Biomedicina TERAPIA FOTODINÂMICA APLICADA

TERAPIA FOTODINÂMICA APLICADA NA INATIVAÇÃO DE Pseudomonas
aeruginosa COM AZUL DE METILENO
Silva CSL, Pereira AHC, Freitas MAA, Siqueira BA, Fontana LC, Ferreira-Strixino J
Universidade do Vale do Paraíba/ Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento IP&D, Av. Shishima Hifumi,
20911, Urbanova - São José dos Campos - SP,
Email: [email protected]
Resumo - Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria muito abundante no ambiente, podendo infectar
principalmente ambientes hospitalares e causar grande risco para pacientes, por apresentar alto perfil de
resistência a antibióticos. A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um tratamento alternativo que vem se
destacando no controle de bactérias em lesões. O objetivo deste estudo é avaliar in vitro, a eficiência do
Azul de Metileno como fotossensibilizador (FS) na inativação de P. aeruginosa isoladas de material
clinico. A concentração do FS foi 0,1 mg/ml e fluência de 10 J/cm² e irradiância de 25 mW/cm² em cepas
clinicas isoladas de incisão e cateter. No geral a TFD aplicada com o FS em questão foi capaz de
inativar cerca de 40% da bactéria estudada em ambas as cepas.
Palavras-chave: Terapia Fotodinâmica, Azul de Metileno, Inativação Bacteriana.
Área do Conhecimento: Biomedicina
Introdução
As bactérias da espécie Pseudomonas aeruginosa são bacilos Gram-negativos presentes no ambiente
inclusive em meios hospitalares, sendo consideradas patógenos que apresentam alto risco para
pacientes por causar retardo no processo de recuperação, podendo levar à óbitos em casos mais
graves. As principais formas de infecção por P. aeruginosa são por meio da epiderme do indivíduo
através de queimaduras, feridas abertas e algumas vezes por feridas pós-cirurgicas, devido a materiais
não esterilizados corretamente. Além disso, esse gênero de bactéria apresenta uma resistência inata aos
antibióticos devido a suas membranas plasmáticas interna e externa e a camada de peptidioglicano, que
agem como um impermeabilizante à fármacos e agentes tóxicos, protegendo a célula bacteriana, além
de que, a auto-medicação e prescrição indiscriminada de antibióticos contribui para o desenvolvimento
de resistência (HASHIMOTO, M.C.E, et. al., 2012).
As infecções por P. aeruginosa são geralmente difíceis de tratar devida a própria resistência da espécie
as varias classes de antibióticos disponíveis hoje no mercado, entre eles os aminoglicosídeos e os βlactâmicos (BUSH, K. 2012). Por essa falta de antibióticos eficientes no combate dessas bactérias,
fármacos que haviam caído em desuso voltaram a ser utilizados para o possível controle bacteriano,
como, por exemplo, as polimixinas, que foram descartados por apresentar efeitos tóxicos para os
pacientes e também por não serem 100% eficientes na inativação dessas bactérias (GELLATLY, S.L.;
HANCOCK, R.E.W, 2012).
Por esses motivos, é necessário o desenvolvimento de tratamentos alternativos para o combate dessas
bactérias e, nesse cenário, a Terapia Fotodinâmica (TFD) surge como alternativa de tratamento que vem
se destacando no controle de microrganismos como as bactérias. A TFD se baseia na interação de uma
fonte de luz em um comprimento de onda adequado, de um fotossesibilizador (FS) e oxigênio molecular.
Nesse processo, o fotossensibilizador absorve a luz em um comprimento de onda especifico e assim
assume um estado excitado de energia, podendo transferi-la para o oxigênio molecular presente nas
células e nos tecidos e, dessa forma, são formadas as espécies reativas de oxigênio (ERO’s), capazes
de induzir a morte das células (MACHADO, A.E.H., 2000; PERUSSI, J.R. 2007).
O Azul de Metileno é um corante do tipo Fenotiazínico que exibem absorção de 600 – 660 nm na região
do espectro eletromagnético, dentro da chamada “janela biológica”, possibilitando maior penetração nos
tecidos. Esse corante no geral apresenta uma leve citotoxidade no escuro para os agentes microbianos,
mas se mostra promissor na inativação de bactérias em estudos in vitro (PERUSSI, J.R. 2007).
Hirao e colaboradores em 2010 realizaram estudos in vivo com ratos do gênero Sprague Dawley
machos, induzindo queimaduras nos animais e infectando-as com cepas de P. aeruginosa.
