Genotipagem de HCV (vírus da hepatite C) em
Propaganda
Genotipagem de HCV (vírus da hepatite C) em portadores do anticorpo anti-HCV, através de RT-PCRlRFLPs Rosa Maria Silva Gonzaga Rosa Maria Silva Gonzaga Genotipa~emde HC\l(vírus da hepatite C) em portadores do anticorpo anti-HCV, através deRT -PCRlRF-LPs DissertaçãO de Mestrado apresentada à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Química e Bíotecnologia do Departamento de Químíca do Centro de Ciências Exatas e Naturais da Universidade Federal de Alagoas, como requisíto para obtenção do grau de Mestre em Química e Bíotecnología, Orientadora: Profa. Ora. Denise Maria Wanderle~Silva Maceió - Alagoas - Brasil Setembro de 2004 1/.: :JoO!. O"! O..?s ~9:J FAP Recebido em' L I~~ Agradecimentos A Deus por mais uma oportunidade ser feito. A Professora ensinamentos, realização Ora. pelo Denise apoio, pelo para fazer o que tem que Maria Wanderlei-Silva, incentivo, por pelos acreditar deste trabalho e pelo exemplo de incansável na busca por conhecimentos. Ao incentivo, Professor Or. pela experiência Clcero Eduardo Ramalho-Neto e pelos ensinamentos durante pelo minha formação acadêmica. Ao Or. Arthur Paiva e ao Or. Renée Oliveira pelo apoio técnico. A Ora. Eliana Santa Rita e a todos que trabalham Universitário Or. Alberto Antunes por terem tornado no Hospital possivel a realização deste trabalho através do envio de material biológico. A Professora Ora. Ana Maria Queijeiro López pelo incentivo e pela força durante o meu curso. A Professora Ora. Ana Cristina Brito pela atenção e força. Aos meus pais Luiz (in memorian) irmãs, por compreenderem sentem por mim. e Maria, minha ausência e às minhas e pelo orgulho que Aos colegas do GEMPRO, Janice, André, Daniela, Edvânia, Jessé, Melka, Velber, Marília, Juliana, Celso e Genovês pela ótima convivência. A todos que de alguma forma contribuíram para a realizaçâo deste trabalho. À Fundação (FAPEAL) trabalho. de Amparo à Pesquisa e o CNPq pelo apoio financeiro do Estado de Alagoas para realização deste Aos meus pais Luiz Maria. Às minhas memoriam), Rosa apoiarem e memoriam) e irmãs Maria do Ó (in Aparecida, por decisões (in Fátima todas e as compreenderem Ana minhas a minha ausência. "Quem Pois rouba meus meus bens pertences ... materiais ... suor não são tão valiosos, a outros ... Mas aquele enriquece e Ganhos rouba ... com meu mas agora escravizam que nome, um bem tão precioso, lhe Nada rouba o meu bom rouba aquilo que não verdadeiramente me empobrece ... " w. Aos meus Jarbas Shakerspeare verdadeiros Carvalho amigos e Marília Góis pela compreensão ... por saberem distingüir o que verdadeiramente importa nesta vida ... A eles todo o meu respeito e afeição ... Dedico. ., . Mensagem! Tempo de provação ... horas de resistência. Terás tido lutas ou estarás dentro delas, qual ocorre a tantos outros companheiros. Observas problemas em muitos lares, acidentes amargos, moléstias desajustes psicológicos. obscuras, experiências de efeitos estranhas e a desfibrar-te a de e Não te deixes abater e caminha para diante. Resiste aos movimentos que tendam coragem e mantém-te em tua tarefa. Recorda que tudo se altera para o bem. Obstáculos são, por si, movimentos renovação progresso. O que possa parecer fracasso ou desencanto é preparação de um mundo novo. Não se retrocede. Sem problemas, não há lições e, sem lições, a evolução não sairia da estaca zero. Não há corações transviados e sim companheiros em transformação. Hoje será sempre o dia de se realizar o melhor. Ninguém nasceu para a tristeza ou desanimo. Não conseguimos sempre possivel modificar os outros, mas ser-nos-á renovar-nos. Nunca é tarde para que alguém seja feliz. EmmanueJ Sumário Lista de Figuras ix Lista de Tabelas xi Lista de Abreviaturas xii Lista de Apêndices xiv Resumo xv Abstract xvi 1. Introdução 01 2. Revisão da Literatura 03 2.1 Hepatite C 03 2.2 Biologia do Vírus da Hepatite C 04 2.3 Epidemiologia 07 2.4 Aspectos Biológicos e Clínicos-epidemiológicos do HCV 10 2.5 Patogênese 11 2.6 Diagnóstico 12 2.6.1 Diagnóstico Sorológico 13 2.6.2 Diagnóstico Molecular 14 2.7 RT -PCR e RFLPs Aplicados ao Diagnóstico Viral 14 2.7.1 RT-PCR 15 2.7.2 PCR aninhada 16 2.7.3 Genotipagem por RFLPs 2.8 Tratamento 3. Objetivos 16 17 20 3.1 Objetivo Geral 20 3.2 Objetivos 20 4. Casuística Específicos e Métodos 4.1 Aspectos Éticos 21 21 4.2 População em Estudo 21 4.3 Participantes 21 4. 3.1 Critérios de Inclusão 22 4.3.2 Critérios de Exclusão 22 4.4 Obtenção das Amostras Clínicas 22 4.5 Isolamento de RNA Total 22 4.6 Transcrição 23 Reversa 4.7 Visualização e Fotodocumentação em Eletroforese em 24 Gel de Agarose do cDNA Amplificado 4.8 PCR Aninhada 25 4.9 RFLP/PCR da 5'NCR 25 4.9.1 Genotipagem 25 4.9.2 Subtipagem 26 4.10 Eletroforese dos produtos de digestão enzimática 28 4.11 Coloração por Nitrato de prata 4.12 Preservação dos géis e registro fotográfico 27 digital 28 30 5. Resultados e Discussão 5.1 Casuísta 32 5.2 Isolamento de RNA viral 34 5.3 RT-PCR 36 5.4 PCR Aninhada 37 5.5 Genotipagem do HCV 38 5.6 Subtipagem do HCV 41 6. Conclusões 49 7. Perspectivas 50 7.1 Sequenciamento Automático de HCV 50 7.2 Diagnóstico Eletrônico das Seqüências de HCV 7.3 Análise filogenética 8. Referências 9. Apêndices dos genótipos de HCV Bibliográficas 50 50 52 64 ix Lista de Figuras Figura 1. HCV mostrando proteínas do envelope, do capsídeo e 04 genômica do HCV mostrando as 05 o RNA vira!. Figura 2. Esquema da estrutura proteínas estruturais Figura 3. e não estruturais. Distribuição de genótipos de HCV em diferentes 08 regiões do Brasil de acordo com Busek & Oliveira (2003). Figura 4. Distribuição sangüineo das amostras processadas neste estudo, negativas; dos resultados considerando-se: das 104 amostras verificadas número de amostras de distribuição 7. Perfil eletroforético em gel de agarose produtos M=marcador da PCR 100pb; aproximadamente de 32 HCV-RNA 38 (n = 76). três amostras 2% corado com brometo de etfdio aninhada 1 anti- a do 3=HCV virus da positivo hepatite C. (banda de 260pb). Figura 8. Distribuição da freqüência digestão dupla com as endonucleases Hinfl-BstOI HCV-RNA por sexo de pacientes HCV positivos com HCV-RNA detectável dos 31 e número de amostras HCV-RNA positivas. Figura 6. Percentual positivas 30 de 104 pacientes anti-HCV (n=1 04). Figura 5. Algoritmo Figura de plasma de genótipos de restrição entre os casos HCV-RNA positivos do HCV após Haelll-Rsal (n=76). e 39 x Figura 9. Padrões de restrição dos produtos da amplificação RT- 40 PCR da região 5"UTR do HCV obtidos após digestão dupla com endonucleases MetaPhor de restrição 4% com tampão 100pb; 1 e 2=genótipo BstllHinfl. de corrida 1( bandas de 53 e 41 pb); e 3 a 8=genótipo 140,573 53pb); 9=controle Figura 10. Distribuição em amostras da freqüência da freqüência obtidos ScrFI aproximadamente 94, 63, de subtipos do genótipo após digestão 1 41 simples com região 5"NCR após digestão de subtipos do genótipo 3 após digestão 42 simples com ScrFI (n=13). Figura 12. Padrões de restrição da 1X. M=marcador negativo. de HCV-RNA positivas a enzimas de restrição RT-PCR gel de restrição BstUI (n=62). Figura 11. Distribuição em amostras TAE em 3 (bandas de aproximadamente de HCV-RNA positivos a endonuclease Eletroforese dos produtos da amplificação do HCV de diferentes simples com endonucleases (1-6) e Bstl (7-10) . Eletroforese indivíduos de restrição em gel MetaPhor 4% com tampão de corrida TAE 1X. M=Marcador de 100pb. 43 xi Lista de Tabelas Tabela 1. Distribuição de pacientes anti-HCV faixa etária (n = 76). do número, percentual por faixas e média com HCV-RNA detectáveis segundo a 33 xii Lista de Abreviaturas AIDS Sindrome de Imunodeficiência ALTs Alanina ANVISA Agência Anti-HCV Anticorpo APS Perssulfato cO NA DNA complementar 5'NCR 5' região não-codificadora DNA Ácido dexoribonucléico DEPC Dietil pirocarbonato dNTP Desoxinucleotideos DTT Ditiotreitol EDTA Ácido etilenediamínotetracético ELISA Ensaio imunoenzimático HCC Carcinoma HCV Vírus da Hepatite HCV-RNA Ácido ribonucléico HU Hospital IFN Interferon ISDR Região determinante IRES Sítio de entrada LiPA. Ensaio em sonda MLV-RT Transcriptase Adquirida amino transferases Nacional de Vigilância Sanitária contra o vírus da hepatite C de amônio hepatocelular C do vírus da hepatíte C Universitário da sensibilidade ribossomal reversa ao Interferon interno do vírus da leucemia moloney murine NAT Teste de ácidos nucleicos ORF Região aberta de leitura pb Pares de bases PCR Reação em Cadeia da Polimerase RFLP Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de xiii Restrição RIBA Ensaio Imunoblote Recombinante RNA Acido ribonucléico RT Transcrição SDS Dodecil sulfato de sódio SUS Serviço Único de Saúde Taq DNA DNA polimerase TBE EDTA tamponado em Tris-borato TEMED N, N, N', N'- tetrametiletilenediamina UFAL Universidade UV Luz ultravioleta GEMPRO Laboratório reversa da bactéria Federal de Alagoas de Genética Proteômica KCI Thermus aquaticus Cloreto de potássio Molecular, Genômica e xiv Lista de Apêndice Apêndice 01. Parecer da Comissiío de Ética em Pesquisa da 64 UFAL. Apêndice 02. Termo de Consentimento Apêndice 03. Questionário Livre e Esclarecido. aplicado os pacientes estudados. 65 66 Resumo A prevalência dos genótipos determinada em principalmente sobre do virus da hepatite C (HCV) tem sido diversas nas regiões os genótipos regiões geográficas do Sudeste e Sul. Não existe informação do vírus circulantes no Estado de Alagoas, Nordeste do Brasil. A partir de padrões eletroforéticos RT-PCR e RFLPs, foi traçado subtipagem) preliminar Dia do Hospital Alagoas (UFAL) Neste trabalho periodo um perfil da população Hospital Brasil, do vírus Universitário e do Laboratório foram avaliados genético gerados por (genotipagem da hepatite da Universidade Central C no Federal de de Alagoas 104 pacientes e anti-HCV, (LACEN). durante o entre março de 2003 a abril de 2004, após consentimento informado. Níveis detectáveis 73,1 % (76/104) genotipagem gerados das amostras foi efetuada pela endonucleases clivagem através de restrição BstUI com de soro avaliadas a partir dos produtos RT-PCR com predominante, de HCV-RNA foram observados ou de genótipo 81,6%, maior 3. O subtipo 1b apresentou (52/76), seguido 11,3% determinados. amostras. Nordeste prevalência infectados Coinfecção para Norte e 3a. mais 17,1% prevalência, do 83,8% Subtipos com o genótipo 3 não puderam já reportados e Sudeste, maior dos genótipos uma maior prevalência o por geral dos tipos de HCV em Alagoas com dados preliminares (Bahia), foi contra infectados com o genótipo seguida 1 1a com ser (1 a/3a) foi detectada em uma (1,3%) das A distribuição congruentes (7/76) com três (4,8%) individuos 1, e seis (7,9%) duplas ScrFI. genótipo relacionados digestões de A da região 5'NCR e Hinfl-BstOI, prevalência por por RT-peR. Haelll-Rsal O em em Estados do determinou-se 1 e 3. Entretanto, do subtipo momento, do tipo 2, já detectado onde uma em Alagoas, 1b, além da ausência, no Brasil. são há até o xvi Abstract The prevalence determined southern of Hepatitis in several geographical and southeastern the genotypes northeastern patients C Brazil. from Universidade the We evaluated Dia Federal of Alagoas in the State 104 analysis of the genotypes polymerase chain of Hospital (UFAL) was performed reaction (RT-PCR) Haelll-Rsal Universitário and Laboratório infected with genotype in one (1.3%) of the samples. 