-0,01
97+/-0,00
5+/-0,22
4+/-0,55
3+/-1,11
0+/-0,00
1+/-0,02 0+/-0,00
0,5µg/mL
95+/-0,00
95+/-0,31
94+/-0,00
5+/-0,16
5+/-0,41
6+/-1,93
0+/-0,00
1+/-1,20 0+/-0,00
1,0µg/mL
96+/-0,00
92+/-0,06
96+/-0,00
4+/-0,15
7+/-0,42
4+/-2,31
0+/-0,00
0+/-0,23 0+/-0,00
2,0µg/mL
86+/-0,07
89+/-0,19
94+/-0,00
14+/-1,33
10+/-1,95
6+/-0,22
0+/-0,28
0+/-0,76 0+/-0,00
3,0µg/mL
77+/-0,15
54+/-0,67
56+/-0,20
23+/-0,43
44+/-2,19
44+/-1,86
0+/-0,60
2+/-2,46 0+/-0,76
4,0µg/mL
66+/-0,26
14+/-0,72
18+/-0,00
33+/-0,70
86+/-3,14
83+/-6,36
0+/-1,03
0+/-2,73 0+/-0,00
Cinética do tratamento de células U937 com a caulibugulona D. As porcentagens de células
foram obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração
por laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas
aleatoriamente 300 células.
Na Tabela 5 estão os resultados das análises dos tratamentos das células
U937 com a IQQ-24. Essa substância demonstrou uma capacidade de induzir
apoptose de forma tardia. Conforme pode ser observado na Tabela 5, nos tempos
iniciais do tratamento a porcentagem de células em apoptose não superava 21%,
inclusive na maior concentração testada. Por outro lado, a partir da concentração de
2,0µg/mL e no tempo de 48 horas foi possível identificar que 25% das células
estavam em apoptose, e alcançou a porcentagem de 94% com a concentração de
4,0µg/mL. Nas demais IQQ e com o lapachol, a necrose ou estava ausente ou não
superou 1% do total de células.
47
Tabela 5. Análises das microscopias de fluorescências das células U937 tratadas com a IQQ-24
% Normais
Concentração
12 horas
24 horas
% Apoptose
48 horas
12 horas
24 horas
% Necrose
48 horas
12 horas 24 horas 48 horas
Controle
97+/-0,11
98+/-0,06
98+/-0,00
2+/-1,09
2+/-1,39
2+/-0,19
0+/-0,45
0+/-0,23 0+/-0,00
0,25µg/mL
98+/-0,07
96+/-0,22
98+/-0,00
2+/-1,62
3+/-1,34
2+/-0,80
0+/-0,28
1+/-0,86 0+/-0,00
0,5µg/mL
98+/-0,00
98+/-0,11
97+/-0,00
2+/-0,12
2+/-0,00
3+/-0,60
1+/-0,00
0+/-0,45 0+/-0,00
1,0µg/mL
92+/-0,06
98+/-0,06
96+/-0,12
8+/-0,51
2+/-0,54
4+/-0,80
0+/-0,24
0+/-0,23 0+/-0,47
2,0µg/mL
94+/-0,00
96+/-0,00
75+/-0,06
6+/-0,17
4+/-0,15
25+/-2,57
0+/-0,
0+/-0,00 0+/-0,23
3,0µg/mL
96+/-0,06
95+/-0,00
61+/-0,00
4+/-0,02
5+/-0,39
39+/-7,83
0+/-0,25
0+/-0,00 0+/-0,00
4,0µg/mL
79+/-0,00
86+/-0,06
5+/-3,03
21+/-2,68
14+/-0,60
94+/-0,24
0+/-0,00
0+/-0,23 0+/-9,64
Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-24. As porcentagens de células foram
obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração por
laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas aleatoriamente
300 células.
Das IQQ testadas, a mais ativa e seletiva foi a IQQ-26. Nos testes para
verificação do tipo de morte celular induzidos, as análises de microscopia de
fluorescência (Tabela 6) revelaram que as concentrações inferiores a 0,75µg/mL
não foram capazes de induzir apoptose em quantidades expressivas, ou seja, não
ultrapassando 13% no tempo máximo dos experimentos. Por outro lado, no tempo
inicial de 12 horas a concentração de 0,75µg/mL foi suficiente para induzir apoptose
em 62% das células, com uma pequena queda e permanecendo com 50% após 48
horas de tratamento. Já nas concentrações iguais ou superiores a 1,0µg/mL, todas
as células entraram em apoptose com 24 horas de tratamento. As taxas de necrose
encontradas também não foram elevadas, sendo a máxima porcentagem obtida foi
3%.
