Avaliação do polimorfismo da CYP2D6 em pacientes portadoras de

INSTITUTO DE ENSINO E PESQUISA DA SANTA CASA DE BELO HORIZONTE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO strictu-sensu EM MEDICINA E
BIOMEDICINA
Patricia Aguiar Bellini
“Avaliação do Polimorfismo da CYP2D6 em Pacientes Portadoras de
Câncer de Mama e Usuárias de Tamoxifeno de Dois Serviços de Mastologia de
Belo Horizonte”
Belo Horizonte
2013
PATRICIA AGUIAR BELLINI
“Avaliação do Polimorfismo da CYP2D6 em Pacientes Portadoras de
Câncer de Mama e Usuárias de Tamoxifeno de Dois Serviços de Mastologia de
Belo Horizonte”
Dissertação de mestrado apresentada ao programa de
pós-graduação strictu-sensu do Instituto de Ensino e
Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte para
obtenção de Título de Mestre em Ciências da Saúde –
Medicina/Biomedicina.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Toscano Simões
Co-orientadores:
Prof. Dr. Clécio Enio Murta de Lucena
Profa. Dra. Valéria Cristina Sandrim
Belo Horizonte
2013
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a
fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Bellini, Patricia Aguiar
“Avaliação do Polimorfismo da CYP2D6 em Pacientes Portadoras de
Câncer de Mama e Usuárias de Tamoxifeno de Dois Serviços de
Mastologia de Belo Horizonte”
84 paginas,
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de pós-graduação do
Instituto de Ensino e pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte. Área de
Concentração: Medicina e Biomedicina.
Orientadora: Simões, Renata Toscano
1. Câncer de Mama, 2. Tamoxifeno, 3. Polimorfismo, 4. CYP2D6
BELLINI PA. Avaliação do Polimorfismo da CYP2D6 em Pacientes Portadoras
de Câncer de Mama e Usuárias de Tamoxifeno de Dois Serviços de Mastologia
de Belo Horizonte. Dissertação de Mestrado em Medicina e Biomedicina:
Instituto de Ensino e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte, MG.
Aprovado em: ____/_____/_____
Banca Examinadora
Profa. Dra.:
Instituição:
Julgamento:_____________Assinatura: ____________________________
Prof. Dr.:
Instituição: inst. do prof.
Julgamento______________Assinatura: ____________________________
Prof. Dr.:
Instituição: inst. do prof.
Julgamento:______________Assinatura: ____________________________
Dedico este trabalho a todas as pacientes que, de uma forma o outra, fazem parte
da minha vida.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao Instituto de Ensino e Pesquisa da Santa Casa Belo Horizonte, pela oportunidade
de crescimento e desenvolvimento profissional;
Ao Dr. José Augusto Nogueira Machado, Coordenador do Programa de Pós
Graduação, pela paciência e carinho com todos os seus alunos;
À minha orientadora querida, Dra. Renata Toscano Simões, que me ajudou ao longo
destes dois anos com muita paciência, carinho e competência, me passando
informações e ensinamentos fundamentais, que esteve ao meu lado no momento
que mais precisei, me apoiando e me dando suporte para conseguirmos chegar ao
fim desta caminhada;
Ao meu chefe e orientador, Dr. Clécio Ênio Murta de Lucena, pelos constantes
ensinamentos, não só em relação à Mastologia, mas também sobre metodologia e
oratória, e que, desde o início, acreditou em mim e me fez crer que tudo isso era
possível;
À Dra. Valéria Cristina Sandrim, por ter idealizado este projeto e acreditado em mim
para realizá-lo;
À Shirley e Zélia, sempre presentes nos meus momentos de necessidade e prontas
para ajudar;
Aos colegas da Clínica de Mastologia da Santa Casa e do Felício Rocho, por
dividirem comigo sua experiência e conhecimentos;
Aos colegas do Laboratório do IEP pela disposição, boa vontade e colaboração;
Às minhas queridas pacientes, por me tornarem além de sua médica, sua psicóloga
e sua amiga, sem vocês tudo isso seria em vão, obrigada;
AGRADECIMENTOS
À minha mãe, Ana Paulina, por sempre estar ao meu lado, me incentivando e me
ajudando em todos os momentos;
Ao meu pai, Augusto, por ter sempre acreditado em mim como pessoa e como
médica;
Aos meus irmãos, Augusto e Fabricio, por, apesar da distância, sempre estarem
presentes nos momentos mais importantes;
Ao meu avô, Victor, por ter me proporcionado a realização de um sonho de criança,
o de ser médica;
Ao meu companheiro, Alessandro, pela paciência, compreensão, força, estímulo e
segurança; amor, tudo vale a pena ao seu lado;
À minha filha, Isabela, que me acompanhou neste último ano da caminhada, e
nasceu, para dar um novo sentido a tudo;
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a concretização deste
sonho, obrigada.
“Dedique algo de sua vida aos outros. Sua dedicação não será um sacrifício. Será uma
experiência divertida porque é um intenso esforço aplicado para um fim significativo.”
Dr. Thomas Dooley
RESUMO
BELLINI PA. Avaliação do Polimorfismo da CYP2D6 em Pacientes Portadoras de
Câncer de Mama e Usuárias de Tamoxifeno de Dois Serviços de Mastologia de Belo
Horizonte. Dissertação de Mestrado em Medicina e Biomedicina: Instituto de Ensino
e Pesquisa da Santa Casa de Belo Horizonte, MG.
O câncer de mama (CM) é uma doença heterogênea e complexa, compreendendo
múltiplas formas de apresentação clínica e morfológica, com diferentes graus de
agressividade tumoral e potencial metastático. Ele é o câncer com maior incidência
entre as mulheres, ainda com elevados índices de mortalidade. Seu tratamento é
multidisciplinar, sendo o uso do tamoxifeno (TAM) uma consagrada e importante
modalidade terapêutica. Ele é metabolizado pela enzima CYP2D6 em seus
metabólitos ativos, 4-hidroxitamoxifeno (HTF) e endoxifeno (EDF). O EDF é até 100
vezes mais potente que o TAM em suprimir a proliferação das células tumorais
estrógeno-dependentes. A redução da atividade da CYP2D6, devido a polimorfismos
no gene codificador da enzima ou ao uso de fármacos inibidores, está relacionada à
redução dos níveis de EDF e ao pior prognóstico em mulheres tratadas com o TAM.
Este trabalho teve como objetivo a avaliação do polimorfismo do CYP2D6, variante
*4 e a associação deste polimorfismo com a evolução do CM. Foi realizada
entrevista com 138 pacientes portadoras de CM em tratamento com TAM. Foram
coletados além dos dados clínicos, amostras de sangue para genotipagem do
CYP2D6. Observamos que 14,5% das pacientes apresentaram recidiva e 30% das
pacientes na pré-menopausa apresentavam ciclos menstruais. O tempo médio de
sobrevida livre de doença (SVLD) em meses foi 43,6±45,7, e o tempo médio de
sobrevida global (SG) em meses foi 44,5±46,1. Em relação ao polimorfismo, 81,15%
eram metabolizadores extensos (*1/*1), 16,66% eram metabolizadores
intermediários (*1/*4) e 2,17% eram metabolizadores pobres (*4/*4). Estes dados
corroboram com a literatura em relação ao polimorfismo da CYP2D6. Considerando
a grande incidência do CM e a larga utilização do TAM no tratamento desta
neoplasia, a realização de pesquisas abordando a farmacogenética do TAM é de
grande relevância para avaliar o impacto dos polimorfismos da CYP2D6 no
tratamento adjuvante do CM.
Palavras Chave: Câncer de mama, Polimorfismo, CYP2D6, Tamoxifeno
ABSTRACT
BELLINI PA. Evaluation of CYP2D6 Polymorphism in Patients with Breast Cancer
and Tamoxifen Users of Two Breast Services of Belo Horizonte. Dissertation in
Medicine and Biomedicine: Institute of Education and Research of Santa Casa de
Belo Horizonte Hospital.
Breast cancer (BC) is a heterogeneous and complex disease, comprising multiple
forms of clinical presentation and morphology, with different levels of tumor
aggressiveness and metastatic potential. It is the cancer with the highest incidence
among women and with high mortality rates. Its treatment is multidisciplinary, and the
use of tamoxifen (TAM) is an established and important therapeutic modality. It is
metabolized by the CYP2D6 enzyme into its active metabolites, 4-hidroxitamoxifen
(HTF) and endoxifen (EDF). The EDF is 100 times more powerful than the TAM in
suppressing the proliferation of estrogen-dependent tumor cells. The reduction of the
CYP2D6 activity due to polymorphisms of the gene that encodes the enzyme or the
use of inhibitory drugs have been linked to reduced levels of EDF and worse
prognosis in women treated with TAM. This study aimed to assess the CYP2D6 * 4
polymorphism and secondarily the association of this polymorphism with the
evolution of BC. Interview was conducted with 138 patients with CM treated with
TAM. We collected clinical data and blood samples for CYP2D6 genotyping. We
observed that 14.5% of patients had recurrence and 30% of premenopausal patients
had menstrual cycles. The average disease-free survival in months was 43.6 ± 45.7,
and the average overall survival in months was 44.5 ± 46.1 Regarding the
polymorphism, 81,15% were extensive metabolizers (*1/*1), 16,66% were
intermediate metabolizers (*1/*4) and 2,17% were poor metabolizers (*4/*4). These
data corroborate with the literature in relation to CYP2D6 polymorphism. Considering
the high incidence of BC and the wide use of TAM in the treatment of this tumor,
conducting research addressing the pharmacogenetics of TAM is of great importance
to assess the impact of CYP2D6 polymorphisms in the adjuvant treatment of BC.
Key words: Breast Cancer, Polymorphism, CYP2D6 gene, Tamoxifen
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 01. ESTIMATIVAS PARA O ANO DE 2012 DAS TAXAS BRUTAS DE INCIDÊNCIA POR 100
MIL HABITANTES E DE NÚMERO DE CASOS NOVOS DE CÂNCER, SEGUNDO SEXO E
LOCALIZAÇÃO PRIMÁRIA. .......................................................................................... 2
FIGURA 02. DISTRIBUIÇÃO
PROPORCIONAL DOS DEZ TIPOS DE CÂNCER MAIS INCIDENTES
ESTIMADOS PARA 2012 POR SEXO, EXCETO PELE NÃO MELANOMA. ............................. 2
FIGURA 03. METABOLISMO DO TAMOXIFENO. .................................................................. 12
FIGURA 04. GEL
DE POLIACRILAMIDA MOSTRANDO PADRÃO DE RESTRIÇÃO ENZIMÁTICA DO
POLIMORFISMO DA VARIANTE *4 DO GENE CYP2D6. .............................................. 244
GRÁFICO 01. CURVA DE SOBREVIDA LIVRE DE DOENÇA, SEGUNDO CADA POLIMORFISMO, DAS
138 PACIENTES. ................................................................................................. 388
LISTA DE TABELAS
TABELA 01. CLASSIFICAÇÃO DOS TIPOS HISTOLÓGICOS DA CARCINOMA DE MAMA QUANTO AO
COMPORTAMENTO BIOLÓGICO. ................................................................................. 4
TABELA 02. PRIMERS E ENZIMA UTILIZADOS PARA GENOTIPAGEM CYP2D6*4. .................. 25
TABELA 03. PADRÃO RFLP E ATIVIDADE METABOLIZADORA DA ENZIMA CYP2D6*4........... 25
TABELA 04. DISTRIBUIÇÃO
DAS PERCENTAGENS OBSERVADAS PARA AS VARIÁVEIS IDADE E
COR DAS PACIENTES. .......................................................................................... 266
TABELA 05. DISTRIBUIÇÃO
DAS
PORCENTAGENS
OBSERVADAS
COMORBIDADES E HÁBITOS DE VIDA DAS PACIENTES.