1b was observed general distribution northern, higher prevalence specially HCV-RNA was from the 5'UTR of PCR amplified sequences followed using by cleavage 1 was the most predominant, with followed by 9.2% (7/76) related to three (3.9%) individuais 1, and six (7.9%) infected with genotype could not be further determined. from those products 68.4% (52/76), for both 1a and 3a. Subtypes in the Central of 60.6%, against 13.5% of the genotype 3. Subtype 1b showed higher prevalence, subtype of by reverse transcription- and Hinfl-BstOI, with BstUI and ScrFI. Genotype prevalence seropositive primers and also by using restriction double digestion endonucleases about of the serum samples by RT-PCR. The region with genotype-specific endonuclease been of Alagoas, anti-HCV of Alagoas (LACEN) from 2003 to 2004. Detectable present in 73.1 % (76/104) has There is no information circulating Hospital genotypes regions of Brazil, mostly in the regions. of the virus (HCV) Coinfection (1 a/3a) A higher frequence in older patients 3 was detected (53.8%) of the (above age 55). The of HCV types in Alagoas is similar to that found northeastern and southeastern of genotypes 1 and 3. However, our results differ previously reported from northeastern for those data related to higher prevalence and absence of genotype 2. regions region with a (Bahia) of subtype 1b INTRODUÇÃO 1 1. Introdução A infecção altamente associada hepatocelular hepático, em causada pelo vírus ao (HCC), o mundo, contaminados devido considerada a fatores como: um número seis aos portadores carcinoma grau de dano vezes maior de do HIV e por isso uma doença de grande impacto OMS, aproximadamente de está A hepatite C é a infecção mais comum com em relação C (HCV) desenvolvimento idade e genótipos. todo da hepatite mundial. Segundo é a 200 milhôes de pessoas estão infectadas pelo HCV, sendo grande parte assintomática, desconhecendo que é portadora do vírus (WEILAND et ai., 1999). O diagnóstico importãncia, resultam preciso e a genotipagem dado que, infecçôes em respostas do v irus é de grande por genótipos diferentes diferentes ao tratamento do HCV com interferon peguilado (LAYDEN & LAYDEN, 2002). Apesar replicação do HCV ser lenta, um agente de baixa 50% a 80% dos pacientes infectividade e que apresentam a forma aguda de hepatite evoluem para uma infecção assintomática, progredindo e após 10 anos terão uma hepatite para individuos persistente que desenvolvem, cirrose hepática apresentam em 13 após quadro anos, um sete anos. definido quadro crônica de e ativa, Em média, de cirrotização hepatocarcinoma (OLIVEIRA et ai., 1999; TAKAHASHI et ai., 1995). Existem agressivo espectro evidências e está de doenças especialmente 2000). mais cirrose Estudos importantes associação de que o subtipo intimamente relacionado crônicas do figado hepática e carcinoma realizados da infecção na Europa pelo subtipo com o amplo em estágio avançado, hepatocelular mostram 1b do virus, direta com a idade dos pacientes infecção crônica. Em pacientes 1b do HCV é o mais (ZEIN, características como a sua e a longa duração da que apresentam doença hepática 2 INTRODUÇÃO por longo período, incluindo carcinoma hepatocelular, foi o mais prevalente com o subtipo peguilado o subtípo 1b (PARANÁ et aI., 2000). Indivíduos infectados 1b tendem do que aqueles HCV. A sensibilidade a responder infectados menos ao com outros ao INF pelo subtipo interferon genótipos de 1b está correlacionada com mutações dentro de uma discreta região da proteína viral nãoestrutural 5A sensibilidade (NS5A), expressando a região determinante ao Interferon (ISDR) (LAYDEN & LAYDEN, 2002). Considerando dos genótipos a ausência de dados referentes e subtipos do HCV circulantes à prevalência em Alagoas, necessidade da determinação para o estabelecimento terapêutico a ser no utilizados, análise utilizado neste trabalho, de ácidos de tratamento métodos nucléicos, RFLPs, para identificar programas da como RT-PCR, Portanto, o objetivo eficiência e especificidade epidemiológicos principal foram baseados PCR aninhada na e que auxiliarão aos em nosso deste trabalho do esquema doença, biomoleculares os genótipos circulantes controle da e a do Estado. é o de avaliar a da diagnose molecular do vírus através de RT-PCR e RFLPs em amostras anti-HCV positivas do Hospital Dia do Hospital Universitário procedentes da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) e do Laboratório Central de Alagoas (LACEN). 3 REVISÃO DA LlTERA TURA 2. Revisão da Literatura 2.1 Hepatite C Os virus intracelulares replicação da hepatite C agem como verdadeiros que desenvolveram e de propagação estratégia capacidade biológica, de mutação, mecanismo de ao longo de milhões de anos de co- habitação com seus hospedeiros. a sua um sofisticado parasitas Eles se adaptaram e modificaram desenvolvendo o que garantiu uma impressionante a sua sobrevivência no planeta até os dias atuais (CONTE, 2000; OSELLA et ai., 2001). A hepatite C é transmitida derivados, e foi disseminada de sangue nas décadas obrigatório o teste sorológico A evolução acentuada sendo a rapidamente através C é caracterizada por periodos incidência das de progressão para a cronicidade. progredir nas seguintes fases: pré-ictérico, periodo ainda não era exposlçao ictérico 2003). por fases de relativa fases incidência periodo de transfusões anti-HCV (FELIPPE-JUNIOR, intercaladas baixa pelo sangue e seus de 1970 e 1980, quando da Hepatite viremia típico principalmente agudas de quietude, e A hepatite a alta C pode ao virus, incubação, e convalescença (WEILAND et aI., 1999). O isolamento que o genótipos vírus é de HCV de diversas altamente distintos heterogêneo. denominados e o 6 foi verificado (cosmopolitas), na Ásia. São reconhecidos 6 de 1 a 6 com aproximadamente 100 subtipos (a, b, c, etc). Os genótipos todos os continentes regiões do planeta mostrou 1 a 3 são encontrados em os 4 e 5 são tipicos da África Estas diferenças subtipos fazem com que varie a susceptibilidade de genótipos e do virus à terapia antivíral (VITRAL et aI., 1999; PARANÁ et aI., 2000). REViSA O DA LlTERA TURA 2.2 Biologia do Virus da Hepatite C O virus da hepatite C foi identificado 80, sendo reconhecido 4 no final da década de como um membro da família Flaviviridae. Seu genoma consiste de uma hélice simples de RNA de polaridade positiva et ai., 1999; com cerca de 9,5 Kb (Figura 2)(OLlVEIRA PARANÁ et ai., 2000; MORADPOUR et ai., 2001). O genoma do HCV possui uma única região aberta de leitura (ORF) que codifica aminoácidos. a síntese de uma macroproteína O desdobramento dessa proteína proteínas menores, com função estrutural com 3.011 resulta ou regulatória em 10 (CHOO et ai., 1989; STRAUSS, 2001). Proteínas do envelope Proteínas do capsfdeo RNA viral Figura 1. HCV mostrando proteínas do envelope, do capsiaeo e o RNA viral (STRAUSS, 2001). Vários genes estruturais entre as regiões terminais e não-estruturais não codificadoras foram identifícados (NCR), 5' e 3', do genoma do vírus HCV (DAVIS et ai., 1999; FANG et ai., 2001). A região estrutural do nucleocapsídeo E1 e E2 correspondem respectivamente, HCV, enquanto aos genes as glicoproteínas os genes viral e as regiões do envelope estruturais codificam, do núcleo e do envelope não-estruturais NS4B, NS5A e NS5B - codificam que outras - NS2, proteínas NS3, do NS4A, e as enzímas REVISAO DA LlTERA TURA necessárias para a replicação 5 viral (Figura 3) (CHOO et ai., 1989; MURASHIMA et ai., 1999). Proteínas não estruturais Proteínas estruturais IRES - sítio de entrada ribossomal ínterno • Figura Poli U 2. Esquema da estrutura proteinas estruturais Embora conservadas, as genômica do HCV mostrando e não estruturais. regiões terminais 5' alguma heterogeneidade e 3' sejam altamente foi observada em outras regiões do genoma do HCV, que são responsáveis cepas ou genótipos do virus já descritos pelas diferentes (SIMMONDS et ai., 1994; DAVIS et ai., 1999; FANG et ai., 2001). Até o momento, identificados informação seis genótipos mais importantes que auxilia nas estratégias ao tratamento, terapêuticas. mais baixos (McHUTCHISON ou seja, Por exemplo, o diagnóstico índices carga viral de resposta et ai., 1998; POYNARD et ai., 1998; DAVIS et ai., 1999; WEILAND et ai., 1999). natural, foram do HCV produzindo o genótipo 1 foi associado com doença mais agressiva, maíor e resistência as e o manejo Portanto, da infecção pelo a história HCV são afetados pelo genótipo vira!. As proteínas estruturais codificadas incluem a proteína central seguida glicosiladas codificadas pelos pela reglao N-terminal por duas proteínas do envelope genes E1 e E2. A proteina 6 REV/SAO DA LlTERA TURA codificada pelo hipervariáveis, ligação para uma proteína A p7, duas por um precursor regiões e2 contém também o sitio de viral especifico também é desconhecida apresenta de membrana dos linfócitos o receptor proteina processada função E2 do envelope e1 e e2. A proteina provavelmente 1998). gene do HCV (PILERI et ai., codificada pela região E2-P7, já foí descrita, (SUZIKI et ai., B (CD81), E2 e porém sua 1999; BARCELLOS et ai., 2002). A região não estrutural (NS) codifica seis proteinas: NS3, NS4A, NS4B, NSSA e NSSB. A NS3 é responsável atividades enzimáticas: serina-proteinase, trifosfatase-dependente codificada de ATP. pela NS2 e seqüência helicase Uma NS2, por três e nucleotideo- segunda protease é N-terminal da NS3. A NS4A forma um complexo heterodinãmico com a NS3, agindo como um ativador necessário proteinase para a atividade provável que codifiquem para aminoácidos da NS3. Sobre o NSSB, é a RNA polimerase, conservados pois apresenta em várias polimerases. da NS2 e NS4B ainda não são bem estabelecidas. NS3 recombinante e NSS permitiram de serina-proteinase polimerase do poliproteínas ai., 1999; As funções A purificação a demonstração de da atividade e de helicase do NS3, bem como a atividade NSS. desenvolvimento códons Isso abrirá novas possibilidades para de drogas capazes de inibir o processamento do HCV e a replicação MORADPOUR et ai., de de RNA do HCV (SUZIKI 2001; STRAUSS, o et 2001; BARCELLOS et ai., 2002). A região S' não-codificadora entre várias HCV's isolados. ramificações Isso (NCR) é altamente mostra e voltas. Existe estruturas conservada secundárias uma boa evidência presença neste domínio de um sitio de entrada ribossomal (IRES), permitindo uma tradução cap-independente para a interno do RNA vira!. Os estudos atuais estão ajudando a mapear mais precisamente seqüências IRES, e identificar com as a proteina celular que se liga a S' KEVISAO DA LlTERA TURA NCR e também (MURASHIMA regula et aI., a tradução do genoma do 7 HCV 1999; MORADPOUR et aI., 2001; STRAUSS, 2001; BARCELLOS et aI., 2002). De acordo poliproteina com SHIMAZAKI (2002), a tradução do HCV é mediada por um IRES localizado região da proteína viral não estrutural da dentro da 5A (NS5A). 2.3 Epidemiologia A Hepatite C é uma doença sendo responsável infecciosa causada por, pelo menos, 90% das hepatites não-B pós-transfusionais. O agente causal infecta demora hepatocelular a se sintomas, preocupações C crônica de saúde de pessoas incluindo (WEILAND infecção C pode não é considerada públíca milhões a doença e de transplante Estima-se estejam 1999; SARBAH nos Estados 2000). et aI., de 200 com o Unidos Uma vez que a causa de doença hepática crônica de fígado nos Estados Unidos e Europa Ocidental, progressivamente. Papua que infectadas o foco de atenção para o controle e/ou a erradicação e Nova Guiné são os que apresentam de 0,4% a 1,0%). No geral, a prevalência na Europa do HCV vem Paises como Egito, Arábia Saudita, número de casos, incluindo doadores voluntários população, crônica, como uma das grandes de pessoas pelo HCV é a principal Filipinas, e após a e 1 a 4% risco mundial. no mundo inteiro quatro et aI., aumentando apresentar na crônica, cirrose que HCC (STRAUSS, 2000; BDOUR, 2002). A hepatite milhões para de cirrose uma doença 85% das pessoas desenvolvem de 20 a 30% evoluem desenvolver virus, A hepatite tanto na sua fase aguda, quanto contaminação, cerca manifestar. e é considerada não-A e principalmente as células do fígado podendo levar ao desenvolvimento e carcinoma pelo HCV, e Estados maior de sangue (média varia de menos de 1% da Unidos, a 10% em regiões Africa e Asia (PARANA et aI., 2000; BDOUR, 2002). da 8 REVISÃO DA L1TERA TURA Não se sabe ao certo a prevalência Brasil. Mas, portadores estima-se que um em da infecção pelo HCV no cada 40 HCV. De acordo com a Organização (OMS) o Brasil tem cerca de quatro milhões estudo transversal realizado de doadores com anti-HCV brasileiros são Mundial de Saúde de portadores. Em em bancos de sangue, a prevalência positivo foi de 1,23%. Porém, existem regiões no País, como o Acre, aonde a prevalência chega a 10% dos doadores de sangue. ,3 H"'lt:iu thult! .:-J Heql(I(1 Ccn1ru UL's'e -.J HeqldO NOll'este Hl~ql;j(, Sllll~~h: ~ Fl.1'lJ;~U 5111 Figura 3. Distribuição de genótipos de HCV em diferentes regiões do Brasil de acordo com Busek & Oliveira (2003). A distribuição genotipica com a área geográfica, predominantemente et al.,2001), sendo que os genótipos encontrados tipo 1, 2 e 3 são na Europa, Japão (KREKULOVA Estados Unidos (ALTER et al.,1999; aI. ,200 1), sendo o genótipo 1b o mais prevalente mundo (PARANÁ et aI., 2000). centro-norte, do HCV no mundo sofre variação leste O genótipo 4 KREKULOVA et no ocidente do é mais frequente no e sul do continente africano (McOMISH et aI., REVISÃO DA LlTERA TURA 1994; PARANÁ et aI., 2000; KREKULOVA et al.,2001); 9 genótipo 6 em Hong Kong (SIMMONDS et ai., 1993 KREKULOVA et al.,2001) e genótipo 7, 8 e 9 no Vietnã (BDOUR, 2002). O mapa de BUSEK & OLIVEIRA (Figura (2003) mostra 3). Com relação circulantes os genótipos ao Estado encontrados de Alagoas, no Brasil os genótipos são descritos neste estudo. Apesar do HCV ter sido clonado em 1988, apenas em 1991 nos EUA e 1993 no Brasil, Ministério da Saúde identificar este virus, do Desta pessoas que necessitaram Portaria forma, derivados, sorológica para Brasil, o HCV Portaria testes infectou ou estão expostos disponivel em N" 1.461 de 22 de dezembro 1376 do para em doadores e infecta da n° laboratoriais obrigatórios dependendo HCV da os tornaram-se sangue. produtos através milhares de de ao sangue e seus utilização cada pais. de triagem Somente em de 1999 o Ministério da Saúde colocou a hepatite pelo HCV na lista nacional de doenças de notificação em registro individual. compulsória A incidência de doadores anti-HCV em regiões do Estado do Paraná, mostraram em Curitiba a taxa de 0,66%, 0,57% em Campo Mourão, 0,52% em Francisco Beltrão, 0,54% em Apucarana, 0,47% em Guarapuava e 0,45% em Cascavel (VALENTE, 2002). No