1111111,11,11111111,j1j1

PI0611979-4 A2
(21)
1111111,11,11111111,j1j1
(22) Data de Depósito: 16/06/2006
(51) Int.CI.:
(43) Data da Publicação: 13/10/2010
(RPI 2075)
A61 K 35/76
A61K 39/39
C12N 7/08
(54) Título: CEPAS DO VÍRUS DA VARÍOLA
(57) Resumo: CEPAS DE PDXVÍRUS ALTAMENTE ATENUADAS,
MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DAS MESMAS COMO INDUTORES
ALTAMENTE ATENUADOS, MÉTODOS PARA A
DE PARAMUNIDADE OU PARA A PRODUÇÃO DE VACINAS DE
PRODUÇÃO DAS MESMAS COMO INDUTORES DE
VETOR. A presente invenção se refere a cepas de poxvírus animal
PARAMUNIDADE OU A PRODUÇÃO DE VACINAS DE altamente atenuadas e ao uso das mesmas como indutores de
VETOR
paramunidade ou para a produção de vacinas de vetor. Como um
resultado do processo de alta atenuação, as cepas de poxvírus animal
16/06/2005 DE 102005027956.2 reivindicadas perdem suas propriedades virulentas e de imunização. A
(30) Prioridade Unionista:
invenção também se refere a um método para produção de tais cepas
de poxvírus altamente atenuadas e ao uso das mesmas para indução
(73) Titular(es): Anton Mayr
de paramunidade, isto é, para ativação do sistema imune não
específico em mamíferos e seres humanos ou para produção de
(72) Inventor(es): Anton Mayr
vacinas de vetor para imunização específica com o efeito colateral
positivo de paramunização. Os poxvirus animais altamente atenuados
são, assim, adequados para a prevenção e tratamento de doenças
(74) Procurador(es): Di Blasi, Parente, S. G. &
associadas a uma deficiência imune. Modalidades preferidas se
Associados S/C
referem a ortopox- (por exemplo, vírus camelpox), leporipox- (por
exemplo, myxomavírus), avipox-, parapox- e outras cepas virais
(86) Pedido Internacional: PCT EP2006005781 de 16/06/2006
ortopox, tal como MVA, as quais têm excelentes propriedades de
paramunização e nas quais as propriedades de imunização foram
(87) Publicação Internacional: WO 2006/133947de 21/12/2006 perdidas.
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para:
"CEPAS
DE PDXVÍRUS ALTAMENTE ATENUADAS, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO
DAS MESMAS COMO INDUTORES DE PARAMUNIDADE OU PARA A
PRODUÇÃO DE VACINAS DE VETOR".
5 ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere a poxvírus animal
altamente atenuado, a indutores de paramunidade produzidos
a partir dos mesmos e a vacinas de vetor baseadas em cepas
de poxvírus animal altamente atenuadas. Os poxvírus animal
10 altamente atenuados da invenção não possuem, em virtude
dos processos de alta atenuação, nenhuma propriedade
virulenta e de imunização, sejam quais forem. Um outro
aspecto da invenção se refere a métodos para produção de
tais cepas de poxvírus animal altamente atenuadas e ao uso
15 das mesmas como indutores de paramunidade para indução de
paramunidade, isto é, para ativação de sistema imune não
específico (para-específico) em seres humanos e animais ou
como vacina de vetor para imunização de um mamífero ou ser
humano. Os poxvírus animais altamente atenuados da
20 invenção são ainda adequados para a profilaxia e
tratamento de distúrbios multifatoriais, usualmente
crônicos. Modalidades preferidas da invenção se referem a
cepas de poxvírus animal altamente atenuadas de todos os
gêneros da família poxviridae, cepas as quais foram
2
isoladas de animais infectados e altamente atenuadas
através de passagens seriais. As cepas de varíola animal
da invenção têm excelentes propriedades de paramunização,
as propriedades virulentas e de imunização tendo sido
5 perdidas em virtude do método de alta atenuação da
invenção.
O sistema imune endógeno de mamíferos pode ser
dividido em uma parte antígeno-especifica e uma antígenonão-específica (para-específica). A parte antígeno
10 específica do sistema imune inclui, por exemplo,
anticorpos ou células imunes específicas, enquanto que a
antígeno-não-específica é responsável pelo desenvolvimento
de paramunidade. As atividades para-específicas do sistema
imune antígeno-não-específico (ou "sistema imune inato")
15 incluem elementos protetores solúveis e celulares nãoseletivos tais como, por exemplo, o sistema complemento de
lisozima e a cascata de citocina regulatória, e elementos
protetores celulares tais como, por exemplo, granulócitos,
micro- e macrófagos, células NK, linfócitos T não20 antígeno-condicionados, células dendríticas e outros.
Paramunidade significa o estado de um sistema de
defesa não-específico otimamente funcionando e bem
regulado o qual confere ao organismo uma proteção de
desenvolvimento rápido, tempo-limitada, aumentada contra
3
um grande número de diferentes patógenos, antígenos e
outros agressores.
Atividades para-específicas têm de ser detectadas no
organismo relevante imediatamente após contato com os
5 agressores, isto é, substâncias endógenas ou exógenas
prejudiciais, e células endógenas transformadas, após
cerca de 2 a 6 horas, enquanto que os efeitos do sistema
imune antígeno-específico aparecem apenas após 5-8 dias
(imunidade celular específica) ou mesmo após semanas
10 (anticorpos). Tempo adicional é obtido, desse modo, de
forma a desenvolver reações de defesa específicas contra
os antígenos, os quais não poderiam ser neutralizados
pelas atividades de paramunização. A defesa paraespecifica, portanto, torna possível que o organismo se
15 defenda imediatamente, isto é, sem perda de tempo, quando
de confronto com uma ampla variedade de materiais
estranhos, patógenos infecciosos, toxinas e células
endógenas transformadas (Anton Mayr, "Paramunisierung:
Empirie oder Wissenschaft", Biol. Med., edição 26(6): 25620
261, 1997).
A defesa imune para-específica é, assim, um processo
fisiológico e pode ser definido como "barreira primária"
em um confronto com um ambiente contendo substância
prejudicial. Essa forma de defesa é insubstituível não
4
apenas para os organismos inferiores, mas, em particular,
também para formas de vida mais altamente desenvolvidas.
Assim, emerge que defeitos congênitos primários nesse
sistema de defesa biológico podem levar a situações que
5 ameaçam a vida. Um exemplo o qual tem de ser mencionado é
a "síndrome de Chediak-Steinbrinck-Higashi" em seres
humanos, a qual é caracterizada por defeitos de
granulócitos e disfunções das células assassinas naturais
(células NK) e, na maioria dos casos, leva à morte do
10 paciente ao final do 10° ano de vida.
A condição de paramunidade é caracterizada por uma
taxa aumentada de fagocitose, uma função aumentada da
citotoxicidade célula-mediada espontânea (células NK) e
uma atividade aumentada de outras células linfo15 reticulares antígeno-não-específicas. Ao mesmo tempo, há
uma liberação de citocinas particulares as quais têm
efeitos de estimulação e/ou supressão (por exemplo, via
mecanismos repressores), isto é, têm efeitos regulatórios
ótimos, com os elementos celulares e umas com as outras.
20 Esse sistema biológico de resposta gradual e intimamente
relacionado de paramunidade com suas várias células
aceptoras, efetuadoras e alvo, e os mensageiros
moleculares de transmissão de sinal (citocinas) está, além
disso, totalmente conectado aos sistemas hormonal e
5
nervoso e, em alguns casos, até com os sistemas vascular e
metabólico. Assim, ele é um componente importante de
comunicação, interação e regulação da rede de defesa a
qual está naturalmente presente com proteção apropriada
5 desde o início. A natureza então proporcionou a todos os
organismos proteção apropriada do exterior. Durante a
filogênese, há inicialmente um desenvolvimento apenas do
sistema de defesa para-específico, isto é, não-específico.
Somente durante o curso posterior de evolução o sistema
10 imune específico se desenvolve gradualmente.
Paramunidade é induzida medicamente através de
paramunização com os assim denominados indutores de
paramunidade. Paramunização médica é obtida através de
ativação dos elementos celulares da parte para-específica
15 do sistema imune e a formação, relacionada à mesma, de
citocinas, com o objetivo de eliminar disfunções,
aumentando prontamente a proteção não-patógeno- e
antígeno-específica de um indivíduo (bio-regulação ótima),
eliminar uma imunossupressão ou imunodeficiência a qual
20 surgiria como um resultado de estresse ou de outras formas
(por exemplo, farmacologicamente), reparar déficits e/ou
atuar como um regulador entre os sistemas imune, hormonal
e nervoso (Anton Mayr, "Paramunisierung: Empirie oder
Wissenschaft", Biol. Med., edição 26(6): 256-261, 1997).
6
Isso significa que determinados processos de defesa
endógenos não-específicos podem ser aumentados,
suplementados ou mesmo eliminados, dependendo do tipo de
paramunização e da responsividade tal como, por exemplo, o
5 estado de defesa do paciente.
O indutor de paramunidade per se é uma proteína, isto
é, não é comparável a um anticorpo ou a um produto
químico, um antibiótico, vitamina ou hormônio. Pelo
contrário, ele ativa, semelhante a um catalisador, através
10 de um mecanismo gradual e mecanismos de defesa humorais.
Indutores de paramunidade, nesse caso, têm efeitos
regulatórios e de reparo sobre as defesas imunes.
Referente ao modo de ação de indutores de paramunidade
sabe-se que eles são captados por células fagocíticas
15 (células aceitadoras) as quais são, assim, ativadas e
liberam mediadores tais como, por exemplo, citocinas, as
quais, por sua vez, mobilizam células efetuadoras.