TABELA 06. DISTRIBUIÇÃO
DAS
PORCENTAGENS
PARA
AS
VARIÁVEIS
............................................. 277
OBSERVADAS
PARA
AS
VARIÁVEIS
CARACTERÍSTICAS RELACIONADAS AO CÂNCER DAS PACIENTES............................... 288
TABELA 07. DISTRIBUIÇÃO
DAS
PORCENTAGENS
OBSERVADAS
PARA
AS
VARIÁVEIS
IMUNOHISTOQUÍMICAS RELACIONADAS AO CÂNCER DAS PACIENTES. .......................... 29
TABELA 08. DISTRIBUIÇÃO
DAS
PORCENTAGENS
OBSERVADAS
PARA
AS
VARIÁVEIS
RELACIONADAS AO TRATAMENTO DO CÂNCER DAS PACIENTES................................. 300
TABELA 09. DISTRIBUIÇÃO DAS MÉDIAS E PORCENTAGENS OBSERVADAS PARA AS VARIÁVEIS
RELACIONADAS À EVOLUÇÃO E POLIMORFISMO DAS PACIENTES. .............................. 311
TABELA 10. DISTRIBUIÇÃO DAS MÉDIAS E PORCENTAGENS OBSERVADAS PARA AS VARIÁVEIS
RELACIONADAS AO POLIMORFISMO DAS PACIENTES. ............................................... 322
TABELA 11. DISTRIBUIÇÃO DAS MÉDIAS E PORCENTAGENS OBSERVADAS PARA AS VARIÁVEIS
RELACIONADAS À PRESENÇA DE RECIDIVA NAS PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA.... 366
LISTA DE ABREVIAÇÕES
A – adenina
AFBM – alteração funcional benigna da mama
AIDS – Síndrome da Imunodeficiência Humana Adquirida
Base T – base timina
BLS – biópsia do linfonodo sentinela
BstNI – enzima de restrição (Bacillus stearothermophilus N)
Ca – câncer
CDIS – carcinoma ductal in situ
CM – Câncer de Mama
CNS – Conselho Nacional de Saúde
CYP – Citocromo P450
CYP2D6 – Citocromo P450 família 2 subfamília D gene 6
CYP2D6*4 – alelo 4
Del – deleção
DNA – ácido desoxirribonucléico
EA – esvaziamento axilar
EBCTCG - Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group
EDF - endoxifeno
EDTA – etilenodiamino tetra-ácido
et al. – e colaboradores
EUA – Estados Unidos da América
FDA – food and drug administration
FISH - hibridização in situ por fluorescência
G – guanina
G1, 2 e 3 - grau histológico
GSTs - glutationa S-transferases
HER-2 – human epidermal growth factor receptor 2
HF – história familiar
HTF – hidroxitamoxifeno
IA – inibidor de aromatase
IEP – Instituto de Ensino e Pesquisa
INCA – Instituto Nacional do Câncer
LHRH – hormônio luteinizante liberador humano
LN – linfonodo
M – metástase à distância
Máx – máximo
ME – metabolizador extensivo
mg – miligramas
MI – metabolizador intermediário
Mín – mínimo
min – minutos
MP – metabolizador pobre
MU – metabolizador ultra-rápido
N – status axilar
NATs - N-acetil-transferases
ng – nanograma
NSABP - National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project
ºC – graus Celcius
p – nível de significância
pb – pares de base
PCR – reação em cadeia de polimerase
q – braço longo do cromossomo
q.s.p. – quantidade suficiente para
RE – receptor de estrogênio
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorfism
RP – receptor de progesterona
SCBH – Santa Casa de Belo Horizonte
SERMs – modulador seletivo receptor de estrogênio
SG – sobrevida global
SNP – single nucleotide polymorphism
SUS – sistema único de saúde
SVLD – sobrevida livre de doença
T – tamanho tumoral
TAM – tamoxifeno
TCLE – termo de consentimento livre e esclarecido
TNM -Tumour, Nodes, Metastasis
TRH – terapia de reposição hormonal
USA – United States of America
α – alfa
β – beta
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1
1.1 Epidemiologia do câncer de mama .................................................................... 1
1.2 Fatores Clínicos, Prognósticos e Preditivos do Câncer de Mama ..................... 3
1.3. Tratamento do câncer de mama ....................................................................... 5
1.4 Endocrinologia Mamária .................................................................................... 7
1.5 Hormonioterapia no câncer de mama ................................................................ 8
1.6 Tamoxifeno ...................................................................................................... 10
1.6.1 Tamoxifeno e o câncer de mama............................................................... 10
1.6.2 Farmacocinética do tamoxifeno: Mecanismo de Ação e Metabolismo....... 11
1.7 CYP2D6 ........................................................................................................... 13
1.8 Tamoxifeno e CYP2D6 .................................................................................... 15
2 HIPÓTESE ............................................................................................................. 18
3 JUSTIFICATIVA..................................................................................................... 19
4 OBJETIVOS ........................................................................................................... 20
4.1 Objetivo Geral .................................................................................................. 20
4.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 20
5 PACIENTES E MÉTODOS .................................................................................... 21
5.1 Aspectos Éticos................................................................................................ 21
5.2 Seleção de pacientes ....................................................................................... 21
5.2.1 Abordagem das pacientes e coleta das amostras ..................................... 21
5.2.2 Aplicação do questionário e Coleta das amostras. .................................... 22
5.2.3 Critérios de Inclusão .................................................................................. 22
5.2.4 Critérios de exclusão ................................................................................. 22
5.3 Questionário de dados sócio-demográficos, clínico e laboratorial ................. 222
5.3.1 Ficha de Coleta de Dados ......................................................................... 23
5.4 Extração de DNA ............................................................................................. 23
5.5 Tipagem do CYP2D6*4 .................................................................................... 23
5.6 Análise Estatística .......................................................................................... 255
6 RESULTADOS ..................................................................................................... 266
7 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 39
7.1 Avaliação dos Parâmetros Clínicos.................................................................. 39
7.2 Avaliação do Polimorfismo da CYP2D6 ......................................................... 433
7.2.1 Polimorfismo CYP2D6 e taxa de sobrevida ............................................. 455
7.2.2 Recidivas ................................................................................................. 466
8 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 488
9 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 49
ANEXO 01 – Estadiamento ................................................................................... 588
ANEXO 02 - Escores para Interpretação da Imunohistoquímica ...................... 600
ANEXO 03 - Comitê de Ética................................................................................. 611
ANEXO 04 – Extração de DNA Salting Out.......................................................... 622
APÊNDICE 01 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ........................ 633
APÊNDICE 02 – Ficha de Coleta Dados .............................................................. 644
1 INTRODUÇÃO
1.1 Epidemiologia do câncer de mama
O desenvolvimento do câncer é geralmente caracterizado por mutações
genéticas, expressão de características oncológicas e secreção anormal de
hormônios ou enzimas. Todos os cânceres têm potencial de invasão e/ou de
metastatização, mas cada tipo possui características clínicas e biológicas
específicas que devem ser estudadas para um adequado diagnóstico, tratamento e
acompanhamento. O tumor maligno é caracterizado pelo crescimento rápido e
desordenado de células que, devido ao acúmulo de mutações, tendem a adquirir um
caráter cada vez mais agressivo, podendo invadir tecidos e órgãos e espalhar-se
para outras regiões do corpo. De forma contrária, os tumores benignos apresentam
crescimento
lento
e
não
possuem
capacidade
de
invasão
e
metástase
(MCPHERSON, STEEL et al., 2000; SAÚDE e CÂNCER, 2011).
As estatísticas mostram que algumas formas de câncer atingem mais de um
terço da população e contribuem com mais de 20% de todas as mortes, sendo a
doença responsável por mais de 10% do custo total com cuidados médicos nos
países desenvolvidos (NUSSBAUM, WILLARD et al., 2002). No Brasil segundo a
estimativa do Instituto Nacional do Câncer (INCA) do Ministério da Saúde,
aproximadamente 52.680 novos casos de câncer de mama (CM) foram
diagnosticados em 2012, sendo o risco estimado de 52 casos para cada 100 mil
mulheres (figura 01). Sabe-se que o câncer de mama é a neoplasia mais frequente
entre as mulheres, em países desenvolvidos e em desenvolvimento (figura 02)
(SAÚDE e CÂNCER, 2011).
O principal fator de risco para o desenvolvimento do câncer é a idade. Visto
que a estimativa de vida populacional no mundo aumentou, os números de casos de
câncer no Brasil e no mundo também vêm aumentando. O Brasil envelheceu em
cinco anos o que a Europa demorou 150 anos para fazê-lo e hoje tem expectativa de
1
vida de 71 anos contra 37 anos do início do século XX (GIL, 2005). Quanto mais se
vive, mais tempo há para adquirir mutações gênicas que levam ao câncer.
Entretanto, acredita-se que o Brasil poderá acompanhar os países desenvolvidos no
sentido de reduzir a mortalidade por essa doença, apesar do envelhecimento
progressivo da nossa população (GIL, 2005).
Figura 01. Estimativas para o ano de 2012 das taxas brutas de incidência por 100 mil habitantes e de
número de casos novos de câncer, segundo sexo e localização primária.
Fonte: INCA, 2012.
Figura 02. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2012 por
sexo, exceto pele não melanoma.
Fonte: INCA, 2012.
2
Embora o Brasil esteja bem próximo das estatísticas mundiais para o CM,
devido as diferentes características regionais do país a distribuição da prevalência e
incidência do CM é bastante diversa. As regiões Sul e Sudeste apresentam as
maiores taxas, seguida da região Centro-Oeste, Nordeste e Norte (SAÚDE e
CÂNCER, 2011).
A distribuição mundial das prevalências do CM na população mostra que é a
doença mais frequente em países ocidentais (EUA, Europa Ocidental) quando
comparado a países orientais (China e Japão). Estima-se que aproximadamente
10% das mulheres da população geral dos países ocidentais desenvolverão, em
alguma época da vida, o CM (LINHARES, DA SILVA et al., 2005). Além de fatores
genéticos transmitidos, existe grande influência dos hábitos das mulheres ocidentais
que propiciam o surgimento da doença (alimentação, reposição hormonal, vida
sedentária, obesidade) e isso explica porque mulheres japonesas que migram para
os EUA, após duas gerações, têm incidência de CM semelhante à de mulheres
americanas (GIL, 2005).
No último ano, foram registrados 130 mil óbitos de câncer no Brasil. Um
volume maior do que o número de casos de AIDS (síndrome da imunodeficiência
adquirida) acumulados em 24 anos. Entre 1979 e 2003, a taxa de mortalidade pela
doença cresceu 30% (SAÚDE e CÂNCER, 2011). Apesar de ser considerado um
câncer de bom prognóstico, se diagnosticado e tratado oportunamente, as taxas de
mortalidade por CM no Brasil continuam altas, provavelmente devido a diagnósticos
tardios. Essa informação é reforçada pela análise do INCA que com base nas
informações disponíveis nos seus registros hospitalares, no período de 2000/2001,
50% dos tumores de mama foram diagnosticados nos estágios III e IV (DA SILVA e
AMADEI, 2006).
1.2 Fatores Clínicos, Prognósticos e Preditivos do Câncer de Mama
O CM é uma doença heterogênea, compreendendo inúmeras apresentações
clínicas, comportamentos biológicos distintos e respostas terapêuticas distintas.
Como fator prognóstico clássico, o status axilar é o mais importante, seguido do
3
tamanho tumoral, do tipo histológico (tabela 1), do grau histológico e da presença de
invasão angio-linfática. Para o estadiamento do CM é utilizada a classificação
Tumor, Linfonodos e Metátase (TNM -Tumour, Nodes, Metastasis Classification),
onde são avaliados o tamanho tumoral (T), o grau de comprometimento axilar
(status axilar) (N) e a presença de metástases à distância (M) (Anexo 01). Quanto
maior o tamanho, o número de linfonodos axilares acometidos ou a presença de
metástases à distância, maior o estadiamento e mais desfavorável é o tumor. O
estadiamento é utilizado para estimativa de prognóstico, para ajudar a definição do
tipo de tratamento que será utilizado, para avaliação de resposta ao tratamento e
para uniformização dos dados clínicos. Na sua sexta edição, já foram incluídos os
termos carcinoma in situ, biópsia de linfonodo sentinela, micrometástases e células
tumorais isoladas (BRASIL, SAÚDE et al., 2004).
Tabela 01. Classificação dos tipos histológicos da carcinoma de mama quanto ao comportamento
biológico.
Tumores com Prognóstico Excelente
Ca tubular
Ca mucinoso tipo colóide
Ca cribiformeinfiltrativo
Ca adenoide cístico
Ca túbulo-lobular
Ca secretor ou juvenil
Tumores com Prognóstico Bom
Ca mistos, ductal com tipo favorável
Tumores com Prognóstico Intermediário
Ca medular
Ca lobular clássico
Ca papilíferoinfiltrativo
Tumores com Prognóstico Desfavorável
Ca ductal invasivo
Ca lobular não clássico
Tumores com Prognóstico Muito
Desfavorável
Ca metaplásico
Ca micropapilar invasivo
Fonte: Câncer de Mama. Tratamento multidisciplinar. 2007. (BARROS e BUZAID, 2007)
Como fatores bioquímicos, os receptores hormonais e a superexpressão do
receptor tipo 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER-2 – Human
Epidermal Growth Factor Receptor 2) são os mais importantes (BARROS e BUZAID,
2007). Os receptores hormonais são subdivididos em dois tipos: o receptor de
estrogênio (RE) e o receptor de progesterona (RP). O RE é o principal regulador do
4
crescimento, proliferação e diferenciação celular e é o mais importante preditor de
resposta terapêutica ao tratamento hormonal (terapia anti-estrogênica). Ele é
detectado por imunohistoquímica em bloco de parafina, o que trouxe praticidade ao
método. Os tumores que expressam receptores hormonais têm evolução favorável
em relação aos que não expressam (receptores negativos), sendo sua avaliação
fundamental ao tratamento e acompanhamento do CM. Em relação ao HER-2, sua
avaliação hoje é fundamental nas pacientes portadoras de CM, pois se encontra
super expresso em até 30% dos casos. Ele, além de predizer prognóstico (estes
tumores tem pior evolução), também é preditor de resposta à terapia biológica
específica, a chamada “terapia alvo” com o anticorpo monoclonal humanizado
trastuzumabe, que se liga ao HER-2 inibindo sua dimerização com outros
receptores, promovendo ausência da proliferação e do crescimento tumoral. Ele,
assim como os receptores hormonais, também é avaliado por imunohistoquímica em
tumores em bloco de parafina (LISBOA e JÄNICKE, 2004) (Anexo 02).