Estado de Alagoas estima-se casos confirmados em tratamento Terapêuticas de portadores de acordo da Hepatite que existam cerca de 4 mil do HCV, dos quais 3500 estão com o Protocolo Clínico Viral Crónica Tipo C (HCV). Somente no primeiro semestre de 2004 foram notificados portadores do HCV, enquanto ':>ram noiificados e Diretrizes que durante 44 novos casos de todo o ano de 2003 34 casos (SINAN, 2004). BRANDÃO (2001) demonstrou HCV ocorrem por via parenteral. que 75,0% das infecções Nos hemofílicos, a prevalência pelo da hepatite pelo virus tipo C no Brasil é de 87,3%, enquanto que nos pacientes hemodialisados de 19,0% a 47,2%. Em verificam-se usuários percentuais de drogas que intravenosas variam que REVISÃO DA LITERATURA compartilham seringas, o indice de contaminação 10 pode chegar a mais de 80,0% (YEN el ai., 2003). Grupos de riscos receberam transfusão hemodiálise (1,0%) compartilharam agulhas sangüinea antes área (6,0%) ou piercings. e contato e leite materno de saúde (2,0%) (BREVIDELLI instrumentos 2.4 Aspectos Na Hepatite el ai., 2002), profissionais CIANCIARULLO, 2001). e de manicures do HCV imunidade natural, quer dizer que, se uma pessoa teve hepatite C e negativou conseqüência (COLOMBO, da alta taxa da (PARANÁ el ai., 2000). C não é desenvolvida devido por com a família e Clinicos-epidemiológicos ela pode ser reinfectada, á que A transmissão de barbeiros esterilizados Biológicos submetidos do portador & que de drogas contaminados, odontológicos, devem ser corretamente e foram (COCHRANE objetos Portanto, individuos os usuários (42,0%) com tatuagens sexo é muito baixa C incluem (6,0%) de 1994, seringas e aqueles (3,0%), para hepatite a diferentes de mutação genótipos seu do isto o vírus, do virus, ácido nucléico 1999). A maioria das pessoas que se infectam pelo HCV apresentam viremia crônica associada inflamatório e fibrose. hepatócitos de individuos de linfócitos infectados evidência de dano associada ao aparecimento T citotóxicas 1999; LECHNER aparecimento perda dessas graus el ai., de células tem sido interpretada A erradicação T citotóxicas viremia (GERLACH el ai., 1999). TAKAKI ai., parece crítico, associada está mediada por (COOPER el como do vírus celular T auxiliadoras. 2000; tem sido processo que 50% ou mais dos de forte resposta e células de albergam o virus. A presença hepático imunomediado. células variáveis Estudos demonstram no parênquima células a el ai., 2000). O visto que a ao ressurgimento da REVISÃO DA LlTERA TURA 11 2.5 Patogênese As características intensa Esta atividade grande sofisticado Contudo, do genoma do HCV se distinguem genética com um grande flexibilidade mecanismo genotípica proporciona para se livrar das defesas por ser um vírus tipicamente seu genoma potencial ao cromossomo por uma de mutação. ao vírus um do hospedeiro. de RNA, o HCV não integra do hospedeiro (BARCELLOS el ai., 2002). In vivo, o vírus da hepatite mecanismo genético de sobrevivência na célula transcríptase consiste do hospedeiro reversa em injetar com que a maquinaria o material (DNA) e STRAUSS, 2001; MORADPOUR o seu material não da enzima de moléculas ao seu material genético, reconheça e seu principal e, com o auxílio ocorre a produção DNA complementares RNA, fazendo C é um retrovírus que é formado por da célula o de cDNA - do hospedeiro destrua (ZEIN, 2000; el ai., 2001; LAYDEN & LAYDEN, 2002). No mecanismo de replicação hospedeira é o hepatócito, a óssea, medula granulócitos. envelope os dentro de um filamento a síntese nucleocapsídeos protéicos do retículo liberados macrófagos, intermediário endoplasmático células do hospedeiro. geral e os rompe o seu a polimerase de RNA negativo, positivos adquirem e linfática o de RNA. Os novos da célula infectada. Os vírus formados ao dia. A sobrevida a célula linfócitos celular que sintetiza formados na circulação os o vírus para novos genomas recém HCV, o vírus também pode infectar da célula, e se liga ao ribossomo qual dirige bilhões rins, Uma vez para a síntese são os entretanto do RNA do envelopes Os vírus e infectam novas atingem o número de 10 média dos vírus é de somente poucas horas (STRAUSS, 2001; LAYDEN & LAYDEN, 2002). Variações importante freqüentes função dos no mecanismo genes virais parecem ter uma de escape do HCV no sistema REViSA O DA UTERA TURA 12 imune do hospedeiro. É comum um vírus mutante da hepatite C escapar ao reconhecimento pelas células T citotóxicas, sugerindo .que o HCV possa 'burlar náo sóa imunidade humoral, mas também, a imunidade celular (CONTE, 2000). . . Estudos mostraram que o HCVassocia-se com lipoproteínas na circulação, no intuito de proteção de anticorpos circulantes e outros mecanismos imunes. A .associação do HCVcom lipídios também promove a entrada do vlrus com facilidade no flgado, pois I.ipídios sáo metabolismo captados hepático pelos hepatócitos, (STRAUSS, 2001; fazendo parte LAYDEN & do LAYDEN, 2002). Estima-se que o HCV sofra quase 1000 mutações por ano dentro do próprio hospedeiro. Dentro de um determinado indivíduo infectado, população as parti cuias do HCV não se comportam como uma homogêne,a, na verdade ,elas funci.onamcomo conjunto de variantes genéticas conhecidas com quasispecies. acontece devido à grande quantidade de erros inerentes à função das enzimas polimerases.É um Isto de replicação aqui que reside uma das mais importantes armas .do HCV, pois a continua geração de uma diversidade tão grande de genomas dificulta a atuação do sistema imune do hospedeiro. Quando o sistema imune encontra um caminho e destrói o .inimigo, este já está se transformando e g.erando partículas diferentes que o sistema de defesa não mais reconhece (CONTE, 2000; STRAUSS,2001;LAYDEN& LAYDEN,.2002). 2.6 Diagnóstico Os testes para detecção da infecção pelo HCV podem ser divididos molecular. basicamente A biópsia histologicamente realizados em três tipos: a exames hepática lesão é hepática complementares endoscopia (pAL TANINet aI., 2002) .. histológico, utilizada para existente. como sorológ.ico e caracterizar Também ultrassonografia são e REVISÃO DA LITERATURA 13 2.6.1 Diagnóstico Sorológico As técnicas utilizadas para infecção pelo HCV são baseadas o vírus. Estas técnicas menos dispendiosas, .riagem inicial. o diagnóstico na detecção de anticorpos apresentam sendo excelentes de escolha Porém detectam sorológico a resposta contra resultados para toda da e são e qualquer do hospedeiro contra o (ZEIN, 2000; BRANDÃO et vírus, e não o próprio vírus díretamente ai., 2001; TOYO et ai., 2001). em ELISA é um método que utiliza proteínas cultura de celular recombinante. inícial ou Esta técnica para detecção facilidade e custo altas sensibilidade produzidas tecnologia é amplamente de anticorpos de automação atualmente através virais molecular utilizada contra o vírus, relativamente como devído à sua baixo. e especificidade teste Apresenta (MORADPOUR et ai., 2001; TOYO et ai., 2001). Em função da prevalência em 3%, o diagnóstico sensível. são Os testes os ELISA, processamento, custo que da hepatite peplídeos C requer comercializados apresentam facilidade relativamente desenvolvidas de infecção pelo vírus C, estimada de baixo. para detecção vantagens automação, As até o momento utilizam sintéticos um teste para a captação três do anti-HCV como alta rapidez no confiabilidade e gerações proteínas bastante de ELISA recombinantes do anti-HCV (BRANDÃO ou et ai., 2001; MORADPOUR et ai., 2001). Resultados confirmados pelo obtidos RIBA nos métodos 11 ou RIBA inconveniente de apresentar inconclusivos ou indeterminados de triagem 111 O método podem RIBA ser tem cerca de 10% a 20% de resultados (SÁEZ-AláUÉZAR BRANDÃO et ai., 2001; MORADPOUR et ai., 2001). et ai, 1996; o REV/SAo DA LlTERA TURA 14 2.6.2 Diagnóstico Testes moleculares Atualmente, como: Molecular estão sendo aplicados exames sorológicos acompanhamento viral detectam em situações de pacientes, de tratamento t'elo HCV, candidatos associado 2000). com tais da carga Outra situação com hepatite interferon de ribavirina vlrus. duvidosos, é a de pacientes a tratamento com a administração ou mensuração (LEWIN, que requer o uso da PCR qualitativa o especificas, indeterminados laboratorial para controle diretamente isolado ou (BRANDÃO el aI., para hepatite aguda 2001; MORADPOUR el ai., 2001). Por fim, o teste é também preconizado no periodo de janela imunológica, detectado quando o RNA do HCV pode ser uma semana após a exposição (BRANDÃO el ai., 2001; MORADPOUR el ai., 2001). Podem ausência ser de determinada o número qualitativos, material nucléico de microrganismos em Adicionalmente, 2.7 RT-peR de polimerase especificas de oligonucleotideos conhecidas. interação de da em cadeia empregado ácidos amostra de onde é biológica. em relação aos da nova fita o molde e uma enzima DNA polimerase in vi/ro pareamento ou da estrutura termo estável de de previamente de DNA é obtida (Iniciadores (componentes tem sido é um método na amplificação arbitrárias oligonucleotídeos Esta técnica Viral (PCR) nucleicos, desoxiribonucleotideos ai., 1999). ou ou genômicas) ao Diagnóstico seqüências A síntese entre virais ou (LEWIN, 2000). rápido e largamente regloes microrganismo menor sensibilidade e RFLPs Aplicados A reação a presença gênicas, e quantitativos, definido apresentam detecta um (partículas volume métodos qualitativos se de mutação ou seqüências quantificado preciso, onde da através reação), do DNA), DNA (FURIONE el adotada como uma abordagem 15 REVISÃO DA LlTERA TURA alternativa de para a análise mapas genéticos diferentes organismos de variabilidade e produção genomlca, de sondas construção genéticas (WELSH & McCLELLAND, para 1990; WILLlAMS et ai., 1990 e BARRY et ai., 1990; FURIONE et ai., 1999). 2.7.1 RT-peR A RT -PC R ocorre amplificação. em duas Sua principal etapas: diferença transcrição reversa e está no fato de a reação não partir de um molde de DNA, mas de uma fita molde de RNA, que após uma reação convertido catalisada em cDNA. por uma transcriptase Na primeira, ocorre a transcrição com a formação de uma fita de cDNA e na segunda, do cDNA (ASLANZADEH resultados a amplificação e de grande sensibilidade, de RNA e que requer cuidados falso-positivos extremos ou falso-negativos Ela é bastante ausência utilizada inconclusiva, infecção quimioterápico sendo crônica que ou cirúrgico também, serão clinica 2000). em indivíduos tratamento A RT-PCR pode com grande infecções agudas (anti-HCV) (FREEMAN et ai., 1999; FURIONE et ai., 1999). O limite de detecção, aproximadamente variações detectar antes mesmo por 1.000 da técnica, PCR, cópias o diagnóstico do aparecimento em do e uma das até 100 cópias 1999; BELD et ai., 2000). para auxiliar de HCV com à submetidos ou contribuir teórico eficiência a presença realizada (STRAUSS, para evitar (BRAN DÃO et ai., para determinar de vírus RNA em casos de suspeita sorologia com reversa para a sintese de uma fita dupla de cDNA, a partir de uma fita simples 2001). é et ai., 2000; MORADPOUR et ai., 2001). A RT-PCR é uma técnica laboriosa utilizada reversa de anticorpos condições ótimas, genoma/mL, mas mais do genoma/mL sensíveis de soro de é existem é capaz (DAVIS de de et ai., REVISÃO DA LlTERA TURA 16 2.7.2 peR aninhada A PCR aninhada é utilizada a eficiência primeiro da reação. de forma localizadas para melhorar a especificidade O segmento genômico e é amplificado, abrangente, copiando até mesmo seqüências fora dela, e depois, utilizando este primeiro amplificação da real seqüência-alvo produto, et (RUSTER ai., a 1996; FURIONE et ai., 1999; ALMEIRA et ai., 2001). Nesta técnica, PCR. No primeiro, realizam-se submetida empregando-se Uma alíquota internamente oligonucleotideos Essa técnica extremamente contaminação técnica apresenta com grande sensibilidade Como posição A segunda determina antes auxiliar na conduta interromper infecção diminuição complicações mesmo vira!. de Como custos a par ainda superior de da à do de material nucléico os riscos de com a et ai., 2001). A precoce de infecções de anticorpos. Além de principais os síntomas e a progressão conseqüência para então amplificação, tendo como objetivos viral, diminuir de por RFLP pode contribuir do aparecimento a replicação do do que os mencionados para o diagnóstico do tratamento é a especificidade esperado, à genotipagem eficiência agudas Saúde direta, pode Pública com ocorrer a eventuais da doença. 