triagem de bactérias extremófilas produtoras de

TRIAGEM DE BACTÉRIAS EXTREMÓFILAS PRODUTORAS DE
EXOPOLISSACARÍDEOS PROVENIENTES DA ESTÂNCIA HIDROTERMAL DE
CALDAS DO JORRO/BA, E DAS MARGENS DO RIO SUBAÉ, SANTO AMARO/BA
Kayque Frota Sampaio1; Elinalva Maciel Paulo2; Leila Thaise Santana Oliveira Santos3;
Elisa Esposito4; Fabricia Santiago Carneiro5.
1.
Bolsista PIBIC/FAPESB, Graduando em Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Feira de Santana
e-mail: [email protected]
2. Orientadora, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, e-mail:
[email protected]
3. Doutoranda em Biotecnologia, Universidade Estadual de Feira de Santana, e-mail: [email protected]
4. Docente programa de pós graduação PPPG, Universidade Estadual de Feira de Santana, e-mail:
[email protected]
5. Graduanda em Ciências Farmaceuticas, Universidade Estadual de Feira de Santana, e-mail
[email protected]
PALAVRAS CHAVE: Fontes termais, bactérias extremófilas, exopolissacarídeos
INTRODUÇÃO
Bactérias extremófilas são aquelas que vivem em ambientes cujas características naturais dos
mesmos são extremas ou mesmo inóspitas à sobrevivência da grande maioria dos seres vivos
do planeta Terra (PORTAL LABSISMI, 2011). Essas bactérias mencionadas possuem
grandes adaptações evolutivas que permitem às mesmas realizar suas funções bioquímicas
vitais em condições ambientais extremas (GOMES et al., 2007). Uma dessas adaptações
evolutivas é a produção de exopolissacarídeos.
Os exopolissacarídeos (EPS) são definidos como polissacarídeos extracelulares, produzidos
por alguns fungos e bactérias, os quais são encontrados ligados à superfície das células ou são
excretados para o meio extracelular, na forma de uma substância mucilaginosa
(SUTHERLAND, 1998). Os EPS possuem a função de proteger a célula bacteriana contra
fatores que podem afetar a sua sobrevivência como a dessecação, altas temperaturas, escassez
de nutrientes, compostos tóxicos, ataque de fagos e de protozoários. Outra possível função
dosEPS inclui sequestrar cátions essenciais e envolvimento na aderência em superfícies
sólidas e formação de biofilmes (DE VUYST; DEGEEST, 1999). Em relação às bactérias
extremófilas a produção de EPS constitui um mecanismo de defesa para que estes microorganismos sobrevivam, e até mesmo se tornem metabolicamente ativos no ambiente inóspito
em que vivem.
Os principais representantes de micro-organismos de perfil extremofílico pertencem ao
domínio Archaea, que são normalmente encontrados em fontes termais, águas extremamente
salgadas, temperaturas baixas, regiões impactadas por dejetos industriais e condições
extremas de pH (CARDOSO et al., 2003).Determinadas espécies de arqueas apresentam clara
definição dos limites de tolerância biológica nos extremos físicos e químicos (WOESE,1998).
Muitos destes organismos possuem um metabolismo diferencial, produzindo substâncias
metabólicas de grande prospecção, caracterizando-os como organismos de grande potencial
biotecnológico, o que vem merecendo uma atenção cada vez maior da comunidade científica
internacional. A exemplo disso são citados os biopolímeros que são polímeros (EPS)
sintetizados por muitos destes micro-organismos extremófilos, sob as mais diversas
condições ambientais, com diferentes composições e propriedades físicas (BASTOS, 2007).
Assim, o isolamento e preservação desses micro-organismos produtores de exopolissacarídeos
de fontes termais e regiões impactadas justifica-se pela grande importância da produção de
produtos biotecnológicos oriundos deste biopolímero, e também para incrementar pesquisas
acadêmicas na área de bactérias extremófilas e/ou exopolissacarídeos.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foi realizado coleta de amostra de água proveniente da Estância Hidrotermal de Caldas do
Jorro, Tucano/BA, sendo estas coletadas em tubos de ensaio contendo meio de transporte
(NaCl, 4,2g; fosfato dipotássico anidro, 0,31g glicerina 300 mL, água destilada 700mL). Os
tubos com as amostras foram congelados -20º C para posteriormente prosseguir com as
análises.
As bactérias oriundas das margens do Rio Subaé , Santo Amaro/BA, foi fornecida para este
experimento, já previamente isoladas.