Indutores de paramunidade baseados em combinações de
dois ou mais componentes de poxvírus animal
20 convencionalmente atenuados os quais são derivados de
diferentes cepas de poxvírus animal com propriedades de
paramunização são descritos na patente Européia EP O 669
133 Bl.
As cepas de poxvírus animal sobre as quais esses
7
indutores de paramunidade são baseados foram atenuadas de
uma forma convencional, isto é, elas estão em uma condição
reduzida na qual as propriedades virulentas e, em
particular, de imunização do vírus foram enfraquecidas,
5 mas não completamente perdidas.
A presente invenção apresenta, pela primeira vez, um
novo método o qual elimina completamente a virulência e
imunogenicidade de cepas de poxvírus animal simplesmente
atenuadas.
10
Tal alta atenuação de poxvírus é mostrada na presente
invenção pela primeira vez com base em ortopoxvírus do
vírus camelpox (Orthopoxvirus cameli) e vírus ektromelia
virus (Orthopoxvirus muris), em leporipoxvírus do voris de
mixomatose (Leporipoxvirus myxomatosis), em avipoxvírus do
15 vírus fowlpox (Avipoxvirus gallinae) e vírus canarypox
(Avipoxvirus serinis) e no parapoxvírus ecthyma
(Parapoxvirus ovis).
Modalidades exemplificativas da invenção se referem à
alta atenuação da cepa de ortopoxvírus do vírus camelpox
20 h-M 27 e da cepa de leporipoxvírus do vírus de mixomatose
h-M 2. Nem uma atenuação nem uma alta atenuação foi, até o
momento, realizada ou descrita para essas cepas de
poxvírus. Outras modalidades preferidas se referem a
outras cepas de ortopoxvírus e a cepas de parapoxvírus e
8
avipoxvírus (veja abaixo).
Uma atenuação convencional simples foi mostrada para
o gênero Orthopoxvirus no caso do vírus da varíola ankara
MVA por A. Mayr, H. Stickl, H.K. Müller, K. Danner e H.
5 Singer, 1978: "Der Pockenimpfstamm MVA", Zbl. Bakt. Hyg.,
I.
Abt.
Orig.
"Geschichtlicher
B
167,
375-390;
Mayr,
Überblick über die
A.,
1999:
Menschenpocken
(Variola), die Eradikation von Variola und den
attenuierten Pockenstamm MVA", Berl. Münch. Tierãrztl
10 Wschr. 112, 322-328; para o gênero de avipoxvírus HP1 e
KP1 por A. Mayr, F. Hartwig e I. Bayr, 1965: "Entwicklung
eines Impfstoffes gegen die Kanarienpocken auf der Basis
eines attenuierten Kanarienpockenkulturvirus", Zbl. Vet.
Med. B 12, 41-49; A. Mayr e K. Malicki, 1966:
15 "Attenuierung von virulentem Hühnerpockenvirus in
Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Vírus",
Zbl. Vet. Med. B. 13, 1-13; e para o gênero de
parapoxvírus ORF-1701 por A. Mayr e M. Büttner, 1990:
"Ecthyma (ORF) vírus": Em: Z. Dinter e B. Morein (eds.):
20 Virus infections of vertebrates, vol. 3; Virus infections
of ruminants, Elsevier Science Publishers, B.V. Amsterdam.
Alguns exemplos de cepas de poxvírus animal altamente
atenuadas por meio do método da invenção são explicados em
maiores detalhes abaixo:
9
Vírus camelpox
Camelpox são os patógenos de uma doença viral
perigosa de camelos a qual tem um curso sistêmico cíclico
e é caracterizada por um exantema, de preferência sobre a
5 pele e membrana mucosa na cabeça, pescoço e região da
garganta e nas extremidades e região inguinal (Munz, E.,
1999: "Pox and pox-like diseases in camels", Proc. lst
Int. Camel Conf. 1, 43-46). A doença ocorre ciclicamente a
cada 2 a 3 anos se uma população suficientemente grande
10 sensível está disponível. Dois gêneros (lhama e camelo) da
família
Camelidae
são, de preferência, afetados pelos
vírus camelpox (Mayr, A. e Czerny C.P., 1990: "Camelpox
virus", Em: Dinter Z. e Morein B. (eds.): "Vírus
infections of vertebrates", vol. 3: Vírus infections of
15 ruminants. Elsevier Science Publishers B.V.Amsterdam). O
gênero
Camelus
inclui o dromedário com uma corcova
(Camelus dromedarius)
corcovas
e o camelo Bactrian com duas
(Camelus ferus bactrianus).
Dromedários e camelos
Bactrian ocorrem principalmente nos países do assim
20 denominado "velho mundo" (desertos, estepes do norte da
África, Arábia, Mongólia), enquanto que o habitat
preferido do lhama é a América do Sul.
O vírus camelpox
(Orthopoxvirus cameli) é um parente
relativamente íntimo do vírus da varíola, o patógeno da
10
smallpox em seres humanos (Varíola). O vírus camelpox não
é patogênico para seres humanos. O vírus camelpox é, da
mesma forma que os poxvírus clássicos, em formato de
tijolo e tem proteínas na superfície característicos as
5 quais são responsáveis pelas propriedades de imunização e
paramunização do vírus ou seus constituintes. O tamanho
médio é, dependendo do gênero e cepa, de 280 nm na direção
longitudinal e cerca de 180 nm na direção transversal
(Otterbein, C.K., 1994: "Pháno-und genotypische
10 Untersuchungen zweier Kamelpoxvirus-Isolate vor und nach
Attenuierung durch Zellkulturpassagen", Vet. Med. Diss.
Munique). O genoma do vírus camelpox consiste de um DNA
fita dupla linear. As duas fitas de DNA são covalentemente
ligadas juntas nas extremidades do genoma, de modo que o
15 DNA do vírus forma uma cadeia de polinucleotídeo contínua.
Vírus de mixomatose
Myxomavírus são os patógenos de mixomatose, uma
doença viral sistêmica contagiosa de coelhos silvestres e
domésticos a qual progride em ciclos e é caracterizada por
20 edemas subcutâneos generalizados, em alguns casos
hemorrágicos, sobre a cabeça e sobre o corpo todo, com
preferência pela região anal, a vulva e o tubo, diferentes
de qualquer outra doença infecciosa. Introdução de
mixomatose em um país anteriormente livre da doença
11
resulta em uma progressão rápida e fatal. Após o vírus se
tornar endêmico, o caráter da doença muda até que as
infecções não sejam clinicamente evidentes (Mayr A.:
Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre,
5
7 a edição, Enke-Verlag, Stuttgart, 2002).
A doença é disseminada entre coelhos com cauda de
algodão Americanos do gênero
Sylvilagus
os quais ocupam
exclusivamente o novo mundo. Esses coelhos silvestres
formam o único reservatório natural da doença. A infecção
10 ocorre em uma forma branda nos mesmos. Em contraste, a
doença tem uma mortalidade de quase 100% na Europa em
coelhos silvestres e domésticos do gênero Oryctolagus,
os
quais também são naturalizados na Austrália, quando o
patógeno é introduzido.
15
A faixa de hospedeiro natural do Myxomavírus (gênero
Leporipoxvirus)
tem limites estreitos. Em geral, o vírus
se reproduz apenas em coelhos com cauda de algodão
Americanos e em coelhos domésticos e silvestres da Europa.
Contudo, também forma observadas umas poucas infecções em
20 lebres silvestres Européias. Transmissão tentada para
outra espécie animal e para seres humanos teve resultados
negativos.
Avipoxvírus
As infecções causadas por avipoxvírus, especialmente
12
vírus fowlpox e vírus canarypox, progridem de uma forma
similar. Fowlpox deriva da Ásia e foi mostrado há milhares
de anos. Eles estão distribuídos ao redor do mundo e são
muito resistentes. A transmissão ocorre por meio de
5 entrada através de feridas na pele. Insetos que picam
também podem estar envolvidos na transmissão. O tempo de
incubação para a doença é de 4 a 14 dias. Existem duas
formas, uma distinção sendo feita entre a assim denominada
forma cutânea e a forma mucosal. A forma cutânea é
10 caracterizada por bolhas ou nódulos cicatriciais sobre a
cabeça, crista, pescoço e pés. A forma mucosal exibe
depósitos brancos amarelados sobre a língua, as membranas
mucosas do bico, da laringe, da traquéia e dos olhos.
O tempo de incubação quando de infecção com o vírus
15 canarypox é de 3 a 16 dias. Após a doença ter emergido, a
maior parte da criação morre dentro de umas poucas horas.
Os pássaros infectados mostram nódulos sobre as partes
córneas e nos ângulos do bico. Lesões respiratórias
massivas ocorrem e os pássaros sufocam rapidamente em
20
virtude de depósitos caseinosos nas vias aéreas causados
pelo vírus.
Cepas atenuadas de avipoxvírus foram obtidas através
de passagens sucessivas em culturas de células de
fibroblasto de embrião de galinha e foram empregadas para
13
vacinação de galinhas. A cepa mais investigada e
disponível é a cepa HP-1 (A. Mayr e K. Malicki, 1966:
"Attenuierung von virulentem Hühnerpockenvirus in
Zellkulturen und Eigenschaften des attenuierten Virus",
5 Zbl. Veg. Med. B 13, 1-13). Mais de 200 passagens em
fibroblastos de embrião de galinha leva a um vírus
atenuado, mas o qual ainda é capaz de replicação e retém
patogenicidade para galinhas quando de administração
intravenosa ou por aerossol. Vírus passados mais de 400
10 vezes são considerados como não patogênicos e são
considerados como vetores eficientes e extremamente
seguros para uso em mamíferos. Foi possível obter
imunização sem que replicação produtiva completa do vírus
ocorresse.
15
Objetivo da invenção
As cepas de poxvírus animal as quais foram
enfraquecidas até o momento através de atenuação
convencional levam a um aumento nas propriedades de
paramunização e a uma redução nas propriedades virulentas
20 e de imunização do vírus e seus constituintes. Contudo,
nem todas as propriedades virulentas e de imunização das
cepas de varíola animal são perdidas em atenuação
convencional. Respostas imunes ainda estão presentes em
mamíferos com cepas de varíola animal simplesmente
14
atenuadas. Isso é presumivelmente relacionado ao fato de a
atenuação simples ter muito pouca estabilidade ou a
atenuação ser muito baixa no caso de poxvírus animais
simplesmente atenuados.