Atualmente,
com
o
desenvolvimento
das
técnicas
de
microarrays,
classificamos o CM pela expressão genética e perfil imuno-histoquímico, em quatro
tipos principais: 1) basalóide, tumores indiferenciados que expressam principalmente
citoqueratinas
basais,
não
expressando
receptores
hormonais
ou
HER-2,
normalmente com pior prognóstico; 2) tipo HER-2, que apresentam receptores
hormonais negativos e normalmente apresentam super expressão da proteína HER2, também com prognóstico desfavorável; e os tipos 3) luminal A e 4) luminal B, que
mostram perfil genético de células epiteliais diferenciadas e expressão de receptores
hormonais. Estes dois últimos normalmente apresentam prognóstico favorável,
sendo o luminal A o de melhor prognóstico (CANCER GENOME ATLAS, 2012).
1.3. Tratamento do câncer de mama
O tratamento do CM é multidisciplinar, incluindo o mastologista, o oncologista
e o radioterapeuta, além do cirurgião plástico no caso de reconstrução mamária, do
fisioterapeuta e do psicólogo quando necessário. Nos últimos anos, houve
importantes avanços na abordagem do CM, principalmente em relação às cirurgias
5
menos mutilantes, assim como a busca da individualização do tratamento. O
tratamento varia de acordo com o estadiamento da doença, suas características
biológicas e das condições da paciente (idade, status menopausal, comorbidades e
preferências). Caso a doença seja diagnosticada no início, o tratamento tem maior
potencial curativo. Entretanto se há evidências de metástases, o tratamento tem por
objetivo prolongar a sobrevida e melhorar a qualidade de vida da paciente
(BARROS, BARBOSA et al., 2001).
O tratamento do CM é dividido em tratamento local (cirurgia e radioterapia) e
tratamento sistêmico (quimioterapia, hormonioterapia e terapia biológica). Quando a
paciente ainda se encontra no estágio I ou II, a conduta habitual consiste de cirurgia,
radioterapia em casos de tratamento conservador, quimioterapia dependendo do
grau do comprometimento axilar e hormonioterapia caso a paciente seja receptor
hormonal positivo. Pacientes com tumores maiores, porém ainda localizados,
enquadram-se no estádio III. Nessa situação, o tratamento sistêmico (na maioria das
vezes com quimioterapia) é a modalidade terapêutica inicial, chamado de
quimioterapia neoadjuvante. Após resposta adequada, segue-se com o tratamento
local (MASTOLOGIA, CANCEROLOGIA et al., 2011).
Já no estágio IV é fundamental que a decisão terapêutica busque o equilíbrio
entre a resposta tumoral e o possível prolongamento da sobrevida, levando-se em
consideração os potenciais efeitos colaterais decorrentes do tratamento. A
modalidade principal nesse estádio é a sistêmica, sendo o tratamento local
reservado para indicações restritas (MASTOLOGIA, CANCEROLOGIA et al., 2011)
Como tratamento cirúrgico do CM, a mastectomia total (retirada completa da
mama) ou a quadrantectomia (retirada parcial da mama,) associada à radioterapia,
podem ser realizadas, ambas com índices de sobrevida semelhantes. Para a
abordagem da axila, a biópsia do linfonodo sentinela (BLS) hoje é o tratamento de
eleição, sendo o esvaziamento axilar (EA) realizado somente em casos
selecionados, de acordo com a indicação. A avaliação dos linfonodos axilares tem
função prognóstica e terapêutica (LYMAN, GIULIANO et al., 2005).
Sobre a radioterapia, o consenso é que ela, independente da idade da
paciente, aumenta as taxas de sobrevida livre de doença, principalmente quando
associada à cirurgia conservadora da mama e ao tratamento hormonal quando
indicado. A radioterapia diminui a incidência de recidiva ipsilateral em pacientes
6
submetidas à cirurgia conservadora e em parede torácica daquelas submetidas à
mastectomia. Estudos mostram que a omissão da radioterapia aumenta não só a
taxa de recidiva local, como também as metástases à distância e a diminuição da
sobrevida global (TRUONG, BERNSTEIN et al., 2006). Atualmente, também
podemos contar com a radioterapia intra-operatória, tratamento realizado no peroperatório de cirurgias conservadoras. Essa técnica utiliza uma dose única de
radiação, evitando assim o desgaste diário provocado pela radioterapia convencional
e que, em casos bem selecionados, pode se tornar a opção ideal para as pacientes
idosas que possuem tumores iniciais de mama (ORECCHIA, CIOCCA et al., 2003).
O tratamento sistêmico (quimioterapia, hormonioterapia e terapia biológica) é
determinado pesando os riscos e benefícios de cada tratamento. Para indicação
desse tratamento três fatores são importantes: o prognóstico câncer específico
(tamanho
tumoral,
status
axilar,
grau
tumoral,
receptores
hormonais
e
superexpressão HER-2), o prognóstico paciente específico (expectativa de vida,
idade e comorbidades) e a toxicidade do tratamento proposto. O tratamento
sistêmico é subdividido em quimioterápico e hormonal, sendo que ambos podem ser
prescritos como adjuvantes (após a cirurgia) ou neoadjuvantes (antes da cirurgia).
As características tumorais é que irão determinar a terapia mais apropriada,
principalmente a caracterização dos receptores hormonais (receptor de estrogênio e
progesterona) e também o perfil de expressão do HER-2, com possível indicação de
terapia biológica anti-HER-2 (trastuzumabe), naquelas pacientes que apresentam
sua super expressão (GOLDHIRSCH, GLICK et al., 2005).
1.4 Endocrinologia Mamária
A mama é um órgão que responde a variações hormonais, iniciando seu
desenvolvimento na puberdade, com o início da síntese ovariana de estrogênio. São
vários os hormônios que atuam na mama, entre eles o estrogênio, a progesterona, a
prolactina, a ocitocina, o hormônio do crescimento, a insulina e corticoides (BLAND e
COPELAND III, 2009).
7
O estrogênio e a progesterona são os principais hormônios envolvidos no
desenvolvimento mamário. Eles são responsáveis pelo crescimento e diferenciação
epitelial e alveolar mamário, nas unidades lobulares e ductos terminais (GRUBER,
TSCHUGGUEL et al., 2002). Esses hormônios atuam por meio de receptores
nucleares (RE e RP), modulando a transcrição de genes alvo e estão
correlacionados a fatores preditivos e prognósticos do CM (BLAND e COPELAND III,
2009).
O estrogênio é sintetizado no ovário feminino na pré-menopausa e encerra a
produção após a menopausa. Entretanto, ele continua a ser sintetizado na pósmenopausa em diferentes tecidos periféricos, por meio da aromatização de
androgênios, e nas supra-renais (BLAND e COPELAND III, 2009). Ele induz a
atividade mitótica ductal e estimula o desenvolvimento do tecido conectivo mamário.
Dessa forma, também estimula o crescimento de células tumorais mamárias
(GRUBER, TSCHUGGUEL et al., 2002).
A concentração de receptores de estrogênio aumenta na fase folicular do ciclo
menstrual e diminui na ovulação (GRUBER, TSCHUGGUEL et al., 2002). Eles são
membros de uma superfamília de receptores hormonais nucleares e são
subdivididos em dois subtipos, α e β, que variam em sua estrutura e localização
gênica (cromossomos 6 e 14, respectivamente). O subtipo α é encontrado
principalmente no endométrio, nas mamas e nos ovários, enquanto o β encontra-se
nos rins, no intestino, no pulmão, nos ossos, no cérebro, nas células endoteliais e na
próstata (GRUBER, TSCHUGGUEL et al., 2002).
1.5 Hormonioterapia no câncer de mama
Além das modalidades da quimioterapia e da terapia biológica, o tratamento
medicamentoso do CM faz uso de fármacos que modulam o efeito de hormônios
essenciais ao crescimento tumoral, a hormonioterapia. Sua indicação se dá em
cerca de 60% dos casos, quando os tumores são receptores de estrógeno (RE+)
e/ou de progesterona (RP+) positivos. Existem principalmente duas estratégias de
tratamento hormonal: aquela que bloqueia a função do receptor de estrogênio, os
8
moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs) e aquela que suprime a
produção de estrogênios, os inibidores da aromatase (IA) (BARROS e BUZAID,
2007).
Os SERMs são bloqueadores do receptor de estrogênio (RE) representados
por drogas com atividade agonista e antagonista do estrogênio, como o tamoxifeno
(TAM), o raloxifeno e o toremifeno, ou por drogas antagonistas seletivos com
atividade antagonista total, como o fulvestrano. Podem ser utilizados tanto em
mulheres na pré-menopausa quanto na pós-menopausa. O raloxifeno é também
utilizado como quimioprevenção do CM (BOFF e WISINTAINER, 2006).
Os inibidores de aromatase (IA), como o exemestano, o anastrozol e o
letrozol, são usados nas pacientes na pós–menopausa. Ele atua impedindo a
conversão periférica da androstenediona em estrona pela enzima aromatase. Os IA
aumentam a sobrevida livre de doença em 3% a 5%, quando comparados com o
TAM. Também já se mostrou que o uso do letrozol, após uso do TAM por 5 anos,
aumentou a sobrevida global de pacientes com axila positiva (adjuvância estendida)
(CANCEROLOGIA., MASTOLOGIA. et al., 2011). Como efeito colateral dos IA,
destacam-se os eventos ósteo-articulares, com diminuição da densidade óssea e
aumento das fraturas, recomendando-se a realização da densitometria óssea
durante o tratamento. Portanto, os IA representam uma opção para o tratamento
hormonal.
Ainda sobre a hormonioterapia, devemos lembrar da ooforectomia cirúrgica
ou dos agonistas de liberação de hormônio luteinizante (agonista LHRH), indicado
em algumas pacientes na pré-menopausa; do tratamento hormonal isolado, indicado
naquelas pacientes sem condições cirúrgicas ou que se negam a submeter-se ao
tratamento cirúrgico; e do neoadjuvante (pré cirurgia), para possibilitar uma cirurgia
conservadora ou diminuir o tamanho tumoral em casos avançados. No geral, 63%
das pacientes tratadas com TAM tem regressão tumoral, com uma média de
resposta de 13 semanas e com efeito terapêutico podendo persistir por até 5 anos.
Também os IA podem ser usados como tratamento isolado e neoadjuvante, com
taxas de resposta clínica e de cirurgia conservadora semelhantes ou superiores ao
TAM (SALMON, ALRAN et al., 2006).
9
1.6 Tamoxifeno
1.6.1 Tamoxifeno e o câncer de mama
O tamoxifeno (TAM) é um fármaco amplamente utilizado no tratamento do CM
em pacientes RE+ ou RP+. O seu uso foi aprovado em 1977 e há mais de 25 anos é
considerado a principal terapia endócrina adjuvante para o tratamento desse tipo de
câncer. Além disso, seu uso é indicado na prevenção do desenvolvimento do
carcinoma em pacientes saudáveis sob alto risco, a chamada quimio prevenção
(FISHER, COSTANTINO et al., 1998).
A terapia com o TAM impactou significativamente a sobrevida das pacientes
portadoras de CM, diminuindo a mortalidade em aproximadamente 31% e as
recorrências em 50%. Estudos como o NSABP B-14 (National Surgical Adjuvant
Breast and Bowel Project) e o EBCTCG (Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative
Group) mostraram que o uso do TAM diminuiu tanto a recidiva local quanto a
sistêmica em 54% e 34%, respectivamente, em 5 anos. Também aumentou a
sobrevida em mulheres acima de 70 anos, independente do status axilar, com efeito
protetor de até 10 anos após o término do tratamento. Os principais efeitos
colaterais da droga são os sintomas vaso-motores, a hiperplasia endometrial e os
eventos trombo-embólicos (FISHER, ANDERSON et al., 2001; EARLY BREAST
CANCER TRIALISTS' COLLABORATIVE, 2005).
Estima-se que a vida de meio milhão de mulheres já foi salva com o uso do
TAM. Mesmo com estudos que mostram que a terapia com IA tem um maior
percentual de sobrevida livre da doença em comparação ao tratamento com o TAM,
este continua sendo um fármaco de alto valor terapêutico, em virtude do seu custo
reduzido e de algumas indicações permanecerem exclusivas para ele, como no
câncer de mama em mulheres na pré-menopausa, no câncer em homens, assim
como na terapia profilática. A terapia combinada do TAM e IA não fornece vantagens
sobre o uso individual destas substâncias (HENDERSON, 2004; JANICKE, 2004;
SMITH, 2004; EARLY BREAST CANCER TRIALISTS' COLLABORATIVE, 2005).
10
1.6.2 Farmacocinética do tamoxifeno: Mecanismo de Ação e Metabolismo
O TAM pertence à classe dos SERMs com atividade antagonista e agonista.
