marina de pádua nogueira menezes estudo da via wnt no

MARINA DE PÁDUA NOGUEIRA MENEZES
ESTUDO DA VIA WNT NO ENDOMÉTRIO NORMAL E NO CÂNCER DE
ENDOMÉTRIO, EM MULHERES APÓS A MENOPAUSA
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para
obtenção do Titulo de Doutor em Ciências.
SÃO PAULO
2011
MARINA DE PÁDUA NOGUEIRA MENEZES
ESTUDO DA VIA WNT NO ENDOMÉTRIO NORMAL E NO CÂNCER DE
ENDOMÉTRIO, EM MULHERES APÓS A MENOPAUSA
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para
obtenção do Titulo de Doutor em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Wagner José Gonçalves
Co-orientadores: Profa. Dra. Celina T. F. Oshima
Prof. Dr. João Norberto Stávale
SÃO PAULO
2011
Menezes, Marina de Pádua Nogueira
Estudo da via Wnt no endométrio normal e no câncer de
endométrio, em mulheres após a menopausa. / Marina de Pádua Nogueira
Menezes. -- São Paulo, 2011.
vii, 63f.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista
de Medicina. Programa de Pós-graduação em Ginecologia Oncológica.
Título em inglês: The role of Wnt pathway in the normal endometrium
and in the endometrial cancer the post menopause women.
1. Neoplasias do endométrio. 2. Proteinas Wnt. 3. Pós-menopausa. 4.
Endométrio. 5. Mulheres.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE GINECOLOGIA
Chefe do Departamento: Prof. Dr. Afonso Celso Pinto Nazário
Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Manoel J. B. C. Girão
i
MARINA DE PÁDUA NOGUEIRA MENEZES
ESTUDO DA VIA WNT NO ENDOMÉTRIO NORMAL E NO CÂNCER DE
ENDOMÉTRIO, EM MULHERES APÓS A MENOPAUSA
Presidente da banca: Prof. Dr. Wagner José Gonçalves
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Levon Badiglian Filho
Prof. Dr. Sérgio Mancini Nicolau
Prof. Dr. Roberto Euzébio dos Santos
Prof. Dr. Paulo Kassab
Prof. Dr. Robério de Sousa Damião
Prof. Dr. João Norberto Stávale
ii
Dedicatória
Aos meus pais, pelo amor e apoio incondicionais! Pelas oportunidades que me
proporcionaram e pelo incentivo e dedicação diários. Meu porto seguro, que estavam
sempre juntos de mim, apesar da distância.
Ao meu esposo, Marcos Vinícius, pelo amor, amizade e apoio. Por estar sempre ao
meu lado, entendendo-me e respeitando-me todos os dias.
A minha querida irmã e amiga, Adriana, pelo seu amor imensurável, fundamental em
todos os momentos de minha vida!
Às minhas sobrinhas, Maria Clara e Bruna, pelo amor único e verdadeiro, e por
entenderem a minha ausência em algumas fases de nossas vidas!
A minha avó Celina e ao meu avô Antônio (in memorian) pelo exemplo e pelo carinho
que sempre me deram.
iii
Agradecimentos:
À Deus, pela oportunidade de estar terminando mais esta etapa da minha formação
pessoal e profissional.
A meu tio querido Dr. Antônio Fortes de Pádua Filho, presente desde o início da minha
formação, sempre com bons conselhos e orientações, um exemplo de dedicação,
amizade e primor profissional.
Ao Professor Doutor Wagner José Gonçalves pela colaboração e pela oportunidade de
realizar esta tese. Por seus ensinamentos, paciência e dedicação sempre oferecidos,
em todos os momentos necessários.
Ao Professor Doutor Sérgio Mancini Nicolau que contribuiu enormemente com a sua
amizade e dedicação, somando os seus ensinamentos muito importantes nesta etapa
da minha formação.
À Professora Doutora Celina Oshima pelo auxílio na confecção deste trabalho.
Ao Doutor Levon Badiglian Filho por toda a amizade, paciência, dedicação e incentivo
na realização desta tese e ainda pelo seu apoio científico imprescindível para a
elaboração e revisão deste trabalho.
Aos Doutores, Robério de Sousa Damião e Roney Signorini Filho por toda a amizade e
companheirismo, e a toda equipe da Disciplina de Oncologia Ginecológica da Escola
Paulista de Medicina – UNIFESP, pela participação e colaboração na realização desta
tese.
Às pacientes, colaboradoras fundamentais para a elaboração deste estudo.
Aos meus familiares e amigos que sempre me apoiaram em todas as etapas da minha
vida acadêmica.
iv
Sumário
Dedicatória....................................................................................................................iii
Agradecimentos..........................................................................................................iv
Resumo.........................................................................................................................vi
Abstract..............................................................................................................vii
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................1
2. PROPOSIÇÕES.........................................................................................................8
3. METODOLOGIA.....................................................................................................10
4. RESULTADOS.........................................................................................................15
5. DISCUSSÃO............................................................................................................24
6. CONCLUSÕES........................................................................................................29
7. ANEXOS...................................................................................................................31
8. BIBLIOGRAFIAS.....................................................................................................52
9. FONTES CONSULTADAS.........................................................................................62
v
Menezes MPN. Estudo da via Wnt no endométrio normal e no câncer de
endométrio, em mulheres após a menopausa [tese]. São Paulo: “Escola Paulista de
Medicina, Universidade Federal de São Paulo”; 2010. 42p.
Resumo
A família de genes Wnt está envolvida na carcinogênese de diversos tecidos e na
embriogênese. Para avaliar as vias Wnt canônica e não-canônica no endométrio
atrófico e no câncer de endométrio, avaliamos a expressão imuno-histoquímica do
Wnt1, Frizzled-1 (FZD1), Wnt5a, Frizzled-5 (FZD5) e β-catenina. O tecido endometrial
foi retirado de peças cirúrgicas de pacientes operadas entre 1995 e 2005 na Escola
Paulista de Medicina – UNIFESP e foram divididas em dois grupos: grupo A,
endométrio atrófico (n=15) e grupo B, adenocarcinoma de endométrio (n=45). A
imunorreação do Wnt1, FZD1, Wnt5a, FZD5 and β-catenina foi analisada em escores
em cada grupo, individualmente. A expressão do Wnt1, FZD1 e Wnt5a não teve
associação significante entre os grupos. Associação significante foi observada entre os
grupos para a expressão do FZD5 (p = 0,001). A proporção do FZD5 positivo foi
significativamente maior no grupo A (80,0%) comparado ao grupo B (31,1%).
Analisando a curva de sobrevida para o FZD5 no grupo B, não encontramos
associação significante entre as mulheres positivas e negativas. A expressão da ßcatenina não foi significante, sendo a expressão para os grupos A e B 100% e 95.6%,
respectivamente (p = 1,000). FZD5 tem menor expressão no adenocarcinoma de
endométrio tipo I quando comparado ao endométrio atrófico.
Palavras Chaves: 1. Neoplasias do endométrio 2. Proteinas Wnt 3. Pós-menopausa
4. Endométrio 5. Mulheres.
vi
Menezes MPN. The role Wnt pathway in the normal endometrium and in
endometrial cancer in the post menopause women [tese]. São Paulo: “Escola
Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo”; 2010. 42p.
Abstract
The Wnt family is involved in tumorigenesis of several tissues as well in embriogenesis.
In order to analize the canonical and noncanonical Wnt pathway in atrophic
endometrium and endometrial adenocarcinoma, we evaluated the immunohistochemical
expression of Wnt1, Frizzled-1 (FZD1), Wnt5a, Frizzled-5 (FZD5) and β-catenin.
Endometrial specimens were obtained from surgeries performed between 1995 and
2005 and the patients were divided in two groups: Group A, atrophic endometrium (N =
15); Group B, endometrial adenocarcinoma (N = 45). Immunoreactivity for Wnt1, FZD1,
Wnt5a, FZD5 and β-catenin was scored for each group. For the expression of Wnt1,
FZD1 and Wnt5a, no significant association was observed between the groups. A
significant association was observed between the groups for the FZD5 expression (p =
0.001). The proportion of FZD5 positive women was significantly higher for group A
(80.0%) compared to group B (31.1%). Regarding the survival curve for FZD5 at group
B, we found no significant association between positive and negative women. No
significant association was observed between ß-catenin expression and the patient
group since the expression for groups A and B were 100% and 95.6%, respectively (p =
1.000).
FZD5 is downregulated in type I endometrial adenocarcinoma when compared to
atrophic endometrium.
Key-words: 1. Endometrial neoplasia 2. Wnt Protein 3. Postmenopause 4.
Endometrium. 5. Woman
vii
1
INTRODUÇÃO
2
Introdução
O câncer de endométrio é a neoplasia genital mais freqüente em países
desenvolvidos. Nos Estados Unidos é a sétima neoplasia maligna mais comum, com
incidência variando em cada região (1). A Sociedade Americana de Câncer estima que
tenham ocorrido 43.470 novos casos de câncer de endométrio em 2010 (5).