5
A presente invenção é, portanto, baseada no objetivo
de proporcionar cepas de varíola animal as quais são
estáveis, exibem um alto grau de atenuação e nas quais os
poxvírus são modificados de uma forma tal que eles tenham
perdido completamente suas propriedades virulentas e de
10 imunização e, assim, possam ser usados como indutores de
paramunidade e vacinas de vetor sem perigo.
Esse objetivo é obtido, de acordo com a invenção,
através dos assuntos em questão das reivindicações em
anexo.
15
Surpreendentemente, descobriu-se que cepas de varíola
animal simplesmente atenuadas são modificadas através de
etapas adicionais de atenuação com passagens de diluição
terminal de placa contínuas em culturas de células
permissivas selecionadas, de uma forma tal que elas perdem
20 completamente sua capacidade de virulência e imunização,
sem que sua capacidade de replicação seja prejudicada. As
cepas de varíola animal da invenção também são ainda
restritas quanto à sua faixa de hospedeiros. As deleções
resultantes da alta atenuação no genoma viral,
15
adicionalmente,
tornam possível introduzir antígenos
estranhos.
A perda, causada pela alta atenuação, das proteínas
de imunização faz torna as proteínas de paramunização
5 adicionais ativas e elas aumentam de uma maneira
significativa a atividade de paramunização dessas cepas.
Dessa forma, indutores de paramunidade altamente ativos e
sem perigo são obtidos e não causam quaisquer alergias ou
outros efeitos colaterais imunopatogênicos, mesmo se
10 administrações são repetidas a curto prazo e são
freqüentes.
As cepas de varíola animal as quais são altamente
atenuadas através do método da invenção são, portanto,
excepcionalmente adequadas como indutores de paramunidade
15 ou para a produção de vacinas de vetor.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção se refere a cepas de poxvírus animal
altamente atenuadas e ao uso das mesmas como indutores de
paramunidade ou para a produção de vacinas de vetor.
20
Modalidades particulares das cepas de varíola animal
altamente atenuadas são cepas do vírus de mixomatose e do
vírus camelpox. Preferência particular é dada à cepa h-M
27 do vírus camelpox com o número de depósito 05040602 e à
cepa h-M 2 do vírus de mixomatose com o número de depósito
16
05040601. Os vírus foram depositados na instituição
depositária do Public Health Laboratory Service (PHLS),
Centre for Applied Microbiology & Research (CAMR),
European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC),
5 Porton Down, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido. Outras
modalidades da invenção se referem à alta atenuação do
vírus canarypox (Avipoxvirus serinae), de preferência da
cepa KP1, do vírus ectromelia (Orthopoxvirus muris), de
preferência da cepa Mü 1 e do vírus fowlpox (Avipoxvirus
10 gallinae), de preferência da cepa HP1 e do vírus parapox
(Parapoxvirus ovis).
Na alta atenuação de cepas de poxvírus animal
descoberta de acordo com a invenção, a virulência das
cepas virais e suas propriedades de imunização são
15 completamente perdidas em comparação com cepas da varíola
animal convencionalmente atenuadas. Os poxvírus animal
altamente atenuados da invenção, portanto, não têm mais
qualquer virulência ou imunogenicidade residual. As cepas
de varíola animal altamente atenuadas são, portanto,
20 particularmente adequadas para uso como indutores de
paramunidade ou para a produção de vacinas de vetor.
A invenção ainda se refere a métodos para produção
das cepas de poxvírus altamente atenuadas da invenção.
Cepas de poxvírus preferidas são cepas as quais pertencem
17
ao gênero ortopoxvírus, avipoxvírus, leporipoxvírus e
parapoxvírus.
A alta atenuação de cepas de poxvírus é obtida, de
acordo com a invenção, através de passagens adicionais de
5 diluição terminal de placa (isto é, transferência e
manutenção) de cepas virais convencionalmente atenuadas,
em linhagens de células permanentes, otimizadas,
selecionadas (por exemplo, células VERO), em culturas de
células primárias (por exemplo, cultura de células de
10 fibroblastos de embrião de galinha (FHE)), ovos de galinha
incubados ou em animais experimentais. Surpreendentemente,
descobriu-se que a virulência e imunogenicidade de
poxvírus animais e seus constituintes são perdidos em
comparação com cepas convencionalmente atenuadas através
15 dessa passagem adicional. A passagem, nos sistemas ou
culturas de células selecionadas, ocorre até que as
propriedades desejadas sejam obtidas, isto é, até que os
poxvírus animais não tenham mais qualquer virulência ou
imunogenicidade e, ao invés disso, mostrem uma atividade
20 aumentada do sistema imune não-específico (paramunidade).
Isso, normalmente, pode ser obtido através de pelo menos
300-500 passagens em sistemas de células otimizados, tais
como culturas de células de passagens de células VERO
(ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection).
18
Tais sistemas otimizados de células proporcionam as
titulações infecciosas necessariamente altas. As outras
propriedades biológicas, genéticas e imunológicas
desejadas resultantes de uma alta atenuação de cepas de
5 varíola animal são listadas na tabela 3.
O método da invenção para produção de poxvírus
altamente atenuados pode ser, em geral, definido pelas
seguintes etapas:
(a) adaptação da varíola animal a um sistema de
10 célula permissivo, por exemplo, consistindo da membrana
corioalantóica de embriões de galinha de 10 dias de idade
(CAM) ou culturas de células, por exemplo, culturas de
células de rim de cordeiro;
(b) transferência e manutenção dos poxvírus animais,
15 para atenuação, através de passagens a longo prazo em
vários sistemas de células permissivas, o que torna
titulações infecciosas ótimas possíveis, especialmente
células AVIVER ou VERO;
(c) transferência e manutenção dos poxvírus animais,
20 para atenuação, em um sistema de células ótimo durante
cerca de 100-300, por exemplo, 100, 105, 110, 115, 120,
125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175,
180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230,
235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285,
19
290, 295 ou 300 passagens, de preferência em células VERO,
sendo preferido que
AVIVER ou MA,
usado em
(c)
o
sistema de
células
venha a diferir do sistema de células usado
em (b);
5
(d)
transferência
em células
10
e manutenção dos poxvírus
VERO durante pelo menos
90,
animais
por exemplo,
95,
100,
105,
110,
115,
120,
125,
130,
135,
140,
145,
150,
155,
160,
165,
170,
175,
180,
185,
190,
195,
200,
205,
210,
215,
220,
225,
230,
235,
240,
245,
250,
255,
260,
265,
270,
275,
280,
285,
290,
295,
300 ou mais passagens,
de preferência passagens de diluição terminal de placa.
Em uma modalidade particularmente preferida, a cepa
de ortopoxvírus altamente atenuada é um vírus camelpox
altamente atenuado
(Orthopoxvirus cameli),
especialmente a
15 cepa h-M 27. Um método preferido para alta atenuação de
vírus camelpox inclui as seguintes etapas:
(a) cultura do vírus camelpox isolado durante cerca
de 2 a 4 passagens em culturas de células de rim de
cordeiro;
20
(b) transferência e cultura dos poxvírus animais
durante cerca de 5 a 10 passagens em passagens de células
VERO (ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection);
(c) transferência e cultura dos poxvírus animais
durante cerca de 114 a cerca de 150 passagens em células
20
MA;
(d) transferência e cultura dos poxvírus animais
durante cerca de mais 267 ou mais, por exemplo, 270, 275,
280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330,
5 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385,
390, 395, 400 ou mais passagens em células VERO, de
preferência passagens de diluição terminal de placas.
Os poxvírus animais gerados dessa forma podem ser
empregados para produção de indutores de paramunidade e
10 vacinas de vetor. Para a produção, é usada a coleta de
vírus capaz de replicação.
Uma outra modalidade da presente invenção se refere a
cepas
de
leporipoxvírus do vírus de mixomatose
(Leporipoxvirus myxomatosis)
15
altamente atenuado, cepa h-M
2.
Um método preferido para alta atenuação de tal cepa
de vírus de mixomatose, de preferência da cepa h-M 2,
inclui as seguintes etapas:
(a) isolamento, de animais doentes via a membrana
20 corioalantóica de embriões de galinha de 10 dias de idade
(CAM) e manutenção nesse sistema durante pelo menos 2 ou
mais, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais
passagens;
(b) transferência e manutenção dos poxvírus animais
21
isolados durante pelo menos 120 ou mais, por exemplo, 125,
130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180 ou
mais passagens em culturas de células VERO;
(c) transferência e manutenção, dos poxvírus animais,
5 em células AVIVER durante pelo menos 24 ou mais, por
exemplo, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais passagens;
(d) transferência e manutenção dos poxvírus animais
em células VERO durante pelo menos 157 a 200 passagens;
(e) transferência e manutenção dos poxvírus animais
10 em células MA durante pelo menos 114 a 150 passagens;
(f) transferência e manutenção dos poxvírus animais
em células VERO durante pelo menos 179 passagens.
As coletas de vírus são inativadas através de
tratamento com beta-propiolactona para produzir indutores
15 de paramunidade.
A invenção também se refere a composições
farmacêuticas as quais compreendem uma ou mais cepas de
varíola altamente atenuadas de diferentes origens em
combinação e à qual um veículo farmacêutico é adicionado
20 onde apropriado.
Um outro aspecto da invenção, portanto, se refere ao
uso de uma ou mais cepas de varíola animal altamente
atenuadas da invenção (por exemplo, em combinação) ou
constituintes das cepas de varíola animal altamente
22
atenuadas para ativação do sistema imune para-específico
em um mamífero ou em um ser humano para profilaxia e
terapia.