Ele liga-se ao RE bloqueando sua ligação com o estrogênio e impedindo a formação
do complexo estrogênio-receptor, promovendo bloqueio da ação hormonal no tecido
mamário. Na ausência do TAM, o estrogênio estimula o crescimento das células
RE+ do tecido mamário maligno, através da ligação com o sítio receptor de
estrogênio e da interação com o DNA da célula, promovendo dimerização, alterando
a atividade do gene e promovendo o crescimento celular. Apesar da ação
antiestrogênica, dependendo da orientação de sua cadeia lateral (alquilaminoetóxi),
o TAM também pode apresentar atividade agonista em alguns órgãos e tecidos,
promovendo proliferação endometrial, aumento da incidência de fenômenos
tromboembólicos e, de maneira desejável, atuando no metabolismo ósseo e lipídico
(BLAND, CALINGAERT et al., 2009; BLAND e COPELAND III, 2009).
Sua comercialização é feita na forma de comprimidos como citrato de
tamoxifeno, em dosagens de 10mg e 20mg de isômero trans puro. A dose diária
recomendada para as pacientes é de 20 mg em dose única ou fracionada (dois
comprimidos de 10 mg), por um período de 5 anos. Após a administração oral, a
concentração sérica máxima é em torno de 4 a 7 horas e meia-vida de sete dias.
Devido a longa meia-vida dos metabólitos, que pode chegar a 14 dias, com uma
dose típica de 20 mg de TAM, o equilíbrio dinâmico é alcançado no período de três a
quatro meses. A excreção ocorre predominantemente nas fezes, sendo a excreção
urinária mínima (HIDOCTOR, 2012).
O TAM é metabolizado por enzimas hepáticas do sistema citocromo P450
(CYP) em muitos metabólitos primários e secundários. Alguns metabólitos do
tamoxifeno formados in vivo são mais ativos que o próprio fármaco, motivo pelo qual
ele pode ser considerado um pró-fármaco. A principal via de metabolismo do TAM
consiste na N-demetilação do tamoxifeno em N-desmetiltamoxifeno, pela ação das
enzimas CYP3A4 e CYP3A5, que em seguida é hidroxilado pela CYP2D6 em
endoxifeno (EDF - 4-Hidroxi N-desmetiltamoxifeno). Uma outra via, que envolve
além do CYP2D6 outras CYPs, metaboliza o TAM em 4-hidroxitamoxifeno (HTF),
11
que também é convertido em EDF pela ação das CYPs 3A4/5 (Figura 3).
Inicialmente achava-se que o HTF era o metabólito mais ativo do TAM (FURR e
JORDAN, 1984), mas hoje sabe-se que a as concentrações plasmáticas do EDF são
5 a 10 vezes maiores que o HTF (JACOLOT, SIMON et al., 1991; AHMAD,
SHAHABUDDIN et al., 2010) e cerca de 6 a 12 vezes maiores em pacientes em com
terapia a longo prazo (WU, HAWSE et al., 2009). Entretanto, esses dois compostos
são 30 a 100 vezes mais potentes que o próprio TAM na sua atividade
antiestrogênica (LIM, DESTA et al., 2005; DAMODARAN, PRADHAN et al., 2012;
HUBER-WECHSELBERGER, NIEDETZKY et al., 2012; WALKO e MCLEOD, 2012).
As concentrações plasmáticas do EDF são aproximadamente seis vezes
maiores do que as concentrações do HTF, que representam cerca de 2% a 5% das
concentrações de TAM, sendo, por isso, o principal responsável pelos efeitos
terapêuticos do tamoxifeno (BRAUCH, MURDTER et al., 2009; IRARRAZAVAL,
2011; MADLENSKY, NATARAJAN et al., 2011).
Figura 03. Metabolismo do tamoxifeno.
Fonte: Irrarázaval, et al. (2011) (IRARRAZAVAL, 2011)
12
1.7 CYP2D6
As enzimas responsáveis pelas reações de biotransformação encontram-se
nos microssomas (retículo endoplasmático) e estão presentes em todo o organismo,
como pulmão, pele, cérebro, intestino, sangue, fígado e rins (LLAMA, DEL CAMPO
et al., 1993; HONKAKOSKI e NEGISHI, 1997b; a). Embora elas tenham uma
distribuição global, o fígado é sem dúvida o principal órgão biotransformador.
Essas enzimas constituem o sistema oxidase de função mista ou
monoxigenases ou sistema citocromo P450 (CYP). Este possui importantes funções
metabólicas, além de ser o sistema de sentinela que primeiro apreende e inativa
vários xenobióticos no organismo. Para uma droga ser metabolizada pelas enzimas
do sistema é necessário ser lipossolúvel, pois essa propriedade facilita a penetração
dela no retículo endoplasmático e a sua ligação ao CYP (HONKAKOSKI e NEGISHI,
1997b; a).
Muitas enzimas evoluíram para desintoxicação de compostos xenobióticos e a
expressão gênica das mesmas é induzida em resposta à presença de determinado
composto. O sistema de metabolização de xenobióticos humano compreende duas
classes de enzimas: as de metabolismo oxidativo mediado, ou de fase I (CYP), e as
enzimas conjugadas, ou de fase II (glutationa S-transferases - GSTs e N-acetiltransferases - NATs) (DUNNING, HEALEY et al., 1999).
As atividades das enzimas de fase I e II tornam os compostos mais solúveis e
rapidamente excretados, o que pode diminuir o risco de câncer. Entretanto, os
produtos mais solúveis de alguns compostos podem ser mais carcinógenos do que a
forma original. Portanto, mutações ou polimorfismos que alterem a expressão gênica
ou atividade da proteína produzida, podem elevar a quantidade dos carcinógenos
reativos formados, aumentando assim o risco de câncer (DUNNING, HEALEY et al.,
1999).
Durante a biotransformação, o citocromo P450 mede as reações da fase I em
que os xenobióticos são desintoxicados ou ativados pelas reações das substâncias
intermediárias. No fígado, eles determinam a intensidade e a duração da ação da
droga e promovem a desintoxicação dos xenobióticos. A contribuição de cada
enzima P450 à inativação dos carcinógenos mostrou que a maioria dos
carcinogênicos ambientais são inativados por um número limitado delas, incluindo as
13
codificadas pelos genes CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1, CYP2D6, e CYP3A
(KAWAJIRI, NAKACHI et al., 1993). Muitos genes são polimórficos, indicando
atividades metabólicas diferentes, refletidas em efeitos tóxicos adversos, incluindo a
carcinogênese induzida por substâncias químicas endógenas (AUTRUP, 2000).
O gene CYP2D6 pertence à família CYP2, subfamília D, polipetídeo 6 e está
localizado no cromossomo humano 22 no locus 22q13.1 (GOUGH, SMITH et al.,
1993). Possui nove éxons e oito introns (TOPIC, STEFANOVIC et al., 2000) e sua
enzima (debrisoquina-4-hidroxilase) metaboliza a debrisoquina e pelo menos outras
80 drogas, dentre elas o tamoxifeno, antidepressivos, antiarrítmicos, antiepilépticos,
antipsicóticos, entre outras (KIMURA, UMENO et al., 1989; BERTILSSON, 1995;
AUTRUP, 2000). Os genes CYP1, 2 e 3 representam cerca de 70% dos CYPs
presentes no fígado e são responsáveis pela maior parte do metabolismo de drogas
(YAN e CALDWELL, 2001).
O gene CYP2D6 é altamente polimórfico e até fevereiro de 2013 105 alelos
foram identificados (http://www.cypalleles.ki.se/cyp2d6.htm). Esses polimorfismos
foram gerados por mutações de ponto (SNP – single nucleotide polymorphism),
pequenas inserções/deleções, conversões, duplicações ou perda total do gene
CYP2D6 (HUBER-WECHSELBERGER, NIEDETZKY et al., 2012). Cerca de 15
alelos foram descritos e associados com a baixa atividade (CYP2D6*2, * 9, * 10) ou
ausência de atividade (CYP2D6*3, *4, *5, *6, *7, *8, *11, *12, *13, *14, *15, *16),
sendo o polimorfismo do alelo *4 o mais comum em caucasianos (12% a 23%). A
combinação de todos estes alelos fornece um grande painel de possíveis fenótipos
em relação às atividades do CYP2D6 (HUBER-WECHSELBERGER, NIEDETZKY et
al., 2012).
Baseado nos fenótipos conferidos pelos genótipos do CYP2D6 os indivíduos
são divididos em quatro categorias de acordo com o grau de metabolização da
enzima: metabolizadores extensivos (ME), que são indivíduos que possuem dois
alelos selvagens (*1/*1) e apresentam atividade enzimática normal; metabolizadores
intermediários (MI), que possuem um alelo selvagem e um alelo mutado (*1/*4),
apresentando atividade enzimática baixa; metabolizadores pobres ou lentos (MP),
que possuem os dois alelos mutados (*4/*4), apresentando ausência de atividade
enzimática e finalmente os metabolizadores ultra rápidos (MU), que são aqueles que
possuem uma atividade enzimática alta devido a uma duplicação do gene (TOPIC,
14
STEFANOVIC et al., 2000; SISTONEN, SAJANTILA et al., 2007; HUBERWECHSELBERGER, NIEDETZKY et al., 2012).
Dentre todos os polimorfismos relacionados à alteração da atividade
enzimática, o alelo *3, ou del2637A (rs35742686), e o alelo *4, ou G1934A
(rs3892097) estão entre os mais comuns do gene. Estes polimorfismos resultam em
uma diminuição ou inatividade da isoenzima de CYP2D6 levando a um fenótipo MP.
Os indivíduos homozigotos para esses alelos possuem um risco aumentado de
efeitos colaterais ou fracasso terapêutico após tratamento medicamentoso,
principalmente com o TAM (STUVEN, GRIESE et al., 1996).
1.8 Tamoxifeno e CYP2D6
O uso do TAM já é consagrado para o tratamento do CM receptor hormonal
positivo, diminuindo o risco de recidiva e aumentando a sobrevida em mulheres
tanto na pré como na pós-menopausa. Esta droga é conhecida por ter uma fraca
afinidade aos receptores de estrogênio e a sua metabolização pela enzima CYP2D6
é essencial para a formação dos metabolitos ativos, principalmente o 4hydroxytamoxifen e endoxifeno (EDF). Este tem pelo menos dez vezes mais
afinidade ao receptor de estrogênio que o tamoxifeno, incluindo a supressão do
crescimento tumoral estrogênio dependente, além de ter uma potência de 30 a 100
vezes maior. Sabe-se que a conversão metabólica de TAM em EDF pela CYP2D6 é
essencial para a paciente se beneficiar com a terapia endócrina (BARROS,
BARBOSA et al., 2001; CANCEROLOGIA., MASTOLOGIA. et al., 2011).
Drogas, como alguns antidepressivos, são inibidoras da CYP2D6, e
consequentemente, tem grande influencia no metabolismo do TAM. Como a
depressão é um diagnóstico bastante comum nas portadoras de CM, estudos
mostraram que o uso de paroxetina ou fluoxetina concomitante ao TAM levam a uma
redução do nível de EDF a MP independentemente do genótipo ME (HUBERWECHSELBERGER, NIEDETZKY et al., 2012), podendo levar a aumento de
recidiva e diminuição de sobrevida. Destacamos que não há estudos prospectivos
randomizados em relação a este assunto.
15
Apesar do CM receptor hormonal positivo ter melhor prognóstico e melhor
sobrevida com o uso da terapia com o TAM, ainda assim vemos pacientes com
recidivas locais, tumores na mama oposta ou metástases à distância que muitas
vezes não são relacionadas as outras características tumorais.
Devido à importância da CYP2D6 na metabolização do TAM e da alta
prevalência do seu polimorfismo, várias pesquisas foram realizadas para avaliar a
importância clínica do polimorfismo na resposta ao tratamento do CM (HUBERWECHSELBERGER, NIEDETZKY et al., 2012). Um estudo alemão, envolvendo
1325 pacientes jovens com CM precoce RE+, avaliou a correlação entre os
polimorfismos do CYP2D6 e a eficácia do tratamento com TAM. Eles verificaram
que, após um acompanhamento médio de 6,3 anos, a taxa de recidiva foi de 14,9%
entre as ME, 20,9% nas MI e de 29% no grupo de MP. A mortalidade nesses grupos,
consideradas todas as causas, foi de 16,7%, 18,0% e 22,8%, respectivamente
(SCHROTH, GOETZ et al., 2009). A maior taxa de mortalidade entre pacientes MP
também foi observada em um estudo holandês (n=108) (BIJL, VAN SCHAIK et al.,
2009), enquanto que uma pesquisa indiana, com 141 pacientes, mostrou aumento
da recidiva em pacientes com atividade reduzida da CYP2D6 (DAMODARAN,
PRADHAN et al., 2012). Por outro lado, alguns estudos mostram que não há
associação entre o polimorfismo da CYP2D6 e a evolução da paciente (WEGMAN,
VAINIKKA et al., 2005; ABRAHAM, MARANIAN et al., 2010).
Considerando que não há estudos clínicos prospectivos padronizados em
relação à idade, status menopausal, raça, características tumorais, tratamento
sistêmico realizado e o tempo de uso do TAM envolvendo este assunto, a realização
de metanálises com alto nível de evidência é dificultada.