No Brasil, a distribuição de casos novos de câncer é desigual, sendo as maiores
taxas nas regiões Sul e Sudeste. Na região Sudeste, o câncer de endométrio é o
terceiro câncer ginecológico mais freqüente, perdendo, apenas, para o câncer de
mama e o câncer de colo do útero (INCA) (4).
Existem diversos fatores relacionados à ocorrência do câncer de endométrio,
como maior longevidade, menor paridade, obesidade, uso abusivo do estrogênio no
climatério, ovários policísticos, hipertensão arterial, diabetes melittus, sedentarismo,
uso de tamoxifeno, antecedente pessoal de câncer de mama, e outros fatores ainda
desconhecidos (1, 3, 4, 5).
É uma neoplasia de maior incidência entre as sexta e sétima décadas e, em
apenas 5 a 30% dos casos é detectada antes dos 50 anos (2, 4, 5).
O câncer de endométrio é subdividido em dois tipos, baseado em um modelo
dualista proposto, em 1983, por Bokhman. O adenocarcinoma endometrióide
representa 70-80% dos carcinomas do endométrio, designado como carcinomas do
tipo I. Outros subtipos histopatológicos, menos incidentes (10-20%) incluem
adenoescamoso, adenoacantoma, seroso papilífero, secretor e células claras, também,
chamados de carcinomas do tipo II (1,4, 5, 62).
O carcinoma endometrióide (Tipo I) está relacionado à hiperplasia endometrial e
ao hiperestrogenismo, sendo tipicamente tumores bem diferenciados, com bom
prognóstico, e geralmente de baixo grau. Ao contrário, o tipo II é pouco diferenciado,
não relacionado ao estrogênio e mais frequentemente do tipo seroso e de células
claras, com curso clínico agressivo e prognóstico sombrio (1, 4, 5, 37, 38, 39, 40, 62).
O diagnóstico ocorre em estadios iniciais em cerca de 90% dos casos pela
precocidade dos sintomas, sendo o mais importante a hemorragia genital na pósmenopausa (1, 4, 5). O estadiamento é cirúrgico conforme determinação da Federação
3
Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO), desde 1988 (82). Devem ser
analisados o grau de invasão miometrial, a presença e o grau de comprometimento do
colo, da vagina, dos anexos e dos paramétrios; o acometimento dos linfonodos, a
citologia peritoneal, invasão de bexiga ou de reto e a presença de metástase à
distância (1, 4, 5).
A forma de tratamento mais importante para o câncer de endométrio é a cirurgia.
O procedimento inclui lavado peritoneal, histerectomia total, anexectomia bilateral,
omentectomia e a linfadenectomia pélvica e para-aórtica (1, 4, 5). A radioterapia
adjuvante é realizada de acordo com os achados cirúrgicos e histopatológicos (1, 4, 5).
A quimioterapia tem avançado no tratamento adjuvante do câncer de endométrio ou na
recorrência, sendo, atualmente, as drogas mais usadas o Paclitaxel e a Cisplatina (1,
36).
A sobrevida, em cinco anos, estabelecida, pela FIGO, é em torno de 85% para o
estádio I; 75% para o II; 45% para o III e 25% para o IV (1, 82). Além do estadiamento,
existem critérios que modificam a sobrevida, como o grau de invasão miometrial, tipo
histológico, grau de diferenciação do tumor, idade, paridade e diagnóstico de diabetes
(1).
Atualmente, os carcinomas do endométrio tipos I e II são caracterizados por tipos
distintos de receptores hormonais e dos oncogenes envolvidos (1, 62). Os receptores
de estrogênio e de progesterona no tumor podem ser detectados pela técnica de
imuno-histoquímica. A presença deles está relacionada com tipos histológicos bem
diferenciados, menor invasão de profundidade, raras metástases regionais e à
distância e maior sobrevida (11, 12).
A relação entre a instabilidade microsatélite e o câncer de endométrio tem sido
mostrada em muitos estudos. Esta ploidia do DNA é determinada por defeito no gene
MMR que não corrige os erros durante a replicação do DNA, resultando em mutação
do genoma humano e consequentemente o fenótipo da instabilidade microsatélite. Está
presente em cerca de 25% dos tumores de endométrio, sendo mais freqüente nos
tumores estrogênio-dependentes (20 a 35%) (11, 12, 35, 39,40, 62, 63).
Também existem outros fatores relacionados, geneticamente, ao câncer de
endométrio,
como
os
oncogenes.
(35).
Existem
alguns
deles
que
estão
4
comprovadamente envolvidos na carcinogênese endometrial, como: p53, o PTEN e a
β-catenina (1, 6, 7, 9, 37, 38, 39, 40).
O gene supressor de tumor p53 encontra-se envolvido no câncer de humanos e é
o mais bem estudado. Observa-se em torno de 10 a 25% dos casos de câncer de
endométrio. Alguns estudos o relacionam a estadios avançados do câncer de
endométrio, tumores pouco diferenciados e subtipos histológicos mais agressivos (6, 7,
9, 37, 62).
O PTEN (Phosphatase and tension homolog) é outro gene supressor de tumor e
consiste na alteração genética mais freqüente do câncer de endométrio, encontrada em
30 a 80 % dos casos. Também está presente em 15 a 55 % das hiperplasias
endometriais com ou sem atipias, o que sugere relacionar-se a um evento precoce da
carcinogênese endometrial, permitindo a evolução do endométrio normal para
hiperplasia e, depois, ao carcinoma (1, 7, 37, 38, 39, 40, 63).
A β-catenina é uma proteína codificada pelo gene CTNNB1 (Cadherin-associated
protein, beta 1), localizado no cromossomo 3p21. Pode agir na membrana da célula,
mantendo a polaridade da mesma, e, no citoplasma, interagindo com proteinas APC
(Adenomatous polyposis coli protein), funciona como fator de transcrição (38, 39, 40).
O acúmulo nuclear anormal de β-catenina pode ocorrer como resultado de
mutações no gene CTNNB1 e nos genes relacionados à ativação da transcrição
através da via LEF/ Tcf. As proteínas APC regulam a quantidade de β-catenina através
da glicogênio sintase quinase- 3β (GSK-3β), induzindo a fosforilação dos resíduos da
serina-treonina codificadas no exon 3 do gene CTNNB1 e é degradado pela via da
ubiquitina. A ativação desta via está presente em diversos tumores humanos, estando
presente em 14 a 44 % dos carcinomas endometriais relacionados ao estrogênio (24,
37, 39, 52, 53, 74, 75). Os tumores de endométrio associados a β-catenina são
caracteristicamente tumores diagnosticados em estádios precoces e com prognóstico
favorável (37,39, 43, 52, 62, 77).
O gene Wnt relacionam-se à carcinogênese endometrial. Faz parte de uma
grande família e foi descrito inicialmente em 1982 por Nusse e Varmus. O Int-1
(integration 1) foi o primeiro membro isolado, a partir da integração do vírus de tumor
mamário em ratos (MMTV) ao DNA do hospedeiro (14, 18, 19, 20, 22, 27). Nusse et al,
5
em 1991, sugeriram a mudança do nome do gene Int-1 para Wnt1 por ele ser ao
mesmo tempo um gene Int e homólogo do gene wingless da drosófila (15, 19).
Em mamíferos, há muitos tipos de genes Wnt conhecidos como: Wnt1, Wnt2,
Wnt2b/13, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b,
Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 e Wnt16 (41, 42).
Podem-se isolar homólogos dos genes Wnt em diversas espécies como
Drosophila, Xenopus, galinhas e humanos (21). No entanto, há diversas razões que
dificultam o conhecimento sobre a via Wnt como a diversidade de tipos de genes e de
frizzled, a difícil purificação do Wnt e a existência de muitas moléculas extracelulares e
de superfície envolvidas nesta via (42, 44).
Os genes Wnt regulam o processo de desenvolvimento, incluindo o crescimento,
a proliferação, a diferenciação, a motilidade e a apoptose celulares, e relacionam-se a
embriogênese, podendo estar envolvidos com diversos tipos de câncer (13, 17, 21, 23,
24, 34, 41, 45). Acredita-se que o Wnt tem diversas funções dependendo do receptor
com o qual se liga (41, 42). Alguns tipos de câncer estão envolvidos com o Wnt, como
o câncer de mama, de ovário, colorretal, renal e de pâncreas (10, 16, 54, 64).
A via Wnt é bastante complexa, sendo dividida em três tipos: canônica, nãocanônica e Wnt-Ca2+ (Figura 1) (24, 26, 27, 61). Existe uma via inicial comum em que
as glicoproteínas secretadas pelos genes Wnt ligam-se ao Frizzled (Fz-uma família de
dez receptores da superfície celular), e a LRP-5 ou LRP-6(co-receptores das
lipoproteínas de baixa densidade), localizados na superfície das células (13, 24, 26).