Tabela 6. Análises das microscopias de fluorescências das células U937 tratadas com a IQQ-26
% Normais
Concentração
Controle
12 horas
24 horas
% Apoptose
% Necrose
48 horas
12 horas
24 horas
48 horas
12 horas
24 horas 48 horas
97+/-0,17 96+/-0,12 96+/-0,17
2+/-1,29
4+/-0,79
3+/-0,16
1+/-0,65
0+/-0,47 0+/-0,68
0,25µg/mL
89+/-0,26 91+/-0,05 95+/-0,00 10+/-3,88
8+/-0,26
4+/-2,07
1+/-1,01
1+/-0,19 1+/-0,01
0,5µg/mL
87+/-0,02 87+/-0,00 94+/-0,04 11+/-2,04
13+/-1,18
5+/-0,06
2+/-0,09
0+/-0,00 1+/-0,16
0,75µg/mL
38+/-0,17 40+/-0,35 49+/-0,90 62+/-1,91
59+/-1,71
50+/-4,36
1+/-0,64
1+/-1,29 1+/-3,28
1,0µg/mL
9+/-6,44
0+/-0,00
0+/-0,00
89+/-6,49
100+/-0,00
100+/-0,00
2+/-13,29 0+/-0,00 0+/-0,00
2,0µg/mL
6+/-7,83
0+/-0,00
0+/-0,00
91+/-0,39
100+/-0,00
100+/-0,00
4,0µg/mL
8+/-4,86
0+/-0,00
0+/-0,00
89+/-2,25
100+/-0,00
100+/-0,00
3+/-6,5
0+/-0,00 0+/-0,00
2+/-10,62 0+/-0,00 0+/-0,00
Cinética do tratamento de células U937 com a IQQ-26. As porcentagens de células foram
obtidas partindo-se da observação por microscopia de fluorescência, com coloração por
laranja de acridina e brometo de etídeo. De cada amostra foram contadas aleatoriamente
300 células.
48
5.3.2. CITOMETRIA DE FLUXO PARA ANÁLISE DE FRAGMENTAÇÃO E
LIBERAÇÃO DE DNA
As células U937, MOLT4 e COLO205 foram submetidas ao tratamento com
as IQQ e com o lapachol. O tempo escolhido foi de 48 horas e as concentrações
foram às máximas, visto que nessas condições os dados da microscopia de
fluorescência indicavam que a maioria das células U937 encontravam-se em
apoptose.
Durante a evolução do processo de apoptose, ocorre a ativação de
endonucleases, que clivam o DNA nuclear em fragmentos internucleossomais com
200pb ou múltiplos. Pela metodologia proposta por Gong (1994), esses fragmentos
podem ser facilmente extraídos dessas células, quando as mesmas são fixadas com
etanol 70% gelado e depois tratadas com tampão de extração de DNA de baixo
peso molecular (fosfato-citrato com concentração de 0,2M e pH=7,8). Na Figura 23
estão representados os histogramas de distribuição das células U937, conforme a
quantidade de DNA que permaneceu após o tratamento com etanol e com o tampão
de extração. Nessa figura, pode-se observar que as células que não foram
submetidas aos tratamentos, portanto, as células controle (Figura 23-A),
apresentam conteúdo de DNA compatíveis com um ciclo celular normal, ou seja,
células diplóides (2N) no estágio G1 da intérfase. À medida que as células entram
em fase de divisão, inicia-se a duplicação do material genético, sendo essa etapa
correspondente no histograma ao intervalo entre os dois picos de DNA, ou seja, a
fase S da intérfase. Quando o DNA já se encontra duplicado, as células encontramse na fase G2, e entra então no processo de mitose (G2/M). Quando uma célula está
em apoptose, ocorre a formação de fragmentos oligonucleossomais de DNA, que
são extraídos com o tratamento efetuado. Assim, na análise por citometria de fluxo
estas células se localizam na região denominada Sub-G1. Na Figura 23-A, observase que a maioria das células está em G1, e que 1,22% das células exibiram
conteúdo de DNA menor que G1, ou seja, estão em apoptose. Quando foram
analisados os resultados das células U937 tratadas com o lapachol (Figura 23-B),
70,45% das células encontravam-se na região Sub-G1 e, portanto, em apoptose.