Em um outro aspecto da presente invenção, os poxvírus
5 animais altamente atenuados são empregados para produzir
vacinas de vetor; as coletas de vírus capazes de
replicação são usadas para essa finalidade. Um ácido
nucléico que codifica um antígeno estranho é, nesse caso,
incorporado em uma das deleções, resultantes da alta
10 atenuação, do ácido nucléico do vetor (poxvírus animal),
de modo que o gene estranho possa ser expresso pelo vetor.
As proteínas estranhas resultantes, dessa forma,
proporcionam epítopos de imunização e, assim, estimulam o
sistema de defesa específico endógeno.
15 DEFINIÇÕES
O termo "atenuação" (atenuar: enfraquecer, aliviar)
de um patógeno infeccioso (por exemplo, vírus, bactérias,
fungos) significa, em princípio, a redução de suas
propriedades virulentas e de imunização. Em particular,
20 dependendo do grau de atenuação, em termos de
de gene,
tecnologia
há uma redução no peso molecular e, assim, uma
redução de seu ácido nucléico, associada à ocorrência de
deleções, em termos biológicos, há uma redução ou perda de
suas propriedades patogênicas com relação à virulência e
23
capacidade de contágio, em termos
há uma
imunológicos,
perda de atividades imunogênicas e um aumento nas
potências para-específicas e, em termos
clínicos,
há uma
restrição na faixa de hospedeiro e uma atividade aumentada
5 de reações de defesa para-específicas do hospedeiro.
"Alta atenuação" significa a redução adicional de
patógenos simplesmente atenuados, mas ainda parcialmente
virulentos e de imunização, até que a virulência e o
potencial de imunização sejam completamente perdidos, a
10 alta atenuação resultando em uma limitação extrema da
faixa de hospedeiro. A alta atenuação aumenta grandemente
o potencial de paramunização. Em relação à reativação de
suas propriedades virulentas e de imunização perdidas, os
poxvírus altamente atenuados são mais estáveis do que
15 cepas convencionalmente atenuadas, isto é, re-conversão é
impossível.
As cepas de varíola animal altamente atenuadas
diferem das cepas de varíola animal convencionalmente
atenuadas, em termos de
tecnologia de gene,
por uma
20 diminuição adicional no peso molecular do ácido nucléico
viral e um aumento em deleções no ácido nucléico; em
termos
biológicos,
pela perda completa de virulência e
capacidade de contágio, essas cepas simultaneamente
obtendo uma titulação infecciosa ótima, a qual é alta em
24
comparação com cepas convencionalmente atenuadas, no
sistema hospedeiro permissivo; em termos
imunológicos,
pela perda total de imunogenicidade e, em termos de
biologia molecular, pela perda de receptores de citocina,
5 por exemplo, receptores para interferon e determinadas
interleucinas.
Os termos "virulência" e "propriedades virulentas"
são usados como sinônimos na presente invenção. Virulência
se refere ao grau das propriedades de causar doenças de
10 uma determinada cepa de uma espécie patogênica em um
hospedeiro particular sob condições de infecção definidas.
O grau de virulência pode variar amplamente dentro das
cepas de uma espécie. Uma distinção é feita entre cepas
altamente, fracamente e não virulentas (avirulentas). Uma
15 alteração no hospedeiro e condições ambientais também pode
levar a uma alteração na virulência da cepa, mas também
pode permanecer inalterada. Assim, as defesas do
hospedeiro, as circunstâncias anatômicas e fisiológicas da
flora do hospedeiro, a temperatura ambiente, a umidade,
20 etc. podem atuar sinergística ou antagonisticamente. Cada
espécie intrinsecamente patogênica ocorre, na natureza, em
numerosas cepas diferindo quando à virulência. A presença
de virulência ou a perda de virulência pode ser avaliada
em sistemas de teste os quais são conhecidos por aqueles
25
habilitados na técnica e é relevante para o respectivo
poxvírus animal. Os poxvírus animais da presente invenção,
em particular, não mostram virulência, seja qual for, em
hospedeiros humanos.
5
O termo "patogenicidade" (pathos = sofrimento) se
refere à propriedade de um patógeno infeccioso ou parasita
metazóico de ser capaz, após penetração, adesão e
replicação idêntica em um hospedeiro, de levar a um dano
local ou geral da capacidade de funcionar (functio lesa) e
10 causar uma doença infecciosa. Uma vez que o
desenvolvimento de uma doença infecciosa depende do
patógeno e do hospedeiro, o termo patogenicidade se refere
a um sistema de patógeno-hospedeiro, não apenas ao
patógeno. A patogenicidade se refere a espécies de um
15
patógeno, não uma variante, uma cepa ou uma colônia. É uma
propriedade básica, um poder o qual pode, mas não precisa
atuar. Uma espécie patogênica não pode, com relação a um
sistema de patógeno-hospedeiro particular, se tornar de
natureza não patogênica porque essa capacidade básica de
20 uma espécie inteira não é perdida.
Os termos "imunogenicidade" e "propriedades de
imunização" são usados como sinônimos na presente
invenção. Imunogenicidade de um poxvírus animal se refere
à capacidade do poxvírus animal de induzir, em um
26
vertebrado, de preferência no hospedeiro natural do vírus
ou em um ser humano, a uma resposta imune humoral e/ou
específica celular, por exemplo, estimular proliferação de
células T e/ou a geração de anticorpos. A perda da
5 imunogenicidade das cepas de varíola animal altamente
atenuadas da presente invenção está associada à perda
dessa capacidade. A imunogenicidade ou a perda da mesma
pode ser investigada em sistemas de teste os quais são
conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
10
"Vacinas de vetor" (vacinas recombinantes, vacinas
híbridas) significam vacinas as quais consistem de dois
componentes: um veículo microbiano (vetor) e um antígeno
de imunização cujo ácido nucléico de codificação é
incorporado no vetor. Veículos microbianos adequados e
15 preferidos são, em virtude de suas numerosas deleções de
ácido nucléico e suas propriedades de paramunização,
poxvírus animais (altamente) atenuados. O ácido nucléico
de gene estranho introduzido é levado à expressão pelo
vetor na vacina, levando à formação de reações de
20 imunização específicas.
"Indutores
específicas)
de
paramunidade"
(vacinas
para-
se referem a produtos bio-regulatórios
compostos de poxvírus animais atenuados, não virulentos e
inativados os quais, dependendo do grau de atenuação,
27
agora compreendem apenas resíduos de (convencionalmente
atenuados) ou nenhuma (altamente atenuados) propriedade de
imunização e se destinam a serem usados para paramunização
em seres humanos e animais. Eles são produzidos da mesma
5 forma que vacinas específicas convencionais e também se
assemelham às mesmas funcionalmente, mas com a diferença
de que eles ativam predominantemente os mecanismos de
defesa para-específicos (não-específicos) e, além disso,
levam, através de suas propriedades de bio-regulação, a
10 sistemas de defesa hemodinâmicos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Geral
A invenção é baseada na descoberta surpreendente de
que a virulência e propriedades de imunização de cepas de
15 poxvírus animal convencionalmente atenuadas podem ser
reduzidas até perda completa através de passagens de
diluição terminal de placa em culturas de células
permissivas, ovos de galinha incubados ou animais
experimentais. Cepas altamente atenuadas dessa forma são
20 estáveis a uma reativação potencial dessas propriedades.
Esse processo, o qual vai além de uma atenuação simples
convencional, é referida na presente invenção como "alta
atenuação". Essas cepas de poxvírus animal altamente
atenuadas são distintamente aperfeiçoadas com relação a
28
patógenos convencionalmente atenuados. Em particular, as
cepas de varíola animal altamente atenuadas diferem,
conforme resumido na tabela 3, das cepas de varíola animal
convencionalmente atenuadas em termos de
5
gene
tecnologia de
através da diminuição no peso molecular do ácido
nucleico viral e aumento em deleções no anticorpo; em
termos
biológicos,
através da perda de virulência e
capacidade de contágio; em termos imunológicos,
perda de imunogenicidade e, em termos de
10
através da
biologia
molecular, através da perda de receptores de citocina.
Inesperadamente, foi descoberto que todas as cepas de
varíola animal atenuadas testadas da família poxviridae, a
despeito do gênero ao qual elas pertencem, podem ser
convencionalmente atenuadas e, então, ainda enfraquecidas
15 com alta estabilidade (veja tabelas 1 e 2). Tal alta
atenuação é mostrada, na presente invenção, a guisa de
exemplo, com representantes dos gêneros ortopoxvírus,
leporipoxvírus e avipoxvírus, mas não é considerada como
confinada a esses gêneros.
20
A capacidade de patógenos infecciosos de mudar de
forma a se adaptar às alterações ambientais, por exemplo,
através de crescimento em culturas de células ou em
sistemas hospedeiros não-naturais, pode ser utilizada
experimentalmente de forma a reduzir acentuadamente o
29
tempo
necessário
para
alta atenuação.
Isso,
de
preferência, ocorre através de passagens a longo prazo em
sistemas hospedeiros permissivos em particular, os quais
normalmente não pertencem à faixa de hospedeiro natural
5 (por exemplo, animais experimentais, culturas de células,
meios nutrientes). Alta atenuação de cepas de poxvírus
leva, comumente, cerca de 15 a 30 anos.
Cepas de poxvírus altamente atenuadas também perdem
suas capacidades de imunização específica, enquanto que
10 sua atividade para-específica é especialmente
intensificada, através do método de alta atenuação
descrito em detalhes abaixo. As cepas de poxvírus
altamente atenuadas são, portanto, adequadas como
indutores de paramunidade ou para a produção de vacinas de
15 vetor.
A intensificação das propriedades para-específicas é,
presumivelmente, atribuível à interferência mútua de
proteínas de imunização e paramunização de poxvírus
animais. A perda, causada pela alta atenuação, das
20 proteínas de imunização torna proteínas de paramunização
adicionais ativas e elas aumentam de uma maneira
significativa a atividade de paramunização dessas cepas.
Dessa forma, indutores de paramunidade altamente ativas e
inócuos são obtidos e não causam quaisquer alergias ou
30
outros efeitos colaterais imunopatogênicos, mesmo se
administrações são repetidas a curto prazo e são
freqüentes.