Através desta interação, um sinal é enviado ao citoplasma da fosfoproteína Dishevelled
(Dsh) que consiste na chave transmissora do sinal Wnt (13, 24, 26). Existem três
proteínas Dsh nos mamíferos (Dsh-1, Dsh-2 e Dsh-3) que contém fortes domínios: o
amino-terminal DIX (nomeado pelo Dsh e Axin), o central PDZ (nomeado pelo
Postsynaptic density-95, Discs-large e Zonula) e o carboxi-terminal DEP (nomeado pelo
Dsh, Egl-10 e Pleckstrin) (24, 28). A este nível, as vias separam-se, seguindo caminhos
distintos, sendo que alguns autores descrevem a via não canônica e a via wnt-Ca2+
como única (24).
Figura 1: Vias canônica e não canônica
6
Fonte: Journal of Biology
Na via canônica, o sinal Wnt utiliza os domínios DIX e PDZ da Dsh para induzir a
estabilização da β-catenina no citoplasma. A regulação da estabilidade da β-catenina é
mediada pelo complexo de proteínas, incluindo Axina, glicogênio sintase quinase 3
(GSK3), proteína ligadora GSK-3 (GBP) e caseína quinase 1 (CK1). Quando não há o
estímulo Wnt, a β-catenina é degradada pelo β-TrCP (β-transducin repeat containing
protein). Porém, se ocorre o estímulo Wnt, a fosforilação da β-catenina pela GSK-3 é
inibida. Consequentemente, a β-catenina não é degradada e se acumula no citoplasma
e no núcleo, onde se liga aos fatores de transcrição TCF/LEF e a outros fatores (coativadores p300, creb-binding protein-CBP), levando à transcrição de genes alvos Wnt
como o c-myc e cyclin D1 (24, 25, 26, 37, 39).
A via não-canônica participa da polaridade celular, dos movimentos celulares
durante a gastrulação e de outros processos por transdução através dos domínios PDZ
e DEP da Dsh, levando à modificação do esqueleto da actina. A este nível, duas vias,
independentes e paralelas, ativam pequenas GTPases, Rho e Rac (24).
A ativação do Rho requer a proteína Daam1 que se liga ao domínio PDZ da Dsh,
levando a ativação quinase Rho-associada ROCK, mediando a reorganização do
citoesqueleto. A ativação do Rac é independente da proteína Daam1 e requer o
domínio DEP da Dsh, simulando a ativação da Jun-N-terminal quinase (JNK) (24).
7
A via Wnt-Ca2+ é importante para a adesão celular e movimentos celulares
durante a gastrulação e recebe influência das vias canônica e não-canônica. A
sinalização ocorre através dos receptores Frizzled, levando ao acúmulo de cálcio
intracelular, processo regulado pelas proteínas G heterotrimericas e outras numerosas
moléculas, incluindo a fosfolipase C (PCL), cálcio-calmodulina-dependente quinase 2
(GamK2), proteína quinase (PKC), Jun-N-terminal quinase (JNK) (24, 26).
Alguns genes Wnt podem ativar tanto uma via quanto a outra, como o Wnt3a. Já
o Wnt5a ativa apenas a via não-canônica e os genes Wnt1 e 7a, a via canônica (24, 29,
30, 31, 55, 56).
A expressão do gene Wnt no útero humano foi estudada pela primeira vez por Bui
et al, em 1997, em Oxford (14). Ele observou forte expressão do gene Wnt7a no
endométrio humano normal, principalmente na fase secretora do ciclo menstrual, e dos
genes Wnt7a e 7b no câncer de endométrio (14,30).
A partir daí, a expressão da via Wnt no endométrio passou a ser investigada por
outros autores. Em 2003, Tulac et al. demonstraram que o gene Wnt7a no epitélio
endometrial mantém a expressão do gene Wnt5a (13). Sabe-se que o gene Wnt5a
contém cinco exons e está mapeado em 3p14.2-p21.1 (32). Diversos estudos apontamno como um importante regulador da proliferação e diferenciação celular (46, 47, 48,
49, 50) e, por esta razão, algumas evidências mostram que variações na sua
expressão podem estar associadas a diversos tipos de cânceres, como os de fígado,
mama, próstata e pâncreas (54, 64). No câncer de endométrio, o Wnt5a tem expressão
diminuída e acredita-se que seja antagonista do Wnt1 (33, 57). O Wnt1 está localizado
no cromossomo 12q13 (51) e consiste em um importante fator de transformação e
tumorigênese celulares (33).
A despeito de vários estudos indicarem o envolvimento dos genes Wnt na gênese
do câncer de endométrio, estudos específicos sobre a participação dos tipos Wnt1 e
Wnt5a na carcinogênese endometrial ainda são escassos na literatura. Por esta razão,
motivamo-nos a pesquisar estas
neoplasia maligna do endométrio.
proteínas para averiguar a sua relação com a
8
PROPOSIÇÕES
9
Proposições
Propõe-se no estudo:
1. Estudar a expressão das proteínas Wnt1, Frizzled1, Wnt5a, Frizzled5 e βcatenina em tecidos de endométrio atrófico e no câncer do endométrio de
mulheres menopausadas, pela técnica de imuno-histoquímica.
2. Mostrar a relação da via Wnt com o endométrio atrófico e com o câncer do
endométrio.
10
METODOLOGIA
11
Metodologia
Pacientes
Estudo retrospectivo de tecidos endometriais, blocados em parafina, de mulheres
na pós-menopausa com diagnóstico histopatológico de endométrio atrófico ou
adenocarcinoma endometrióide de endométrio, atendidas na Disciplina de Ginecologia
Oncológica da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina
(UNIFESP-EPM), no período de 1993 a 2005.
Os blocos e lâminas corados pela Hematoxilina-eosina (HE) pertinentes às
casuísticas de interesse foram recuperados do Arquivo de Blocos do Departamento de
Patologia da UNIFESP/EPM. A revisão histopatológica foi realizada e foram
selecionadas as áreas de interesse ao estudo imuno-histoquímico.
O estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em Pesquisa da UNIFESP/EPM sob o
número 0226/06.
Foram formados dois grupos: A – endométrio atrófico (n=15) e B – câncer do
endométrio (n=45).
Critérios de Inclusão
Foram incluídos os blocos de pacientes com diagnóstico de endométrio atrófico
ou adenocarcinoma endometrióide de endométrio sem tratamento (quimioterápico ou
radioterápico), pré-cirúrgico, maiores de 40 anos e nos quais o material histopatológico
encontrava-se adequado para montagem do TMA (Tissue microarray).
Critérios de Exclusão
Pacientes com qualquer outro tipo histológico de câncer endometrial, menores de
40 anos, com tratamento pré-cirúrgico. Não foram utilizados blocos que apresentaram
material inadequado para a confecção do TMA.
Construção do Tissue Microarray (TMA)
12
Para a confecção do TMA os blocos com material embebido em parafina foram
selecionados oriundos do arquivo do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM.
Posteriormente, cortes histológicos foram efetuados e corados pelo HE. Foram
analisados por patologista que selecionou e delimitou área representativa do tumor. A
seguir, esta área foi delimitada no “bloco doador” com uma caneta de marcação
permanente, que serviu de guia para a retirada dos fragmentos tumorais do local exato.
Após marcação, o bloco doador foi puncionado e retirado fragmentos com 1.0 mm
de diâmetro que foi transferido para o bloco receptor. Foi confeccionado o bloco
receptor com imagem em espelho, sendo incluídos 220 cilindros de adenocarcinoma de
endométrio e 30 cilindros de endométrio atrófico. Tecido hepático foi acrescentado no
bloco para auxiliar na localização inicial de cada seqüência utilizada.
Os blocos receptores foram colocados na estufa a 35° por 15 minutos, a fim de
permitir a aderência entre a parafina do bloco e os cilindros. Após a aderência, os
blocos receptores foram retirados da estufa e cortados com espessura de 4 µm. Foi
colocada fita adesiva em cima do bloco antes de ser cortado, para auxiliar na aderência
entre o corte e a lâmina. Para manter esta aderência, a lâmina foi submetida à luz
ultravioleta por 15 minutos, depois em solução (TPC Solvent) novamente por 15
minutos. Para retirada da fita, a lâmina foi deixada em temperatura ambiente até
secarem, e posteriormente, a fita foi retirada com o auxilio de uma pinça e a lâmina
estocada no freezer.
Por meio de planilha elaborada no programa Excel® (Windows® - Microsoft®
Office) foi possível organizar e localizar cada caso nas lâminas do TMA.