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Posteriormente, submetiam as feridas infectadas à TFD utilizando o fotossesibilizador Azul de Metileno
(AM) e dispositivo a laser em 660nm para irradiação. A diminuição no número de bactérias foi em torno
de 2 logs em relação ao controle (HIRAO, A, et. al., 2010).
Outro estudo in vitro realizado por Thakuri em 2011, obteve uma redução de até 4 logs no crescimento
da P. aeruginosa nas maiores fluências de energia, utilizando Riboflavina-5-fosfato como
fotossensibilizador e um dispositivo de LED para a irradiação (THAKURI, P.S, et. al., 2011).
Tendo em vista os padrões de resistência da Pseudomonas aeruginosa e a falta de fármacos eficazes
em sua inativação e a possibilidade da TFD ser uma terapia alternativa no tratamento de infecções
causadas por essa espécie, o objetivo desse estudo foi avaliar a aplicação da TFD utilizando o Azul de
Metileno como FS no controle de duas cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas de materiais clínicos
distintos.
Objetivo
O objetivo desse estudo é a avaliação da aplicação da Terapia Fotodinâmica (TFD) utilizando o Azul de
Metileno como fotossesibilizador (FS) no controle de duas cepas de Pseudomonas aeruginosa isoladas
de material clínico.
Metodologia
Obtenção e acondicionamento de cepas bacterianas
As cepas de P. aeruginosa foram cedidas pelo Laboratório Oswaldo Cruz de São José dos Campos, que
celebra convênio com o Laboratório de Terapia Fotodinâmica da Universidade do Vale do Paraíba. As
cepas cedidas provêm de material clínico e já haviam sido submetidas a procedimentos de identificação.
As cepas elas foram acondicionadas em freezer a -4ºC em suspensão de caldo BHI com 5% de glicerol.
Aplicação da Terapia Fotodinâmica
Para a realização dos experimentos as cepas foram retiradas do freezer, descongeladas a temperatura
ambiente e incubadas com caldo BHI em estufa a 37ºC durante 24 horas.
Para o preparo das amostras, a cultura de P. aeruginosa foi diluída em PBS até a concentração relativa
ao tubo nº 0,5 da escala nefelométrica de MacFarland (1,5 x 108 células/mL).
Os grupos amostrais foram divididos de acordo com a Tabela 1 e, para cada grupo, foram transferidos
1mL da solução de bactérias para tubos cônicos. Os tubos cônicos foram centrifugados a 3500 rpm
durante 10 minutos, o sobrenadante desprezado, adicionados 200 µL de AM na concentração de 0,1
mg/mL e incubados durante 15 minutos a 37ºC. Após incubação, o conteúdo dos tubos foi distribuído em
placa de 24 poços, onde foram adicionados 900 µL de caldo BHI por poço. Posteriormente, a placa foi
irradiada com dispositivo a base de LED’s Biopdi/Irrad-Led5 660, com comprimento de onda em 660nm,
irradiância de 25 mW/cm², potência de 70 mW e fluência de 10 J/cm², durante 6 minutos e 40 segundos.
Tabela 1: Grupos Amostrais
Pseudomonas sp.
Grupo
Controle Escuro
AM
Controle Claro
TFD
FS
s/ FS
Azul de Metileno 0,1 mg/mL
s/ FS
Azul de Metileno 0,1 mg/mL
Irradiação (Fluência)
s/ Irradiação
s/ Irradiação
10 J/cm²
10 J/cm²
Após a irradiação, foram retiradas alíquotas de todos os grupos amostrais e semeadas por
espalhamento em Agar BHI e incubadas a 37ºC durante 24 horas para a contagem do numero de
unidades formadoras de colônias (UFC/mL).
Todos os ensaios foram realizados em triplicata para garantir a fidelidade dos dados.
Os resultados obtidos pela contagem de colônias foram submetidos ao teste ANOVA (Bioestat 5.3)
utilizando nível de significância α=0,05.
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Resultados
Nos resultados obtidos para a cepa isolada de incisão (Clínica 1), foi possível observar que o grupo
somente com o FS apresentou aumento significativo em relação ao grupo controle (p<0,01), não
apresentando redução no número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC/mL), portanto o AM não
foi citotóxico para a cepa clínica 1. No grupo irradiado, houve um aumento significativo (p<0,01) na
contagem de UFC’s, possivelmente devido ao efeito bioestimulador da luz, sendo que a luz no
comprimento de onda de 660nm pode apresentar ação bioestimuladora para as células, dependendo dos
parâmetros de irradiação. Já o grupo submetido à TFD, apresentou uma diminuição significativa (p<0,01)
de aproximadamente 2,5 log’s nas UFC’s (Tabela 2).