Comumente, atenuação convencional simples leva a uma
5 redução na virulência e capacidade de contágio e a uma
limitação na faixa de hospedeiro e a pequenas alterações
no genoma do patógeno, com uma simultânea diminuição no
peso molecular e a ocorrência de deleções nas regiões
terminais do genoma viral. Além disso, há uma diminuição
10 nas atividades especificamente de imunização e um aumento
na atividade para-específica. Contudo, uma alta atenuação
intensifica esses efeitos drasticamente, de modo que os
vírus altamente atenuados resultantes são superiores em
termos de sua estabilidade, sua especificidade pelo
15 hospedeiro, a falta de virulência e imunogenicidade com
relação a vírus convencionalmente atenuados (tabelas 3 e
4).
Os poxvírus animais altamente atenuados
Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere
20 a um poxvírus animal altamente atenuado baseado em uma
cepa de poxvírus animal da família poxviridae,
caracterizado pelo fato de o poxvírus animal não ter mais
quaisquer propriedades virulentas e de imunização e o
poxvírus animal altamente atenuado exibe um menor peso
31
molecular do ácido nucleico viral,
deleções mais
freqüentes na região terminal e uma perda aumentada de
receptores de citocina em comparação com cepas de varíola
animal convencionalmente atenuadas. Poxvírus animais
5 atenuados conhecidos têm entre O e 3 deleções em uma ou
ambas as regiões terminais do genoma viral. O número de
deleções em várias cepas de poxvírus animais meramente
atenuados varia, contudo, de modo que os poxvírus animais
altamente atenuados da presente invenção, tomados juntos,
10 exibem entre 1, 2, 3, 4, 5 ou mais deleções nas regiões
terminais do genoma viral, do que aquelas em poxvírus
animais meramente atenuados. Em uma modalidade preferida
da invenção, os poxvírus animais altamente atenuados da
presente invenção exibem, no total, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou
15 mais deleções nas regiões terminais. Eles exibem, de
preferência, deleções mais freqüentes, de preferência pelo
menos 2 deleções na região direita e pelo menos 2 deleções
na região esquerda.
Em uma modalidade preferida do poxvírus animal
20 altamente atenuado da presente invenção, o genoma viral
mostra uma perda de receptores de citocina para interferon
a e y.
É particularmente preferido que o poxvírus animal
mostre, adicionalmente também, uma perda de receptores
32
para IL-1R e/ou células TH 1.
Em uma modalidade, o genoma viral do poxvírus animal
é 16%, 17%, 18%, 19% e, particularmente de preferência,
cerca de 20% ou menor do que o genoma viral do tipo
5 silvestre. As deleções estão, de preferência, localizadas
em uma ou mais regiões terminais do genoma do poxvírus
animal.
Em uma modalidade preferida, o poxvírus animal
altamente atenuado da presente invenção é obtenível
10 através do seguinte método:
(a) adaptação da varíola animal em um sistema de
células ou cultura de células permissiva, em particular
células de rim de cordeiro ou células CAM particular;
(b) transferência e manutenção dos poxvírus animais
15 para atenuação, através de passagens a longo prazo, em
vários sistemas de células permissivas, o que torna
titulações infecciosas ótimas possíveis, por exemplo, em
células VERO, em particular durante cerca de 5 a 10
passagens; no caso de vírus de mixomatose; de preferência,
20 pelo menos 100, de preferência pelo menos 110, pelo menos
120, pelo menos 130 ou mais passagens em células VERO são
realizadas, seguido por pelo menos 20, de preferência pelo
menos 24 passagens intermediárias em culturas de células
AVIVER e outras passagens em células VERO;
33
(c)
transferência e manutenção do poxvírus animal
para atenuação em um sistema de célula ótimo durante cerca
de 100-300 passagens, por exemplo, em células MA-104,
células VERO ou células AVIVER, em particular durante 200
5 a 300 passagens; e
(d) transferência e manutenção do poxvírus animal em
células VERO durante pelo menos 90 passagens, de
preferência durante pelo menos 100, 110, 120, 130, 140,
150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250,
10 260, 270, 280, 290, 300 ou mais passagens.
Passagens placa-purificadas são, de preferência,
realizadas em uma ou mais etapas (b), (c) e (d).
O Método de alta atenuação
Uma atenuação convencional (bem como as primeiras
15 etapas da alta atenuação) começa com adaptação de poxvírus
animais isolados em sistemas de células homólogos ou
heterólogos permissivos tais como, por exemplo, culturas
de células, ovos de galinha incubados ou em animais
experimentais. Isso é seguido por atenuação, através de
20 passagens a longo prazo, em vários sistemas de células
permissíveis. Os sistemas de células permissíveis
apropriados para cada cepa viral são especificamente
selecionados para cada espécie de poxvírus animal. A
seleção depende da titulação infecciosa dos vírus no
34
sistema de célula particular. Além disso, o sistema de
células selecionado para a passagem proporcionará a maior
titulação infecciosa para a espécie particular do vírus.
Tal sistema de células, em particular linhagem de células,
5 pode ser determinado pelo trabalhado habilitado através de
métodos conhecidos na técnica. Isso também corresponde, ao
mesmo tempo, à titulação ótima de vírus. A atenuação é
continuada mantendo-se os poxvírus animais durante cerca
de 100-300, em particular 110, 120, 130, 140, 150, 160,
10 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270,
280, 290 ou 300 passagens nesses sistemas de células
ótimos. Isso é seguido por uma fase terminal caracterizada
por 3-5 passagens de diluição terminal de placa. Esse
material pode ser ainda processado de acordo com o uso
15 adicional.
Todos os representantes descritos aqui de orthopox-,
leporipox-, parapox- e avipoxvírus podem ser atenuados de
uma forma convencional. A subseqüente alta atenuação
ocorre mantendo-se as passagens da cepa viral
20 convencionalmente atenuada de modo simples em sistemas
hospedeiros permissivos homólogos ou heterólogos. A
escolha do sistema hospedeiro, por sua vez, depende da
espécie de varíola animal e é selecionada de acordo com os
aspectos mencionados acima (titulação infecciosa). Alta
35
atenuação ocorre, por exemplo, mantendo-se os ortopoxvírus
simplesmente atenuados em células VERO ou os avipoxvírus
simplesmente atenuados em culturas de células de
fibroblastos de embrião de galinha embriônico (FHE).
5 Poxvírus (por exemplo, vírus ectromelia, vírus camelpox)
são, de preferência, altamente atenuados através de pelo
menos 60 a 300 passagens, dependendo da cepa do vírus em
particular, em culturas de células VERO (por exemplo, 150
ou 260 passagens). A cepa de leporipoxvírus de mixomatose
10 é altamente atenuada através de cerca de pelo menos mais
150 a 300 passagens em culturas de células MA e VERO, de
preferência 290 passagens. A cepa de avopoxvirus gallinae
é altamente atenuada através de cerca de 100 a 150
passagens adicionais, de preferência através de 98
15 passagens, em culturas de células FHE. A cepa de
parapoxvírus é altamente atenuada através de mais 100 a
160, de preferência através de 164 passagens (tabelas 3 e
4). É preferido usar o assim denominado método de diluição
terminal de placa para passagem das cepas virais (isto é,
20 na transferência e inoculação).
Em geral, culturas de fibroblasto de embrião de
galinha (FHE) são usadas para alta atenuação do gênero
avipoxvirus e células de rim de macaco MA-104 permanentes
(para abreviar: células MA) e muitas outras são usadas
36
para todos os outros gêneros, tais como
leporipoxvirus
and
parapoxvirus.
orthopoxvirus,
Um meio totalmente
sintético é, de preferência, empregado para cultura das
culturas de células MA ou VERO, com preferência particular
5 pelo meio MEM ("meio mínimo essencial"), o qual compreende
BMS a 5% a 20%, de preferência 10% (meio substituto de
soro) e hidrolisato de lactalbumina a 5 a 20%, de
preferência 10%. Após troca do meio de cultura, o meio de
vírus usado é, de preferência, meio MEM com hidrolisato de
10 lactalbumina a 5% a 20%, de preferência 10%, sem BMS e sem
soro fetal de bezerro e sem antibióticos. Todos os métodos
de produção são, de preferência, realizados em valores de
pH de 7,0 a 8,0, de preferência em um valor de pH de 7,25.
Coletas de vírus com titulação de 10 5 a 10 8 TCID 50 /ml, de
15 preferência pelo menos 10 7 ' 5 TCID50 /ml, são preferidas como
material de iniciação para produção das cepas de varíola
altamente atenuadas.
Replicação dos poxvírus em células VERO leva a um
efeito citopático típico, o qual leva à destruição das
20 células infectadas (lise). Com uma dose inicial de
inoculação de cerca de 10 MOI ("multiplicidade de
infecção), uma rápida fase de arrendodamento (1-2 dias) é
seguida por estruturas de células reticuladas durante
cerca de 3 dias e por lise das células após cerca de 5
37
dias.
As coletas de vírus obtidas da última passagem podem
ser ainda processadas apropriadamente para seu uso. Por
exemplo, os ácidos nucleicos presentes nos vírus podem ser
5 clonados recombinantemente para produzir vacinas de vetor.
Ou as coletas de vírus altamente atenuadas podem ser
liofilizadas e ser armazenadas, por exemplo, através da
adição de gelatina a 2,5% a 4°C para uso adicional, por
exemplo, como indutores de paramunidade. Para indicações
10 médicas e terapêuticas, o liofilizado pode ser verificado
com relação à sua inocuidade e atividade.