2.7.3 Genotipagem Variabilidade número à do PCR (RUSTER et ai., 1996; ALMEIRA aliada com um par amplificado quando a concentração reduzida. de novo par de iniciadores, utilizados. são ainda maiores PCR aninhada, da produto relação diferentes, PCR e é recomendada é consecutivos cerca de 15 a 30 ciclos usando-se em inicialmente com oligonucleotídeos reação. do à nova amplificação localizados ensaios um segmento de DNA é amplificado de oligonucleotídeos, amplificação. dois diferente por RFLPs genética de técnicas, pode ainda dentre ser identificada por um elas, RFLPs. O princípio da REV/SAO DA LITERATURA técnica está genomas, associado a eventuais diferenças que podem ser visualizadas dos organismos resultado, é tratado fragmentos polimórfico) são nucleotídicas, sítios variantes ainda genotipagem DNA gerados, uma vez diferentes se que de baseia-se RT-PCR aninhada. tamanhos (DNA variação nas seqüências cliva o DNA em mutantes ou 1996) e de um segmento da (RUSTER et na amplificação da extremidade ai., O produto 5' do vírus pela técnica de de aproximadamente base é submetido a RFLP que emprega gera com fragmentos identificação através disponíveis padrões padrões eletroforéticos já no mercado a oligonucleotideos mais complexos isolados e em pacientes de HCV, sintéticos os dois Existem a outros sendo o reversa do produto baseados nos dados do HCV. Todavia, em casos com infecção testes que permite para a genotipagem, de amplificação de diferentes que estabelecidos. o LiPA que é uma hibridização de seqüência 260 pares de enzimas de restrição mais conhecido, definitiva Como e ainda, de genótipos descritos região não codificadora subtipo de restrição. (FURION E et ai., 1999). A metodologia métodos o DNA diferentes ocorrer entre quando a endonuclease de restrição, não claramente com endonucleases de existentes 17 por mais de um não apresentam uma solução (FURIONE et ai., 1999; FREEMAN et ai., 1999). 2.8 Tratamento O tratamento objetivos sintomas Estudos soro principais infecção recentes de causada interromper e a progressão abaixo chances da pelo a replicação HCV viral, tem como diminuir os da infecção viral (OSELLA et ai., 2001). demonstraram de 1 milhão responder que pacientes de cópias ao virais tratamento com carga viral no por mL têm maiores (OSELLA et ai., 2001; MORADPOUR et ai., 2001). A principal interferon estratégia e a ribavirína. para o tratamento Interferons da hepatite C inclui o são glicoproteínas produzidas REV/SAO DA LITERATURA pelas células que ativam os macrófagos, os neutrófilos NK e, para alguns, possui uma atividade antiviral é um análogo mensageiro (CHAN da guanosina meses 2000). efeitos resposta impede e assim inibe a replicação et aI., provocam que Tanto colaterais tratamento. a formação significativos. quanto ocorrer vários de antivirais, polimerase e da helicase. alto grau de mutabilidade de protease, ainda, vacinas do HCV (BJ0RO terapia à em fase de estudo os inibidores Não existem, uma boa ao final de 6 resistência sendo esta a razão de estarem como a ribavarina Considera-se apresentada, tipos do RNA de muitos virus DNA e RNA o interferon Pode e as células direta. Ribavirina quando a carga viral se torna indetectável de 18 de devido ao et aI., 2002; WEBSTER et aI., 2000; MORADPOUR et ai., 2001). O custo elevado Embora a Ribavirina é outro fator o tratamento. no Brasil, o Interferon não é, e seu preço pode chegar a U$ 345.00 por dose (SLOBODA, 2004). O tratamento completo gratuitamente inclusão, seja produzida que dificulta custa U$ por segundo a portaria 639 do Ministério o protocolo atualmente do SUS a ribavirina convencional Cerca OIagnostlco pelo elevar SÚS. ae portadores estratégias mês é oferecido desde que o portador do HCV faça parte do grupo de . _,,_,;;memou promete 1,700.00 a resposta de nove dos portadores e ao tratamento tratamento pacientes e o interferon para 60% dos casos. terapêuticas mil da Saúde (MS), que aos recebem peguilado, que de 47% do interferon-a São de grande importância que possam melhorar a qualidade de vida do HCV (WEBSTER et ai., 2000; FELlPPE-JUNIOR, 2003). O interferon IFN-a-2b PEG com proporção peguilado recombinante peso molar a partir da ligação do á uma molécula de cadeia única linear de molecular de foi sintetizado médio 1: 1. O de PEG 12.000 liga-se dáltons em uma por união cova lente 19 REVISÃO DA L1TERA TURA primária à histidina 34 da IFN-a-2b (MORADPOUR et ai., 2001). Os sítios secundários peguilação de bem como os resíduos SCHERING-PLOUGH, A peguilação de retardar proteínas, a lisina -31, das proteínas se a cisteína -121 e -134 (MONOGRAFIA é um método bem estabelecido e reduzir a imunogenicidade mostrado seguro para os seres (WANG et ai, 2000; WEBSTER et ai., 2000). A molécula inerte, hidrossolúvel, constituindo-se para retardar aplicações asparaginase, de não-tóxica e de em um agente modificador a depuração clínicas, N-terminal, 1997). depuração tendo incluem tais a interleucina-2, hormônio do crescimento a adenosina de PEG é variável, de proteínas de aminase, o fator de estimulação o fator humanos ideal que já foi utilizado de uma variedade como macrófagos-granulócitos, tamanho das de necrose com a L- de colônia tumoral e o humano (WANG et ai, 2000, WEBSTER et ai., 2000; MONOGRAFIA SCHERING-PLOUGH, 1997). OBJETIVOS 20 3. Objetivos 3.1 Objetivo Geral - A partir dos padrões eletroforéticos RFLPs, traçar um perfil genético gerados por RT-PCR e (genotipagem e subtipagem) preliminar da população do virus da hepatite C no Hospital Dia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) e do Laboratório Central de Alagoas (LACEN). 3.2 Objetivos - Verificar Especificas a prevalência do RNA-HCV em amostras anti-HCV positivas; - Avaliar a eficiência e especificidade da diagnose molecular do vírus através de RT-PCR e RFLPs nas amostras analisadas. MATERIAIS & MÉTODOS 21 4. Casuisticas e Métodos O trabalho foi executado no Laboratório de Genética Molecular, Genõmica e Proteõmica - GEMPRO da UFAL, a partir de amostras obtidas de Universitário Laboratório do serviço da Universidade Hepatologia Federal do de Alagoas Hospital (UFAL) e do Central de Alagoas (LACEN). 4.1 Aspectos Éticos Este trabalho contou com as autorizações da Comissão Ética em Pesquisa da UFAL em agosto de 2001 (Apêndice participantes pela assinatura de 1) e dos de um termo de livre consentimento (Apêndice 2). 4.2 População em Estudo Na diagnose identificação formulário dos contendo: sexo, endereço, risco (Apêndice transfusão também e pacientes telefone, 3). levantados do através nome completo, outro neste estudo de foi dados de pesquisa, a de idade, dos fatores de relacionados alcoolismo, do perfil de portadores efetuada preenchimento e ocorrência lado, tabagismo, HCV, estado civil, profissão, procedência Por sanguínea, conhecimento genotipagem tatuagem com foram objetivando-se o antí-HCV positivo. 4.3 Participantes Cerca de 104 indivíduos anti-HCV positivos foram avaliados em relação à presença de HCV-RNA, durante março de 2003 a abril de 2004, após consentimento informado. Desses, relação ao tipo e subtipo vira!. 76 foram avaliados em MATERIAIS & METODOS 22 4. 3.1 Critérios de Inclusão Foram incluídos no estudo indivíduos pelo método de Elisa 3" geração com anti-HCV e pacientes positivo sem de tratamento (Apênd ice 1). 4.3.2 Critérios de Exclusão Foram excluídos do estudo indivíduos em tratamento e com anti-HCV negativo. 4.4 Obtenção das Amostras Clinicas As amostras selecionados foram posítiva seringas descartáveis O sangue coletado obtenção do acondícionado Laboratório sangue com sorologia utilizando-se para de coletadas para antí-HCV sangüíneo. em microtubos de Genética pacientes comprovado, e de uso individual. foi centrifugado plasma dos 4000xg durante O material biológico a 5°C e posteriormente Molecular, Genômica 2 min foi levado e Proteômica ao em caixa térmica e mantido em freezer a -20.C. 4.5 Isolamento de RNA Total A extração do RNA total foi realizada extratora TRlzol" protocolo de CHOMCZYNSKY basicamente isolamento LS Reagent (Life Technologies™), & SACCH I (1989). por fenol e isotiocianato de RNA viral utilizando de amostras a solução baseada no Esta é composta de guanidina, de sangue indicado total, para soro ou plasma sangüíneo. No período enfatizou-se que alguns antecede cuidados RNAses, durante a manipulação Esses 0,1%. materiais foram tratados ao para isolamento evitar de pipetas, de RNA contaminações vidrarias total, por e bancadas. com inibido r de RNAse, DEPC MA TERIAIS & METODOS o protocolo separação, adaptado precipitação, foram adicionados incubados lavagem LS Reagent (Life em ambiente por 15 mino Em seguida por min recuperada Technologies'"). vortex a durante 2°C. A em alíquotas superior a 4000xg (sobrenadante) de 500j.JL que foram transferidas isopropílico a -20°C. Os microtubos temperatura ambiente min a 2°C. Em precipitado foi o com foram agitados sobrenadante 1000 llL foi para um 500 llL de álcool por 10 min e centrifugado seguida, esta à temperatura foram centrifugados novo tubo de 1,5 mL onde foram adicionados lavado Após Os tubos foram 15 s e incubados camada para Logo após ambiente. 200 llL de clorofórmio. agitados lise, Em microtubos de plasma sangüíneo por 5 min à temperatura etapa foram adicionados 45 em cinco etapas: e solubilização. 250 llL da amostra 750 llL de TRlzol'" foram TRlzol consiste 23 e incubados a 4000xg foi por 30 removido de etanol 75% a e o (em água tratada com OEPC). A amostra foi agitada em vortex e centrifugada a 4000xg por 15 min a 2°C. O sobrenadante microtubos foram deixados 30 min para permitir RNA total ambiente por Para redissolver com OEPC) e finalmente por 60 min a 5rC com o objetivo de e os o receberam um volume de 100 j.JLde água livre de RNAse (tratada amostras em temperatura a secagem das amostras. RNA total, os microtubos Milli-Q abertos foi descartado foram incubado de inativar traços de RNAse. As acondicionadas a -20°C até o momento de serem utilizadas. 4.6 Transcrição Reversa O RNA total foi utilizado qual foi realizada utilizando-se para a síntese da fita de cONA, a KCI 75 mM, Tris-HCI 50 mM (pH 8,3), MgCI2 3 mM, OTT 2,5 mM, dNTPs 1 mM, 20 U de MLV-RT (Gibco BRL (Invitrogen), Life Technologies, USA), 2,0 11Mde oligonucleotídeos 8 U de antisenso Inibidor desenhados partir da região 5'NCR (5' - TCGCAAGCACCCTATCAGGCAG (LUNGE et ai., 1999) e 3 llL de RNA extraído. RNAse a - 3') A síntese de cO NA MA TERIAIS & MtTODOS foi realizada a 3rC por em termociclador (Eppendorf 50 min de incubação, aquecimento Mastercycler Gradiente) seguida respectivamente a 95°C durante 5 min e resfriamento 24 por um a 5°C durante 5 mino Várias transcrição minutos; resultado seguida temperaturas reversa 42°C e tempos em cO NA foram por 30 minutos satisfatório, de incubação testados: e finalmente incubação de uma inativação de a 37°C durante 30 a que apresentou de 37°C da enzima para por 50 minutos, a 99°C por 5 minutos e mantida por 5 minutos a 5°C. Os produtos amplificação da RT (10 IlL) serviram de molde por PCR. Todas as reações foram realizadas volume final de 50 IlL com os seguintes reagentes: para a para um KCI 50 mM, Tris-HCI 10 mM (pH 8,3), MgCI2 1,5 mM, dNTPs 0,2 mM, 2,0 IlM de oligonucleotídeos senso da GAAAGCGYCTAGCCATGGCGTTAG Taq ONA Polimerase consistiu ciclos (Cenbiot). de desnaturação de amplificação. região (5'- - 3') (LUNGE et ai., 1999) e O processo de ciclagem inicial por 3 min a 95°C Cada ciclo consistiu 30s a 94°C, pareamento 5'NCR térmica seguida de 35 de desnaturação por 40s a 55°C e extensão por por 1 min a 72°C. As amostras foram incubadas por um período adicional de 10 min a 72°C (extensão final), após o térmíno do último ciclo. 4.7 Visualização e Fotodocumentação de Eletroforese em Gel de Agarose do cDNA Amplificado Alíquotas contendo tampão de corrida 9 IlL de cO NA amplificado 10X (0,25% azul de bromofenol; cianol ; 40% de sacarose) e 1 flL de 0,25% xileno em água em 1,0 L de tampão de corrida TBE 1X (10,8g de Tris base; 5,5g de ácido bórico; 4 mL de EOTA a 0,5 M; 1000 mL de água destilada). por eletroforese As amostras foram analisadas em gel de agarose 2%, corado com brometo de MA TERIAIS & METODOS 25 etídio 10 Ilg'mL.', 5,0 V'cm-' por o qual foi submetido 1 h. Os produtos Transiluminador de peso molecular de presença as amostras elétrica de visualizados em de fragmentos 325pb. Essa etapa inclui de 100pb (Cenbiot, o produto da amplificação contendo de PCR foram UV para detecção bandas de aproximadamente uma corrente à de um padrão RS) para comparações com do cDNA. Logo após, o gel de agarose foi fotodocumentado em sistema digital Kodak. 4.8 PCR Aninhada Com o objetivo de aumentar realizada uma outra reação mesmas concentrações novo conjunto a especificidade em cadeia de reagentes da polimerase da anterior oligonucleotídeos: partir da região temperaturas não-codificada e tempos com as utilizando senso CCCCTGTGAGGAACTWCTGTCTTCACGC ACGGTC TACGAGACCTCCCGGGGC da RT-PCR foi um (5' 3') e antisenso (5' - - 3'), também desenhados 5'NCR (LUNGE de ciclagem foram a et ai., 1999). As mantidos, porém o número de ciclos foi reduzido para 30. 4.9 RFLP/PCR da S'NCR Os fragmentos de bandas amostras HCV positivos aninhada da região enzimática 260pb obtidos através das amplificações 5'NCR foram fracionados com as endonucleases BstOI e digestões de aproximadamente de por PCR por digestão dupla Haelll-Rsal, Hinfl- de restrição simples com ScrFI ou BstUI. 