Tabela 2 – Contagem total de UFC/ml (Log10) obtidas após tratamento para cepa de P. aeruginosa
isolada de incisão
Cepa Clínica 1 - Incisão
Grupos
Controle
Azul de Metileno
Irradiado 10J/cm²
TFD
Total
9,07
9,80
11,38
6,53
Desvio Padrão
0,11
0,15
0,03
0,03
Nos resultados obtidos para a cepa isolada de Catéter (Clínica 2), percebe-se que o grupo somente com
o FS obteve redução significativa (p<0,01), porém não apresentou alta taxa de redução em relação ao
controle, indicando que, o AM não foi altamente citotóxico para a cepa clínica 2. Para grupo somente
irradiado, percebe-se que houve um aumento significativo (p<0,01) das UFC’s semelhante ao
apresentado na cepa clínica 1. Já no grupo da TFD, percebe-se que houve uma diminuição significativa
(p<0,01) de aproximadamente 3,5 log’s nas UFC’s (Tabela 3) em relação ao controle não irradiado.
Tabela 3 – Contagem total de UFC/ml (Log10) obtidas após tratamento para cepa de P. aeruginosa
isolada de cateter.
Cepa Clínica 2 - Catéter
Grupos
Controle
Azul de Metileno
Irradiado 10J/cm²
TFD
Total
10,39
8,84
11,30
6,86
Desvio Padrão
0,09
0,06
0,05
0,06
O gráfico 1 compara os resultados obtidos entre as duas cepas clínicas. O grupo controle da cepa 2,
apresentou crescimento significativo (p<0,01) superior ao grupo controle da cepa 1, contudo pode-se
notar que a cepa 2 foi mais sensível a interação com o AM, apresentando redução de 1,5 log em relação
ao controle, enquanto a cepa 1 não apresentou redução e sim um aumento de 0,7 log no crescimento,
demonstrando que houve baixa citotoxicidade do AM apenas para cepa Clínica 2. No grupo somente
irradiado, ambas as cepas apresentaram crescimento acima de seus respectivos controles, porém, para
a cepa 1, a luz estimulou o crescimento em cerca de 2,3 log’s acima do respectivo grupo controle. A
cepa 2 apresentou crescimento em cerca de 1 log acima do controle no grupo apenas irradiado. Ambos
os resultados demonstraram que a luz pôde exercer fator estimulante para o crescimento das bactérias.
Para os grupos que foram submetidos à TFD houve uma redução de aproximadamente de 2,5 log’s na
cepa 1 e de 3,5 log’s na cepa 2 nas UFC, no entanto não houve inativação total em ambas as cepas.
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Grafico 1 – Dados da aplicação da Terapia Fotodinâmica nas cepas de P.aeruginosa, sendo *, •, ∆, ◊ e °
equivalentes a p<0,01.
Discussão
A Terapia Fotodinâmica é uma terapia alternativa ainda em estudo, porém apresenta um grande
potencial para a inativação de bactérias, mesmo àquelas que apresentem resistência a antibióticos como
é o caso da P. aeruginosa, uma espécie que frequentemente pode complicar o quadro de pacientes
hospitalizados e leva-los a óbito (HASHIMOTO, M.C.E, et. al., 2012).
Para a TFD apresentar o máximo de eficiencia é ideal, que o FS utilizado para o tratamento, apresente
baixa ou nenhuma citotoxicidade no escuro (PERUSSI, J.R., 2007). Nesse estudo, observou-se que o
AM, na concentração testada, apresentou baixa citotoxicidade para ambas as cepas clínicas de P.
aeruginosa, apresentando pequeno efeito citotóxico apenas para a cepa clinica 1, que reduziu em
apenas 1,5 log o crescimento em relação ao controle, indicando que o AM pode ser um FS em potencial
para ser utilizado na TFD.
Os grupos que sofreram somente ação da irradiação na fluência de 10J/cm² apresentram elevação da
contagem de colônias em relação ao controle, sugerindo que a luz na região do vermelho estimulou as
cepas a se multiplicarem. Da mesma forma, o estudo realizado por Decarli em 2016, aplicou a luz no
comprimento de onda de 630nm (vermelho) em variadas fluências em cepas de P. aeruginosa, obtendo,
também, um cresciemento em relação ao controle não irradiado, ou seja, a bactéria é bioestimulada
quando em contato apenas com a luz em comprimeto de onda na região do vermelho (DECARLI, M.C.,
et. al., 2016).