Imuno-Histoquímica
O método imuno-histoquímico foi empregado para a detecção das proteínas
Wnt1, Wnt5a, Frizzled1, Frizzled5 e β-catenina em um total de 60 amostras (45 de
câncer do endométrio e 15 de endométrio atrófico).
Foi utilizado o método da streptavidina-biotina-peroxidase, que utiliza três
reagentes e baseia-se na capacidade da estreptavidina ligar-se na biotina. O primeiro
reagente é representado pelo anticorpo primário específico para o antígeno a ser
13
localizado e o segundo pelo anticorpo conjugado à biotina com capacidade para ligarse especificamente ao anticorpo primário. O terceiro é o complexo peroxidase
conjugado à biotina associada à estreptavidina. Por último, utilizou-se um substrato e
agente cromogênico que permitiu visualizar o antígeno pela formação de precipitado
marrom estável na região correspondente a membrana e citoplasma da célula.
Como controle positivo, foi utilizado corte histológico de carcinoma de cólon
comprovadamente positivo para as proteínas de interesse. Para o controle negativo o
anticorpo primário foi substituído por PBS. A imuno-expressão correspondeu à
coloração acastanhada do núcleo, da membrana ou do citoplasma, dependendo das
características de cada proteína.
Critérios de Avaliação
Em relação às proteínas Wnt 1, Wnt 5a, Frizzled 1 e Frizzled 5, a interpretação
dos resultados seguiu a seguinte padronização:
- Pontuação 0: nenhuma coloração ou coloração de menos de 10% das células.
Reação considerada negativa;
- Pontuação 1+: fraca coloração em mais de 10% das células. Células coradas
apenas em parte da membrana. Reação considerada negativa;
- Pontuação 2+: Coloração de fraca a moderada. Membrana corada
completamente em mais de 10% das células. Reação considerada positiva;
- Pontuação 3+: Coloração forte e completa da membrana em mais de 10% das
células. Reação considerada positiva.
Já a interpretação da β-catenina foi feita conforme a seguinte pontuação:
- Pontuação 1: Coloração de até 4% do núcleo e do citoplasma da célula. Reação
considerada negativa;
- Pontuação 2: Coloração de 5% a 29% do núcleo e do citoplasma da célula.
Reação considerada fraca;
14
- Pontuação 3: Coloração de 30% a 49% do núcleo e do citoplasma da célula.
Reação considerada moderada;
- Pontuação 4: Coloração de mais de 50% do núcleo e do citoplasma da célula.
Reação considerada forte.
Análise estatística
Neste teste, considerou-se duas hipóteses:
- Hipótese da nulidade: As populações estudadas não diferem em relação à
frequência com que ocorre uma característica (independente entre as variáveis).
- Hipótese experimental: As diferenças amostrais refletem diferenças reais na
população (dependência entre as variáveis). Se as diferenças entre as frequências
obtidas e as esperadas forem suficientemente grandes, rejeita-se a hipótese de
nulidade e afirma-se que há uma diferença real na população.
O impacto de determinadas variáveis sobre o prognóstico foi medido analisandose a sobrevida global que é definida como o tempo, em dias, desde a data da cirurgia,
ou da biópsia, até o óbito, ou a última informação objetiva do seguimento. No
acompanhamento, considerou-se como perdida a paciente que não retornou à
consulta, ou da qual não se obteve qualquer informação após o intervalo estipulado
pelo médico para sua reavaliação.
O cálculo dos estimadores de sobrevida foi realizado pela técnica de
Kaplan-Meier.
As
comparações
entre
distribuições
de
sobrevida
para
as
categorias de uma mesma variável foram realizadas pelo teste de Log-Rank,
quando não houve cruzamento entre as curvas, ou pelo teste de Wilcoxon, quando
houve cruzamento entre elas (KAPLAN & MEIER, 1958).
A análise estatística foi feita através do teste qui-quadrado, comparando-se as
médias, distribuições e porcentagens das amostras, segundo os critérios avaliados. O
teste t Student´s foi usado para as amostras pequenas, em que as variâncias foram
iguais. Os resultados foram considerados significativos com valores de p menores que
5%.
15
RESULTADOS
16
Resultados
Os resultados foram avaliados nos dois grupos estudados: grupo A - endométrio
atrófico e grupo B - câncer do endométrio.
No grupo B, a média de idade foi 65,9 anos e a doença foi mais incidente na raça
branca (88,9%) (tabela 1) e o estadiamento mais encontrado foi o IB e IC (tabela 2).
Tabela 1: Média de Idade e Raça das Pacientes com Câncer de Endométrio
Variáveis
(n = 45)
Idade (anos)
média (dp)
65,9 (8,6)
mediana
mínimo – máximo
65
51 – 88
Raça – n (%)
Branca
40 ( 88,9%)
Negra
5 ( 11,1%)
Tabela 2: Estadiamento Clínico das Pacientes com Câncer de Endométrio
Estadio Clínico – n (%)
n = 44
IB
13 ( 29,5%)
IC
16 ( 36,4%)
IIA
2(
4,5%)
IIB
5 ( 11,4%)
IIIA
5 ( 11,4%)
IIIB
1(
2,3%)
IIIC
2(
4,5%)
17
Em todos os casos, a expressão dos marcadores Wnt1, Wnt5a, Frizzled1,
Frizzled 5 e β-catenina foi encontrada praticamente somente no citoplasma (figura 2).
Figura 2: Expressão dos Marcadores das proteínas Wnt1, Wnt5a, Frizzled1,
Frizzled 5 e β-catenina nos grupos A e B.
18
Nenhuma diferença significante foi observada na expressão da ß-catenina entre
os grupos A e B, com positividade de 100% e 95.6%, respectivamente (p = 1.000)
(tabela 3 e gráfico 1).
Tabela 3 – Distribuição da Expressão da β-catenina e do sublocal nas pacientes
segundo o grupo
Grupo
Escore de Beta
catenina – n (%)
Tumor (n = 45)
Negativo
2(
Positivo
Atrófico (n = 15)
4,4%)
43 ( 95,6%)
Comparação
0(
0,0%)
15 (100,0%)
p = 1,000
Sublocal
0
2(
2
4,4%)
43 ( 95,6%)
0(
0,0%)
15 (100,0%)
Porcentagem de pacientes
Gráfico 1 – Distribuição da expressão de β-catenina nas pacientes segundo o grupo
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
95,6
4,4
Tumor
0
Atrófico
p = 1,000
Beta catenina negativo
Beta catenina positivo
19
Com relação à expressão do Wnt1, FZD1 e Wnt5a, nenhuma diferença
significante foi observada entre os grupos (tabelas 4, 5, 6 e gráficos 2, 3, 4).
Tabela 4 – Distribuição da Expressão de Wnt 1 e do sublocal nas pacientes segundo o grupo
Grupo
Escore de Wnt 1 n
(%)
Tumor (n = 45)
Negativo
2(
Positivo
Atrófico (n = 15)
4,4%)
43 ( 95,6%)
Comparação
0(
0,0%)
15 (100,0%)
p = 1,000
Sublocal
0
1(
2,2%)
0(
0,0%)
1
1(
2,2%)
0(
0,0%)
2
43 ( 95,6%)
15 (100,0%)
Porcentagem de pacientes
Gráfico 2 – Distribuição da expressão de Wnt 1 nas pacientes segundo o grupo
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
4,4
Tumor
p = 1,000
100,0
95,6
WNT 1 negativo
0,0
Atrófico
WNT 1 positivo
20
Tabela 5 – Distribuição da Expressão de FZD1 e do sublocal nas pacientes segundo o grupo
Grupo
Escore de FZD1 – n
(%)
Maligno (n = 35)
Negativo
1(
Positivo
Benigno (n = 21)
2,2%)
44 ( 97,8%)
Comparação
0(
0,0%)
15 (100,0%)
p = 1,000
Sublocal
2
45 (100,0%)
15 (100,0%)
Porcentagem de pacientes
Gráfico 3 – Distribuição da expressão de FZD1 nas pacientes segundo o grupo
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
2,2
Tumor
p = 1,000
100,0
97,8
FZD 1 negativo
0,0
Atrófico
FZD 1 positivo
21
Tabela 6 – Distribuição da Expressão de Wnt 5a e do sublocal nas pacientes segundo o
grupo
Grupo
Escore de Wnt 5a –
n (%)
Tumor (n = 45)
Negativo
0(
Positivo
Atrófico (n = 15)
0,0%)
0(
45 (100,0%)
Comparação
0,0%)
15 (100,0%)
p = ---
Sublocal
2
45 (100,0%)
15 (100,0%)
Gráfico 4 – Distribuição da expressão de Wnt 5a nas pacientes segundo o grupo
Porcentagem de pacientes
100,0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0,0
Tumor
WNT 5a negativo
100,0
0,0
Atrófico
WNT 5a positivo
Em contrapartida, houve diferença significante entre os grupos com relação à
expressão do FZD5 (p = 0.001). A proporção das mulheres FZD5 positivas foi maior no
grupo A (80.0%) comparado ao grupo B (31.1%) (tabela 7 e gráfico 5).