4.9.1 Genotipagem Três microtubos Haelll-Rsal, Aliquotas adicionadas de 0,6 mL foram previamente Hinfl-BstOI de 10,0 e s/d IJL das (sem amostras digerir), positivas em cada um dos três microtubos, IJL do tampão One-Phor-AII identificados respectivamente. do HCV foram juntamente Plus (100 mM Tris-acetato com 1,0 pH 7,5; (100 MA TERIAIS & METODOS 26 mM acetato de magnésio; 500 mM acetato de potássio)). das ocorreu da seguinte forma: 5 U de Rsal enzimas de restrição e 5 U de Haelll Hinfl. num microtubo O microtubo controle e no outro 5 U de BstOI identificado como sld, utilizadas de restrição. Para a 25 J.!L do produto com o tampão da enzima incubadas aproximadamente digestão por amplificado de um nenhum tipo de digestões 10 U de cada uma das enzimas adicionadas corrida as e 5 U de por se tratar interno da reação a ele não foi adicionado endonuclease A adição simples, foram ScrFI ou BstUI foram do cDNA juntamente a 10X. Logo após, as amostras foi interrompida pela 12 h a 37°C. adição 10X (0,25% azul de bromofenol; foram Em seguida, de 0,5 J.!L de tampão a de 0,25% xileno cianol ; 40% de sacarose). 4.9.2 Subtipagem Dois microtubos como sendo digerir), da enzima do microtubos, HCV mM acetato da seguinte microtubo. em cada forma: de das após, dois da enzima 10X magnésio; 500 enzimas as 12 h a 37°C. pela adição 10X (0,25% azul de bromofenol; de sacarose). dos de restrição num como sld, por se tratar de um Logo por aproximadamente foi interrompida amostras 5 U de ScrFI ou 5 U de BstUI identificado restrição. um acetato de A adição e sld (sem IJL das interno da reação a ele não foi adicionado incubadas corrida 25,0 com 1,0 IJL do tampão pH 7,5; (100 mM O microtubo endonuclease digestão de adicionadas de potássio)). identificados ScrFI ou BstUI Alíquotas foram juntamente (100mM Tris-acetato controle de restrição respectivamente. positivas ocorreu de 0,6 mL foram previamente nenhum tipo de amostras foram Em seguida, de 0,5 J.!L de tampão a de 0,25% xileno cianol ; 40% MATERIAIS & METODOS 27 4.10 Eletroforese dos produtos de digestão enzimática Os padrões fragmentos eletroforéticos de bandas referentes através das digestões gel de poliacrilamida nitrato referentes aos diferentes a tipos de HCV distintos, enzimáticas (RFlPs) obtidos foram visualizados em 8% (SAMBROOK et aI., 1989) e corados com de prata de acordo com o método adaptado SANGUINETTI et ai. (1994), uma amostra não digerida descrito Para fins comparativos juntamente por foi utilizado com marcadores de peso molecular (100pb e 174pb). Os géis utilizados eletroforéticos poliacrilamida foram a preparados visualização a partir de dos uma padrões solução de em um béquer de 50 ml as soluções de 8%, de acordo com a lista abaixo: Foram adicionados poliacrilamida para (14,5g acrilamida, O,5g bis-acrilamina). o TBE 10X (108g de Tris base; 55g de ácido bórico; EDTA a 0,5 M) e a água milli-Q autoclavada. logo gel foram adicionados após, a homogeneização 125 Jil persulfato 12,5 Jil TEMED 0,01 % com o objetivo polimerização gel foi imediatamente separadas presos da poliacrilamida. superior de amônio (APS 10%) e de catalizar aplicado entre duas para polimerização a aplicação das o qual permitiu amostras do gel de poliacrilamida amostras contendo foram aplicadas marcadores aparelho vertical padrões foi ligado de tampão vidro, na parte a formação distintas. Após elétrica de a 30 para uma cuba de de corrida molecular a uma fonte de 8% (aproximadamente nas cavidades peso placas foi aplicado min), o pente foi retirado e o gel foi transferido eletroforese de de 0,4 mm de espessura de aço e em seguida um pente com 10 dentes, cavidades a reação Como o auxílio de uma seringa o uma da outra por espaçadores com grampos da mistura do (TBE 1X). As do gel, como também os (100pb e 174pb). O de alta voltagem e as MA TERIAIS & METODOS 28 amostras foram submetidas a uma corrente elétrica de 5v.cm-', por 1 h e 20 mino 4.11 Coloração por Nitrato de Prata Após eletroforese, (EtOH 10%; ácido o gel foi acético imerso 1,3 mM) em solução durante fixadora 5 min sob agitação manual e em seguida esta solução foi removida e reservada. após, o gel foi corado manual constante com nitrato reveladora colocada cuidadosamente (NaOH 750 lentamente formaldeido de prata 36 em solução durante foi descartada fixadora mM) foi onde o gel foi depositado. até o aparecimento seguida a solução reveladora em solução mM; no recipiente Nesta etapa, o gel permaneceu colocado (nitrato e o gel lavado uma vez em água Milli-Q. A solução sempre agitado de prata 0,2 % em agitação por 10 mino A solução corante 20 mM) foi desprezada Logo 10 min sendo das bandas e em e o gel foi novamente por 5 min e finalmente, lavado e mantido por 10 min em água Milli-Q. 4.12 Preservação dos géis e registro fotográfico o gel de poliacrílamida em água milli-Q sistema digital colocado foi então 8% que foi mantido durante retirado Kodak e secos entre duas folhas digital 10 min da água e fotodocumentado para serem arquivados. de papel celofane incolor Este foi sobre uma placa de vidro, em seguida as bordas foram dobradas lateralmente sobre o lado inferior da placa sempre com bastante cuidado para a eliminação ocorreu Após de eventuais à temperatura a eliminação bolhas. Logo após, a desidratação ambiente completa anexado ao livro de registros A eletroforese digestão por eletroforéticos por aproximadamente de umidade, para consultas dos fragmentos endonucleases característicos de do gel 24 horas. o gel desidratado foi posteriores. de bandas obtidos através da restrição produziu para cada tipo viral, os quais mapas foram MA TERIAIS & MÉTODOS 29 comparados et aI (1995) com padrões dos diferentes comparações foram tamanho fragmentos dos de restrição RFLPs já identificados. tipos realizadas de e obtidos subtipos levando cDNA em polimórfico por de DAVIDSON HCV. Essas consideração gerados o pelos RESUL fADOS E DISCUssAo 5. Resultados Em 104 e Discussão amostras anti-HCV positivas avaliadas trabalho, foram realizados testes para o diagnóstico onde foi indivlduos possível detectar o HCV-RNA enquanto que 26.9% (28/104) RNA negativos 30 (Figura descritos na literatura em biomolecular, 73,1% (76/104) foram considerados 4). Esses dados são coerentes (PATINO-SARCINELI que mais de 50% dos portadores neste HCV- com 05 at ai.• 1994). uma vez anti-HCV positivos mantêm a infecção. 26,9% • HCV-RNA .Indeteetável Figura 4. Distribuição das amostras processadas de plasma sangOrneo de 104 pacientes anti-HCV (n=1 04). A Figura 5 mostra um algoritmo neste estudo, levando-se dos resultados em consideração verificados o número de amostras HCV-RNA negativas e positivas dos pacientes participantes. RESUL TADOS E DISCUsSAO Anti-HCV N = 104 I HCV-RNA+ N=76 HCV-RNAN=28 Genótipo 1 N=62 Genótipo 3 N = 13 Subtipo 3a N=7 Subtipo la N=7 neste estudo, dos resultados considerando-se: Infecção Mista N=l Indetenninado N=6 Indetenninado N=3 Subtipo lb N = 52 Figura 5. Algoritmo 31 das 104 amostras verificadas número de amostras negativas; e número de amostras HCV-RNA positivas. HCV-RNA RESUL TADOS E DISCUSSÃO 32 5.1 Casuista Este estudo preliminar da prevalência de HCV-RNA plasma sangOlneo de portadores anti-HCV participação do sexo masculino feminino de indivlduos, tanto e todos cumpriram os critérios positivos de inclusão, em contou com quanto do de acordo com o item 4.3.1. A Figura 71,1 % (54/76) 6 mostra amplo predomínio em relação do sexo masculino, ao sexo feminino, 28,9% (22/76) em amostras de pacientes HCV-RNA positivos. • Masculino • Feminino Figura 6. Percentual de distribuição por sexo de pacientes anti- HCV positivos com HCV-RNA detectável (n = 76). Neste trabalho, indivlduos HCV-RNA cerca de 72 individuos, positivos estavam entre de um total de 76 36 e 70 anos. A média de idade para ambos sexos foi de 49,7 anos (Tabela 1). Como a maioria das pessoas infectadas com o HCV tem de 30 a 49 anos, o número de mortes atribulvel a esta doença do fígado deverá aumentar de forma alarmante nos próximos 10 anos. RESULTADOS E DISCUSSÃO 33 Outro fator preditivo de evolução para doença hepática grave é o uso de álcool, mesmo em consumo moderado (CDC, 1998; POYNARD ei ai., 1997; KOFF & DI ENSTANG ei ai., 1995; VENTO el aI., incrementar parece Pacientes tem progressão aumentar a replicação viral ou da célula à infecção viral (VENTO a susceptibilidade ei ai., 1999). álcool, O álcool 1999). com doença hepática desencadeada mais rápida da infecção pelo hepática; entre estes os que apresentam cirrose têm alto risco de progressão para HCC (VENTO ei ai., 1999). Pacientes definida (casos esporádicos) sem causa de transmissão de infecção pelo HCV, têm alto risco de má evolução, possivelmente pela interação com fatores como a longa duração da infecção e idade mais avançada no momento da descoberta da infecção (PARANÁ ei ai., 2000). Tabela 1. Distribuição pacientes etária (n anti-HCV = do número, percentual por faixas e média de com HCV-RNA detectáveis segundo a faixa 76). N° de Faixas etárias pacientes Percentual por pacientes faixas faixas O - 35 4 5,26% 36 - 70 72 94,74% Total 76 100% A prevalência do n° por mundial de HCV é de 0,2% a 2% em doadores de sangue, e de 80% em usuários de drogas intravenosas. Uma RESULTADOS E DISCUSSAO 34 de casos de HCV é devida à transmissão grande porcentagem transfusão e outros agulhas, meios exposição Entretanto, ocupacional metade desconhecida doadores de compartilhamento a das infecções sangue e de hemodiálise. por HCV possui transmissão (AL TER et aI., 1999; PARANÁ et aI., 2000). PATINO-SARCINELI prevalência parenterais por et e os fatores de sangue soro positividade aI. (1994), estudaram de risco para os anticorpos voluntários no Brasil, estava fortemente etnia não-branca quando a anti-HVC observaram em que a associada ao sexo masculino, à e a idades mais avançadas, o que provavelmente reflete um longo tempo de exposição à infecção e baixas condições socioeconômicas. negativos A obtenção, em 38 amostras pelos autores, (60,3%) e de resultado em dez amostras (15,8%) que apresentaram nos testes de triagem, quando analisadas RIBA ocorrência li, sugerem comprovando a a necessidade em todas as amostras testes sorológicos 5.2 Isolamento de que apresentarem extrações de testes confirmatórios resultado do amostras HCV-RNA para não anti-HCV várias hipóteses, se era RNA é 4°C. a 4°C. mas funcionando Por foram microtubos Vários foi este recomendada fato, realizadas a testes detectada positivas. nos 8.000 foram a xg, inicialmente, utilizando dentro realizados para as uma de com um esse presença de HCV-RNA nas Para este fato, foram consideradas como, se a amostra estava em boas condições, HCV-RNA transcrição reagente de RNA viral microcentrifuga artificio, falso-positivos, de triagem. de refrigerador indeterminado pelo teste confirmatório resultados da realização resultados valores baixos de DO Segundo o protocolo TRlzol a temperatura o isolamento de reversa, positivo, a metodologia empregada para a PCR do cDNA e se a PCR aninhada estava corretamente. RESUL TADOS E D/SCUSSAO 35 Diante dos resultados, o isolamento Eppendorf isopor de sequenciamento. HCV-RNA dimensões às foi possivel de 4°C. Outros testes de placas placas de a detecção do foram realizados de 3°C e 2°C, respectivamente. Melhores foram obtidos a 2°C. Técnicas HCV-RNA, de biologia molecular, para embora menos acessíveis, fundamental subtipos para em uma centrifuga semelhantes Com essas alterações com as temperaturas de tentativas (modelo 5810R) com a utilização à temperatura resultados nas primeiras de RNA, foram feitas adaptações refrigerada de obtidos virais importância e se para tornaram detecção complexas dos para são tipos (CONTE, 2000). Da mesma maneira, a necessidade isolamento de RNA não-degradado de moléculas SAMBROOK, de cDNA (ERLlCH & do para a construção GREENBERG, 1994; 1989). O protocolo adaptado do TRlzol LS Reagent o isolamento centrlfuga e confirmação diagnóstica é essencial do e onerosas, a ídentificação necessárias direta do RNA viral, refrigerada portanto, recomenda o protocolo para a utilização com rotação de 12.000 xg. Entretanto, a rotação máxima da centrífuga xg, adaptou-se foi eficiente da como utilizada neste trabalho é de 4.000 aumentando em 3 vezes o tempo de centrifugação. Os resultados de 28 amostras negativos analisadas e/ou a persistência de HCV-RNA no plasma sangüfneo podem ser devido à baixa carga viral do vlrus em outros sítios de replicação, medula óssea, células mononucleares se considerar também sorológica Hepatíte resultar aI., da apresentado E possivel, reagentes C exibem em falso-positivos 1997). alta empregados Deve- na triagem sensibilidade, podendo (SCHMIDT et aI., 1997; ZEHENDER também, que estas amostras et tenham um número de cópias inferior a 1.000 cópias virais por mL, número necessário 2003). que do sangue periférico. como para a detecção por RT-PCR (DAVIS et aI, RESULTADOS E DISCUSSAO 36 5.3 RT-PCR A transcriçllo de plasma reversa foi realizada em RNA total proveniente sangüíneo oligonucleotídeos sido observada de pacientes desenhados portadores a partir alta especificidade de da regillo HCV, com 5' NCR, tendo para a regillo do genoma vira!. A temperatura de incubaçllo uma inativaçllo da enzima a ggoC por 5 minutos e 5 minutos a 5°C, foram eficientes de 37°C por 50 minutos, seguida de para a produçllo de cDNA a partir de RNA. A PCR, realizada logo após o término da transcriçllo foi eficiente diagnóstico foi para amplificaçllo da infecçllo possível 2%, seguido detectar, do cDNA, através da eletroforese da visualizaçllo o em gel de agarose por UV, fragmentos de bandas de 325pb. Vinte e oito amostras tíveram resultados primeira PCR quanto técnicas de PCR utilizadas na PCR aninhada, apresentaram negativos, tanto na demonstrando que as alta especificidade e para a detecção da presença do vírus da hepatite C. A PCR pôde detectar infectados possibilitando pelo vírus da Hepatite C. Por essa técnica DNA de aproximadamente sensibilidade reversa, o RNA no soro sangüineo de pacientes em apenas 1 ou 2 semanas após a exposição ao vírus (Figura 6). Vinte e oito amostras foram negativas o cDNA como molde para a reaçllo. novamente isolados reaçôes de transcriçllo e a partír para a PCR utilizando Essas tiveram deles foram seus RNAs efetuadas novas reversa e de PCR para a confirmaçllo dos resultados. De acordo com vezes negativa, sorológico Taya o resultado deve ser repetido, antí-HCV falso-positivo. et aI. (2001), deve ser se a PCR for por duas questionado e o teste pois pode se tratar um resultado de RESULTADOS E DISCUSSAO 37 Com o objetivo de dar maior segurança aos resultados amostras HCV-RNA positivas foram realizadas das duas amplificações para cada amostra. Além disso, para cada reação de transcrição reversa, PCR e PCR aninhada foi utilizado um controle positivo (amostra de HCV-RNA positiva) e um controle negativo (sem a fita molde), visando indicar a presença de contaminação das reações com cO NA exógeno. 