Por essa metodologia foi possível confirmar que 78,25% das células U937 entraram
em apoptose quando tratadas com a caulibugulona A (Figura 23-C), e 51,15% com
a caulibugulona D (Figura 23-D), 75,81% com a IQQ-24 (Figura 23-E) e 63,18%
quando o tratamento aplicado foi com a IQQ-26 (Figura 23-F).
49
Utilizando-se da técnica de citometria de fluxo para quantificação do DNA
celular foi possível identificar que as células MOLT4 quando submetidas aos
tratamentos com as IQQ e o lapachol apresentaram deslocamento da população
celular em direção a região Sub-G1, o que confirma a capacidade de induzir
apoptose dessas substâncias. As células do controle (Figura 24-A) apresentavam
um discreto pico de células na região Sub-G1, equivalendo a 14,94%, enquanto que
o tratamento com lapachol (Figura 24-B) elevou essa quantidade para 39,18%, com
uma tendência para a formação de apenas uma população em Sub-G1.
Figura 23. Citometria de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular. Células U937
foram submetidas ao tratamento com as IQQ e o lapachol, pelo período de 48 horas e com
as concentrações de 4,0µg/mL para as IQQ e 40,0µg/mL para o lapachol. Como controle, as
células foram cultivadas em condições ideais, apenas com meio de cultura DMEM/F12
completo. As células foram analisadas em citômetro FACS Calibur, e os histogramas obtidos
pelo software WinMDI2.9. A-controle, B-lapachol, C-caulibugulona A, D-caulibugulona D, EIQQ-24 e F-IQQ-26.
O mesmo foi observado para o tratamento com a caulibugulona A, com forte
tendência para a formação de um único pico populacional em Sub-G1 (Figura 24-C).
O tratamento com a caulibugulona D foi o menos efetivo, mostrando apenas 21%
das células em Sub-G1. Os tratamentos com IQQ-24 e IQQ-26 foram os mais
efetivos. Quando tratadas com a IQQ-24 (Figura 24-E), mais de 64% das células
50
apresentavam baixas quantidades de DNA, e, portanto, foi possível confirmar que
mais de 64% das células estavam em apoptose. Os resultados mais expressivos
foram com a IQQ-26 (Figura 24-F), confirmando-se mais de 85% das células em
Sub-G1. Tendo em vista a grande amostragem dos experimentos, foi possível
confirmar que o tratamento com essas substâncias foram capazes de induzir morte
por apoptose nas células MOLT4.
Figura 24. Citometria de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular. Células
MOLT4 foram submetidas ao tratamento com as IQQ e o lapachol, pelo período de 48 horas
e com as concentrações de 4,0µg/mL para as IQQ e 40,0µg/mL para o lapachol. Como
controle, as células foram cultivadas em condições ideais, apenas com meio de cultura
DMEM/F12 completo. As células foram analisadas em citômetro FACS Calibur, e os
histogramas obtidos pelo software WinMDI2.9. A-controle, B-lapachol, C-caulibugulona A, Dcaulibugulona D, E-IQQ-24 e F-IQQ-26.
As análises por citometria de fluxo para as células COLO205 demonstraram o
aparecimento de células com baixo conteúdo de DNA, enquanto que as células
controles apresentavam apenas 4,3% na região de Sub-G1 (Figura 25-A). O
tratamento com lapachol deslocou uma boa parte das populações para Sub-G1
(Figura 25-B), atingindo a porcentagem de 30,02%. O tratamento com a
caulibugulona A elevou a quantidade de células para a região de Sub-G1,
alcançando a proporção de 24,55% (Figura 25-C), quando comparado com o grupo
51
controle. Da mesma forma foi possível confirmar apoptose em 16,25% das células
tratadas com a caulibugulona D (Figura 25-D). A substância mais ativa sobre as
células COLO205 foi a IQQ-26, e assim como nos experimentos de viabilidade, na
citometria de fluxo foram possíveis confirmar que 49,38% das células estavam em
apoptose, apresentando conteúdo de DNA Sub-G1 (Figura 25-E).