22
Tabela 7 – Distribuição da Expressão de FZD5 nas pacientes segundo o grupo
Grupo
Escore de FZD5 – n
(%)
Tumor (n = 45)
Atrófico (n = 15)
Negativo
31 ( 68,9%)
3 ( 20,0%)
Positivo
14 ( 31,1%)
12 ( 80,0%)
Comparação
p = 0,001 *
Porcentagem de pacientes
Gráfico 5 – Distribuição da expressão de FZD5 nas pacientes segundo o grupo
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
80,0
68,9
31,1
20,0
Tumor
Atrófico
p = 0,001 *
FZD 5 negativo
FZD 5 positivo
Quanto à curva de sobrevivência para FZD5, no grupo B, não se observou
diferença entre mulheres positivas e negativas (p= 0,301) (gráfico 6).
23
Probabilidade de Sobrevida
Gráfico 6 – Curva de Sobrevida FZD5
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
p = 0,301
5
10
15
20 25 30 35 40 45 50
Tempo de Seguimento (meses)
FZD 5 negativo
FZD 5 positivo
55
60
24
DISCUSSÃO
25
Discussão
Via Canônica
O adenocarcinoma endometrióide está relacionado ao câncer do endométrio tipo
I, o qual está associado, diretamente, ao hiperestrogenismo (1). Portanto, a chave para
entender o papel da via de sinalização Wnt no câncer do endométrio tipo I, é encontrar
a ligação entre Wnts e a sinalização do estrogênio.
Muitos autores sugerem que a mutação da β-catenina/CTNNB1 no endométrio
levaria ao seu acúmulo no núcleo, resultando no câncer do endométrio (74, 75, 76).
Pijnenborg et al encontraram o acúmulo nuclear de β-catenina em 38% dos cânceres
do endométrio (43). Kariola et al encontraram 53% (17) e Schlosshauer et al, 47% (71).
Em nosso trabalho, não encontramos diferença significante na expressão da βcatenina, quando comparamos o endométrio atrófico com o câncer do endométrio.
Bansal et al (2009) pontuaram que a β-catenina tem menor associação com o câncer
endometrial, embora significante, quando comparada a outras alterações genéticas
(65). Segundo estes autores, a mais freqüente alteração genética do câncer do
endométrio é o PTEN, conforme também demonstrado em outros trabalhos (1, 7, 8, 37,
38, 65, 72). Por outro lado, parece que as mutações do PTEN não causam acúmulo
nuclear de β-catenina em carcinomas do endométrio, como foi demonstrado por
Wappenschmidt et al (72). Assim, conjecturamos que, em nossa pesquisa, este pode
ter sido o motivo de não termos achado diferença entre os grupos estudados.
Além disso, a expressão da β-catenina pode estar envolvida com o
desenvolvimento das lesões precursoras do câncer do endométrio, sendo menos
importante para o desenvolvimento do câncer endometrial. Nei et al encontraram a βcatenina nuclear em 70% das amostras de hiperplasia endometrial e 56,7% das
amostras do câncer do endométrio. Entretanto, eles também demostraram que existe
acúmulo nuclear da β-catenina nas fases pré-proliferativa e pós-proliferativa, e na fase
secretora inicial do endométrio normal durante o ciclo menstrual. Neste período,
observaram que 12 dos 15 casos estudados (80,0%) apresentaram acúmulo nuclear da
β-catenina (53). Em razão disto, nosso resultado pode ter sido semelhante para ambos
os grupos, endométrio atrófico e câncer do endométrio, por a β-catenina está expressa
desde o endométrio normal até o câncer.
26
Há relatos que correlacionam estrógenos com a via canônica Wnt, sugerindo que
esta seja capaz de regular o crescimento celular uterino dependente do estrogênio,
através da estabilização nuclear da β-catenina. Mostram, também, que o aumento do
número de receptores estrogênicos promove a inibição do Wnt5 e Frizzled5, levando
ao desenvolvimento do câncer (77,79).
Os estudos realizados em células epiteliais mamárias e no câncer de mama
revelaram que a baixa concentração da β-catenina em células com elevado nível de
MTA1s (antígeno metastático do tumor) foi acompanhada por redução correspondente
na expressão do gene Wnt1 (73). Assim, conforme exemplificado por Kumar et al,
destaca-se que outros fatores podem coexistir, interferindo na sinalização da via Wnt.
Em relação aos resultados encontrados para o Wnt1, observamos que os dois
grupos estudados foram Wnt1 positivos (endométrio atrófico 100%; adenocarcinoma
95,6%), sem diferença estatística entre eles. Olson et al afirmaram que o Wnt1 está
relacionado com a tumorigênese, enquanto o Wnt5a não (33, 78, 80, 81). Propuseram,
ainda, que existe uma relação antagonista entre estes dois genes, podendo um
suprimir o outro (13, 33, 57). Sugere-se então que em nosso estudo o Wnt5a pode ter
inibido o Wnt1 no endométrio atrófico e não no adenocarcinoma do endométrio,
conforme explicaremos a seguir. Por outro lado, Topol et al demonstraram que o Wnt1
pode também ser inibido por diversos mecanismos, incluindo a expressão de proteínas
APC e Siah2 (Seven-in-Absentia Homolog 2) (54).
Segundo os resultados da nossa pesquisa, o Frizzled1 foi positivo em ambos os
grupos, não existindo diferença significante.
O Frizzled1 constitui receptor da superfície celular, que se liga a diversos coreceptores, podendo ativar diferentes vias Wnt. É responsável pela diferenciação,
proliferação e apoptose celular, e sua função depende do Wnt a que está ligado (59).
Evidências sugerem que o Frizzled 1 pode ser estimulado a partir dos Wnt3a, Wnt3 e
Wnt1 e, dessa forma, em nosso estudo, o Frizzled1 pode ter seguido várias
alternativas, mostrando resultados semelhantes em ambos os grupos (58, 60).
Sabe-se, também, que o Frizzled1 pode antagonizar a ação do Wnt1 (59). Assim,
pode ter suprimido este gene no endométrio atrófico, e nele ter atuado sinergicamente
com o Wnt5a.
27
Via Não-Canônica
Em nosso estudo, encontramos o Wnt5a positivo (100%) em ambos os grupos.
Entretanto, a expressão do FZD5 foi significativamente maior no grupo A – endométrio
atrófico (80,0%), quando comparado ao grupo B – adenocarcinoma (31,1%).
É possível que a semelhança entre os grupos em relação ao Wnt5a seja causada
pela expressão natural do Wnt5a no endométrio normal e no câncer do endométrio.
Pode-se conjecturar, ainda, que o mesmo padrão hormonal entre os dois grupos, levam
a fenótipos parecidos, havendo interferência na expressão do Wnt e permitindo
resultados iguais e positivos 100 % em ambos os grupos (13, 14).
Infere-se dos estudos de Olson et al que o Wnt5a é inibido no câncer de
endométrio e no câncer de mama, por regular o crescimento e a proliferação celular.
Isto sugere que a diminuição da expressão do Wnt5a é importante na progressão dos
eventos que levam ao desenvolvimento do câncer. Por outro lado, podemos, ainda,
considerar o fato de que o Wnt5a se ligou ao FZD5. Dessa forma, acredita-se que, em
nosso estudo, devido à baixa frequência do FZD5 no grupo do adenocarcinoma, a
sinalização não-canônica pode não ter funcionado adequadamente, possibilitando o
desenvolvimento do câncer, pela ação tumorigênica do Wnt1.
Corroborando com as idéias explanadas, Ishitani et al e Topol et al propuseram
que a sinalização não-canônica pode inibir a sinalização canônica através de diversos
mecanismos (54, 66).
Singleton et al descobriram que o Wnt5a e o FZD5 são inibidos pelo bisfenol-A
(um antagonista do receptor de estrogênio) e pelo estradiol (67). Estas descobertas
estão de acordo com a fisiopatologia do adenocarcinoma do endométrio do tipo I.
Semelhante ao câncer de endométrio, o câncer de mama também é estimulado por
estrogênios (67). Jonsson et al descobriram que a perda de expressão do Wnt5a foi
significativamente associada à um alto grau histológico, recidivas da doença e morte
(68). Semelhantes achados foram descritos por outros autores em seus estudos sobre
o câncer de mama e a via Wnt (43, 68,69,70).