5.4 peR Aninhada Com o objetivo de melhorar a sensibilidade, e a eficiência submetido da reação, o produto a uma nova amplificação oligonucleotídeos de coNA utilizando capazes de amplificar produto de cO NA de 260pb utilizando a especificidade amplificado foi um conjunto de um fragmento interno do como molde o segmento de 325pb. Vários testes foram realizados em consideração temperatura para PCR aninhada de pareamento levando e quantidade de produto de PCR. Após eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio da RT-PCR, foi possível visualizar fragmentos de bandas de aproximadamente mostra fragmentos aninhada, em transiluminador de aproximadamente de três amostras para fins comparativos, 325 pb. A Figura 7 260pb, de diferentes UV obtidos indivíduos, da PCR utilizando um marcador de peso molecular de 100pb, além de um controle negativo para a reação. A região 5' NCR do genoma do HCV tem sido a mais utilizada nas reações de PCR aninhado. utilizado na metodologia aI. (1996). O conjunto de oligonucleotídeos foi obtido através do trabalho de KRUG et RESULTADOS E DISCUSSAO 38 260pb Figura 7. Perfil eletroforético de três amostras HCV-RNA positivas em gel de agarose 2% corado com brometo de etídio dos produtos da PCR aninhada do vfrus da hepatite C. M=marcador 100pb; 1 a 3=HCV positivo (banda de aproximadamente A PCR aninhada Acredita-se diminuir 260pb). tem sido recomendada que ela melhora a sensibilidade os altos custos com a utilização por várias razOes. do teste. Além de de sondas radioativas, também reduz o tempo de reação e elimina o risco potencial biologista molecular (ASlANZADEH na utilização de materiais do radioativos el a/., 2000). 5.5 Genotipagem do HCV Resultados obtidos neste estudo mostraram a ocorrência de 2 genótipos analisadas, no Estado de Alagoas: 1 e 3. De 76 amostras 62/76 foram reativas para o genótipo 1 (81,6%), 13/76 genótipo 3 (17,1%),1/76 (1,3%) 1a/3a infecção mista. Não foram encontradas amostras do genótipo 2 (Figura 8). RtESUL TADOS tE DISCussAO 39 1.3% .HCV 1 HCV3 oHCV 1ai3a Figura 8. Distribuição digestão da freqüência de genótipos dupla com as endonucleases Hinfl-BstOI do HCV após de restrição Haelll-Rsal e entre os casos HCV-RNA positivos (n=76). Neste estudo, os resultados obtidos demonstraram que o genótipo 1 é o mais prevalente no Estado de Alagoas. Além disso, o estudo revelou estudos com realizados uma verificado detectados baixa no Na figura Bstl/Hinfl. em diferentes ocorrência também particularmente obtidos alto Indice do genótipo foi a Nordeste do regiões do pais, em contraste genótipo inexistência do 1 em relação a outros Brasil, 3. de como Fato importante outros genótipos o genótipo 2, em Salvador. 9 está destacado após digestão o perfil dos genótipos dupla com as endonucleases de HCV de restrição RESUL TADOS E DISCUSSÃO 40 ----~ - 100pb--. Figura 9. Padrões de restrição dos produtos da amplificação PCR da região 5"UTR do HCV obtidos endonucleases de restrição após digestão Bstl/Hinfl. dupla com Eletroforese em MetaPhor 4% com tampão de corrida TAE 1X. M=marcador 1 e 2=genótipo 1( bandas de pb); e 3 a 8=genótipo 53pb); 9=controle aproximadamente RT- gel 100pb; 94, 63, 53 e 41 3 (bandas de aproximadamente 140, 57 3 negativo. YOSHIDA et ai. (1999) estudaram 59 pacientes com hepatite C crônica prevalência na cidade do Rio de Janeiro, de 85,7% para o genótipo os valores percentuais encontrado encontrando uma 1. Neste estudo preliminar nos portadores de HCV do HU e LACEN estão de acordo com esse estudo. De acordo com KRUG et ai. (1996) o genótipo mais freqüente no Sul do Brasil é o genótipo um indice estudos mais baixo realizados pode ser em relação 3. Esta diferença, segundo Sudeste analisaram (pacientes hemofílicos com grupos Al Ts e um KRUG et ai. epidemiológicos alteradas a outros também, devida ao fato de que os trabalhos na região doença do figado). para esse genótipo no pais. Os autores detectaram, alto Indice do genótipo (1996), 1, apesar deste estudo ter revelado realizados restritos pacientes com RESULTADOS E DISCUSSÃO 41 MARTINELLE et ai. (2000). analisaram 90 pacientes gerados do Estado a partir endonucleases de São Paulo da região de restrição mapas coerentes por RFLPs. 5'NCR após digestão Amplicons dupla com as e Bstl/Hinfl Haelll/Rsal aos genótipos baixo, o genótipo 5. plasma sangüineo de produziram 1, 2 e em um percentual muito Este último, geralmente encontrado na África do Sul, Egito e sudeste asiático. OLIVEIRA distribuição ai. (1999) investigaram os padrões de dos genótipos do HCV, estudando 250 pacientes anti- HCV positivos, encontraram et através da detecção HCV-RNA pelo RT-PCR e prevalência de 72% para o HCV 1, 25,3% para o tipo 3, 2% para o 2 e 0,7% para o 4, semelhantes aos genótipos de várias regiões mundiais. 5.6 Subtipagem do HCV O subtipo 1b foi o mais freqüente dentre o genótipo 1 com um percentual de 83,8% (52/62), o subtipo 1a apresentou um Indice de 11,3% (7/62) e 4,8% (3/62) do genótipo 1 que não foram tipados (Figura 10). 4.8% 11.3% .HCV 1a .HCV 1b O Indeterminados 83.9% Figura 10. Distribuição da freqüência de subtipos do genótipo 1 em amostras de HCV-RNA positivos após digestão simples com a endonuclease de restrição BstUI (n=62). RESUL TADOS E DISCUSSÃO 42 Com relação ao genótipo 3. o subtipo 3a teve um percentual de 53.8% (7/13). Devido a especificidade dos oligonucleoUdeos ao subtipo 3a, o restante das amostras 46,2% (6/13) do genótipo 3 ainda não foi identificada. É posslvel que pertençam a outros subtipos do genótipo 3 (Figura 11). 46,2% Figura 11. Distribuição da freqOência de subtipos do genótipo 3 em amostras de HCV-RNA positivas após digestão simples com a enzimas de restrição ScrFI (n=13). Os resultados encontrados neste estudo. associados ao alto indice de pacientes com o subtipo 1b e 1a e 3a em Alagoas, significam uma perspectiva preocupante em relação ao prognóstico clinico e ao tratamento dos pacientes portadores destes genótipos (Figura 12). RESUL TADOS E DISCUSSÃO 43 209 42 Figura 12. Padrões de restrição dos produtos da amplificação PCR da região 5'NCR do HCV de diferentes após digestão simples com endonucleases e Bstl (7-10) , Eletroforese indivlduos RT- obtidos de restrição ScrFI (1-6) em gel MetaPhor 4% com tampão de corrida TAE 1X. M=Marcador de 100pb. Segundo ZEIN (2000), o subtipo todos os genótipos ao tratamento e o que apresenta com Interferon. 1b é o mais agressivo de baixa resposta sustentada Os genótipos 2 e 3 respondem melhor ao tratamento com o antiviral. Vários resultados estudos têm demonstrado terapêuticos e a seqüência uma correlação entre os de um aminoácido de uma pequena região da protelna não estrutural 5A (NS5A) do HCV. Isto tem sugerido que essa sensibilidade pela expressa a região determinante ao IFN (ISDR), podendo mediar a resistência interação direta associadas com (WEBSTER et ai" estudo região indicaram a com uma resposta 2000). Os ou duas virológica resultados protelnas sustentada encontrados da ao IFN celulares ao IFN neste que os subtipos 1b de HCV são importantes na . BEW.LIADQ~E. DISCUSSÃO 44 determinação do tempo resposta que o individuo de tratamento apresentará índice encontrado de pacientes se levarmos em consideração portadores no nosso trabalho, do subtipo encontrados 1b do HCV. no Estado de Alagoas. LUNGE et aI. (1999), encontraram para os genótipos da a esse tratamento. Esses dados são preocupantes o alto e conseqüentemente., padrões de bandas tfpicas 1 (1a e 1b). 2 e 3. Os mesmos genótipos foram nas regiões Sul e Sudeste do Brasil por KRUG et ai. (1999), OLIVEIRA et ai. (1999) e BASSIT et ai. (1999). mista foi verificada em 8 amostras, 6 no Norte e 2 no Nordeste. Um padrão não descrito para um genótipo como indeterminado. foi encontrado No estudo foi determinada Infecção e definido a prevalência dos subtipos 1a e 1b. O subtipo 1b foi o mais prevalente 60% na região Norte e 71 % na região Nordeste (KRUG et aI., 1999). BARBARO et ai. (1999) verificaram com genótipos 1b ultraestruturais podendo Sendo freqüentemente das mitocôndrias comprometer assim, pacientes evolução a o com genótipos apresentavam depleção de fosforilização aumentada 1b poderia da doença hepática, aumentando Nesses pacientes, de com este fato, desenvolvidas hepático. livres nos citopático resistência terapêuticas à na do aumento ação dos A ser confirmado poderão vir a ser no combate a essa doença. fator da infecção de risco A persistência descontrolada o efeito da doença hepática. estratégias A persistência importante radicais mtDNA, oxidativa. haveria, portanto, conseqüente e pior evolução novas de do atuar de modo negativo vírus C da hepatite. interferons alterações com processo produção hiperoxidação, que os pacientes de HCV a fatores pelo vírus da para o desenvolvimento da infecção que à proliferação celular, transcrição Stat acúmulo cujo associado ao desenvolvimento levaria regulam associados 3, hepatite a transcrição de HCC. forma é um de câncer a urna exposição como é o caso na C de genes do fator fosforilada de está Rt=SlJtl'Jl:DO$E DISCl:JSSAO 45 No Brasil, realizados. poucos BASSlT doadores de estudos de genotipagem SAÉS-ALQUÉSAR & de HCV foram (1999) estudaram sangue na cidade de São Paulo utilizando de L1PA, obtendo como resultado as prevalências 54 a técnica de 59% para o genótipo 1, 6% para o genótipo 2 e 35% para o genótipo 3. De acordo com KRUG et ai. (1996) a incidência no Brasil é provave'lmente estabeleçam a principalmente poucos real baixa, nas regiões dados publicados. à falta de estudos que devido prevalência dos do Nordeste genótipos e Norte, Entretanto, obtidos para Alagoas neste trabalho, do genótipo 1 segundo a suposição no país, onde existem os resultados dos autores não reflete a realidade encontrada no Estado. PARANÁ et aI. (2000), detectaram o subtipo 1a em 75 pacientes (32%), 1b em 72 (31%), 3a em 61 (26%), 2a em 14 (6%), 5 (2,5%) tinham indeterminado. genótipo 1 apresentavam pelo genótipo reportado Salvador e 5 (2,5%) associado amplamente 3. Nesta população nos estudos seja europeus. composta nenhum genótipo epidemiologia o genótipo estudo ao que foi negra de ou miscigenada, o que pode significar nesta região via imigração algumas peculiaridades do vírus da hepatite C no Brasil e fortemente nessa O 3 não parece estar Embora 80% da população foi identificado, demonstra específiCo. em contraste por população africano que sua introdução com no nordeste do Brasil, seguido que o vírus da hepatite C foi introduzido Este o genótipo que pacientes a um genótipo ao uso de drogas venosas, européia. tiveram média de idade mais alta e nenhum fator esteve 1 predominou relacionado mista Os autores também observaram de risco peculiar genótipo infecção região esteve relacionada da sugere à imigração européia e não à africana. O nosso estudo não está de acordo com o trabalho de PARANÁ ei aI. (2000), pois encontramos percentuais, um número 8 vezes comparação com o subtipo 1a. maior em termos para o subtipo 1b em RESULTADOS E DISCUSSÃO 46 Estudos associam o subtipo 1b com evolução mais freqüente para cirrose e hepatocarcinoma que não são confirmados quando afastados elementos como idade, duração da infecção ou forma de aquisição do pacientes mais pacientes com doença demonstram HCV, ou seja, idosos, o com muito adquirida que a distribuição semelhante em genótipo pacientes 1b associava-se tempo de infecção ou nos por via transfusional. dos diferentes com com Estudos genótipos pode ser