Figura 25. Citometria de fluxo para quantificação do conteúdo de DNA celular. Células
COLO205 foram submetidas ao tratamento com as IQQ e o lapachol, pelo período de 48
horas e com as concentrações de 4,0µg/mL para as IQQ e 40,0µg/mL para o lapachol .
Como controle, as células foram cultivadas em condições ideais, apenas com meio de
cultura RPMI completo. As células foram analisadas em citômetro FACS Calibur, e os
histogramas obtidos pelo software WinMDI2.9. A-controle, B-lapachol, C-caulibugulona A, Dcaulibugulona D, E-IQQ-26.
5.3.3. ELETROFORESE DO DNA CELULAR
Para analisar o perfil do DNA das células tratadas com as IQQ e o lapachol foi
realizada a eletroforese em gel de agarose, utilizando a metodologia de Gong (1994)
para a extração do DNA celular. As células U937, MOLT4 e COLO205 foram
tratadas nas mesmas condições utilizadas nos experimentos de citometria de fluxo.
Na Figura 26 pode ser visto o perfil do DNA extraído das células COLO205 (A),
U937 (B) e MOLT4 (C). Nota-se que os grupos controles, em que as células foram
cultivadas em condições ideais, uma pequena fração de DNA foi extraído, e mesmo
assim, o perfil não indicava o padrão em ladder (fragmentos oligonucleossomais)
típico de células em apoptose. As células COLO205 foram as que apresentaram
menor quantidade de DNA extraído, sendo possível verificar a presença de bandas
apenas nos tratamentos com a IQQ-26 (Figura 2-A/I26) e com a caulibugulona A
52
(Figura 26-A/CA). Os tratamentos com a caulibugulona D e com o lapachol não
produziram DNA de baixo peso molecular que pudesse formar bandas e ser
observado por essa metodologia. O perfil do DNA extraído das células U937 foi mais
intenso, onde pode ser notada a presença de bandas de DNA em todos os
tratamentos (Figura 26-B). Nas análises do perfil do DNA extraído das células
MOLT4 (Figura 26-C) pode ser observado após o tratamento com as IQQ-24 e 26
(Figura 26-C/I24 e I26) e com o lapachol (Figura 26-C/LAP) apresentava o perfil de
ladder.
Figura 26. Eletroforese em gel de agarose (1%) para perfil do DNA extraido das células
COLO205 (A), U937 (B) e MOLT4 (C) tratadas com IQQ e lapachol por 48 horas. Como
controle, as células foram cultivadas em meio de cultura DMEM/F12 (U937 e MOLT4) e
RPMI (COLO205) completos. O DNA celular foi extraído pela metodologia de Gong e
analidado por eletroforese em gel de agarose a 1%, com voltagem de 60V por 120 minutos.
CTL-controle, I26-IQQ-26, I24-IQQ-24, CA-caulibugulona A, CD-caulibugulona D e LAPlapachol.
53
6. DISCUSSÃO
Pelo método de LDH, as células que sofrem danos na membrana plasmática
liberam para o meio extracelular a enzima LDH, que reduz o NAD a NADH e esse
último converte um substrato colorimétrico que tem sua intensidade de cor
mensurada por espectrofotômetro (Racher et al., 1990).
O teste de metabolização do MTT avalia a viabilidade celular pela presença
de mitocôndrias viáveis, sendo essas últimas capazes de reduzir o MTT, um
metabólito solúvel de coloração amarelada, para cristais de coloração púrpura.
Esses cristais são solubilizados e quanto maior a coloração gerada, maior é a
quantidade de mitocôndrias viáveis e, portanto, maior a quantidade de células vivas
(Morgan, 1997).
Quando são confrontados os dados experimentais de liberação de LDH e de
metabolização do MTT, os achados indicam que se as células estiverem vivas as
taxas de metabolização de MTT serão altas e as taxas de liberação de LDH mínimas
ou ausentes. Por outro lado, quando as células estão mortas por necrose ocorre
uma ausência na redução de MTT e intensa liberação de LDH e, se as células
estiverem em apoptose, não se observa a redução de MTT e nem a liberação de
LDH, tendo em vista a manutenção da integridade da membrana plasmática. Porém,
se as células permanecem por um longo período de tempo em apoptose, esgotamse as reservas energéticas necessárias para manter o gradiente iônico entre os
folhetos interno e externo da membrana plasmática, o que leva as células a um
processo de necrose secundária ao processo de apoptose que ocorreu
anteriormente (Lobner, 2000).