Segundo Catherine M. Kelly do departamento de Oncologia Médica do
Hospital Mater Misericordiae University em Dublin, surgiu nos últimos nove anos,
uma indústria de avaliação do CYP2D6. Além disso, o Clinical Pharmacology
Subcomite da FDA sugeriu que o rótulo do TAM inclua informações sobre o aumento
do risco de recorrência de CM em pacientes com baixa expressão da CYP2D6.
Por este motivo, testes de farmacogenética para realização de genotipagem
da CYP2D6 entre as pacientes portadoras do CM, avaliando seu polimorfismo e
identificando fenótipos de metabolismo reduzido ou ausentes, poderiam ser
recomendados. Estes testes teriam a intenção de tentar prever a melhor ou pior
16
resposta à terapia com TAM e ajudar a escolher a melhor conduta de tratamento,
evitando efeitos colaterais indesejáveis e melhorando o prognóstico do CM.
17
2 HIPÓTESE
Visto que o gene CYP2D6 apresenta polimorfismos que podem levar a
diferentes padrões de metabolização do tamoxifeno, nossa hipótese é que mulheres
tratadas com TAM que possuem variantes de baixa ou nenhuma atividade
metabolizadora enzimática estão mais propensas a sofrer recidiva.
18
3 JUSTIFICATIVA
O câncer de mama é uma das doenças que mais acomete mulheres no
mundo e atinge todas as faixas etárias e níveis sociais. O diagnóstico precoce e o
tratamento adequado permite às pacientes altos índices de sobrevida livre da
doença e de sobrevida global, com baixas taxas de recidivas e mortalidade.
O tratamento do CM é multidisciplinar e envolve a cirurgia, a radioterapia, a
quimioterapia e a hormonioterapia.
A hormonioterapia com o tamoxifeno é o tratamento hormonal padrão do
câncer de mama, pois apresenta índices elevados de controle local e sobrevida nas
pacientes receptor hormonal positivo. Entretanto, existe uma parcela das pacientes
que não responde bem ao tratamento hormonal, apresentando altos índices de
recidiva local e à distância.
Esta discrepância na evolução das pacientes, que apresentam o mesmo perfil
tumoral e hormonal, pode estar relacionada a fatores genéticos. Para que o TAM
produza seu metabólito ativo, o endoxifeno, a enzima CYP2D6 precisa ser ativada e
determinados polimorfismos presentes no gene CYP2D6 levam à diminuição ou
perda da função enzimática e, consequentemente, à má resposta hormonal ao CM.
Baseado na importância prognóstica da análise desses polimorfismos, cujo
conhecimento pode direcionar a uma terapia hormonal individualizada, este estudo
visa conhecer a distribuição desses polimorfismos em uma amostra de pacientes de
Belo Horizonte, atendidos em dois Serviços de Mastologia da cidade.
19
4 OBJETIVOS
4.1 Objetivo Geral
Avaliar a prevalência da variante do gene CYP2D6*4 em pacientes receptor
hormonal positivo, submetidas ao tratamento do câncer de mama em dois Serviços
de Mastologia de Belo Horizonte.
4.2 Objetivos Específicos
 Analisar os dados clínicos das pacientes portadoras de câncer de mama;
 Analisar a prevalência do alelo *4 do gene CYP2D6 nessas pacientes, em
função dos parâmetros epidemiológicos;
 Estudar o comportamento evolutivo das pacientes com CM com receptor
hormonal positivo e em uso de tamoxifeno, em função da presença ou não do
alelo *4.
20
5 PACIENTES E MÉTODOS
5.1 Aspectos Éticos
O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Santa
Casa de Belo Horizonte – CEP/SCBH (protocolo número 065/2009), como exigido
pela legislação brasileira, conforme as resoluções CNS nº 196/96 e 304/00 do
Conselho Nacional de Saúde, sobre Diretrizes e Normas Regulamentadoras de
Pesquisas Envolvendo Seres Humanos (Anexo 03).
Foi solicitada autorização prévia do Serviço de Mastologia do Grupo Santa
Casa de Belo Horizonte e do Serviço de Mastologia do Hospital Felício Rocho.
Aos participantes da pesquisa foi apresentado o Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido (TCLE) solicitando sua participação voluntária. Aos que
aceitaram participar, foi garantido o anonimato e o direito de desistência em
qualquer fase da pesquisa (Apêndice 01).
5.2 Seleção de pacientes
5.2.1 Abordagem das pacientes e coleta das amostras
As pacientes foram selecionadas nos ambulatórios apoiados pelo Sistema
Único de Saúde (SUS) dos Serviços de Mastologia do Grupo Santa Casa de Belo
Horizonte e do Hospital Felício Rocho. As que preenchiam os critérios de inclusão
foram convidadas a participar do estudo e, após aceitar participar do estudo, foi
agendada uma data para que ela comparecesse ao Instituto de Ensino e Pesquisa
da Santa Casa de Belo Horizonte (IEP/SCBH) para aplicação do questionário e
coleta de sangue para a pesquisa.
21
5.2.2 Aplicação do questionário e Coleta das amostras.
A aplicação do questionário e coleta das amostras foi realizada no período de
30/06/2011 a 29/06/2012 em uma sala apropriada no IEP/SCBH, onde está sediado
o Laboratório de Biologia Molecular e Biomarcadores, local de processamento das
amostras. De cada paciente que aceitou participar da pesquisa, foi coletado um tubo
de 4,5ml de sangue contendo ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA –
Ethylenediamine tetraaceticacid) para posterior extração de DNA. As coletas de
sangue foram realizadas por um técnico em enfermagem.
O questionário com os dados epidemiológicos foi aplicado pela própria aluna
de mestrado que, por ser mastologista, soube conduzir bem a entrevista e avaliar
cada caso.
5.2.3 Critérios de Inclusão
 pacientes submetidos à biópsia histológica prévia e com diagnóstico de
câncer invasor da mama.
 pacientes em uso ou que já tenham feito uso de tamoxifeno, independente do
tempo e início do uso.
5.2.4 Critérios de exclusão
 falha no recrutamento das amostras e aplicação do questionário.
 carcinoma in situ isolado.
5.3 Questionário de dados sócio-demográficos, clínico e laboratorial
22
5.3.1 Ficha de Coleta de Dados
Variáveis avaliadas: idade ao diagnóstico do câncer, status menopausal, cor
da pele, história familiar de câncer, tipo e grau histológico do tumor, invasão angiolinfática, tamanho tumoral, número de linfonodos axilares acometidos, presença de
metástases à distância, estadiamento cirúrgico, dosagem do receptor hormonal, uso
de quimioterapia, uso de radioterapia, uso de hormonioterapia e tipo de cirurgia
realizada (Apêndice 02).
5.4 Extração de DNA
O DNA das amostras sanguíneas foi extraído a partir de 500µL do sangue
total, utilizando o protocolo modificado de Salting-out (MILLER, DYKES et al., 1988)
(Anexo 04).
5.5 Tipagem do CYP2D6*4
A tipificação do polimorfismo CYP2D6*4 (1846G>A; rs3892097) foi realizada
pela reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de digestão enzimática, técnica
conhecida como PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism). A enzima
utilizada para a RFLP foi a Mval (BstNI) (Thermo Scientific, USA) que reconhece o
sitio de restrição “5'...CC W GG...3'“ , onde W pode ser a base Adenina (A) ou
Timina (T).
A PCR foi realizada em um volume final de 24 μL contendo: 1x PCR Master
Mix (Promega, Madison, WI. USA), 0,4 μM de cada iniciador, 200ng DNA e água
q.s.p. 24 μL. Após a uma desnaturação inicial à 94°C por 5 minutos (min), foram
realizados 35 ciclos de desnaturação o DNA à 94°C por 1min, pareamento dos
iniciadores à 60°C por 1min e extensão à 72°C por 1min. Um ciclo final de extensão
23
foi realizado à 72°C por 10min. O produto da PCR (355pb) foi submetido a digestão
com a enzima Mval, seguindo as recomendações do fabricante, e em seguida a
eletroforese em gel de poliacrilamida não-desnaturante 10% corado por nitrato de
prata (SANGUINETTI, DIAS NETO et al., 1994).
O polimorfismo aqui analisado, 1846G>A, é uma transição da base G (alelo
selvagem) para a base A (alelo mutante) no íntron 3. Essa transição leva a um
códon de parada prematuro levando a uma proteína não funcional. Na presença do
alelo selvagem G (metabolizadores rápidos), a enzima Mval cliva o fragmento
amplificado pela PCR em dois fragmentos menores de 250pb e 105 pb. Na presença
do alelo mutado A (metabolizadores pobres), a enzima não reconhece o sitio de
restrição e o fragmento permanece integro (355pb). Nos indivíduos heterozigotos
(metabolizadores intermediários) a enzima leva a formação de três fragmentos:
355pb, 250pb e 105pb (Figura 04). Os primers e enzima utilizados e as misturas de
reação para a PCR-RFLP estão descritas na tabela 02 e padrão de restrição
enzimática na tabela 03.
Figura 04. Gel de poliacrilamida mostrando padrão de restrição enzimática do polimorfismo da
variante *4 do gene CYP2D6.
Legenda: M: marcador de peso molecular de 100pb; 1: amostra heterozigota *1/*4 (MI); 2: amostra
homozigota *4/*4 (MP); 3 e 4: amostras homozigotas *1/*1(ME); 5: amostra homozigota *4/*4.
24
Tabela 02. Primers e enzima utilizados para genotipagem CYP2D6*4.
Sequência (5’ – 3’)/Sitio de restrição Amplicons (pb)
Iniciador
2D6*4F
GCCTTCGCCAACCACTCCG
2D6*4R
AAATCCTGCTCTTCCGAGGC
Mval (BstNI)
355pb
5'...CC W GG...3'
Referência
(SOBTI, ALBADRAN et al.,
2005)
-
Tabela 03. Padrão RFLP e atividade metabolizadora da enzima CYP2D6*4.
GENE
CYP2D6*4
Legenda :
Enzima RFLP
MvaI
ME=metabolizador
Nível de Atividade
Padrões de bandas (pb)
Rápido
(ME)
Selvagem
250, 105
Intermediário
(MI)
Heterozigoto
355, 250, 105
Pobre
(MP)
Mutado
355
rápido
ou
extensivo ;
MI=metabolizador
intermediáio;
MP=Metabolizador Pobre
5.6 Análise Estatística
A análise estatística foi realizada por meio pacote estatístico STATA
(VERSÃO 10.3). Inicialmente as variáveis foram recodificadas conforme a
necessidade para análise. Foi realizada a análise descritiva das variáveis
qualitativas utilizadas neste estudo classificando-as em nominais ou categóricas. A
partir da recodificação, foi utilizada a estatística descritiva como medidas de
tendência central (frequência simples, média, mediana, máximo e mínimo) e
medidas de dispersão (desvio-padrão).
Para todas as variáveis quantitativas foi realizado o histograma com curva de
densidade para distribuição dos dados. Nos dados com distribuição normal foram
utilizados testes não paramétricos e para àqueles com distribuição não normal foram
utilizados teste paramétricos. Para todos os testes estatísticos, considerou-se o nível
de significância de 5%, ou seja, os dados foram estatisticamente significativos para
p≤0,05.
25
6 RESULTADOS
A
tabela
04
mostra
os
resultados
referentes
às
características
epidemiológicas das 138 pacientes que participaram do estudo. A média de idade foi
de 56 anos. Observa-se que 35,3% apresentavam idade entre 46 e 55 anos. Em
relação à cor das pacientes a maioria era leucodermico (61,3%), seguido de
feodermico (32,8%).
Tabela 04. Distribuição das percentagens observadas para as variáveis idade e cor das pacientes.
Variáveis
N
%
Idade
Cor da pele
<45 anos
33
24,2
46 – 55
48
35,3
56 – 65
41
30,1
>65
14
10,4
Leucodermo
84
61,3
Feodermo
45
32,8
Melanodermo
8
5,8
As comorbidades e variáveis relacionadas aos aspectos comportamentais
estão descritas na tabela 05. Podemos observar que 50,4% da população era
hipertensa e 34,8% obesa. Houve uma prevalência de passado de nódulo benigno
em 5,1% das pacientes. O uso regular de álcool foi relatado por 2,9% e o seu uso
ocasional por 22,4% das pacientes. O habito tabagista foi identificado em 40,8% e a
prática regular de atividade física em 23,8% das pacientes.
26
Tabela 05. Distribuição das porcentagens observadas para as variáveis comorbidades e hábitos de
vida das pacientes.
Variáveis
N
%
Hipertensão
Sim
69
50,4
Diabetes Mellitus
Sim
22
15,9
Doença Tireoide
Sim
11
7,9
Obesidade
Sim
48
34,8
Depressão
Sim
19
13,7
Etilismo
Nega
99
71,7
Ocasional
31
22,4
Regular
4
2,9
Ex-etilista
4
2,9
Nega
81
59,2
Tabagista
55
40,8
Atividade Física
Pratica
32
23,8
Doença Prévia Mama
Nega
119
86,2
AFBM/Mastite
12
8,7
7
5,1
Tabagismo
Nódulo benigno
Legenda: AFBM = alteração funcional benigna da mama
As características relacionadas ao câncer estão descritas na tabela 06. O tipo
histológico mais frequente foi o ductal (84,8%) e o grau histológico foi G2 (58,9%).