Recentemente, o nosso serviço defendeu a idéia de que a via Wnt não-canônica
tem papel importante no câncer de ovário, relacionado ao pior prognóstico. Em
contrapartida, em relação à β-catenina, não se confirmou tal associação, exceto com o
28
carcinoma endometrióide do ovário. Esta neoplasia tem um padrão molecular
semelhante ao adenocarcinoma do endométrio, no que concerne a via Wnt. Dessa
forma, pode-se sugerir que a baixa atividade da via Wnt não-canônica, por não
degradar a
β-catenina, permitiria o desenvolvimento do adenocarcinoma do
endométrio do tipo I. Isto reflete a complexidade da via Wnt, em que o conceito de
genes supressores e promotores de tumores é inconstante (64).
No presente estudo, não encontramos diferença entre os grupos referentes ao
Wnt5a. No entanto, outras pesquisas acharam-no inibido em carcinomas do endométrio
quando comparado ao tecido normal (14).
Em relação à curva de sobrevida do FZD5, houve uma tendência de melhor
prognóstico para as mulheres FZD5 positivas; entretanto, a associação não foi
significante. Isto também reforça a idéia de uma função de "protetor" da via Wnt nãocanônica para o carcinoma endometrial.
29
CONCLUSÕES
30
Conclusões
1) Observou-se grande expressão do Wnt1, Frizzled1, Wnt5a e βcatenina, tanto no câncer do endométrio quanto no endométrio atrófico,
não havendo diferença entre os grupos. Em contrapartida, verificou-se que
a expressão do Frizzled5 foi maior no endométrio atrófico do que no câncer
do endométrio.
2) A via Wnt está envolvida no tecido endometrial, podendo estar
relacionada ao câncer do endométrio.
31
ANEXOS
32
Anexo 1: Aprovação Comitê de Ética
33
34
Anexo 2: Identificação das Pacientes com neoplasia do endométrio
Caso
n0
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
Nome
(Iniciais)
EOV
HF
MCMS
AZC
DLRLP
TA
EMA
EMT
NR
MA
AJML
ESP
MFP
PPP
EMJP
DAS
GP
AS
IBO
RAM
RZGFP
DAFA
GAG
SSD
RNP
WT
CS
MAC
GNS
MJM
AAM
IBP
RMTF
LAM
RJR
NCO
TNL
IVCS
MFNSC
EAA
EPO
DFB
RFC
MFRM
MHF
Identificação
(RG – HSP)
817.086
825.219
840.454
415.180
674.443
860.632
901.106
889.383
903.933
916.948
937.128
943.134
939.872
722.129
935.374
966.405
850.066
434.048
334.851
1.004.840
1.012.705
951.933
893.799
1.134.962
1.113.914
1.116.275
648.097
1.164.898
818.247
684.434
10.022.817
847.374
1.100.903
10064489
772.992
356.909
902.480
10.020.491
1.051.409
10.040.681
1.201.218
601.299
1.062.508
10.020.893
741.065
Número da
lâmina
B93/8.625
B93/9.662
B93/11.278
B93/11.711
B94/4.636
B94/11.605
B95/10.045
B95/10.904
B95/12.993
B95/19.081
B96/12.867
B96/15.094
B96/16.992
B96/17.766
B97/656
B97/17.163
B98/1.022
B98/14.541
B98/17.246
B98/21.981
B99/5.228
B99/6881
B01-12530
B01-14369
B01-18651
B01-18816
B01-21662
B01-22453
B01-23356
B03-00987
B03-14689
B03-19803
B03-26792
B03-30535
B01-20544
B03-22720
B03-28421
B02-16746
B00-13456
B02-39361
B01-23352
B01-40704
B00-30897
B02-13071
B94/2.176
Idade
(Anos)
58
62
56
66
53
63
69
61
68
75
57
79
71
78
62
70
64
83
69
72
59
62
78
72
63
53
56
63
59
69
70
78
54
55
69
64
66
70
56
70
65
63
73
51
55
Raça
BRANCA
BRANCA
NEGRA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
NEGRA
BRANCA
BRANCA
NEGRA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
NEGRA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
NEGRA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
BRANCA
35
Anexo 3: Antecedentes Ginecológicos e Obstétricos: Idade da Menarca e da
Menopausa , Tempo de Menopausa (Anos), Número de Gestações (G), Partos (P) e
Abortamentos (A) das enfermas com neoplasia endometrial.
Caso n0
Menarca
Menopausa
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
13
13
11
14
11
14
14
13
11
12
13
15
12
14
12
13
12
11
11
12
13
13
13
13
14
12
15
12
12
12
18
12
17
11
11
16
14
12
13
13
11
16
14
14
12
54
52
52
50
46
54
50
46
45
53
50
45
50
51
52
53
50
55
45
45
40
57
48
48
53
47
45
48
49
48
36
53
52
49
50
52
43
50
47
50
48
55
53
53
42
Tempo de pósmenopausa
4
10
4
16
7
9
19
15
23
20
7
34
11
17
10
17
14
28
24
27
19
5
30
30
10
6
26
40
14
22
34
16
26
5
19
26
21
13
9
1
8
10
20
6
12
G
P
A
0
0
7
3
4
3
3
3
1
5
3
2
1
3
6
4
0
8
2
2
3
2
2
3
3
1
11
4
3
9
1
4
3
2
6
5
4
1
0
3
3
2
7
2
3
0
0
6
3
3
1
3
1
1
4
3
1
1
2
5
4
0
7
1
1
3
2
2
3
3
1
11
3
3
9
1
4
2
2
6
3
4
1
0
3
3
2
7
2
2
0
0
1
0
1
2
0
2
0
1
0
1
0
1
1
0
0
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
1
36
Anexo 4: Dados Clínicos: Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS), Índice de Massa
Corpórea (IMC) e o Valor da Glicemia de Jejum (mg/dl) das enfermas com câncer de
endométrio.
Caso No
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
HAS
Ausente
Presente
Presente
Presente
Ausente
Presente
Presente
Ausente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Ausente
Presente
Presente
Ausente
Ausente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Presente
Presente
Ausente
Presente
Ausente
Presente
Presente
Ausente
Ausente
Ausente
Presente
Presente
Ausente
Ausente
IMC
30,82
28,98
25,47
24,77
31,24
27,11
35,58
28,84
24,58
27,35
33,46
25,15
24,21
27,05
24,12
27,20
24,97
28,65
34,04
25,47
23,29
37,39
29,68
31,11
25,77
17,77
21,87
27,11
26,91
29,08
32,41
26,57
26,98
34,37
31,11
33,20
36,71
27,55
29,29
27,15
22,27
24,44
27,55
26,95
25,34
Glicemia de jejum
93
84
130
159
94
82
106
86
99
84
91
241
124
102
94
92
88
84
103
204
112
143
157
235
100
77
80
93
71
116
125
90
91
90
154
100
102
129
100
100
140
111
202
87
89
37
Anexo 5: Diagnóstico Anatomopatológico e Estadiamento Clínico-Cirúrgico das
Pacientes com Adenocarcinoma de Endométrio.
Caso No
Número da lâmina
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
B93/8.625
B93/9.662
B93/11.278
B93/11.711
B94/4.636
B94/11.605
B95/10.045
B95/10.904
B95/12.993
B95/19.081
B96/12.867
B96/15.094
B96/16.992
B96/17.766
B97/656
B97/17.163
B98/1.022
B98/14.541
B98/17.246
B98/21.981
B99/5.228
B99/6881
B01-12530
B01-14369
B01-18651
B01-18816
B01-21662
B01-22453
B01-23356
B03-00987
B03-14689
B03-19803
B03-26792
B03-30535
B01-20544
B03-22720
B03-28421
B02-16746
B00-13456
B02-39361
B01-23352
B01-40704
B00-30897
B02-13071
B94/2.176
Diagnóstico
Anatomopatológico
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Adenocarcinoma endometrióide
Estadio
Clínico
IC G2
IIA G1
IB G1
IB G2
IB G2
IIIA G1
IC G1
IC G2
IIIC G1
IB G2
IC G1
IC G1
IC G1
IC G2
IC G1
IIA G1
IB G1
IB G2
IIB G2
IB G2
IB G2
IIB G3
IC G2
IC G1
IIIA G2
IB G2
IIB G2
IIIA G2
IIIA G3
IC G3
IC G1
IC G1
IB G1
IIIC G2
IC G2
IB G2
IC G1
IB G1
IC G1
IIIA G3
IIIB G3
IIB G2
IIB G3
IB G2
IB G1
Sobrevida
(Meses)
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
60
60
>60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
50
> 60
15
> 60
> 60
38
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
> 60
60
> 60
24
> 60
> 60
38
Anexo 6: Técnica Imuno-histoquímica
Para o método Imuno-histoquímico foram obtidos cortes histológicos de 4µm de
espessura depositados em lâminas previamente tratadas com o adesivo 3aminopropyl-triethoxysilane (Sigma-USA) (Burns & Mcgee, 1988).
As lâminas com os cortes foram levadas para a estufa a 60°C, por um
período de 24 horas, para melhor adesão do tecido e desparafinização.