Orthopoxvírus altamente atenuados
Em uma modalidade preferida, o seguinte método de
alta atenuação, descrito a guisa de exemplo com vírus
15 camelpox, pode ser usado para ortopoxvírus:
Orthopoxvirus cameli, h-M 27
Vírus camelpox, isolados de material pustular de
animais doentes, tal como a cepa M 27, são cultivados em
culturas de células de rim de cordeiro embriônicas durante
20 cerca de 2 passagens. Os poxvírus animais cultivados dessa
forma são transferidos, através de um método adequado, de
preferência através do método de diluição terminal de
placa, em células VERO e mantidos ali durante cerca de 5
passagens. Após passagem em uma cultura de células VERO, a
38
última passagem em cultura de células é adaptada à células
MA (células de rim de macaco MA-104) e mantidos durante
cerca de 114 passagens. A
121 a passagem em MA placa-
purificada obtida dessa forma (total de 284 passagens)
5 provou ser simplesmente atenuada. É possível, em isolados
dessa passagem, isto é, com uma atenuação simples, já
observar um declínio na virulência para o hospedeiro
homólogo, uma restrição da faixa de hospedeiro, um aumento
na titulação infecciosa, uma diminuição nas células
10 gigantes no efeito citopático em culturas de células e uma
pequena diminuição nas atividades imunogênicas
específicas. Em virtude das propriedades de imunização, as
quais ainda estão presentes após uma simples atenuação,
dos poxvírus animais, vírus camelpox simplesmente
15 atenuados também são adequados para vacinação parenteral
contra varíola humana ou como vacina contra camelpox (O.R. Kaaden, A. Walz, C.P. Czerny e U. Wernery, 1992:
"Progress in the development of a camelpox vaccine", Proc.
1° Int. Camel Conf., 1, 47-49).
20
A cepa M 27 do vírus camelpox pode ser altamente
atenuada mantendo-se a cepa atenuada em células VERO. Para
essa finalidade, é necessário realizar pelo menos mais 50150 passagens, de preferência 1000 passagem em VERO placapurificada. Um vírus camelpox hM-27 altamente atenuado (h
39
altamente atenuado) obtido dessa forma prova ser
extremamente estável. Em geral, portanto, cerca de 384
passagens em cultura de célula são necessárias para
produzir o vírus camelpox altamente atenuado da invenção.
5 Não se pretende, contudo, que o número exato de passagens
seja considerado como restritivo a esse respeito. Aqueles
habilitados na técnica apreciarão que modificações dos
métodos descritos aqui e dos parâmetros usados,
especialmente do número de passagens em células ou a
10 linhagem de células para alta atenuação de uma cepa de
poxvírus animal, estão dentro do escopo da invenção.
O vírus camelpox, cepa h-M 27, altamente atenuado
obtido através do método da invenção exibe uma perda total
de virulência e capacidade de contágio para o hospedeiro
15 homólogo e uma elevada titulação infecciosa em células
VERO (10 7.25 CID50 /m1). Portanto, ele é particularmente
adequado para uso como uma vacina para-específica (indutor
de paramunidade). Além disso, é possível que o indutor de
paramunidade baseado em poxvírus animais altamente
20 atenuados sejam usados em uma forma capaz de replicação e
em uma forma inativada. Na forma inativada, o vírus
altamente atenuado é tratado, conforme descrito abaixo,
com beta-propiolactona (V. Fachinger, T. Schlapp, W.
Strube, N. Schmeer e A. Saalmüller, 2000: "Pox-virus-
40
induced immunostimulating effects on porcine leukocytes",
J. Virology 74, 7943-7951; R. Fõster, G. Wolf e A. Mayr,
1994: "Highly attenuated poxvirus induce functional
priming of neutrophils in vitro", Arch.Virol. 136, 2195 226; Mayr A., 1999: "Paraspezifischen Vaccinen aus
Pockenviren (Paramunitãtsinducer): "Eine neue Art von
Impfstoff", Árztezschr. Naturheilverf. 40, 550-557;
Mayr, A. 2000: "Paraspezifische Vaccine - Eine neue Art
von Impfstoffen zur Regulation von Dysfunktionen in
10 verschiedenen Kõrpersystemen", Erfahrungsheilkunde (EHK)
49, 591-598).
Com uma atenuação simples, o comprimento do genoma do
vírus já é acentuadamente reduzido através da ocorrência
de deleções. O comprimento do genoma viral inicial (tipo
15 silvestre) é cerca de 193 900 bp, enquanto que o
comprimento do genoma da cepa M 27 atenuada é cerca de 172
400 bp. A atenuação convencional, assim, resulta em uma
perda acentuada de nucleotídeos no DNA. Digestão por
restrição com a enzima de restrição HindIII mostra que, no
20 genoma, quatro fragmentos de restrição menores estão
presentes no gel de análise (Otterbein C.K., 1994, Vet.
Med. Diss. Munique). Nesse caso, existem duas deleções no
segmento terminal direito e duas deleções no esquerdo do
genoma viral. A região central conservada do genoma viral
41
permanece inalterada (C. Gubser, S. Hue, P. Kellam e G.L.
Smith, 2004: "Poxvirus genomes: a phylogenetic analysis",
J. Gen. Virol. 85, 105-117). O comprimento do genoma viral
foi ainda reduzido através da alta atenuação, de 172 400
5 bp (vírus atenuado) para 160 300 bp. O número de deleções
se eleva de 4 para 5 (duas no segmento terminal esquerdo e
3 no direito do genoma), com a região central conservada
do genoma viral permanecendo estável. A alta atenuação
levou ainda a uma perda de receptores de interferon a e y e
10 outros receptores de interleucina e, surpreendentemente,
também à ativação de células tronco hematopoiéticas.
Leporipoxvírus de mixomatose, vírus h-M 2 de mixomatose
Em uma outra modalidade da invenção, a alta atenuação
foi realizada com a cepa M 2 do vírus de mixomatose. Mais
15 uma vez, houve passagem em células CAM, seguido por várias
passagens em células VERO e AVIVER e, finalmente,
passagens adicionais em células VERO.
Em uma modalidade preferida, o método para produção
de indutores de paramunidade a partir de myxomavirus
20 altamente atenuados incluem as etapas:
(a) isolamento, de animais doentes via a membrana
corioalantóica, de embriões de galinha de 10 dias de idade
(CAM) e manutenção nesse sistema durante pelo menos 2 ou
mais, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais
42
passagens;
(b) transferência e manutenção dos poxvírus animais
isolados durante pelo menos 120 ou mais, por exemplo, 125,
130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180 ou
5 mais passagens em culturas de células VERO;
(c) transferência e manutenção dos poxvírus animais
em células AVIVER durante pelo menos 24 ou mais, por
exemplo, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais passagens;
(d) transferência e manutenção dos poxvírus animais
10 em células VERO durante pelo menos 157 a 200 passagens;
(e) transferência e manutenção dos poxvírus animais
em células MA durante pelo menos 114 a 150 passagens;
(f) transferência e manutenção dos poxvírus animais
em células VERO durante pelo menos 179 passagens.
15
Em uma outra modalidade, o vírus de mixomatose usado
para a atenuação a partir de subcutis edematosa (orelha
esquerda) de um coelho silvestre Europeu (gênero
Oryctolagus)
sofrendo, de uma forma típica, de mixomatose,
o myxomavírus foi isolado através de cultura, sobre a
20 membrana corioalantóica (CAM) de ovos de galinha (ovos
VALO) incubados durante 10 dias e adaptados três vezes
sobre a CAM em passagens através do métodos de Herrlich
A., Mayr A. e Munz E.: "Die Pocken",
2 a edição, Georg
Thieme Verlag, Stuttgart, 1967). A terceira passagem em
43
CAM foi adaptada, em um primeiro estágio, às células VERO
durante 120 passagens (ATCC CCL-81, WHO, American Type
Culture Collection), reproduzidas, em um 2° estágio,
através de 24 passagens intermediárias em culturas de
5 células AVIVER e ainda cultivadas, na 3a fase, em células
VERO. No total, cerca de 300 passagens foram realizadas
com o objetivo de atenuação. Após essas passagens de
diluição terminal contínuas, o myxomavírus originalmente
virulento foi atenuado.
10
A cepa M 2 de myxomavírus altamente atenuada é obtida
através de manutenção da cepa atenuada em células VERO.
Para essa finalidade, é necessário realizar pelo menos
mais 250 a 350 passagens, de preferência 300 passagens
placa-purificadas, em células VERO. A cepa h-M 2 de
15 myxomavírus (h = altamente atenuada) obtida dessa forma
provou, semelhante à cepa de camelpox altamente atenuada,
ser extremamente estável. Da mesma forma, ela exibe uma
perda total de virulência e capacidade de contágio para o
hospedeiro
20
homólogo, uma elevada titulação
infecciosa
(10 6.75 CID 50 ), perda completa de imunogenicidade, aumento
na atividade de paramunização, restrição adicional da
faixa de hospedeiro, deleções adicionais no genoma e perda
de vários receptores de interferon e interleucina.
44
Propriedades de ortohpoxvírus altamente atenuados
As cepas de varíola animal altamente atenuadas da
invenção são caracterizadas como segue:
1. estabilidade biológica aumentada;
5
2. perda de virulência e capacidade de contágio,
mesmo para camundongos bebês de 2-3 dias de idade
(parenteral, intraperitoneal);
3.
perda
de
imunogenicidade
específica
apos
administração parenteral e intraperitoneal;
10
4. restrição completa da faixa de hospedeiro;
5. aumento na titulação infecciosa do vírus atenuado
em células VERO;
6.
forte atividade de paramunização (capaz de
replicação e inativada);
15
7. redução do comprimento do genoma dos poxvírus
animais atenuados;
8. aumento no número de deleções na região terminal;
9. perda do receptor de interferon a e y e outros
receptores de interleucina;
20
10. ativação de células tronco hematopoiéticas.
O número de passagens em células e os tipos de
células necessários para atenuação convencional, comparado
com alta atenuação, são compilados na tabela 3. Comumente,
mais de 100 a cerca de 300 passagens em vários sistemas
45
hospedeiros permissivos são necessárias para alta
atenuação. Um período de cerca de 15-30 anos é necessário
para atenuação completa.