Quando analisamos o tamanho do tumor, observamos que 48,8% das pacientes
foram classificadas como T2, 56,2% tinham axila negativa e 31,4% apresentaram
invasão angiolinfática. A maioria das pacientes encontrava-se no estadiamento I e
IIa (31,7% e 30,8%, respectivamente).
27
Tabela 06. Distribuição das porcentagens observadas para as variáveis características relacionadas
ao câncer das pacientes.
Variáveis
N
%
Ductal
106
84,8
Lobular
17
13,6
Especial
10
8,8
CDIS
62
49,6
G1
13
11,6
G2
66
58,9
G3
32
28,6
T1
53
42,4
T2
61
48,8
T3
5
4
T4
4
3,2
TX
2
1,6
0 LN
72
56,2
1 a 3 LN
34
26,6
4 a 9 LN
17
13,2
> de 10 LN
5
3,9
Invasão angio-linfática
Sim
22
31,4
Estadiamento
I
39
31,7
II a
38
30,8
II b
21
17,1
III a
17
13,8
III b
3
2,4
III c
4
3,2
IV
1
0,8
Tipo histológico
Grau Histológico
Tamanho do Tumor
Status Axilar
Legenda: G1 = bem diferenciado; G2= moderadamente diferenciado; G3= indiferenciado
Os resultados referentes à análise imunohistoquímica dos receptores estão
descritos na tabela 07. Observa-se que 98,2% das pacientes apresentaram perfil
positivo para receptor de estrogênio e 82,4% para receptor de progesterona. O
receptor tipo HER-2 mostrou-se negativo em 75,2% das pacientes e somente 6,7%
apresentaram forte expressão desse marcador.
28
Tabela 07. Distribuição das porcentagens observadas para as variáveis imunohistoquímicas
relacionadas ao câncer das pacientes.
Variáveis
N
Média/%
Receptor de estrogênio
Positivo
109
98,2
Receptor de progesterona
Positivo
89
82,4
HER-2
Negativo
67
75,2
+
13
14,6
++
3
3,3
+++
6
6,7
O tratamento para o câncer de mama está descrito na tabela 08. A
radioterapia foi realizada por 93,4% e a quimioterapia por 63% das pacientes, sendo
10,1% tipo neoadjuvante e 52,9% tipo adjuvante. Em relação ao procedimento
cirúrgico, o mais realizado foi a quadrantectomia mais esvaziamento axilar (37,5%),
seguido da quadrantectomia mais retirada do linfonodo sentinela (33,1%). Todas as
pacientes (100%) usaram tamoxifeno e o tempo médio de uso foi 25,9 meses.
29
Tabela 08. Distribuição das porcentagens observadas para as variáveis relacionadas ao tratamento
do câncer das pacientes.
Variáveis
N
Média/%
Uso de radioterapia
Sim
129
93,4
Quimioterapia
Não realizou
51
36,9
Neo
14
10,1
Adjuvante
73
52,9
Tamoxifeno
Sim
138
100
Inibidor de aromatase
Não
137
99,2
Sim
1
0,72
138
25,9±21,2
116
84,1
Fluoxetina
5
3,6
Paroxetina
6
0,7
Outros
16
11,6
Mastectomia +EA
35
25,7
Mastectomia + BLS
4
2,9
Quadrantectomia + EA
51
37,5
45
33,1
Tempo em meses de uso de tamoxifeno*
Uso de antidepressivos e tamoxifeno
Procedimento
Nega
Quadrantectomia + BLS
*Váriável apresentada como média ± desvio padrão.
Min: Valor mínimo observado
Máx: Valor máximo observado
Min
Máx
1
132
Na tabela 09 podemos observar que 14,5% das pacientes apresentaram
recidiva e 11,1% informaram apresentar ciclos menstruais. O tempo médio de
sobrevida livre de doença (SVLD) em meses foi 43,6±45,7 e o tempo médio de
sobrevida com global (SG) em meses foi 44,5±46,1. Em relação ao polimorfismo
CYP2D6, 81,15% eram metabolizadores extensivos (*1/*1) e 2,17% eram
metabolizadores pobres (*4/*4). Como somente 3 pacientes eram homozigotas para
o alelo *4, elas foram excluídas das análises comparativas da tabela 10.
30
Tabela 09. Distribuição das médias e porcentagens observadas para as variáveis relacionadas à
evolução e polimorfismo das pacientes.
Variáveis
N
Média/%
Min
Máx
Recidiva
Sim
20
14,5
- Local
Sim
9
6,5
- à distância
Sim
4
2,9
- Tumor Contralateral
Sim
7
5,1
Ciclos menstruais
Sim
15
11,1
Tempo (em meses) de SVLD*
138
43,6±45,7
6
288
Tempo de SG (em meses) **
138
44,5±46,1
6
276
- homozigoto *1/*1
112
81,15
- heterozigoto *1/*4
23
16,66
- homozigoto *4/*4
3
2,17
Polimorfismo
*tempo de sobrevida livre de doença, dados apresentados como média±desvio padrão.
**tempo de sobrevida global, dados apresentados como média±desvio padrão.
Os dados comparativos entre os polimorfismos estão descritos na tabela 10.
Podemos observar que as variáveis cor da pele e tipo histológico ductal foram
estatisticamente diferentes entre as pacientes com e sem o alelo *4. O genótipo
heterozigoto, *1/*4, foi mais frequente nas pacientes leucodérmicas e nas pacientes
com história prévia de doença mamária. O tipo histológico ductal foi menos
frequente nas heterozigotas.
31
Tabela 10. Distribuição das médias e porcentagens observadas para as variáveis relacionadas ao
polimorfismo das pacientes.
Polimorfismo
Metabolização
Variáveis
*1/*1: ME
*1/*4: MI
*4/*4: MP*
% (N)
% (N)
% (N)
53,1±11,1 (112)
49,3±10,3 (23)
67,6±16,5 (3)
0,09
Leucoderma
56,8 (63)
78,3 (18)
100 (3)
0,05
Feoderma
36,9 (41)
17,4 (4)
6,3 (7)
4,3 (1)
111
23
Status menopausal Pré
35,1 (39)
47,8 (11)
Pós
64,9 (72)
52,2 (12)
100 (3)
111
23
3
Nega
52,2 (57)
34,8 (8)
100 (3)
<5anos
10,1 (11)
13 (3)
>5anos
4,6 (5)
4,3 (1)
Pré menopausa
33 (36)
47,8 (11)
109
23
3
Nulipara
17,1 (19)
13 (3)
33,3 (1)
Gestou
82,9 (92)
87 (20)
66,7 (2)
111
23
3
Não
88,4 (99)
73,9 (17)
100 (3)
AFBM/Mastite
8,9 (10)
8,7 (2)
Nódulo benigno
2,7 (3)
17,4 (4)
112
23
3
Idade
Cor da pele**
Melanoderma
Total
Total
TRH**
Total
Gestações
Total
Doença prévia
mama**
Total
P
3
0,25
0,29
0,63
0,09
Hipertensão
Sim
50,5 (56/111)
47,8 (11/23)
66,7 (2/3)
0,81
Diabetes
Sim
15,2 (17/112)
17,4 (4/23)
33,3 (1/3)
0,79
Doença tireoide
Sim
6,3 (7/112)
17,4 (4/23)
0,07
Obesidade
Sim
34,8 (39/112)
39,1 (9/23)
0,69
Depressão
Sim
13,4 (15/112)
17,4 (4/23)
0,61
32
HF câncer
Sim
67,9 (76)
69,6 (16)
66,7 (2)
0,87
Etilismo
Nega
71,4 (80)
73,9 (17)
66,7 (2)
0,75
Ocasional
21,4 (24)
26,1 (6)
33,3 (1)
112
23
3
55,9 (62)
69,6 (16)
100 (3)
9 (10)
4,3 (1)
34,2 (38)
26,1 (6)
110
23
3
23,1 (25/112)
17,4 (4/23)
100 (3/3)
0,54
25,5 (28)
26,1 (6)
33,3 (1)
0,93
Regular
3,6 (4)
Ex- usuário
3,6 (4)
Total
Tabagismo**
Nega
Tabagista
Ex-tabagista
Total
Atividade física
Procedimento**
Pratica
Mastectomia +
EA
Mastectomia +
BLS
Quadrantectomia
+ EA
Quadrantectomia
+ BLS
39,1 (9)
33,6 (37)
30,4 (7)
33,3 (1)
110
22
3
T1
44,2 (46)
33,3 (6)
33,3 (1)
T2
T3
47,1 (49)
55,6 (10)
66,7 (2)
3,8 (4)
5,6 (1)
T4
3,8 (4)
TX
1 (1)
5,6 (1)
104
18
Total
Estadiamento
33,3 (1)
38,2 (42)
Total
Tamanho do
tumor**
2,7 (3)
I
32 (33)
35,3 (6)
II a
30,1 (31)
23,5 (4)
II b
17,5 (18)
17,6 (3)
III a
12,6 (13)
23,5 (4)
III b
2,9 (3)
III c
3,9 (4)
IV
Total
0,24
0,68
3
100 (3)
0,83
1 (1)
103
17
3
Receptor de
estrogênio
Positivo
97,8 (91)
100 (16)
100 (2)
0,55
Receptor de
Positivo
81,1 (73)
87,5 (14)
100 (2)
0,53
33
progesterona
HER-2
Negativo
75,3 (58)
72,7 (8)
+
13 (10)
27,3 (3)
++
3,9 (3)
+++
7,8 (6)
Total
100 (1)
0,45
77
11
Ductal
82,1 (92/112)
52,1 (12/23)
0,00
Lobular
12,5 (14/112)
8,7 (2/23)
0,65
Especial
7,1 (8/112)
13 (3/23)
0,37
47,3 (53/112)
34,7 (8/23)
0,28
G1
9
3
0,13
G2
59
5
G3
26
6
Total
94
14
Tamanho do tumor T1
46
6
T2
49
10
T3
4
1
T4
4
0
TX
1
1
104
18
I
33
6
II a
31
4
II b
18
3
III a
13
4
III b
3
0
III c
4
0
IV
1
0
103
17
0 LN
58
11
1 a 3 LN
28
6
4 a 9 LN
14
3
Tipo histológico
CDIS
Grau Histológico
Total
Estadiamento
Total
Status axilar
> de 10 LN
1
0,48
0,83
0,78
5
0
105
20
Metástase
2
0
0,51
Invasão
angiolinfática
39
7
0,48
Total
34
Tamoxifeno
100 (112)
Inibidor de
aromatase
0,9 (1/112)
Tempo de uso de
tamoxifeno
Recidiva
Ciclos menstruais
100 (23)
100 (3)
26,3±21,1 (112)
25±22,9 (23)
19,3±15,6 (3)
10,6 (13)
13,1 (3)
0,78
0,31
Sim
10 (11)
13 (3)
Não
28,2 (31)
34,8 (8)
pós menopausa
61,8 (68)
52,2 (12)
66,7 (2)
110
23
3
Tempo de
sobrevida livre da
doença
59,2±62,1 (112)
41,1±41,8 (32)
22,6±15,2 (3)
0,19
Tempo de
sobrevida global
59,6±61,1 (112)
42,1±42,5 (32)
22,6±15,2 (3)
0,19
Total
33,3 (1)
0,68
Legenda: ME = metabolizador extensivo; MI = metabolizador intermediário; MP = pobre
metabolizador. *retirados do cálculo estatístico; **agrupados para cálculo estatístico; Negrito
intragrupo: agrupados para análise; (N) =número amostral
A comparação entre as características observadas e a presença ou não de
recidiva estão descritas na tabela 11. As variáveis história familiar de câncer de
mama, tempo de uso de tamoxifeno e sobrevida livre de doença foram
significativamente diferentes entre as pacientes com e sem recidiva. A história
familiar de câncer foi mais frequente no grupo de pacientes que não apresentaram
recidiva, e o tempo de uso de tamoxifeno entre as pacientes com recidiva foi
aproximadamente o dobro do tempo das pacientes sem recidiva. O tempo livre de
doença também foi maior no grupo de pacientes com recidiva.
35
Tabela 11. Distribuição das médias e porcentagens observadas para as variáveis relacionadas à
presença de recidiva nas pacientes com câncer de mama.
