Aula 01 - Saliva

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOTECNOLOGIA-CCE
PROFESSOR: JOÃO BATISTA BUZATO
SALIVA: DEMONSTRAÇÃO DA CAPACIDADE TAMPONANTE E DOSAGEM DO TAMPÃO
FOSFATO
Fundamento teórico: A saliva é um fluido viscoso e contém cerca de 99% de água e 1% de sólidos
orgânicos e inorgânicos. Embora o NaCl seja o componente inorgânico mais abundante da saliva, é o
bicarbonato (HCO-3) que possui propriedade tamponante. Outro tampão inorgânico é o fosfato. O principal
sólido orgânico da saliva é a uréia, porém outras biomoléculas é que funcionam como tampões: mucina,
amilase, lisosima, imunoglobulinas (IgA, IgG e IgM), lípase e urease. Na saliva, do total das substâncias
inorgânicas, os ânions constituem aproximadamente 150mg%. Destes, aproximadamente a metade são
cloretos e em seguida, estão os fosfatos (em redor de 40mg%). Na saliva, os fosfatos constituem o tampão
fosfato:
H2PO-4 // HPO4-2 , cujo pK de 6,86 é bem próximo do pH da saliva (6,9 – 7,0)
Mecanismo de ação: Sob condições de excesso de H+ ou OH-, o tampão fosfato age da seguinte maneira:
Excesso de acidez: H+ + HPO2-4  H2PO-4
Excesso de alcalinidade: OH- + H2PO-4  HPO2-4 + H2O
Técnica:
a) Pool da saliva:
Coletar, aproximadamente, 6mL de saliva da equipe em um becker de 100mL de capacidade;
Transferir 0,5mL de saliva para o tubo 3 da tabela 3 (dosagem do tampão fosfato);
Diluir o restante da saliva em um volume total de 50mL;
Colocar a barra magnética e homogeneizar;
Acrescentar 25 gotas do indicador alaranjado de metila e continuar a homogeneização;
Transferir 2mL para o tubo 3 da tabela 1 (referência).
b) Para acompanhar a evolução de cor durante a titulação, preparar a bateria de tubos abaixo (tabela 1 –
referência) e usar a mesma como padrão de cor e ponto de viragem durante a titulação.
Tabela 1 - Referência
Tubo
Água destilada
1
2mL
2
1,8mL
3
Ácido lático
Saliva diluída
Indicador
03 gotas
0,2mL
03 gotas
2mL
c) Titulação:
Proceder a titulação adicionando 0,2mL de ácido lático e anotar o pH na tabela 2.
Completar a tabela 2, repetindo a adição de alíquotas de ácido lático e medindo o pH até atingir o ponto de
viagem, isto é, até a cor inicial igualar a cor do tubo 2 da tabela 1.
Tabela 2 - Titulação
Ácido lático
pH
Dados adicionais:
Efeito do ácido lático na água
pH da água destilada: _________________
pH da água destilada adicionada de 0,2mL de ácido
lático: __________________
Grafar os valores
Atenção: Usar escala única para fazer os 02 gráficos
Grafar os valores obtidos em papel milimetrado.
d) Dosagem do tampão fosfato:
Fundamento teórico: O uso do ácido do TCA (ácido tricloacético) é para precipitar as proteínas presentes
na amostra de saliva, pois as mesmas interferem na reação posterior. As proteínas desnaturadas são
precipitadas por centrifugação para obter o sobrenadante límpido. O método de dosagem de fosfato foi
desenvolvido por Fiske e Subbarow, no qual o fosfato é transformado em ácido fosfomolíbdico e
posteriormente é reduzido pelo aminonaftolsulfônico em um produto de cor azul. A intensidade da
coloração azul é proporcional à concentração de fosfato.
Para fazer a dosagem do tampão fosfato da saliva, proceder as pipetagens conforme a tabela 3 – Dosagem.
Tabela 3 – Dosagem
Tubo
1
Branco
Água destilada
- 0,5mL
2
Padrão
[20mg%]
- 0,5mL
3
Saliva
- 0,5mL
Adicionar em cada tubo 4,5mL de TCA 5%.
Agitar vigorosamente e na presença de precipitado (tubo 3), descansar o tubo por 10 minutos.
Em seguida, centrifugar durante 5 minutos.
Após centrifugação, transferir o sobrenadante para outro tubo.
Em todos os tubos, adicionar 0,5mL de molibdato de amônio.
Adicionar 0,2mL do agente redutor de fósforo.
Acrescentar 5,0mL de água destilada.
Medir a absorvância no comprimento de onda () de 660nm. Usar o tubo 1 (Branco) para zerar o aparelho.
Calcular a concentração de tampão fosfato na saliva fazendo a comparação de absorvância e concentração
com o tubo padrão.