Inicialmente realizamos a desparafinização em três banhos de xilol à
temperatura ambiente por 5 minutos cada e passagem por três banhos de etanol
absoluto por 1 minuto cada.
As lâminas foram lavadas em água corrente por 5 minutos, e submetidas ao
calor (recuperação antigênica) em panela a vapor, submersas em tampão citrato
10mM pH 6,0 por 30 minutos.
Após resfriamento por 20 minutos à temperatura ambiente e posterior
lavagem em água corrente por 5 minutos, foi realizado bloqueio da peroxidase
endógena, utilizando-se solução de peróxido de hidrogênio a 3% em quatro banhos de
5 minutos cada. As lâminas novamente foram lavadas em água corrente por 5 minutos
e posteriormente com tampão PBS pH 7,2 - 7,6, também por 5 minutos.
A incubação com os anticorpos primários foi realizada em câmara úmida à
temperatura de 4°C por um período mínimo de 16 a 18 horas (overnight). Foram
utilizados os anticorpos primários: monoclonal mouse anti-human p53 protein (clone
DO7-Dako) (1:100), monoclonal mouse anti-human p27kip1 protein (Clone SX53G8Dako) (1:100), monoclonal mouse anti-human p21wafi/cip1 protein (Clone SX118-Dako)
(1:50).
Após três lavagens em tampão PBS pH 7,2 - 7,6 foi realizada a incubação
com o anticorpo secundário biotinilado (kit LSAB–Dako, Glostrup, Denmark)
em
câmara úmida, à temperatura ambiente, por 30 minutos.
Posteriormente, após três lavagens em tampão PBS pH 7,2 - 7,6, foi
realizada incubação com o complexo estreptavidina-biotina-peroxidase (kit LSABDako, Glostrup, Denmark) em câmara úmida à temperatura ambiente, por 30 minutos.
Seguiram-se lavagens com tampão PBS pH 7,2 - 7,6 e revelação com 60
mg de Diaminobenzidina (DAB–Sigma, USA) diluído em 100 mL de PBS pH 7,2 - 7,6,
39
acrescido de 2 mL de peróxido de hidrogênio a 3% à temperatura ambiente, por 5
minutos.
Após lavagem em água corrente por 3 minutos, realizou-se a contracoloração com hematoxilina de Harris por 1 minuto. As lâminas foram desidratadas em
três banhos de etanol absoluto e três banhos de xilol e posteriormente montadas com
lamínulas e resina Entellan (Sigma-USA) para análise em microscopia óptica comum.
40
Anexo 7: Declaração de aceite da revista São Paulo Medical Journal/Evidence for
Health Care
41
Anexo 8: Artigo original
PDF gerado em: 13/10/2010 as 15:52:47
Protocol: SPMJ000187/2010 (4th submission: January 31, 2011)
Original article
Canonical and noncanonical Wnt pathways: a comparison
between endometrial cancer type I and atrophic endometrium in
Brazil
Vias Wnt canônica e não canônica: uma comparação entre o câncer endometrial
tipo I e endométrio atrófico no Brasil
Gynecological Oncology Sector, Department of Gynecology, Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina (Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil
Autores
Marina de Pádua Nogueira MenezesI, Celina Tizuko Fujiyama OshimaII, Levon Badiglian
FilhoI, Thiago Simão GomesIII, Luis Fernando Mesias BarrezuetaIV, João Norberto StávaleII,
Wagner José GonçalvesV
I
MD. Gynecologist and Gynecological and Obstetric Surgeon, Gynecological Oncology Sector,
Department of Gynecology, Universidade Federal de São Paulo — Escola Paulista de Medicina
(Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil.
MD, PhD. Adjunct Professor, Department of Pathology, Universidade Federal de São Paulo —
II
Escola Paulista de Medicina (Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil.
MSc. Biologist, Department of Pathology, Universidade Federal de São Paulo — Escola Paulista de
III
Medicina (Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil.
IV
MSc. Pathologist, Department of Pathology, Universidade Federal de São Paulo — Escola Paulista
de Medicina (Unifesp-EPM), São Paulo, Brazil.
V
MD, PhD. Adjunct Professor, Head of the Gynecological Oncology Sector, Department of
Gynecology, Universidade Federal de São Paulo — Escola Paulista de Medicina (Unifesp-EPM), São
Paulo, Brazil.
42
KEY WORDS:
Wnt proteins.
Endometrial neoplasms.
Women.
Postmenopause.
Endometrium.
ABSTRACT
CONTEXT AND OBJECTIVE: The Wnt pathway is involved in tumorigenesis of several
tissues. For this reason, we proposed to evaluate Wnt gene expression in endometrial cancer
type I.
DESIGN AND SETTING: Cross-sectional study on materials gathered from the tissue bank
of the Department of Pathology, Universidade Federal de São Paulo.
METHODS: Endometrial specimens were obtained from surgeries performed between 1995
and 2005 at São Paulo Hospital, Universidade Federal de São Paulo. The material was
divided in two groups according to tissue type: Group A, atrophic endometrium (n = 15); and
Group B, endometrial adenocarcinoma (n = 45). We compared the immunohistochemical
expression of Wnt1, Frizzled-1 (FZD1), Wnt5a, Frizzled-5 (FZD5) and beta-catenin between
endometrial cancer type I and atrophic endometrium.
RESULTS: Regarding Wnt1, FZD1 and Wnt5a expression, no significant association was
observed between the groups. A significant association was observed between the groups in
relation to FZD5 expression (P = 0.001). The proportion of FZD5-positive samples was
significantly higher in group A (80.0%) than in group B (31.1%). Regarding the survival
curve for FZD5 in group B, we did not find any significant association between atrophic
endometrium and endometrial adenocarcinoma. We also did not find any significant
association regarding beta-catenin expression (P = 1.000).
CONCLUSION: FZD5 is downregulated in endometrial adenocarcinoma, in comparison
with atrophic endometrium.
PALAVRAS-CHAVE:
Proteínas Wnt.
Neoplasias do endométrio.
Mulheres.
43
Pós-menopausa.
Endométrio.
RESUMO
CONTEXTO E OBJETIVO: A via Wnt está envolvida na tumorigênese de diversos tipos
de tecidos. Por esta razão, propusemo-nos a avaliar a expressão de genes da família Wnt no
câncer endometrial tipo I.
TIPO DE ESTUDO E LOCAL: Estudo transversal com coleta de materiais do banco de
tecidos do Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo.
MÉTODOS: Amostras endometriais foram obtidas de cirurgias que ocorreram entre 1995 e
2005 no Hospital São Paulo, Universidade Federal de São Paulo. Foram separados dois
grupos segundo o tipo de tecido obtido: grupo A, com endométrio atrófico (n = 15); e grupo
B, com adenocarcinoma endometrial (n = 45). Comparamos a expressão imunoistoquímica
de Wnt 1, Frizzled-1 (FZD1), Wnt 5a, Frizzled-5 (FZD 5) e beta-catenina entre câncer
endometrial tipo I e endométrio atrófico.
RESULTADOS: Na expressão do Wnt1, FZD1 e Wnt5a, não observamos associação
significante entre os grupos. Na expressão do FZD5, encontramos associação significante
entre os grupos (P = 0,001). A proporção de positividade do FZD5 foi significantemente
maior no grupo A comparado ao grupo B (31,1%). Em relação à curva de sobrevida para o
FZD5 no grupo B, não tivemos associação significante entre endométrio atrófico e
adenocarcinoma do endométrio. Também não observamos associação significante na
expressão da beta-catenina (P = 1,000).
CONCLUSÃO: FZD5 é downregulated no adenocarcinoma endometrial quando comparado
ao endométrio atrófico.
Corpo do texto
INTRODUCTION
The Wnt family has an important role in tumorigenesis and embryogenesis.1-5 Wnts
are an evolutionarily highly conserved family of genes/proteins that act through three
signaling pathways.6 The canonical pathway involves regulation of beta-catenin. Briefly, in
the absence of Wnt signaling, a multiprotein complex, that includes adenomatous polyposis
coli (APC), glycogen synthase kinase-3 (GSK3) and axin, ensures degradation of betacatenin, thereby limiting the free intracytoplasmic pool of beta-catenin. The presence of Wnt
signaling through the Frizzled (FZD) receptor and the low-density lipoprotein receptorrelated protein 5 and 6 (LRP5/6) receptor complex inactivates GSK3 and causes its
44
dissociation from axin, thereby preventing phosphorylation of beta-catenin. The
intracytoplasmic pool of beta-catenin thus increases, and it translocates to the nucleus, where
it complexes with members of the T-cell factor/lymphocyte enhancement factor (LEF/TCF)
family of transcription factors to mediate transcriptional induction of target genes such as cmyc, cyclin D, vascular endothelial growth factor (VEGF) and others.1-5
In noncanonical or planar cell polarity (PCP) signaling, Wn.t signaling is transduced
through FZD, independent of LPR5/6. This pathway mediates cytoskeletal changes through
activation of the small GTPases Rho and Rac. Another noncanonical Wnt signaling pathway
is WntCa2+. Wnt signaling via FZD mediates activation of heterotrimeric G-proteins, which
engage Dsh, phospholipase C calcium-calmodulin kinase 2 (CamK2) and protein kinase C
(PKC). This pathway modulates cell adhesion and motility.7
A fourth Wnt signaling pathway can be envisaged, since Chen et al. demonstrated that
adenylyl cyclase signaling via protein kinase A (PKA) and its target transcription factor
cAMP-responsive element-binding protein (CREB) are required for Wnt-directed myogenic
gene expression. They also showed that Wnt proteins can also stimulate CREB-mediated
transcription.6,8
In relation to endometrial cancer, most of the studies that have linked Wnt signaling
to this disease focused on the role of beta-catenin. However, other components of Wnt
signaling have been highlighted in recent published papers.