Recidiva
Variáveis
Não
Sim
média±dp / % (n)
média±dp / % (n)
52,8±11,5 (122)
52,6±10,4 (16)
0,93
Branca
60 (73)
69 (11)
0,77
Parda
34 (41)
25 (4)
Negra
6 (7)
6 (1)
121
16
Pré
36 (44)
43 (6)
Pós
64 (78)
57 (8)
122
14
Nega
52 (62)
40 (6)
<5anos
10 (12)
14 (2)
>5anos
5 (6)
Idade
Cor da pele
Total
Status menopausal
Total
TRH
Pré menopausa
33 (40)
46 (7)
120
15
Nulipara
16 (19)
25 (4)
Gestou
84 (102)
75 (12)
121
16
85 (104)
94 (15)
AFBM/Mastite
9 (11)
6 (1)
Nódulo benigno
6 (7)
Total
Gestações
Total
Doença prévia mama
Nega
Total
122
16
P
0,62
0,58
0,37
0,55
Hipertensão
Sim
49,5 (60)
50 (8)
0,97
Diabetes
Sim
85 (103)
82 (13)
0,72
Doença tireoide
Sim
92 (112)
94 (15)
0,87
Obesidade
Sim
64 (81)
56 (9)
0,43
Depressão
Sim
87 (106)
81 (13)
0,53
HF câncer
Sim
35 (43/122)
6 (1/16)
0,01
36
Etilismo
Nega
70 (86)
81 (13)
Ocasional
24 (28)
19 (3)
Regular
3 (4)
Ex- usuário
3 (4)
Total
Tabagismo
122
16
Nega
59 (72)
56 (9)
Tabagista
8 (10)
6 (1)
Ex-tabagista
32 (38)
38 (6)
120
16
72 (88/122)
87 (14/16)
0,09
18 (3)
0,29
Total
Atividade física
Pratica
Procedimento
Mastectomia + EA
26 (32)
Mastectomia + BLS
Quadrantectomia +
EA
Quadrantectomia +
BLS
3 (4)
35 (43)
56 (9)
34 (42)
18 (3)
121
15
T1
41 (49)
40 (4)
T2
47 (55)
60 (6)
T3
6 (5)
T4
4 (4)
TX
2 (2)
Total
Tamanho do tumor
0,70
Total
115
0,94
0,86
10
Receptor de estrogênio
Positivo
2 (2)
Receptor de progesterona
Positivo
18 (18)
15 (1)
0,89
HER-2
Negativo
76 (64)
60 (3)
0,17
+
14 (12)
20 (2)
++
2 (2)
20 (2)
+++
8 (6)
Total
84
7
23,7±18,2 (122)
43,1±32,6 (16)
0,03
Sim
84 (103)
81 (13)
0,91
Não
4 (4)
6 (1)
pós menopausa
1 (1)
Tempo em meses de uso de tamoxifeno
Ciclos menstruais
Total
11 (14)
13 (2)
122
16
37
Tempo em meses de
sobrevida livre da doença
Polimorfismo
34,8±27,1 (122)
111,2±87,5 (16)
0,00
*1/*1
81 (99)
81 (13)
0,80
*1/*4
16 (20)
19 (3)
*4/*4
3 (3)
Total
122
16
Legenda: TRH = terapia de reposição hormonal; HF = história familiar; AFBM = alteração
funcional benigna da mama
O gráfico 01 mostra o tempo de sobrevida livre de doença das pacientes do
presente estudo segundo cada polimorfismo. Podemos observar que as pacientes
que apresentam o genótipo *1/*4 (linha vermelha), em que há uma metabolização
intermediária, tem menor sobrevida quando comparado às pacientes *1/*1 (linha
azul), com fenótipo ME, porém sem diferença significativa (p=0,78).
Gráfico 01. Curva de sobrevida livre de doença, segundo cada polimorfismo, das 138 pacientes.
Legenda: poli1 = *1/*1; poli2 = *1/*4; poli3 = *4/*4
Na vertical sobrevivência acumulada
Na horizontal, tempo em meses.
38
7 DISCUSSÃO
7.1 Avaliação dos Parâmetros Clínicos
O CM, segundo o último relatório do INCA (2012) (SAÚDE e CÂNCER, 2011)
é o tipo de câncer mais frequente entre as mulheres e com maior incidência nas
regiões Sul e Sudeste. Embora seja uma neoplasia com relativamente bom
prognóstico, observa-se que as taxas de mortalidade ainda continuam elevadas no
Brasil e no mundo (BOYLE e LEVIN, 2008; SAÚDE e CÂNCER, 2011). Nas últimas
três décadas o uso do tamoxifeno tornou-se padrão ouro no tratamento endócrino do
CM, porém sabe-se que os resultados clínicos dessa terapia podem ser
influenciados por diversos fatores, dentre eles o genótipo metabolizador do CYP2D6,
a aderência ao tratamento, o uso concomitante de outras medicações que podem
inibir a conversão do TAM em metabólitos ativos, além de outros mecanismos de
resistência molecular (BRYANT, FISHER et al., 2001).
Dos 138 pacientes analisados neste estudo, 137 eram mulheres e 01 homem.
Em relação à idade, a maioria das pacientes encontrava-se na faixa de 46 a 55 anos
(35,3%), seguida de 56 a 65 anos (30,1%). Segundo Harris et al. (2009), vemos a
incidência de 1% de CM em homens, sendo a idade média de acometimento na
faixa dos 65 anos, diferente das mulheres, onde há uma distribuição bimodal, com
picos entre os 50 e 70 anos (HARRIS, LIPPMAN et al., 2009).
Em relação à cor da pele, a grande maioria das nossas pacientes era
leucodermica (61,3%), seguida de feodermica (32,8%) e melanodermica (5,8%). De
acordo com o INCA (2012), a incidência de CM é maior na raça branca, porém esta
maior incidência costuma estar associada ao nível de desenvolvimento social
(SAÚDE e CÂNCER, 2011).
Sobre uma das principais comorbidades relacionada ao aparecimento do CM,
a obesidade, 34,8% das pacientes eram obesas. Sabe-se que a obesidade é fator
de risco para o desenvolvimento do CM. Segundo Friedenreich (2001), o índice de
39
massa corpórea é relacionado diretamente com o risco de CM, porém este risco é
mais elevado nas mulheres na pós menopausa (FRIEDENREICH, 2001).
Em nosso estudo, 71,7% das pacientes não faziam uso de bebida alcóolica,
apenas 2,9% faziam uso regular (diário) e apenas 23,8% pacientes praticavam
atividade física. Sabe-se que o etilismo e o sedentarismo são fatores de risco para o
aparecimento do CM. A Sociedade Brasileira de Mastologia (2002) relata que o
consumo de álcool confere um risco relativo de 1,41 para desenvolvimento do CM
quando o consumo é entre 30 a 60 gramas por dia e que o tipo de bebida consumida
não tem influencia no aumento do risco (MASTOLOGIA e OBSTETRÍCIA, 2002a).
Embora a depressão seja uma comorbidade bastante frequente na população
com CM, 84% das nossas pacientes não apresentaram esse sintoma. Quando
comparamos com o polimorfismo do CYP2D6, observamos uma frequência de
13,4% do genótipo ME (*1/*1) e 17,4% para o genótipo MP (*1/*4). Entretanto, um
estudo realizado por Merwe et al (2012) mostra uma prevalência maior, com 37% de
história de depressão entre as pacientes com CM e o genótipo ME (VAN DER
MERWE, BOUWENS et al., 2012). Alguns antidepressivos podem interferir no
metabolismo da enzima CYP2D6, então a associação desse tipo de droga com um
genótipo MP pode interferir na resposta da paciente ao tratamento.
A presença de doença prévia na mama pode levar a um aumento do risco de
desenvolver CM. Segundo alguns autores, as hiperplasias epiteliais atípicas, a
adenose
esclerosante,
os
fibroadenomas
complexos,
a
cicatriz
radial,
a
papilomatose e o carcinoma lobular in situ são lesões que podem aumentar em até
10 vezes o risco do aparecimento do carcinoma invasor (ELMORE e GIGERENZER,
2005; HARTMANN, SELLERS et al., 2005; SANTEN e MANSEL, 2005). Entretanto,
em nosso estudo, a maioria das pacientes (86,2%) não apresentavam doença prévia
na mama.
Em relação às características tumorais, o tipo histológico mais comum
observado em nossas pacientes foi o ductal (84,4%), seguido do lobular (13,6%).
Estes dados são similares à literatura, onde se vê que aproximadamente 75% dos
CM são do tipo histológico ductal e 10% são do tipo lobular (BLAND e COPELAND,
2009).
Devido ao grande incentivo ao rastreamento mamográfico realizado tanto pelo
sistema público quanto o privado, os diagnósticos de CM estão sendo realizados
40
mais precocemente, levando a detecção de tumores menores e com menor
acometimento axilar. Segundo a Sociedade Brasileira de Mastologia (2002),
(MASTOLOGIA e OBSTETRÍCIA, 2002b) o rastreamento mamográfico deve ser
anual e iniciado aos 40 anos, a cada dois anos entre os 50 e os 69 anos e de acordo
com a expectativa de vida após os 70 anos. Isso ficou claro em nosso estudo, onde
pudemos detectar que 48,8% das pacientes eram T2 e 42,4% eram T1. Isso também
foi evidente para o acometimento axilar, pois 56,2% das nossas pacientes não
tinham nenhum linfonodo axilar acometido. Em relação ao estadiamento, 31,7% das
nossas pacientes era estádio I e 30,8% estádio II.
Quando se trata de receptores hormonais, sabe-se que aproximadamente 80
e 60% dos CM são RE e RP positivos, respectivamente, e que estes tumores
normalmente tem uma melhor evolução clínica. Page et al. (1998) mostraram que
esses tipos de tumor estão mais associados ao baixo grau histológico, baixo
pleomorfismo nuclear, baixa atividade mitótica e acometem principalmente mulheres
na pós menopausa (PAGE, JENSEN et al., 1998). Normalmente o tumor que
expressa o RE também expressa o RP, mas há casos em que há a expressão
somente de um deles. A taxa de resposta ao TAM também varia em relação à
positividade dos receptores. Sabe-se que a resposta clínica ao tratamento com o
TAM pode variar de paciente para paciente e aproximadamente 35% das pacientes
com CM RE positivo não respondem ao seu uso (OSBORNE, 1998). Tumores que
são RE e RP positivos têm uma taxa de resposta de até 77%, quando são RE
negativo e RP positivo esta taxa diminui para 46%, RE positivo e RP negativo chega
a 27% e quando ambos são negativos esta taxa reduz ainda mais, podendo chegar
a 11%. (EISENBERG e KOIFAMAN, 2001). Em nosso estudo, detectamos uma
positividade para o RE de 98,2% e para o RP de 82,4%. Lembramos que todas as
nossas pacientes faziam uso de TAM, o qual é indicado em tumores receptor
hormonal positivo. O fato de não obtermos uma positividade de 100% para os
receptores hormonais se deve a ausência de dados de algumas pacientes.
Em se tratando do HER-2, que hoje faz parte da avaliação básica
imunohistoquímica tumoral, até 30% dos tumores têm sua superexpressão (HER-2
+++), significando que seu gene codificador está amplificado. Estes tumores
costumam ter uma pior evolução clínica e resistência a certos tipos de
quimioterápicos, podendo conferir às células um fenótipo maligno e acelerar a
41
tumorigênese. (BURSTEIN, 2005). Em nosso estudo, 75,2% das pacientes eram
HER-2 negativo e 14,6% expressavam fracamente (HER-2 +), o que clinicamente e
imunohistoquimicamente é considerado HER-2 negativo (YAZIJI, GOLDSTEIN et al.,
2004). Apenas 6,7% das pacientes apresentavam superexpressão (HER-2 positivo).
Para os casos duvidosos à imunohistoquímica (HER-2 ++), foi realizado teste de
amplificação gênica por hibridização in situ por fluorescência (FISH). A discrepância
observada em nosso estudo comparado à literatura em relação à positividade do
HER-2 pode ser devido à ausência de dados de algumas pacientes.
Sobre o tratamento cirúrgico realizado, 37,5% das nossas pacientes foram
submetidas à quadrantectomia e EA, 33,1% a quadrantectomia e BLS, 25,7% a
mastectomia e EA e 2,9% a mastectomia e BLS. Entretanto, tivemos uma baixa
porcentagem de BLS (36%). Apesar de esta ser uma técnica consagrada, segundo a
Sociedade Brasileira de Mastologia ela apresenta como contraindicação axilas
clinicamente
positivas,
e
apenas
recentemente
foi
incorporada
ao
SUS
(MASTOLOGIA, 2007). Em relação ao tratamento complementar, 93,4% das
pacientes realizaram radioterapia e 63% quimioterapia (adjuvante ou neoadjuvante).
Por ser um critério de inclusão do nosso estudo, 100% das pacientes fizeram
ou fazem uso do TAM. O tempo médio de uso foi de 25,9 meses, variando de 1 a
132 meses. A duração do tratamento com o TAM é de cinco anos, mas em casos de
metástases á distância este tempo pode ser aumentado (BLAND e COPELAND,
2009). Somente uma paciente de nossa amostragem havia suspendido o TAM e
estava em uso de inibidor de aromatase por ter apresentado trombose.
Das nossas 50 pacientes que se encontravam na pré-menopausa, somente
15 (30%) apresentavam ciclos menstruais com o uso do TAM. Este dado é
importante, pois a amenorreia (ausência de ciclos menstruais) é um dos efeitos
colaterais do TAM e da quimioterapia (MOURITS, DE VRIES et al., 2001; BUIJS,
WILLEMSE et al., 2004). Isto é um indício de que nestas pacientes o TAM possa
não estar agindo de forma correta, podendo levar a evoluções não favoráveis.
Contraditoriamente, quando analisamos o grupo que teve a recidiva, 81% das
pacientes apresentavam ciclos menstruais, enquanto somente 6% apresentavam
amenorreia. No mais, 13% das pacientes encontravam-se na pós menopausa.