séricas normais, enzimas comparada àqueles com enzimas aumentadas. Est.e,strabalhos têm resultados concordantes de SILlNI e FRETZ (1999) que demonstraram com os estudos alta prevalência do tipo 1 em amostras de pacientes com hepatite causada pelo vírus C. Três genótipo neste amostras identificadas 3 não puderam trabalho. capacidade genótipo A de e comumente subtipo do HCV, podemos são denominadas devido à replicação constantes, provável imperfeita mutações. ter 1 e seis do gen6tipo ser subtipadas hipótese mutação como pelo método para pois este dentro variações de quasisespecies. fato utilizado está na de um mesmo do vírus, que Estas ocorrem do HCV, através de pequenas, mas Pela técnica de RFLPs restrição reconhecem seqüências de 4 a 6 as enzimas nucleotídeos de e se por acaso ocorrer uma pequena mutação em algum sítio de restrição, então a enzima não reconhece o sítio e deixa de clivar nesta região de seqüência específica. Os mecanismos pelo subtipo responsáveis 1b não foram existência de quasiespecies ainda pela persistência elucidados. da infecção Parece que a e a grande capacidade mutagênica do vírus propiciam o constante escape à intensa resposta imunológica desenvolvida pelo hospedeiro. A documentação e análises de dados obtidos dos ensaios de amplificação e digestão subseqüente identificação dos cONA do HCV, conduziram a uma preliminar dos genótipos circulantes em ~ESULTADOS E D/SCUSSAO 47 Alagoas. Em adição, variabilidade geração virais pela avaliação da genética da população do HCV também resultarão na de dados estatísticos considerados contribuirá objetivo as informações referentes resistentes ao para o desenvolvimento um controle obtidas à ocorrência interferon dos tipos peguilado. Isso de mecanismos que têm como epidemiológico mais eficiente e, conseqüentemente, em subáreas geográficas específicas, para a redução da mortalidade entre homens e mulheres potencialmente candidatos à cirrose hepática e ao HCC. As Portarias GM/MS SAS/MS nO 17, de 22 de janeiro n° 1.464, antivirais de 22 de dezembro Interferon Informações e Ribavirina Ambulatoriais considerando a genotipagem para na do Sistema necessidade da a determinação causador da hepatite, de 1999, Tabela de 1997 e incluíram os Sistema de do Único de Saúde SIA/SUS, realização do o que estabelece tipo do exame genético do de vírus o esquema terapêutico a ser utilizado no tratamento desta doença. Em junho de 2000 o Ministro de Estado da Saúde, sanciona a Portaria N" 639 Terapêuticas da hepatite e a gravidade necessidade tecnicamente indicações mecanismos o Protocolo viral crônica Clínico de diagnóstico a prescrição e de seus tipo de sua evolução de custear o tratamento contém critérios .J aprova e Diretrízes da Hepatite Vira! Crônica Tipo C (HCV), considerando a prevalência brasileira que esquemas acompanhamento clínica da infecção. e tratamento, médica. C na Além uso e diante de ética e regulamentar e de da Esse protocolo observando terapêuticos de população e as estabeleça avaliação de resultados, garantindo assim a prescrição segura e eficaz. O ponto importante na Portaria tratamento da infecção de acordo com o genótipo do portador do N° 639 é o estabelecimento do tempo do HCV. Para o pacientes com genótipo 1 e para os demais genótipos tratamento de 12 meses e 6 meses respectivamente, única dose semanal de Interferon. com uma RESUt1'AOOS E D/SCUSSAO 48 Em 2003, a Portaria 1.407 tornou obrigatória a incorporação da técnica de NAT (Teste sorológica dos doadores imunodeficiência de adquirida) transmissão desses vírus. de Ácidos sangue Nucléicos), para e HCV, visando o na triagem HIV (vírus reduzir da o risco de CONCLUSÓES 49 6. Conclusões • A metodologia empregada neste estudo foi eficiente para a extração de RNA, detecção genotipagem • do HCV-RNA em soro de portadores anti-HCV Universitário do Laboratório • e subtipagem de HCV. A positividade anticorpo do HCV-RNA, bem como para a selecionados da Universidade Hospital do Dia do Hospital Federal de Alagoas (UFAL) e Central de Alagoas (LACEN) foi de 73,1%. Entre as amostras RNA-HCV positivas, mais prevalente, o genótipo 1 foi o seguido pelo tipo 3. • O subtipo 1b foi mais freqüente que o 1a. • Não foi detectado o genótipo 2 nas amostras analisadas. • A prevalência do subtipo 1b em Alagoas é maior do que tem sido descrito para a Bahia, Sudeste e Sul do país. PERSPECTIVAS 50 7. Perspectivas 7.1 Sequenciamento Automático Oligonucleotídeos região de HCV específicos para a amplificação 5'NCR (260 pb) de diferentes parcial da HCV serão utilizados. Os produtos de PCR serão purificados utilizando o kit Wizard™ Preps DNA purification (Promega Corp., Madison, WI). As sequências do cDNA viral serão determinadas através de um sequenciador automático de DNA MegaBace 1000 do Laboratório de Genética Molecular, Genômica e Proteômica - GEMPRO/CECA da Universidade Federal de Alagoas -UFAL. 7.2 Diagnóstico Eletrônico das Seqüências de HCV As seqüências geradas dos diferentes HCV serão submetidas ao banco de dados de domínio público, o NCBI (National Center for Biotechnology - www. ncbi.nlm.nih.gov/), utilizando o algoritmo heurístico BLAST que busca alinhamentos ótimos. Tal procedimento irá permitir a identificação precisa dos genótipos e subtipos desconhecidos de HCV das amostras seqüenciadas. 7.3 Análise filogenética dos genótipos de HCV Árvores parsimônicas serão construidas a partir da comparação de sequências homólogas alinhadas do cDNA dos diferentes tipos de HCV, utilizando-se o programa PAUP 3.1.1. (SWOFFORD, 1993), do Sistema Apple Mclntosh. Os valores de bootstrap, o suporte interno de cada ramo, serão computados com 500 replicações. A polaridade 'i dos caracteres (outgroups) será determinada serão produzidos MEGA 1.01 (KUMAR similaridade (distância árvores fenéticas genética) enquanto será o de Kimura's em grupos irmãos mediante utilização de determinar entre as seqüências utilizando que comparadas. a As os métodos UPGMA e o modelo two-parameter do programa de distância a ser (LI & GRAUR, 1991). O será efetuado com 500 replicações. A partir da análise filogenética relação genética entre os genótipos genótipos baseada et aI., 1993) com o objetivo serão construídas NJ (neighbor-joining), bootstrap 51 designados. Fenogramas utilizado PERSPECTIVAS t e subtipos agrupamentos gerados. novos será possivel estabelecer a de HCV, como também identificar ou indeterminados, de acordo com os REFERt=NCIAS BIBLlOGRAFICAS 52 8.. Re.fe.rência.s.Bibl.iog.ráfic.as. ALMEIDA, R.w ..; RIBEIRO, M.O.; CARVAlHEIRA, P.C.; ANDRADE, E.F.; CORREIA, E.M.; SOUZA, S.C.; LEITE, F.M.S.; NOVAES, L.T.; TEIXEIRA, M.H.; FELLOWS, I.B.; Genotipagem a do vfrus da comparação determinação MORTENSEN, C.; COBO, E. hepatite C: o sequenciamento direto e com seqüências do genótipo padrão e como do ( www.newslab.com.br/genotipagem.htm). método subtipo. para Newslab. Acesso em 15 de janeiro 2002. ALTER, Clinicai M.J. The epidemiology of acute and chronic hepatitis C. liver Diseases, v. 1, p. 559-568. 1999. ASLANZADEH, J.; PADILLA, B.B.; SHANLEY, J.D. Evaluation of PCR and nested PCR for laboratory diagnosis of hepatitis C virus infection. Molecular and Cellular Probes, v. 10, p. 173-178. 2000. BARBARO, BELLONI, G; G. Hepatocellular hepatitis Journal DI LORENZO, GRISORIO, mitochondrial C: ultrastructural Gastroenterology, G.; B; ASTI, A..; RIBERSANI, FILlCE, alterations G; BARBARINI, in patients andbiochemical P.P.; Carcinogênese carcinoma DE viral: G. with chtónic findings. American v. 94, p. 2198-2205. 1999. BARCELLOS, C.S.; ALMEIDA, F., ABREU, LAS.; VALEIRO, M.; BRITO, Relação P.H.T.; do vfrus hepatocelular. da BRAGA, M.A; FERREIRA, hepatite Disponfvel http://www.medstudents.com.br/original/revislio/hcv/hcv.htm Acesso em 01 de novembro de 2002. R.P. C com o em . REFER~NCIAS BIBLlOGRAFICAS 53 BARRY, T; POWELL, R.; GANNON, F. A general method generate ONA probes for microorganisms. BioTechnology, to v. 8, p. 223-236. 1990. BASSIT, L.; RIBEIRO-DOS-SANTOS, K.; VILLACA, P.; DAVID-NETO, G.; DA SILVA, L.C: TAKEI, E.; ALQUEZAR, A. Genotype distributions CHAMONE, O.; SAEZ- of hepatitis C vlrus in São Paulo, Brazil: rare subtype found. Hepatology, v. 29, p. 994-995 (Letter). 1999. BASSIT, L.; SÁEZ-ALQUÉZAR, A.; DA SILVA, L.C. Chronic hepatitis C virus infections in brazilian patients: association genotypes, clinicai with parameters and response to long term alpha interferon therapy. Revista Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v..41, n. 3,. p. 183-189. 1999. BOOUR, S. hepatitis C virus infection in Jordanian haemodialysis units: serological Microbiology, BELO. M.; Evaluation qualitative diagnosis and genotyning. Medicai of v. 51, p. 700-704. 2002. HABIBUW. of M.R.; automated REBERS, S.P.; RNA-extration REESINK, technology H.W. and a HCV assay for sensitivity and detection of HCV RNA in pool-screening systems. Transfusion, BJ0RO Journal v. 40, p. 575-579. 2000. K, BELL H, MYRVANG B, RAKNERUO N, SANDVEI P, ST0RSETH S,RITLANO S, lUNO-T0NNESEN HELLUM KB. Effect of Interferon-a S, BUCHER A, induction therapy on genotype 2b/3a and low viral load hepatite C virus infection: a randomized multicentre study. Scandinavian 37, n. 3, p..344-349. 200.2. Journal of Gastroenterology, v. REFER~NCIAS BIBLlOGRAFICAS 54 BRANDÃO, MAB.; FUCHS, S.C.; SILVA, M.A.A.; EMER, L.F. Diagnóstico da hepatite C na prática médica: revisão da literatura. Revista Panamericana Salud Publica, v. 9, n. 3, p. 161-168. 2001. BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria n° 639 de 05 de fevereiro de 2002. institui, no âmbito do SUS, o Programa Nacional para a Prevenção e o Controle das Hepatites Virais. União de 05 de fevereiro de Diário 2002; Oficiai Disponível http://www.anvisa.gov.brllegis/portarias/63902.htm da em: . Acesso em 15 de janeiro de 2003. BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria n° 1376 de 19 de novembro de 1993. Aprova alterações na Portaria 72l1GM de 09 de agosto de 1989, que aprova Normas Técnicas para coleta, processamento transfusões de sangue, componentes e derivados. da de União 02 de dezembro de 1993; Diário Oficial Disponivel http://www.anvisa.gov.brllegis/portarias/1376-93.pdf e . Acesso em: em 15 d.ejaneiro de 2003. BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria n° 1407 de 01 de agosto de2002. Diário Oficial da União de 02 de agosto de 2002, seção I, p.26. BRASIL. Ministério da Saúde. Portaria n° 1461 de 22 de dezembro de 1999. Diário Oficial da União de 23 de dezembro de 1999, seção I, p. 34. BREVIDELLI, M. M.; CIANCIARULLO, T. L Aplicação do modelo de crenças em saúde Application occupational of the na prevenção health needlestick 35, n. 2. 2001. belief injuries. dos model Revista acidentes to the com agulha. prevention of de Saúde Pública, v. REFERt=NCIAS BIBLJOGRAFICAS 55 BU5EK, 5.; OLIVEIRA, G. Molecular epidemiology of the hepatitis C vírus in Brazi/. Genetics and Molecular Research, v. 2, n. 1, p. 117-123.2003. COCHRANE, A.; 5EARLE, B.; HARDIE, A.; DELAHOOKE, T.; CAMERON, S.; ROBERTSON, R.. ; TEDDER, R.5.; DUSHEIKO, G. M.; DE LAMBALLERIE, X.; 5IMMOND5, P. A Genetic Analysis of Hepatitis C Virus Transmission The Journal of Infectious COLOMBO M. Hepatitis Bailliere's Clinicai between Injection Drug Users. Diseases v. 186, p.1212-1221. 2002. C vírus and hepatocellular Gastroenterology, carcinoma. v. 13, n. 4, p. 519-528. 1999. CHAN M. Treatment children. Bailliere's Gastroenterology,v. CHOMCZYN5KI, isolation by of chronic Best hepatitis Practice and C vírus Research ínfection in in Clinicai 14, n. 2, p. 341-350. 2000. P.; acid extraction. Analytical 5ACCHI, N. 5ingle-step guanidinium Biochemistry, method of RNA thiocyanate-phenol-chloroform v. 162, p. 156-159. 1987. CONTE, P.V. Hepatite crônica por vírus C. Parte 1. Considerações gerais. Arquives COOPER, 5.; Gastroente.rology, ERICK50N, A.L., v. 37, n. 3, p. 187-194.2000. ADAM5, E.J. Analysís of a successful immune response against hepatitis C virus. Immunity, v. 10, p. 439-449. 1999. CHOO, Q-L.; KUO, G.; WEINER, A.J.; OVERBY, L.R.; BRADLEY, D.W.; HOUGTON, M. Isolation of cDNA clone derived from a bloodborne non-A, non-B viral hepatitis. 359-369. 1989. Science, v. 244, n. 4902, p. REFER~NCIAS BIBLlOGRAFfCAS 56 oAVIDSON, F.; SIMMONoS, P..; FERGUSON. J.C., JARVIS, LM.; DOW,B.C.; FOLLETT,E.A.C.; SEED, C.R.G.; KRUSIUS, T.; UN, C.; MEoGYESI, G.A.;KIYOKAWA. H.;OUM, G.; OURAISAMY, G.; CUYPERS, T.; SAEED. AA .• TEO, O.; CONRADlE•.J.; KEW, M.C.; UN, M.; NUCHAPRAYOON, C.; NDIMBIE, O.K.; YAP, P.L Survey of major genotypesand subtypes ofhepatitis sequences amplífied from the 5' C virus using RFLP of noncoding region. Joutnal of General Virology, v. 76, p. 1197-1204. 1995. OAVIS.G.L Hepatítís C. in: MAODREY, W.C.;Diseases SCHIFF, E.R.; of the Uver. SORRELL. M.F.; 8th ed.eds. Schiff's Philadelphia: Uppincott-Raven Publishers, p. 793-836. 1999. ERUCH, G..O.; GREENBERG, S.J. infections disease. Boston: Blaekwell PCR-based Seientie diagnostics in Publicátions, p. 25-27. 