Já os grupos submetidos à TFD, demonstraram, nas condições testadas, redução do crescimento de
bacterias em 2,5 e 3,5 log’s para as cepas clinica 1 e 2, respectivamente. Tal resultado demonstra que,
mesmo com uma taxa relevante de inativação, ainda resta uma carga bacteriana consideravél em cada
um dos grupos que, extrapolando para uma situação clínica, poderiam reinfectar o tecido tratado.
Semelhantemente a esse estudo, Usacheva em 2001 demonstrou o sucesso da terapia ao obter a
redução em cerca de 3,5 log’s em cepas ATCC de P. aeruginosa, utilizando fluência de energia de 40
J/cm² e concentração de AM de 200 µM. Outro estudo, realizado por Shih e Huang em 2013, obteve
redução de 4 e 2 log’s no crescimento bacteriano de cepa de P. aeruginosa utilizando as fluências de 50
e 25J/cm², respectivamente, e AM na concentração de 0,5 µg/mL, indicando que a terapia com AM pode
ser alternativa para combater infecções causadas pela espécie de bactéria em estudo (SHIH. M.H.,
HUANG. F.C., 2013).
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Pode-se citar também que, assim como nesse estudo, o trabalho de Pereira de Lima Carvalho em 2014
que aplicou a TFD em diferentes cepas clínicas de Pseudomonas sp. utilizando AM na concentração de
0,1 mg/mL e fluência de 50J/cm², obteve resposta semelhante à TFD para ambas as cepas clinicas
isoladas, sugerindo que, mesmo que a espécie derive de materias clínicos distintos, elas podem ser
igualmente inativadas com a terapia, podendo-se assumir que a terapia possa ser aplicada em diferentes
sítios de infecção por essa espécie (PEREIRA DE LIMA CARVALHO et al., 2014).
Mesmo que para esse estudo a TFD não tenha sido capaz de inativar completamente as cepas
estudadas, espera-se que o aumento da fluência de luz utilizada seja um fator que possa potêncializar o
efeito da terapia, visto que Kashef e colaboradores em 2011, demonstraram que o sucesso da TFD
utilizando o AM geralmente não está ligado a concentração do FS, mas sim na dose de luz utilizada nas
cepas. Em seu estudo, foram utilizadas concentrações variadas de AM (25, 50 e 100µg/mL) e variadas
fluências de energia (27.3, 54.6 e 109,2 J/cm²) obtendo redução de até 92,23% em cepas de E. coli,
bactéria também gram-negativa, quando utilizada a maior fluencia de energia testada, não apresentando
grandes diferenças variando-se a concentração de FS (KASHEF, N, et. al., 2011). Outro estudo que
obteve uma redução de apenas 0,5 log no crescimento bacteriano foi o realizado por De Oliveira em
2014, o qual foi utilizada uma concentração de AM de 50 µM e uma dose de luz de 9 J/cm² em cepas de
P. aeruginosa, reforçando a ideia de que baixas doses de energia são fatores limitantes para a
inativação (DE OLIVEIRA. B.P, et. al., 2014).
Além das limitações em relação a dose de energia, , as características das membranas e da parede
celular das bactérias gram-negativas podem ser outro fator que impede resultados mais eficientes para a
TFD aplicada à cepas de P. aeruginosa. Tal bactéria, tipicamente apresenta uma resistência inata a
corantes como o AM, caracterizada pela propriedade de suas membranas celulares interna e externa
que contém endotoxinas capazes de tornar a espécie quase impermeável a esses compostos
(KO¨MERIK, N., et. al., 2000). Portanto, uma alternativa interessante além do aumento da fluência, seria
a a aplicação seriada da TFD, como demonstrado por Yildiriam e colaboradores em 2013, onde após
seriadas aplicações da terapia obteve uma redução de mais de 90% em todas as cepas estudadas.
Dessa forma, a carga bacteriana remanescente após a TFD, poderia ser completamente inativada,
garantindo que não haja recontaminação do tecido pós-tratamento (YILDIRIM. C., et. al., 2013).
Conclusão
Podemos concluir com esse estudo que as cepas de P. aeruginosa irradiadas a 10 J/cm² a uma
concentração de 0,1 mg/ml de Azul de Metileno puderam reduzir o crescimento bacteriano, in vitro, em
cerca de 40%, porém não foi capaz de inativar totalmente as cepas testadas, devido aos parâmetros
utilizados. Também foi possível observar que cepas clínicas oriundas materiais distintos, responderam
de maneira semelhantes à TFD.
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