Em relação às recidivas, ela aconteceu em 14,5% dos casos, sendo que
destas, 44,83% foram recidivas locais, 20% foram recidivas à distância e 35,17%
42
foram tumores na mama oposta (contralateral). O tempo médio de uso do TAM nos
casos de recidiva foi de 47,5 meses, sendo o menor tempo de uso 24 meses e o
maior 60 meses. Isso nos indica que as recidivas nas pacientes receptor hormonal
positivo se iniciam principalmente após dois anos de sobrevida, podendo ocorrer
inclusive após o término do uso do TAM (5 anos). Estes dados corroboram com
Harris et al., que mostraram que tumores receptor positivo costumam recidivar mais
tardiamente que os negativos. A menor idade observada nas pacientes que
recidivaram foi de 30 anos, a maior de 76 anos e a maioria das pacientes (40%)
encontravam-se no estadiamento IIa (HARRIS, LIPPMAN et al., 2009).
7.2 Avaliação do Polimorfismo da CYP2D6
Nas últimas três décadas o uso do TAM tornou-se padrão ouro no tratamento
endócrino do CM, porém sabe-se que os resultados clínicos dessa terapia podem
ser influenciados por diversos fatores, dentre eles o genótipo metabolizador
CYP2D6, a aderência ao tratamento, o uso concomitante de outras medicações que
podem inibir a conversão do TAM em metabólitos ativos, além de outros
mecanismos de resistência molecular (BRYANT, FISHER et al., 2001).
No presente estudo o fenótipo metabolizador intermediário (*01/*04) foi
identificado em 16% (23/138) e o metabolizador pobre (*04/*04) em 3% (3/138). Os
demais pacientes, 81% (112/138) apresentaram genótipo homozigoto selvagem
(*01/*01), ou seja, metabolizadores extensivos do tamoxifeno. Nossos achados
corroboram com Sukasem et al. (2012) que ao analisarem 58 pacientes tailandesas
com CM encontraram uma prevalência de 70,8% para o grupo metabolizador
extensivo e 29,2% para o grupo metabolizador intermediário (SUKASEM,
SIRACHAINAN et al., 2012). Entretanto, em um estudo realizado no Brasil por
Antunes et al. (2012) ao analisarem o perfil metabolizador de TAM em 97 pacientes,
eles observaram uma frequência bem menor de metabolizadores extensivos (39,2%)
e um pouco maior dos metabolizadores intermediários (49,5%). Contudo a
frequência do genótipo metabolizador pobre foi semelhante (4,1%). Essas diferenças
podem ser devidas ao tamanho amostral e/ou perfil de miscigenação da população.
43
Estes pesquisadores também dosaram EDF, e observaram que a concentração
sanguínea era menor nas pacientes com o genótipo metabolizador pobre, quando
comparadas com as pacientes com o genótipo metabolizador extensivo (ANTUNES,
LINDEN et al., 2012).
Duas
características
foram
estatisticamente
relacionadas
com
os
polimorfismos da enzima CYP2D6. As variáveis investigadas cor da pele e tipo
histológico foram diferentes entre os pacientes com e sem a presença do alelo *4.
Segundo Huber et al. (2011), aproximadamente 5 a 10% dos caucasianos são
portadores do perfil MP. Os alelos mais comuns nesse grupo são o *3, *4, *5 e *6,
responsáveis por 97% dos casos, sendo o *4 o mais frequente (12 a 23%). Em
relação aos afro-americanos, o perfil MP representa até 19% dos casos, sendo o
alelo *4 responsável por 1,2 a 7%. Quando analisamos o perfil MI, há uma
prevalência de 10 a 15% nos caucasianos e 10 a 30% nos afro-americanos, sendo o
alelo *17 o principal responsável nestes (HUBER-WECHSELBERGER, NIEDETZKY
et al., 2012).
Há importantes diferenças étnicas em relação às frequências dos alelos do
CYP2D6, sugerindo que diferentes grupos étnicos respondam de forma desigual à
terapia medicamentosa com substratos da CYP2D6 (BERNARD, NEVILLE et al.,
2006). No Brasil, há dois problemas que dificultam essa comparação por etnia. O
primeiro é o perfil de miscigenação da população, o segundo é que essas
frequências alélicas ainda não são conhecidas (SOUZA, MARTINS et al., 2011). No
presente estudo, observamos que a maior prevalência do genótipo MP foi entre
pacientes leucodérmicos (supostamente de origem caucasiana) com 78%. Como
dito anteriormente, a miscigenação no Brasil é muito grande, e por esse motivo para
associarmos os polimorfismos do gene CYP2D6 com etnia, seria necessário um
estudo que avaliasse marcadores de ancestralidade para maior confiança dos
resultados. Contudo, uma análise em um número amostral significante também
poderia ajudar a traçar o perfil de metabolização dos pacientes com CM brasileiros.
44
7.2.1 Polimorfismo CYP2D6 e taxa de sobrevida
Há vários estudos na literatura que investigam a associação de polimorfismo
na enzima CYP2D6 e a evolução do CM (GOUGH, SMITH et al., 1993; DUNNING,
HEALEY et al., 1999; AUTRUP, 2000; TOPIC, STEFANOVIC et al., 2000; BIJL, VAN
SCHAIK et al., 2009; SCHROTH, GOETZ et al., 2009; ABRAHAM, MARANIAN et al.,
2010; SUKASEM, SIRACHAINAN et al., 2012; WALKO e MCLEOD, 2012). O tempo
médio de sobrevida livre de doença das nossas pacientes (tempo decorrido entre o
tumor inicial e a recidiva, no caso das pacientes que recidivaram, ou até o dia da
entrevista para aquelas que não recidivaram) foi de 43,6 meses. O de sobrevida
global (tempo decorrido entre o diagnóstico do CM até o dia da entrevista) foi de
44,5 meses, sendo 34,8 meses naquelas que não recidivaram e 111,2 meses
naquelas que recidivaram. Pacientes receptor hormonal positivo costumam recidivar
mais tardiamente (após 2 anos) e em nosso estudo foram incluídas tanto pacientes
em uso prolongado de TAM, como pacientes em uso recente dessa droga, isso
podendo explicar a discrepância nos resultados.
Em relação ao polimorfismo, a sobrevida livre de doença das pacientes
metabolizador extensivo, intermediário e pobre foi de 59,2, 41,1 e 22,6 meses
respectivamente, diferença esta que não foi significante estatisticamente.
Estes
dados corroboram com Sirachainan et al. (2012), que ao avaliarem 20 pacientes
com CM em uso de TAM, observaram que indivíduos com fenótipo MP
apresentaram menores médias de sobrevida livre de doença quando comparados
com os pacientes com o fenótipo MI (SIRACHAINAN, JARUHATHAI et al., 2012).
Ao analisar 140 mulheres indianas, Kumar et al. (2010) observaram que os
polimorfismo de baixa metabolização da enzima estavam associados a estágios
mais avançados da doença e a uma pobre resposta terapêutica ao uso do TAM
(KUMAR, REDDY et al., 2010). Por outro lado, Toyama et al. (2008) ao avaliarem
154 pacientes com CM na população asiática recebendo TAM, não observaram
diferença significativa de sobrevida livre de doença entre os diferentes tipos de
genótipos para CYP2D6 analisados (TOYAMA, YAMASHITA et al., 2008). Esse
mesmo padrão foi observado por Sukasem et al (2012) em 58 pacientes tailandesas
(SUKASEM, SIRACHAINAN et al., 2012).
45
Considerando a sobrevida, um grande estudo realizado por Abraham et al.
(2010), que investigou a associação de variantes do CYP2D6 com os resultados
clínicos de 3.155 pacientes recebendo terapia adjuvante com TAM e 3.485 pacientes
que não receberam tratamento por hormonioterapia, observaram a associação da
variante MP com menor sobrevida (ABRAHAM, MARANIAN et al., 2010).
7.2.2 Recidivas
Quando analisamos recidiva, observamos que a distribuição das pacientes
em relação ao tipo de polimorfismo é o mesmo para quem teve ou não recidiva. Não
houve diferença significativa entre a presença de recidiva e os polimorfismos do
gene CYP2D6*4. Este achado não corrobora com Damodaram et al. (2012)
(DAMODARAN, PRADHAN et al., 2012), que ao analisarem 141 pacientes, sob as
mesmas circunstancias que as do presente estudo, encontraram uma correlação
positiva entre a diminuição da função da enzima e as variantes CYP2D6*1, *2, *4, *5
e *10 e a recorrência da neoplasia.
Em nossa pesquisa, somente história familiar de CM, o tempo de uso de TAM
e a sobrevida livre de doença foram significativamente diferentes entre os grupos
com e sem recidiva. O maior tempo de uso do TAM (23,7 e 43,1 meses para não
recidiva e recidiva respectivamente) e a sobrevida livre de doença (34,8 e 111,2
meses para não recidiva e recidiva respectivamente) foram maiores naquelas
pacientes que recidivaram. Isto pode ser explicado por pacientes com pouco tempo
de uso do TAM e sobrevida (1 mês) terem sido incluídas no estudo e o fato do
menor tempo de uso do TAM nas pacientes que recidivaram ser de 24 meses.
Importante ressaltar que a maioria das nossas recidivas foi após o tempo padrão de
uso do TAM (5 anos) e que tivemos pacientes com recidiva com até 24 anos de
sobrevida livre de doença.
Liu et al. (2006) afirma que as características clinico-patológicas podem estar
associadas ao polimorfismo do CYP2D6, porém no presente estudo nenhuma outra
variável, além de cor da pele e tipo histológico ductal, mostrou-se associada ao
polimorfismo (GLENN e ROBINS, 2006). Segundo Dumitrescu e Cotarla (2005) os
46
polimorfismos no gene CYP2D6 ainda são de baixa penetrância e podem estar
associados tanto ao aumento quanto ao decréscimo ao risco de CM (DUMITRESCU
e COTARLA, 2005), isso pode justificar os resultados controversos encontrados na
literatura.
47
8 CONCLUSÃO
Concluímos que a prevalência dos polimorfismos do gene CYP2D6 em
pacientes submetidas a tratamento do câncer de mama e usuárias de tamoxifeno
em dois Serviços de Mastologia de Belo Horizonte é de 81,15% para metabolizador
normal, 16,66% para metabolizador intermediário e 2,17% para metabolizador
pobre.
Em relação aos parâmetros epidemiológicos associados ao polimorfismo do
gene CYP2D6*4 concluímos que para a presente amostra, apenas as variáveis cor
da pele e tipo histológico foram significativamente diferentes entre os pacientes com
e sem o polimorfismo.
Apesar da sobrevida livre da doença não ter mostrado diferença estatística
entre os pacientes com e sem variante *4, observamos que aqueles que possuíam o
fenótipo metabolizador extensivo, tinham uma maior sobrevida.
48
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57
ANEXO 01 – Estadiamento
58
59
ANEXO 02 - Escores para Interpretação da
Imunohistoquímica
60
ANEXO 03 - Comitê de Ética
61
ANEXO 04 – Extração de DNA Salting Out
Extração de DNA de sangue total ou do anel de células
1. Pipetar 500ul de amostra em um microtubo de 1,5ml ou 2ml;
2. Acrescentar 1ml de Lise I, homogeneizar bastante (não usar vortex),
3. Centrifugar por 5 minutos a 5.000 rpm;
4. Desprezar o sobrenadante
IMP: Repetir a lavagem com Lise I ( passos 1 a 4) quantas vezes for necessário até o
pellet de células ficar completamente limpo (livre de hemoglobina).
5. Acrescentar ao pellet de células:
 250 μL de tampão de Lise II
 5 μL de SDS 20% ou 10 μL de SDS 10%
6.
Homogeneizar em vortex por 10 segundos,
7.
Adicionar 100 μL de NaCl saturado.
8.
Homogeneizar em vortex por 15 segundos e centrifugar por 3 minutos, 5.000 rpm.
9.
Recuperar o sobrenadante resultante em um tubo limpo;
10.
Adicionar 300 μL de isopropanol absoluto, homogeneizar e esperar por mais ou
menos 15 minutos até a total precipitação do DNA (pode deixar até dois dias);
11.
Centrifugado por 5 minutos, 5.000 rpm, desprezar o sobrenadante;
12.
Lavar o DNA precipitado duas vezes com solução de etanol 75%;
13.
Centrifugar por 5 minutos, 5.000 rpm;
14.
Desprezar o sobrenadante e deixar o DNA secar a temperatura ambiente por +/20min (pode ficar até 12h em repouso);
15.
Hidratar o DNA com e água ultra pura autoclavada*.
* Quantidade de água ultra pura:
Para 500 μL de sangue adicionar 250 μL
Para 1000 μL de sangue adicionar 350 μL
SOLUÇÕES DE USO
Tampão de Lise I
3 M de Sacarose (PM = 342,3)
10 mM Tris-HCl (pH = 7,5)
5 mM MgCl
Triton x-100 1%
Estocado em recipiente âmbar, sob refrigeração (4 ºC).
Tampão de Lise II
0,075 M NaCl
0,024 M Na-EDTA pH = 8,0, ajustado com NaOH.
Estocado à temperatura ambiente.
62
APÊNDICE 01 – Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido
63
APÊNDICE 02 – Ficha de Coleta Dados
64
65
66
67