A tabela 3 a tabela 4 mostram uma visão geral das
5 diferenças biológicas e de tecnologia genética entre uma
atenuação convencional e uma alta atenuação de invenção
para o exemplo do vacciniavírus, cepa MVA. Assim, deleções
freqüentemente ocorrem nas regiões terminais do genoma
viral (repetição terminal invertida) e o peso molecular é
10 reduzido em virtude de menos pares de base. No caso de
poxvírus animais altamente atenuados, cerca de 20% do
genoma original estão faltando (o que, também, portanto,
os torna tão atraentes como vacinas de vetor, veja
abaixo). Também, descobriu-se que há uma perda de
15 receptores, por exemplo, para
IL-l(3 e células TH 1, e uma
intensificação na ativação de células NK e da formação de
células tronco hematopoiéticas e uma restrição adicional
da faixa de hospedeiros em culturas de células. Além
disso, há uma intensificação de interferon a e y, IL-1, 2,
20 6, 12 e GM-CSA, TNF. Finalmente, as cepas de varíola
animal altamente atenuadas não têm imunogenicidade
específica, mas têm uma atividade aumentada do sistema
imune não específico (paramunidade). Há uma ausência
46
completa de virulência para seres humanos e animais.
Processamento
Adicional
de
parapoxvírus
altamente
atenuados em indutores de paramunidade
Na produção de indutores de paramunidade a partir de
5 cepas de poxvírus altamente atenuadas, é possível realizar
uma inativação através de tratamento químico com betapropiolactona em uma concentração de beta-propiolactona de
0,01%-1%. Uma concentração de beta-propiolactona de 0,05%
é particularmente preferida a esse respeito. Idealmente,
10 inativação com beta-propiolactona é realizada em um pH de
7,8 e a 4°C durante cerca de 1 hora enquanto se agita e,
subseqüentemente, incubação a 37°C durante cerca de 4
horas e durante a noite a +4°C. Inativação com betapropiolactona leva a uma perda completa das propriedades
15 de imunização com uma grande elevação simultânea na
atividade para-específica.
Na produção de indutores de paramunidade, as
partículas de vírus altamente atenuadas são, de
preferência, purificadas através de centrifugação em
20 baixas revoluções (por exemplo, 1000 rpm). Após a
centrifugação, é possível adicionar gelatina succinilada a
0,5-10% (por exemplo, poligelina, obtenível, por exemplo,
da Hausmann, St. Gallen, Suíça), de preferência gelatina
succinilada a 5%. A mistura resultante pode, então, ser
47
liofilizada em porções, por exemplo, de 1,5 ml, em frascos
ou ampolas de vidro estéreis apropriadas e ser dissolvida
com água destilada conforme requerido. Um volume de 0,5-2
ml, de preferência de 1,0 ml, do liofilizato dissolvido em
5 água destilada corresponde a uma dose de vacina para seres
humanos quando de administração intramuscular (veja também
Mayr A. e Mayr B.: "Von der Empirie zur Wissenschaft",
Tierãrztl. Umschau, edição 57: 583-587, 2002). O produto
liofilizado pode ser armazenado estavelmente durante um
10 tempo ilimitado em temperaturas de cerca de +4°C a +8°C ou
em temperaturas menores (por exemplo, -60°C)
Uso de poxvírus animais altamente atenuados como indutores
de paramunidade
Um outro aspecto da invenção se refere ao uso de
15 cepas de poxvírus animal altamente atenuadas ou de
constituintes de cepas de varíola animal altamente
atenuadas unicamente ou combinações como indutores de
paramunidade. Exemplos são poxvírus animais recentemente
isolados os quais são capazes de replicação ou inativados
20 e os quais são derivados de poxvírus animais recentemente
isolados, envelopes virais, envelopes desprendidos e
produtos da clivagem e formas anormais desses envelopes,
polipeptídeos ou proteínas nativas ou recombinantes
simples, especialmente receptores na membrana e superfície
48
os quais ocorrem em poxvírus animais isolados ou são
expressos recombinantemente por um poxvírus geneticamente
modificado ou uma parte de sua informação genética.
Um outro aspecto da presente invenção, portanto, é
5 combinar várias cepas de varíola altamente atenuadas do
mesmo ou outro gênero para uso como indutores de
paramunidade.
Em virtude de suas propriedades de paramunização
ótimas, os poxvírus animais são adequados para as
10 seguintes indicações profiláticas ou terapêuticas em seres
humanos e animais:
-
doenças com fator infeccioso multifatoriais e
infecções misturadas, manifestações crônicas de processos
infecções obstinadamente recorrentes e
infecciosos,
15 infecções
bacterianas
e
virais
resistentes
à
quimioterapia;
- enfraquecimento da defesa e desregulação no sistema
de defesa de um organismo;
- ameaça de infecção neonatal;
20
- terapia adjuvante para determinadas doenças
neoplásicas, por exemplo, prevenção de metástase, redução
de efeitos colaterais de quimio- e radioterapia;
-
melhora na cicatrização de ferimentos, evitar
infecções secundárias após procedimentos cirúrgicos ou
49
lesões;
- regulação de homeostase entre os sistemas hormonal,
circulatório, metabólico, vascular e nervoso.
Os poxvírus animais altamente atenuados, através do
5 início imediato do efeito de paramunização, promovem
inocuidade com relação aos patógenos, assim, neutralizando
sintomas de estresse, infecções latentes, febre, uma
condição geral reduzida e outros fatores os quais podem
afetar a imunização.
10
Os indutores de paramunidade da invenção baseados em
cepas de varíola animal altamente atenuadas são, assim,
adequados para indução do sistema imune para-específico
e/ou para a profilaxia ou tratamento de deficiências ou
doenças infecciosas multifatoriais. Exemplos de tais
15 doenças são disfunções do sistema imune, imunossupressão,
distúrbios de imunodeficiência, disfunções de homeostase
entre os sistemas hormonal, circulatório, metabólico e
nervoso, ameaça de infecção neonatal, doenças neoplásicas,
doenças virais, doenças bacterianas, doenças com fator
20 infeccioso resistentes à terapia, infecções virais e
bacterianas
misturadas,
manifestações
crônicas
de
processos infecciosos, doenças hepáticas de várias
origens, doenças crônicas da pele, doenças herpéticas,
hepatite crônica, infecções de influenza, lesão por
50
endotoxina, melhora na cicatrização de ferimento com
prevenção de infecções secundárias.
Administração das cepas de varíola animal altamente
atenuadas
descritas
aqui pode ocorrer local
ou
5 parenteralmente. Administração local de indutores de
paramunidade estimula especificamente os mecanismos de
defesa para-específicos nas membranas mucosas e na pele.
Contudo, também há um determinado efeito sistêmico. Por
outro lado, paramunizações aplicadas parenteralmente
10 dificilmente influenciam os mecanismos de defesa locais na
pele e mucosas. Preferência é dada, a esse respeito, a uma
composição farmacêutica a qual inclui uma ou mais das
cepas de varíola animal altamente atenuadas da invenção e,
onde apropriado, um veículo farmaceuticamente aceitável.
15
Exemplos de tal veículo ou aditivos são polietileno
glicol, dextrose, sorbitol, manitol, polivinilpirrolidona,
gelatina, estearato de magnésio, carboxil polimetileno,
carboxil metilcelulose, ftalato de acetato de celulose ou
acetato de polivinila.
20
Uso de poxvírus animais altamente atenuados como vacinas
de vetor
Um outro aspecto da invenção se refere ao uso das
cepas de poxvírus altamente atenuadas para produção de
vacinas de vetor (revisão: Pastoret, P.-P. e
51
Vanderplasschen,
A.,
2003).
Comparado
com
cepas
convencionalmente atenuadas, as cepas de poxvírus animal
altamente atenuadas são ainda mais adequadas como vetores
para produção de vacinas de vetor porque elas perderam
5 completamente suas propriedades de imunização através da
alta atenuação. Uma vez que os vírus são passados com base
em sua titulação infecciosa, as deleções estão localizadas
em regiões as quais são desnecessárias para replicação
viral. Em virtude do fato de as deleções que ocorrem em
10 regiões terminais do genoma viral serem ainda maiores em
comparação com atenuação convencional, os poxvírus animais
altamente atenuados proporcionam espaço suficiente para
inserção de um ácido nucléico estranho (DNA) a ser
expresso ou um imunogênio estranho.
15
O ácido nucléico estranho pode codificar um peptídeo
ou proteína a qual proporciona epítopos de imunização.
Contudo, a invenção não se destina a estar restrita a um
peptídeo ou proteína em particular. Aqueles habilitados na
técnica apreciarão que os genes estranhos podem ser
20 clonados de acordo com seu tamanho na região de deleção
apropriada do vírus. Expressão do peptídeo ou proteína
introduzida pode ser controlada por elementos de controle,
tal como um promotor e, se necessário, por elementos
intensificadores. A incorporação de um ácido nucléico
52
estranho o qual codifica um peptídeo ou proteína pode
induzir a uma propriedade de imunoestimulação específica
contra o peptídeo ou proteína. Isso pode ser utilizado,
por exemplo, através de clonagem, na estrutura de vetor,
5 de uma seqüência de ácido nucléico viral cuja expressão
induz a uma resposta imune no hospedeiro transfectado.
A clonagem de poxvírus animais recombinantes como
vacinas de vetor ocorre após a última passagem de diluição
terminal de placa. Para a clonagem, o ácido nucléico viral
10 pode ser clivado com endonucleases de restrição adequadas
e ser ligado às seqüências de ácido nucléico estranhas
através de métodos de ligação padrões.
Comparado com vacinas ou vacinas de vetor
convencionais para as quais outros vetores microbianos são
15 usados, as vacinas de vetor da invenção têm a vantagem de
que elas não têm efeito alérgico e proporcionam um sistema
imune otimamente regulado ao antígeno específico eluído, o
que também contribui para um resultado de inoculação
ótima. As vacinas de vetor da invenção também são isentas
20 de efeitos colaterais negativos locais ou sistêmicos. Uma
vez que elas utilizam o intervalo imunológico até que a
imunidade se desenvolva completamente, elas são adequadas,
em particular, para inoculações de emergência (por
exemplo, no caso de risco agudo de infecção, antes de
53
viagens inesperadas).