Nesse trabalho, os experimentos de viabilidade por metabolização de MTT e
os testes de liberação de LDH com as células tumorais foram realizados
conjuntamente. Através do teste de viabilidade celular foi possível avaliar a
capacidade de indução de morte celular apresentado pelas caulibugulonas. Os
testes realizados por Milanowski et al., (2004), com as caulibugulonas extraídas
diretamente do Bryozoan marinho indicaram que essas moléculas foram capazes de
reduzir a viabilidade das culturas celulares de origens tumorais murinas IC2WT e com
IC50 variando entre 0,34µg/mL e 1,67µg/mL, enquanto que as sintéticas aqui
testadas obtiveram IC50 entre 0,3µg/mL (Figura 8-B e D) e 3,5µg/mL (Figura 10-A).
O lapachol foi empregado como droga controle, por se tratar de um medicamento de
54
uso aprovado pela ANVISA e que tem a estrutura molecular mais próxima das IQQ.
Assim como as IQQ, o lapachol também foi efetivo sobre as linhagens de células
tumorais U937, MOLT4 e COLO205, porém, não exibiu efeito redutor da taxa de
viabilidade celular sobre as células de linhagem pulmonar H460. As concentrações
necessárias para que as células tivessem sua viabilidade reduzida foi muito maior no
lapachol do que nas IQQ, chegando a ser 294 vezes maior (Figura 7-A) onde pode
ser observado IC50=29,4 e (Figura 11-A) onde o IC50=<0,25. Em outros testes
realizados com o lapachol também foi demonstrado que outras linhagens celulares
mostraram-se sensíveis a essa droga. Nos estudos de Rao et al., (1968), as células
de carcinossarcoma de Walker 256 e Linfosarcoma de Murphy Sturm foram
sensíveis ao lapachol, enquanto que para as neoplasias de ratos adenossarcoma
755, carcinoma pulmonar de Lewis, Leucemia Linfocítica P388 e leucemia L-1210
esta droga não teve atividade.
Dentre as IQQ, a mais efetiva foi a IQQ-26 (Figura 19), onde os IC50 dos
testes de viabilidade não excederam 0,5µg/mL, sendo a caulibugulona A mais
efetiva do que as demais caulibugulonas. Enquanto que as IQQ-19, IQQ-21 e IQQ25 não foram efetivas sobre as células testadas, sendo que IQQ-19 e IQQ-25 são
isômeros e mesmo a mudança na estrutura molecular não foi suficiente para tornar
as substâncias mais potentes. Contudo, algumas mudanças estruturais podem
acarretar efeitos farmacológicos diferentes, conforme foi observado nos ensaios de
viabilidade com as IQQ-23 e IQQ-24 que também são isômeros. A IQQ-23 foi ativa
apenas contra a linhagem MOLT4 e a IQQ-24 foi ativa também contra as linhagens
U937 e H460 (Figura 18). Efeitos semelhantes já foram relatados anteriormente na
literatura. Um exemplo é a observação de que o verapamil, que é empregado como
antagonista do Ca++ no tratamento da angina pectoris e em arritmias cardíacas, a
sua atividade é observada quando é comercializado na forma de mistura racêmica
de seus isômeros cis e trans, pois a atividade farmacológica do dexverapamil - cis é
diferente e mais tóxica que a de seu enantiômero – Trans (Surakitbanharn et al.,
1995).
Os resultados obtidos para os experimentos conjuntos de liberação de LDH e
de viabilidade celular pela metabolização do MTT foram sugestivos de morte celular
por apoptose. Em muitos dos experimentos pode ser observado que a taxa de
liberação de LDH não foi proporcional com a perda da viabilidade celular, como se
observa na Figura 19, indicando que a morte celular não promoveu ruptura da
55
membrana plasmática. Experimentos conjuntos com dados de LDH e MTT foram
realizados por Upadhyaya et al., (2007), que obteve dados semelhantes, com baixas
taxas de viabilidade e liberação de LDH quando trataram células U937 e HL-60 com
β-caroteno.