Para o isolamento das bactérias extremófilas provenientes de fontes termais, foram utilizadas
amostras direta e diluídas (10-1, 10-2 e 10-3) em solução salina de NaCl (0,85%), sendo estas,
inoculadasno caldo BHI (ACUMEDIA®). A incubação foi realizada em estufas a 35°C / 72
horas e a 55°C/48 horas. Após o período de incubação, as culturas desenvolvidas foram
semeadas em agar BHI e incubadas nas suas temperaturas de crescimento. Em seguida foram
selecionadas 30 colônias e purificadas pelo método da semeadura composta por esgotamento
de inóculo. Após o processo de purificação realizou-se os testes de coloração de Gram e de
catalase e imediatamente preservaram-se estas colônias a -80º C em leite desnatado
reconstituído (LDR) a 20%para posteriormente seguir com o processo de triagem de produção
de EPS.
A triagem dos isolados bacterianos produtores de biopolímeros extracelulares foi realizada no
meio base otimizado por GUIMARÃES (1999), com algumas modificações e adaptações,
variando os açúcares na concentração de 10% (sacarose, glicose e manitol), o pH (5,5, 6,5 e
7,5) e a temperatura de incubação (entre 28°C e 30°C). As leituras foram realizadas em 48
horas de incubação.O método utilizado foi o desenvolvido por PAULO (2010). Esta técnica
consiste em inocular 5uL da cultura ativa de cada isolado em discos de papel de filtro (5mm
Ø) esterilizados, depositados sobre o meio de cultura sólido. Após o período de incubação
determinado para cada temperatura, foirealizado a leitura, baseada na formação de colônias
densas sobre os discos. O nível de produção de biopolímero foi avaliado de acordo com o
diâmetro da colônia: como (0 mm) sem produção de biopolímero; (7 mm) pouca produção;
(15 mm) grande produção. Foi realizado um teste rápido quanto à produção de biopolímero,
misturando uma alçada da colônia potencialmente produtora de biopolímero em 2 mL de
etanol absoluto. A formação de um precipitado no meio era o indicativo da produção de
biopolímeros do tipo polissacarídeos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não houve evidência de crescimento bacteriano nos meios incubados a 55° C. Na temperatura
de 35 °C houve crescimento bacteriano tanto na amostra direta (Tabela 1).
Com o intuito de adaptar as possíveis bactérias termofílicas, e tornarem-se ativas, incubou-sea amostra de água coletada na fonte termal, que estava congeladas a -20° C no banho-maria
(65°C). No entanto, mesmo com este procedimento não houve evidência de crescimento
bacteriano, após a amostra ter sido semeada no caldo e agar BHI e incubadas a 55° C, mas
houve crescimento bacteriano quando incubadas a 35° C. Diante deste resultado presume-se
que o fato de ter congelado as amostra antes de ter realizado a semeadura no meio e incubado
a 55 ° C, ocasionou “traumas” nas células termofílicas, impossibilitamdo depois a sua
ativação. Já nas culturas que se desenvolveram a 35°C, isto não aconteceu devido estas
bactérias apresentarem características mesofílicas e terem a capacidade de esporular
(confirmado pela coloração de esporo utilizando a técnica de WirtzConklin).
Tabela 1. Aspectos do crescimento bacterianono caldo BHI da amostra de água proveniente
da Estância Hidrotermal de Caldas do Jorro – Tucano/BA
AMOSTRA
Amostra direta
Amostra diluída
( 10-1, 10-2, 10-3 )
ASPECTO DO CRESCIMENTO
Turvação do meio
Sem crescimento bacteriano
Os resultados apresentados na Tabela 1 indicam que a concentração bacteriana nas águas
termais do Jorro é baixa, visto que as diluições feitas da inoculação das alíquotas puras não
apresentaram evidências de crescimento bacteriano. E, provavelmente a concentração de
bactérias termofílicas na água coletada é muito baixa, prevalecendo às bactérias termodúricas
esporuladas do gênero Bacillus (o que pode ser observado através das Tabelas 2 e 3).
Tabela 2. Aspectos do crescimento bacteriano no ágar BHI, incubadas a 35°C e 55°C, da
amostra de água proveniente da Estância Hidrotermal de Caldas do Jorro – Tucano/BA
AMOSTRA
35°C / 72 horas
55°C / 48 horas
ASPECTO DO CRESCIMENTO
Colônias bacterianas com aspecto
semelhante às de bactérias esporuladas
(espalhadas e foscas)
Sem crescimento bacteriano.
Tabela 3. Resultados dos testes morfotintoriais e da produção da catalase das colônias
bacterianas proliferadas no ágar BHI.