OBJECTIVE
To investigate the role of the expression of the proteins Frizzled-1, Wnt5a, Frizzled-5
and beta-catenin on atrophic endometrial tissues and endometrial cancer, using
immunohistochemical techniques on tissue microarrays obtained from postmenopause
women.
METHODS
Endometrial specimens were obtained from some way operations performed between
1995 and 2005 in the Gynecological Oncology Sector of the Universidade Federal de Sao
Paulo (Unifesp), from patients who underwent laparotomy to treat endometrial cancer or
hysterectomy to treat benign disease. All tissue samples obtained in that period were included
in the study (convenience sample limited by time). None of the patients had received any
45
preoperative therapy. We did not have any sample losses because this was a cross-sectional
study.
The patients were divided into two groups: Group A, atrophic endometrium (n = 15);
and Group B, endometrial adenocarcinoma (n = 45).
All the patients had menopausal status at the time of diagnosis. All the patients in
group B had the endometrioid histological subtype of endometrial adenocarcinoma, of a
variety of tumor grades. The cases of atrophic endometrium (group A) were compared with
the endometrial cancer cases Group B, using parameters that avoided hormonal interference
during the tissue analysis such as menopausal women.
The clinical and surgical staging and histological typing were performed in
accordance with the classification of the International Federation of Gynecology and
Obstetrics.9 The study was approved by the Institutional Ethics Committee (Unifesp).
RESULTS
Most of the patients in group B were staged as IB and IC (Table 1). In all cases,
expression of the markers was found practically only in the cytoplasm (Figure 1).
Regarding Wnt1, FZD1 and Wnt5a expression, no significant association was
observed between the groups.
A significant association was observed between the groups in relation to FZD5
expression (P = 0.001). The proportion of FZD5-positive women was significantly higher in
group A (80.0%) than in group B (31.1%). Regarding the survival curve for FZD5 in group
B, we did not find any significant association between positive and negative women (Figure
2).
No significant association was observed between beta-catenin expression and patient
group, since the expressions for groups A and B were 100% and 95.6%, respectively (P =
1.000).
DISCUSSION
Canonical pathway
Endometrioid endometrial adenocarcinoma is essentially connected with type I
endometrial cancer, which in turn correlates with hyperestrogenism status. Hence, the key to
understanding the role of Wnt signaling in type I endometrial cancer is to find the link
between Wnts and estrogen signaling. Many authors have suggested that a mutation of beta-
46
catenin/CTNNB1 in the endometrium would lead to nuclear accumulation of beta-catenin and
then result in uterine endometrioid cancer.1-3
Pijnenborg et al.3 found nuclear accumulation of beta-catenin in 38% of their
endometrioid endometrial cancer cases, while Kariola et al. found 53% and Schlosshauer et
al. found 47%.4,5 On the other hand, we found no difference in beta-catenin expression
between cases of atrophic endometrium and endometrial cancer, since both groups stained
almost equally in the cytoplasm. This may be explained by the fact that beta-catenin has a
low level of association with endometrial cancer, compared with loss of PTEN (phosphatase
and tensin homologue protein).6 Furthermore, it seems that PTEN mutations do not cause
nuclear beta-catenin accumulation in endometrial carcinomas.7
It is possible that beta-catenin has a more important role in relation to precursor
lesions than in uterine cancer itself. Hideyuki et al. found nuclear beta-catenin in 70% of
their endometrial hyperplasia samples and 56.7% of their endometrial cancer samples.
However, they also showed that nuclear staining of beta-catenin occurred in the midproliferative, late proliferative and early secretion phases of the normal endometrium during
the menstrual cycle. Twelve out of 15 cases (80.0%) during these periods showed nuclear
staining.8
All these findings are concordant with reports that correlate estrogens with the
canonical Wnt pathway, thus suggesting that estrogens or estrogen receptors are capable of
stimulating beta-catenin accumulation.10,11
Comparing lean and obese rats, Zhang et al. found that estrogen more strongly
induced the antiproliferative genes retinaldehyde dehydrogenase-2 and secreted frizzledrelated protein-4 (a negative regulator of Wnt signaling) in lean rats, but had little or no
effect on obese rats.12
Noncanonical pathway
Both groups reached total staining for Wnt5a, and the proportion of FZD5-positive
women was significantly higher in group A (80.0%) than in group B (31.1%).
It is known that noncanonical signaling can inhibit canonical signaling through a
variety of mechanisms.13 We suggest that because of the low proportion of FZD5 positivity
in the adenocarcinoma group, the noncanonical signaling could not function properly and
that this subsequently led to development of hyperplasia and cancer.
Singleton et al. found that Wnt5a and FZD5 were downregulated by bisphenol-A (an
47
estrogen receptor agonist) and estradiol.14,15 These findings are concordant with the
physiopathology of type I endometrial adenocarcinoma.
Breast cancer is comparable with endometrial cancer in that it is also stimulated by
estrogens. Jönsson et al. found that loss of Wnt5a protein expression was significantly
associated with higher histological grade, recurrent disease, early relapse and death. 16
Similar findings have been reported by others.16-18
Recently, we advocated the idea that the noncanonical Wnt pathway has an important
role in ovarian cancer and would lead to a worse prognosis. Furthermore, we advocated that
beta-catenin would not play an important role in epithelial ovarian cancer.19 However,
endometrioid ovarian cancer is an exception to this. This neoplasia has a molecular pattern
similar to that of endometrial adenocarcinoma, with regard to the Wnt pathway. In fact, in
this respect, we suggest that low activity of the noncanonical Wnt pathway would lead to
type I endometrial adenocarcinoma. This would reflect the complexity of the Wnt pathway,
in which the concepts of tumor suppressors and promoters are fickle. Although we did not
find any difference between the groups regarding Wnt5a, others have found that it was
downregulated in endometrial carcinomas, in comparison with normal tissue.20
Regarding the survival curve for FZD5, there was a tendency towards better
prognosis for FZD5-positive women, but this association was not significant. This also
strengthens the idea that the noncanonical Wnt pathway has a protective function in relation
to endometrial carcinoma. The more we learn about the Wnt family and its interactions, the
more we obtain new insights into old problems.
CONCLUSION
Wnts can produce different effects depending on the context. Here, we showed that
FZD5 is downregulated in type I endometrial adenocarcinoma, compared with atrophic
endometrium.
REFERENCES
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uterine endometrium. Cancer Res. 1998;58(16):3526-8.
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CTNNB1
and
APC
genes
in
uterine
endometrioid
carcinoma.
Mod
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2000;13(10):1066-71.
3. Pijnenborg JM, Kisters N, van Engeland M, et al. APC, beta-catenin, and E-cadherin and
the development of recurrent endometrial carcinoma. Int J Gynecol Cancer. 2004;14(5):94756.
4. Kariola R, Abdel-Rahman WM, Ollikainen M, et al. APC and beta-catenin protein
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2005;4(2):187-90.
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6. Bansal N, Yendluri V, Wenham RM. The molecular biology of endometrial cancers and
the implications for pathogenesis, classification, and targeted therapies. Cancer Control.
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Sources of funding: None
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Date of first submission: October 10, 2010
Last received: April 27, 2011
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Marina de Pádua Nogueira Menezes
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Cell. (+55 79) 9132-9002
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Table 1. Clinical staging of patients with endometrial cancer
Clinical staging – n (%)
n = 44
IB
13 (29.5%)
IC
16 (36.4%)
IIA
2 (4.5%)
IIB
5 (11.4%)
IIIA
5 (11.4%)
IIIB
1 (2.3%)
IIIC
2 (4.5%)
51
Figure 1. Expression of the proteins Wnt1, Wnt5a, Frizzled-1 (FDZ1), Frizzled-5 (FDZ5) and
beta-catenin in groups A and B.
Figure 2. Survival curve for Frizzled-5 (FDZ5) in groups A and B.
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