Os efeitos tóxicos das drogas antitumorais se devem a baixa seletividade, ou
seja, as drogas matam tanto as células cancerígenas quanto as células normais
humanas. Dessa forma, substâncias que possam atuar diretamente sobre as células
tumorais e poupar as células normais são um bom indicador para a continuidade dos
testes de avaliação do potencial antitumoral. Diante dos resultados com as linhagens
celulares cancerígenas foram realizados experimentos de viabilidade para investigar
se as IQQ atuavam promovendo a morte em células humanas normais. Em culturas
de PBMC estimuladas com SEB foi possível separar as IQQ em dois grupos. No
primeiro, quatro IQQ e o lapachol não foram capazes de reduzir a viabilidade das
culturas de PBMC nas concentrações testadas, demonstrando certa seletividade
sobre as células tumorais, enquanto que outras cinco IQQ foram ativas em reduzir
tanto a viabilidade de células tumorais quanto de células PBMC. Esses dados foram
importantes, pois se busca drogas que tenham como alvo terapêutico apenas as
células tumorais, e assim, conferindo menos efeitos tóxicos durante o tratamento.
Upadhyaya et al., (2007) em seus testes identificou que os β-carotenos atuavam
seletivamente sobre as linhagens U937 e HL-60, poupando as células PBMC.
Além de serem seletivas atuando sobre as células tumorais, é necessário que
as drogas antineoplásicas promovam morte celular por apoptose. Dados de
patologia indicam que um processo de necrose superior a 5% das células totais de
um organismo geram reações inflamatórias incompatíveis com a vida (Kumar et al.,
2005). Assim, promover apoptose sem liberar mediadores pró-inflamatórios é um
fator importante na identificação de uma droga antineoplásica. Para confirmar os
achados dos experimentos de LDH e viabilidade, foram feitos testes com
microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e eletroforese de DNA em gel de
agarose buscando a confirmação da capacidade de induzir morte celular por
apoptose das IQQ que demonstraram ser seletivas.
As cinéticas de morte celular realizadas por microscopia de fluorescência com
as células U937 confirmaram a morte celular por apoptose induzida pelos compostos
testados. A necrose foi rara e a partir de 12 horas já foi possível identificar que todas
as células tratadas com a caulibugulona A estavam em etapa inicial de apoptose
56
(Tabela 3) e, portanto, esse foi o processo majoritário de morte induzido pelas IQQ.
De acordo com as morfologias observadas na microscopia de fluorescência (Figura
22), é possível verificar que células que em 12 horas já se encontravam em
apoptose inicial, com 48 horas não conseguiam manter o gradiente iônico entre os
folhetos da membrana plasmática e entravam em necrose secundária (Figura 22 –
D). Esses dados são compatíveis com os encontrados nos experimentos de
liberação de LDH. Os tratamentos com a caulibugulona A na concentração de
4µg/mL levaram 100% das células a apoptose com 12 horas, e como esperado, em
48 horas todas já estavam em necrose secundária e liberando LDH (Figura 8). De
semelhante resultado, as células U937 tratadas com a caulibugulona D
apresentavam-se 33% em apoptose com 12 horas (Tabela 4) e com 48 horas a taxa
de liberação de LDH obtida indicava que 25% das células haviam perdido a
integridade da membrana (Figura 10), assegurando, portanto, que os dados de
liberação de LDH foram compatíveis com os dados de microscopia de fluorescência
no tempo de 12 horas.
A condensação de cromatina, acompanhada de fragmentação nuclear e por
fim, o aparecimento de corpos apoptóticos está entre as características morfológicas
mais marcantes do processo de morte por apoptose e que podem ser facilmente
observados nas células em apoptose por testes de microscopia de fluorescência.
Por isso, esses testes geralmente são os primeiros a serem realizados para
investigar o tipo de morte celular. Alguns autores, no entanto, consideram essa
metodologia muito subjetiva, pois para ser executada de maneira correta, o avaliador
deve ser imparcial e possuir um conhecimento suficiente para diferenciar as
morfologias celulares (Leite et al., 1999). Apesar dos valores da cinética de
microscopia de fluorescência serem compatíveis com os dados encontrados para a
viabilidade celular e as taxas de liberação de LDH, processou-se também outras
duas metodologias de análises de apoptose.