TESTES
Produção da catalase
Coloração de Gram
Coloração de endósporo
RESULTADOS
Positivo
Bacilos curtos Gram positivos.
Presença de endósporo e esporos liberados.
Devido ao fato de não ter obtido isolados termofílicos na amostra da Estância Hidrotermal de
Caldas do Jorro, procedeu-se a triagem de produção de EPS somente com as bactérias
previamente isoladas, provenientes das margens do Rio Subaé (Tabela 4).
Tabela 4. Reaçoes morfotintoriais dos isolados bacterianos de amostras coletadas das margens
do Rio Subaé no município de Santo Amaro/BA.
Isolados
Morfologia
Coloração de Gram
1
cocobacilo
-
2
cocobacilo
-
3
bacilos
-
4
bacilos
-
5
bacilos
-
6
bacilo
-
7
cocos
+
8
cocos
-
Tabela 5. Produção de EPS em diferentes carboidratos e pH dos isolados bacterianos de
amostras coletadas das margens do Rio Subaé no município de Santo Amaro/BA.
Carboidratos
pH
Isolados produtores de
EPS/Ø
glicose
5,5
todos (acima de 15mm)
6,5
todos (acima de 15mm)
7,5
Nenhuma produziu
5,5
todos (acima de 15mm)
6,5
todos (acima de 15mm)
7,5
todos (acima de 15mm)
5,5
todos (acima de 15mm)
6,5
todos (acima de 15mm)
7,5
todos (acima de 15mm)
sacarose
manitol
Pelo que se observa na Tabela 5, houve a produção de exopolissacarídeos nos 8 isolados nos
carboidratos glicose (exceto no pH 7,5), sacarose e manitol. Com relação ao nível de
produção de EPS, pode-se considerar que houve grande produção em todos eles, visto que os
diâmetros de EPS formados ao redor dos discos foram superiores a 15 mm (ver figura 1).
Figura 1: EPS produzidos pelas colônias bacterianas inoculadas em discos de papel filtro dispostos em meio Ágar EPS
Sacarose, pH 7,5.
CONCLUSÃO
Diante dos resultados encontrados nos procedimentos de inoculação, isolamento/purificação e
identificação preliminar das colônias bacterianas presentes nas amostras de água coletadas no
Jorro, pode-se inferir que:

A concentração bacteriana nas águas analisadas é pequena;

Não foram encontradas bactérias termofílicas (ou se as mesmas estiverem presentes
na água, estão em número muito pequeno);

Dentre as bactérias presentes, predominam termodúricos, com características de
esporulados.
Com relação aos isolados provenientes das amostras do rio Subaé, percebe-se que as mesmas
possuem um grande potencial de fornecer exopolissacarídeos, polímeros estes, de grande
interesse industrial.
REFERÊNCIAS
BASTOS, V. D. Biopolímeros e polímeros de matérias-primas renováveis. Revista do Bndes,
Rio de Janeiro,14:28, 201-234, 2007.
CARDOSO, A. M. et al. Archaea: Potencial biotecnológico. Revista Biotecnologia Ciência e
Desenvolvimento. Ed.30, janeiro/junho 2003.
DE VUYST, L.; DEGEEST, B. Heteropolysaccharidesfromlacticacidbacteria. FEMS
Microbiology, Amsterdam, v.23, n.2, p.153-177, 1999.
GOMES, A. et al. Enzimas termoestáveis: fontes, produção e aplicação industrial. Química
Nova, vol. 30, ed. 1, jan/fev 2007.
GUIMARÃES, D. P.; COSTA, F. ; RODRIGUES, M. I.; MAUGERI, F. Optimization of
dextran synthesis and acid hydrolisis by susface response analysis.Brazilian Journal of
Chemical Engineering, 16:2, 129-139, 1999.
PAULO, E. M.Produção de exopolissacarídeos (EPS) por bactérias láticas visando
microencapsulação de Lactobacillusacidophilus La-5 pelo processo de Spray drying. 2010.
Tese 212f. (Doutorado em Biotecnologia), Departamento de Ciências Biotecnológicas,
Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana, 2010.
PORTAL LABISISMI. Extremófilos. Disponível em:http://labisismi.fmrp.usp.br/index.
php/br/extremofilos . Acesso em 20. ago. 2012, 12:27.
SUTHERLAND, I. W. Novel and established applications of microbial polysaccharides.
Trends in Biotechnology, Limerick, v.16, p.41-46, 1998.
WOESE, C. R. The universal ancestror. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. Ed. 95, p. 6854–
6859.