1994. FANG, S-H; CHIANG B-L; WU, M-H; IBA, H; LAI. M-Y.; YANG. PM; CHEN, O-S; HWANG, L-H. Functional Measurement of Hepatltis C Virus Core-Specific C08+ T-CellResponses in the LivéfS or Pefipheral Blood of Patients by Using Autologous Peripheral Blood Mononuclear Cells as Targets or Stimulators. Journal Mlerobfology, of Clinicai v. 39, n. 11, p. 3895-3901. 2001. FElIPPE-JUNIOR, J.; TORRES, N.A. Hepatite C: Estratégia bio- oxidatíva. Disponível http://www.medieinacomplementar.com!br/a .shtm. Acesso em: 30/05/2003. em: rtiaol'evisaofozonio REFERt=NCIAS BIBLlOGRAFICAS 57 FONSECA, A.S.K.; LUNGER, V.R.; IKUTA, N.; CHEINQUES, H. Prevalência de genótipos do vlrus da Hepatite C no Estado do Rio Grande do Sul. Newslab doenças infecciosas 1998; v. 27, e auto-imunes. p. 62-64. Principais Rio de Janeiro: Guanabãta Koogan, p.37-49. 1998. FREEMAN, W.M. Biotechniques, FURIONE M., SIMONCINI L, v. 26, p. 112-125. 1999. GATTI M., FAUSTO B., REVELLO M. G., GERNA G. HCV genotyping by three methods; analysis of discordant Vitology, results based on sequencing. Journal of Clinicai v. 13, p. 121-130. 1999. GERLACH, J.T.; DIEPOLDER, H.M.; JUNG, M.C. Recurrence of hepatitis C virus after Joss of virus-specific CD4(+) T-cell têspoilse in acote hepatttis C. Gastroenterology, KREKULOVA, L.; L.W. v. 117, p.933-941. 1999. REHAR, V.; WAKIL, A.E.; HARRIS, E.; RILEY, Nésted restrictionsite-specific PCR to detect and type hepatitis C virus (HCV): a rapid method to distinguish HCV subtype 1b ftom other genotypes. Journal of Clinicai Microbiology, v. 39, n. 5, p. 1774-1780.2001. KRUG, L.P.; CHEIQUER, LUNGE, L.S.; V.R.; OZAKI, IKUTA, BARROS, A.S.; S.G. FONSECA, Hepatitis C H.; virus genotypes in Southern Brazil. Brazilian Journal Medicine BiolOly, V. 29, p. 1229-1232. 1996. LAYDEN, J.E.; LAYDEN, T. J. Viral kinetics of Hepatitis C: new insights and remaining limitations. Hepatology, 970.2002. V. 35, n. 4, p. 967- REFE~NCIAS BIBLIOGRÁFICAS 58 LECHNER, F.; WONG, D.K.; DUNBAR. P.R. Analysis of successful immune responses Journal Experimental in persons infected with hépatitis C vitus. of Medicine, v. 191, p. 1499-1512.2000. LEWIN. B. Genes VII. Oxford Unive.rsity Press, New Yôtk, USA, p. 1272.2000. LUNGE, V.R.; IKUTA, N.; FONSECA, A.S.; KRUG, L.P.; CHEIQUER, L.S.; OZAKI, BARROS, S.G. Prevalence of hepatitis C vitus genotypes in north and northeast regions trom Brazil. Editado em XX wordl Congress ofPathology and Laboratory Mediclne, p. 81-86.1999. MARTINELLl, A.C.; BROWN, D.; MORRIS, A. et aI. Quantificação dó RNA-HCV no fígado de pacientes Arquives Gastroenterolory, com hepatite C crônica. vol.37, n. 4, p.203-207. 2000. McHUTCHISON, J.G; GORDON, S.C; SCHIFF, E.R.; SHIFFMAN, M.I..; I..EE, W.M.; RUSTGI, V.K. at aI. Interferon alfa-2b ãlóneor in cômbination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. Hepatitis Interventional Therapy Group. New England JoUrnal Medicine, v. 339, n. 21 p.1485-1492. McOMISH, F.; YAP, P.LB.C.; A..J.; KELLER, 1998. DOW, E.A.C.; FOLLETT. C.; SEED, T.J.; COBAIN, T.; KRUSIUS, E.; KOLHO, R.; NAUKKARINEN, C.; MORADPOUR, D.; CERNY, A.; HEIM, M.H.; BLUM, H.E. Hepatitis C: an update. Swlss Medicai Weekly, v. 131, p. 291-298. 2001. REFER&JcIAS.BIBUOGRÁFICAS 59 MURASHIMA, S.; IDE, T.; M~YAJ~MA,L; KUMASHIRO, R.; UENO. L;SAK1SAKA, S.; SATA, M. Mutationsin responsetointerferon hepatitis the NS5A geneprediet therapy in japanese pacients with chronic C and eirrh.osis. Scandinavlan Journal of Infectious Oiseases, v. 31, n. 1, p. 21-32. 1999. OLIVEIRA, M.l.A.; BASTOS,F.I.; SCHREt.ER, E.; PAUl/, a.; SABINO, RR ... ;. PAETZOlO, U.; YOSHIOA, C.F.T. Distributionof HVC genotypes among different exposure categorJes in Brazil.Brazilian Journal of MedicaI .Biological Researcn. v.32, p. 219-282. 1999. OSElLA, A.R.; M1SCIAGNA, G.; BUONG.IO.RNO,G.; CAVALLlNl, MONOELll. M.V.; GUERRA, A. DllEO, V.; ELBA, S.; A.; SONZOGN1, L; StLlNl, E.M. Hepatitis C Virus Genotypes and Risk of Cirr.hosis.,inSOut~ernUaly. ClinJcallnfectious Diseases, v. 33, p. 70-75. 2001. PALTANIN, Lf.; REICHE, EM.V. Seroprevalence of anti.l1épatitis C virusanUbodies among bJood donors. BraziLRev.ista P6blica,v. de Saúde 36, n. 4.2002. PARANA, R.; VITVlTSKI, l.; BERBY, r.; H.P.; CAVALCANTE, A.; LYRA, L; TREPO, C. HCV infectio"n in northeastern BrazH:unexpected PORTUGAL, M.; COTR1M, high prevalence cf genotype 3a andabsen.ee .ofAfrieao genotypes..Arquives Gaslroen:terolory •. v.. 37, n. 4, p. 213-216 .1000. PATIJilO-SARClNELll, F.; HYMAN, J..; CAMACHO. LA.B.; UNHARES, O.B.; AZEVEDO, J.G. Prevalenee and riskfactors hepatitis Cantibodies Transfusion, invoh:lnteer v. 34, p. 138-141. 1994. blood donorsin for Brazil. REFER~NCIAS BIBLlOGRAFlCAS 60 PILERI P, UEMATSU Y, CAMPAGNOlt S, et ai. Binding of hepatitis C vírus to CD81. Science, v. 282, p. 938-941. 1998. POYNARD, T.; MARCELltN, P.; LEE, S.S.; NIEDERAU, C.; MINUK, G.S.; IDEO, G. Randomísed trial of interferon _2b plus ribavitín for 48 weeks or for 24 weeks versus interferon _2b plus placebOfor 48 weeks for treatment International Lancet, of chronic infection Hepatitislnterventional with Therapy hepatitis Group C. (IHlT). v. 352, n. 9128, p. 1426-1432. 1998. RUSTER, B.; sequences ZEUZEM, encoding hepatocellular S.; truncated carcinoma. Research Communications, sAEZ-ALQUÉZAR, ROTH, core W.K. Hepatitis proteins Biochemical vírus detected and in Biophyslcal A.; BASSIT, L; SABINO, E.C. Hepatites. doenças a v. 219, n. 3, p. 911-1}15.1996. FERREIRA, A.W.; AVILA, S.L.M.Diagn6stico principais C infecciosas laboratorial e auto-imunes, In: das Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; p. 37-49. 1996. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular Cloníng: A Labóratory Manual, v. 1-3. Cold Spring Harbour Laboratory, NY. 1989. SANGUINETTI, C.J.; DIAS-NETO, Silver and recovery staining polyacrylamide E.; SIMPSON, A.J.G. of PCR products gels. BioTechniques, Rapíd separeted v. 17, n. 5, p.915 on - 919. 1994. SARBAH, S.A.; YOUNUS$I,. silent epidemic. Journal 30, n. 2, p.125-143. 2000. Z.M. Hepatitis C: an update on the Gastroenterology and Hépatológy, v. REFER~NCIAS BIBLlOGRAFICAS 61 SCHMIDT, W.N.; WU, P.; HAN, J.; PERINO, MJ.; LABRECQE. D.R.; STAPLETON. J.T. Distribution of hepatitis C virus (HCV) RNA in whole blood and blood cel! factions: plasma HCV RNAanãlyses underestimates circulations virus load. Journal Infectology Diseases, v. 176, p. 20-26, 1997. SHIMAZAKI, Inhibition T.; HONDA, of internai M.; KANEKO, S.; KOBAYASHI, ribosomal entry site-directed translation K. of HCV by recombinant IFN-n' correlates with a reduced Laprotein. Hepatology, v.35. p. 199-208. 2002. SILlNI, E.; FRETZ, C. Molecular epidemiology ofhepatItiS C virus infection among intravenous drug users. Journal of Hepatology, v. 22, p. 691-695. 1999. SIMMONDS, P.; HOLMES. MCOMISH, F.; IRVINE. E.C.; CHA, T.; CHAN. S-W.; B.; BEALL, E.; YAP. P.L.; KOLBERG, J. & URDEA, M.S. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes by phy/ogenetic analysis of the NS-5 region. Journal General Virology, SLOBODA, of v. 74, p. 2391-.2399. 1993. P. Hepatite C: um mal silencioso. Disponível http://www.fiocruz.br/ccs/novidades/dez03/hepato_510.htm em . Acesso em: 05 de setembro de 2004. STRAUSS, E. Hepatite C. Revista Medicina Tropical, da Sociedade Brasileirã de v. 34 n. 1 p. 69-82. 2001. SUZIKI R.; SUZIKI T.; ISHII K.; MATSUURA, Y.; MIYAMURA, T. Processing Intêrvfrology, and Functions of hepatitis v. 42, p. 145-152. 1999. C virus proteins. REFER~NCIAS BIBLJOGRAFICAS 62 TAKAHASHI, M.; YAMADA, course chronic of Gastroenterology, TAKAKI, A.; G.; hepatitis MIYAMOTO, C. R. et aI. Natural Journal Ameriean v. 88, p. 240-243. 1995. WIESE, M.; MAERTENS, G. Cellular immUne responses persist and humoral responses decrease two decades after recovery from a single-source outbreak of hepatitis C. Natural Medicine, v. 6, p. 578-582. 2000. TOYO, C.V.; GALPERIM, S.; LARDI, G.; SANTOS, G.O.; HOCSMAN, J.; SOARES, P.R.S.; DE ALMEIDA, P.R.L. Diagnóstico diferencial das hepatites. Mom. & Perspec., Saúde - Porto Alegre, v.14-n.Y:z.2001. VALENTE, V.B. Estudo da distribuição dos marcadores sorológicos das hepatites S e C entre doadores de sangue do Hemocentro de Ribeirão Preto. 2002. VITRAL, C.L.; YOSHIDA, C.F:T.; GASPAR, A.M.C. Developments in hepatitis A and C viruses experimental human primates. The Infection infections studies in non- Diseases Review, V. 1, n. 4, p. 253 -260. 1999. WANG, Y-S; YOUNGSTER, S.; BAUSCH, J. ldentification major positional Biochémistry. isomer of Pegylated interferon of the aplha-2b. v. 39, p. 10634-10640. 2000. WESSTER, G.; BARNES, E.; BROW, D.; DUSHEIKO, G. HCV genotyes-role in pathogenesis of disease and responde to therapy. Bililliere's BestPractlce Gastroenterology, and Research v. 14, n. 2, p. 229-240. 2000. in Clinicai REFERt:NC1AS B1BLlOGRAF1CAS 63 WEILAND, O. Treatment of naIve patients with chronic hepatitis C. Journal of Hepatology, WELSH, J. arbitrarily primers. & v. 31, n. 1, p. 168-173. 1999. MCCLELLAND. J. Genomic fingerprinting using primed PCR and a matrix of pairwise combinátion Nucleic Acids Research, of v. 19, n. 19, p. 5275-5279. 1990. WILLlAMS, J.G.K.; KUBELlK, A.R.; LlVAK, K.J.; RAFALSKI, J.A. & Tlngey. DNA polymorphisms amplified useful as genetic markers. Nucleic by arbitrary Acids primérs Research, '1.18, are p. 6531-6535.1990. YEN, T.; KEEFFE, E.B.; AHMED, A. The Epidemiology of Hepatitis C Virus Infection. Journal of Clinicai Gastroenterology, v. 36, n. 1, p. 47-53. 2003. YOSHIDA, H.; SHIRATORI, Y.; MORIYAMA, M. Interferon ttlêràpy reduces the risk for hepatocellular carcinoma: National surveillahce program of cirrhotic and noncirrhotic patients with chronic hepatitis C in Japan. Annal International Medicine, v. 131, p. 174-181. 1999. ZEHENDER, G.; MERONI, L.; MADDALENA, C.; VARCHETTA, 5.; MONTI, G.; GALLI, M. Detection of hepatitis C virus RNA incD19 periphertal blood patients. Journal mononuclear Infectology cells of Diseases, choronically infected v. 176; p. 1209-1214. 1997. ZEIN, N.N. Clinicai Clinicai Microbiology significance of hepatitís C virus genotypes. Review, v. 13, p. 223-235. 2000. AP~NDICE 64 9. L-ista de Apêndice ~:d". 01, P".o," de éli Comi~.o de "'io' em Pesqui•• d. m UNIVERSIDADE FEbERAL DE A~AÇOAS COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA Senhor(a) Pesquisador(a) : de Ética na Pesquisa (CEP), reunido em oS !/IO~~.1 ,<1,,,,,,, e com base no parecer ,emi,tidOpeIO(a), sob o título~ di- KT -' "«'62£ q o Comitê ~ Ps K, do ,,,o,,w l-kV ~~ ' ,~ cw.flo rn£ e.. 9If~ de sua autOl;a, vem por este instrumento comunicar sua aprovação;, - , com base , no item VIII. 13,b, da Resolução n' 196/96, Outrossim, recomendamos a observância do que cqnsta 'na folha de ' , rosto com respeito ao cumprimento dos prazos para entrega de velatórios, bem COI110 o atendimento da referida Resolução, sobretudo no que se refere ,aos Ítens m. IV e V> (proteção ao sujeito) e das demais Resoluções da CONEP/CNS, quando for o caso(-), Na eventualidade de esclarecimentos ,adicionais este Comitê colocase à disposição dos interessados para o acompanhamento da pesquisa em seus dilema1sêticos r:t=s ~ c::: ~Lo.:y;J 1J!~()JYYW1 ~pOJLR.: evn. ~ (*) A'renscemálicnscspeciais nt:~k su~:tL~~h. vn..~~u ~ ,e.- pJt;2..b Cbe.1;iAA.Q . /%! 6err-é-~ct'- (~, '1g6 t~NJ , APÊNDICE 65 ""', a Apêndice 02. Termo de Consentimento Uvree Esclarecido . , , - .\ SERViÇO PUBLICO FEDERAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS Termo de Consentimento Livre e I;sclarecido Eu _ Concordo em participar voluntariamente da pesquisa "Genotipagem de HCV (vírus da hepatite C) em Maceió através de RT-PCR/RFLPs e sequenciamento automático". Fui informado(a) que o estudo consistirá de coleta de sangue para realização de RT-PCR, seguido da identificação de tipos e subtipos de HCVs por RFLPs, sem danos à minha saúde. Fui esclarecido(a) que os resultados do estudo contribuirão com exames complementares para o diagnóstico de HCV, auxiliando o meu tratamento, e que, quan-do dá aprêSénláçãO dos resultados da pesquisa, serão omitidos dados que me identifiquem. participar, Visto que nada tenho a me opor, concordo em assinando este termo, sabendo que posso desistir do estudo, sem qualquer prejuízo em meu atendimento neste Hospital. Maceió,__ Assinatura doPaciente Assinatura do(a)Médico(a) I 1 APt=NDICE 66 .""'. , a 03. Questionário aplicado as pacientes estudadas. Apêndice ' - o', '._ ~_ERV1ÇOPÚBLlCOFE'pERAL UNIVERSIDADE FEDERAL. DE ALAGOAS DIAGNOSE MO/.ECULAR DE ACIDOS NUCLEICOS HEMOCENTRO: _ DATA DE COLETA: __ /__ /__ PRONTUÁRIO: ------- -------------------------o NOME: SEXG: MASGUUN0D FEMININO DATA DE NASCIMENTO: __ /__ /__ ENDEREÇO: _ ------------------------ PROFISSÃO: ---------- ------- -------------------- TELEFONE: ----------------------o ESCOLARIDADE: ESTADO CIVIl: SOLTE1RO(A)D o o VlÚVO(A) TRANSFUSÃO SANGuINEA: DOADOR DE SANGUE: SIM FUMO: SIM ÁLCOOL: SIM o o NÃO NÃO CASADO(A) OUTROS SIMD NÃO o o DIVORC1ADO(A)D NÃCO o o QUANTO TEMPO? ANOS QUANTO TEMPO? ANos TESTES SOROLÓGICOS: ELISA I R1BAl o o TRATAMENTO: O ELISA 11 ElISAlII o R1BAuD NÃO IMUNOTERAPIA: NÃOU o SIMD SIM[] DATA: __ DATA: __ /__ /__ ,_ ,_