Por citometria de fluxo para marcação do ciclo celular, a utilização do tampão
de fosfato-citrato remove os fragmentos de DNA de baixo peso molecular gerados
durante o processo de apoptose. A geração desses fragmentos depende da ativação
de endonucleases, que clivam o DNA em fragmentos de 200pb. As células em
apoptose, quando tratadas com o tampão de fosfato-citrato, têm esses fragmentos
de DNA removidos e passam a emitir menos fluorescência quando tratadas com o
57
fluorocromo iodeto de propídeo, passando a ocupar a região de Sub-G1 no
histograma populacional (Gong et al., 1994).
Quando o DNA das células em apoptose é observado por eletroforese, notase o padrão de bandas em ladder. Os dados obtidos da citometria de fluxo foram
compatíveis com as observações do perfil do DNA extraído das células após os
estímulos. Por citometria de fluxo, as células U937 exibiram deslocamento da
população em direção a região Sub-G1 quando tratadas com todas as quatro IQQ
seletivas e com o lapachol e o perfil do DNA analisado por eletroforese indicou a
formação de bandas em ladder. Por citometria de fluxo, 78,29% das células tratadas
estavam com pouco conteúdo de DNA e, portanto, morreram por apoptose. O perfil
do DNA celular extraído confirmou sua fragmentação, uma vez que nos grupos
controles em que as células apresentavam DNA integro, não foram visualizados
fragmentos de DNA (Figura 26:CTL - A, B e C). As células MOLT4 também
apresentaram formação de população Sub-G1 após o tratamento com as IQQ e com
o lapachol, confirmando a presença de apoptose, principalmente no tratamento com
a IQQ-26, em que foram confirmadas mais de 85% das células em apoptose e com
perfil de DNA fragmentado. As células COLO205 apresentaram perfil de DNA com
pouca fragmentação o que refletiu na baixa confirmação de células em apoptose
pela metodologia de Sub-G1, pois o DNA pouco fragmentado não pôde ser extraído
das células.
Como não foram realizados experimentos de cinética de viabilidade, liberação
de LDH e nem de microscopia de fluorescência com as linhagens celulares MOLT4 e
COLO205, não foi possível confrontar os dados obtidos nos testes de viabilidade e
de liberação de LDH com as citometrias de fluxo e as eletroforeses do DNA. Dados
semelhantes foram obtidos por Vashishtha et al., (1998), quando comparou dados
de viabilidade celular com fragmentação de DNA nuclear, concluindo-se que no
momento em que foi realizada a extração do DNA ainda não havia ocorrido a
ativação das endonucleases. Tal feito ocorre nas diversas linhagens celulares
apresentam perfis diferenciados de ativação de endonucleases, e com isso, a
formação de fragmentos de DNA não segue o mesmo tempo para todas as células
submetidas aos estímulos de indução de apoptose.
A linhagem celular COLO205 é conhecida pela multi-resistência a diversas
drogas antitumorais (Medina et al., 1998). Nos testes realizados nesse trabalho, as
células COLO205 demonstraram serem sensíveis aos tratamentos com as IQQ e
58
com o lapachol, inclusive, com resultados sugestivos de indução de morte celular por
apoptose quando são confrontados os dados dos experimentos de viabilidade e de
liberação de LDH. Os resultados das citometrias de fluxo e de eletroforese do DNA
celular, ambos realizados com 48 horas, evidenciaram pequenos picos de células
em Sub-G1 com discreta ou ausente fragmentação do DNA nuclear, sugerindo que
os eventos de apoptose são tardios e no tempo de 48 horas a ativação de
endonucleases não foi suficiente para a clivagem do DNA de modo a ser observado
por essas metodologias.
59
7.
CONCLUSÃO
•
As caulibugulonas sintéticas mantiveram a capacidade de induzir morte
celular por apoptose.
•
Quatro IQQ demonstraram seletividade em induzir morte celular nas
células cancerígenas, sendo que IQQ-24, caulibugulona A e caulibugulona D não
foram capazes de induzir morte nas células PBMC.
•
A IQQ-26 foi à substância mais promissora levando em consideração
atividade e seletividade.
•
O processo de morte celular por apoptose foi identificado através de
microscopia de fluorescência e confirmado por citometria de fluxo para população
Sub-G1 e por eletroforese do DNA celular.
•
Os resultados apontam as IQQ como indutoras de apoptose em células
tumorais humanas e abre perspectivas para a continuidade da investigação dos
efeitos antineoplásicos dessas substâncias.
60
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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