A observação de que os resultados de inoculação e a
inocuidade das vacinas podem ser consideravelmente
aumentados através da excelente atividade para-específica
5 sobre a parte de poxvírus animal do vetor é nova e torna
as cepas atraentes para produção de vacinas de vetor.
Vacinas de vetor baseadas em cepas de varíola animal
altamente atenuadas são, portanto, superiores em termos de
sua atividade e inocuidade com relação à vacinas de vetor
10 convencionais.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Membros da familia Poxviridae
Tabela 2: Classificação de ortopoxvírus (gênero
Orthopoxvirus, OPV)
15
Tabela 3: Diferenças entre atenuação convencional e
alta atenuação
Tabela
4:
Número de passagens em uma atenuação
convencionais comparado com uma alta atenuação
Tabela 5: Regime de administração para tratamento com
20 indutor de paramunidade
Tabela 6: Indicações para paramunização com o
myxomavirus h-M 2 altamente atenuado.
EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são modalidades preferidas e
54
servem para explicar adicionalmente a invenção, mas a
última não se destina a estar restrita aos mesmos.
Exemplo 1
Como material de iniciação para produção de indutores
5 de paramunidade contra mixoma (h-PIND-Myxo), myxomavírus M
2 convencionalmente atenuado (3 passagens em CAM, 277
passagens em VERO, 24 passagens em AVIVER = 304 passagens)
foram ainda passados durante mais 114 passagens em MA e
179 passagens em VERO (total de 597 passagens) e, assim,
10 altamente atenuado (veja tabela 4). As coletas de vírus de
VERO do Leporpxivirus myxomatosis h-M 2 altamente atenuado
têm uma titulação de pelo menos 10 6 ' 75 CID50 /ml.
Os leporipoxvírus altamente atenuados obtidos dessa
forma não mostraram propriedades virulentas ou de
15 imunização em geral e foram ainda processadas ao indutor
de paramunidade da seguinte forma:
As coletas de vírus foram inativadas com betapropiolactona a 0,05% (pH de 7,8, 1 hora a + 4 °C
(agitada)), agitadas em uma temperatura de +37 °C em um pH
20 de 7,8 durante 4 horas (monitorada até que o pH tivesse
sido ajustado para um pH de 7,8 se necessário), incubadas
durante a noite (estacionária em uma temperatura de +4 °C
durante cerca de 12 horas) e, então, purificadas através
de centrifugação em baixa velocidade (15 min, aprox. 4000
55
g). Poligelina (pH de 7,8) foi adicionada ao material de
vírus inativado para uma concentração total de gelatina de
2,5%. O material de vírus preparado dessa forma foi
distribuído em frascos de 1,5 ml estéreis e liofilizado.
5 Os liofilizados foram armazenados em uma temperatura de
+4°C. Antes de uso, os liofilizados foram dissolvidos em 1
ml de água destilada estéril para injeção e administrados
através de injeção intramuscular profunda.
As seqüências de administração e indicações médicas
10 são listadas na tabela 5. O indutor de paramunidade contra
mixoma é adequado, por exemplo, para tratamento de suporte
de herpes zoster (modo 4) através de paramunização. Nesse
caso, o tratamento leva à cicatrização das pústulas as
quais são típicas da doença após 3-4 dias. No caso de
15 infecções pré-influenza, quando de uso dos indutores de
paramunidade da invenção, é observado um desaparecimento
completo dos sintomas (febre, cansaço, dores de cabeça e
dor nos membros). Em pacientes com feridas (por exemplo,
após operações), uma cicatrização de ferida incomumente
20 rapida, sem infecções secundárias, é observada com o hPIND-myxo. Em casos de estomatite e lesões associadas à
visita ao dentista, esfregação do liofilizado foi seguida
pelo desaparecimento das aftas e lesões após 1-2 horas.
Exemplo 2
56
Vírus camelpox M 27 convencionalmente atenuado (veja
seção descrição) foi altamente atenuado através de mais
263 passagens em células VERO (total de 384 passagens).
Coletas de vírus acima de 10" CID50 /m1 serviram como
5 material de iniciação para produção de indutores de
paramunidade. Para essa finalidade, a coleta de vírus foi
inativada, centrifugada e liofilizada de uma maneira
análoga ao Exemplo 1. O modo de administração, bem como as
indicações, são análogos àquelas do Exemplo 1. Os vírus
10 obtidos não mostraram propriedades virulentas ou de
imunização em geral em virtude da alta atenuação.
Exemplo 3
Vírus canarypox convencionalmente atenuado
serinae,
(Avipox
KP1, 535a passagem em FHE) foi altamente atenuado
15 através de mais 67 passagens em FHE (veja tabela 4). A
602a passagem em FHE serviu, de uma maneira análoga aos
Exemplos 1 2 3, como vírus de varíola de canário altamente
atenuado para produção de indutores de paramunidade. Os
vírus obtidos não mostram propriedades virulentas ou de
20 imunização em geral em virtude da alta atenuação.
Exemplo 4
Vírus fowlpox convencionalmente atenuado (Avipoxvirus
gallinum, HP1, 444a passagem em FHE) foi altamente
atenuado através de mais 98a passagens em FHE. Após a 542a
57
passagem em FHE, o vírus da varíola HP1 provou ser
altamente atenuado e foi usado, de uma maneira análoga ao
Exemplo 1, para produção de indutor de paramunidade. Os
vírus obtidos não mostraram propriedades virulentas ou de
5 imunização em geral em virtude da alta atenuação.
Exemplo 5
Indutores de paramunidade baseados em mixomavírus
(OPV muris) e parapoxvírus também foram produzidos em
analogia aos métodos descritos nos exemplos precedentes.
10
Exemplo 6
Cepas de varíola animal altamente atenuadas são
usadas para produzir vacinas de vetor. Na produção de
vacinas de vetor, atenção particular deve ser dada ao
monitoramento do pH após cada etapa de produção
15 individual. O pH deverá ser cerca de 7,8. A atenuação e a
alta atenuação de vírus usados para produção de vetores
ocorrem conforme descrito no Exemplo 1. É possível, a esse
respeito, usar todos os métodos de tecnologia genética
convencionais para inserção de segmentos de ácido nucléico
20 os quais codificam antígenos específicos contra o qual uma
reação de inoculação específica, isto é, desenvolvimento
de imunidade, tem de ser obtida. O gene estranho é
rotineiramente incorporado, por meio de enzimas de
restrição adequadas, nas regiões de ácido nucléico
58
deletadas as quais foram geradas pela alta atenuação nas
cepas de varíola animal da invenção. Técnicas de clonagem
e digestões por restrição padrões são usadas a esse
respeito.
5
É possível usar, para isolamento de estruturas de
vírus recombinante, quaisquer genes marcadores (seleção)
ou cassetes de seleção tais como, por exemplo, o gene de
p-
galactosidase, os quais estão sob o controle de seqüências
de controle adequadas.
10
Exemplos de métodos para produção de tais vetores a
partir de cepas de varíola animal são descritos no
WO 00/69455. A divulgação da presente publicação e do
ensinamento contido na mesma sobre a produção de vacinas
de vetor é aqui expressamente incorporada por referência.
15 Da mesma forma, todas as outras publicações citadas aqui
são incorporadas por referência.
59
Tabelas
Tabela 1:
Membros da família Poxviridae
Gênero
Espécie
Doença infecciosa
Variola
Catapora/rubéola
(ser humano)
Opv. commune
Variola de macaco
varíola/alastrim
"Cowpox"
simiae 1
similar)
bovis
Monkeypox
cameli
"Cowpox"
muris
similar)
(e
Ortopoxvírus
(and
Camelpox
Mousepox
(ectromelia)
Apv.gallinae
Avipoxvírus
u.a.
meleagris
Fowlpox
columbae
Turkeypox
serinis
Pigeonpox
coturnica,
Canarypox
agapornicis
Wild bird pox
60
Gênero
Espécie
Doença infecciosa
Sheeppox
(original)
Cpv. ovis
Capripoxvírus
Goatpox
caprae
(original)
bovis
Doença com
protuberâncias da
pele (gado)
Mixomatose
Lpv. myxomatosis
(coelhos)
fibromatosis
Fibroma (coelhos)
sciuris,
Fibroma em
Leporipoxvírus
leporis
esquilo, fibroma
em lebre
Suipoxvírus
Spv. suis
Variola de suínos
Ecthyma, ORF
(ovelha, gado)
Ppv. ovis
Estomatite
bovis 1
papular (gado)
bovis 2
Caroço na teta,
cameli
nódulos de vaca
Parapoxvírus
leiteira
Ecthyma de camelo
61
Espécie
Gênero
Doença infecciosa
(nao oficial)
Tumor de macaco
Ypv. simiae 2
Yaba Tanapox (ser
Yatapoxvírus
tanae
humano, macaco)
Molluscum
Molluscipoxvírus Mpv. molluscae
contagiosum (ser
humano)
Tabela 2:
Classificação de ortopoxvírus (gênero Orthopoxvirus, OVP)
(atualizado do "7° Report of the International Committee
of Taxonomy of Viruses", 2000)
Espécie
Hospedeiros suscetíveis
Vírus da varíola (OPV
Ser humano
Varíola)
Vacciniavirus (OPV
Todos os mamíferos
commune)
Coxpox vírus (OPV bovis)
Todos os mamíferos
Ectromelia vírus (OPV
Camundongo, raposa, marta
muris)
Vírus camelpox (OPV
Camelo (experimentalmente,
cameli)
possivelmente macacos,
62
Espécie
Hospedeiros suscetíveis
camundongos, coelhos), seres
humanos não são suscetíveis
Vírus monkeypox (OPV
Macacos, ser humano
simiae)
Espécies não
classificadas:
Racum
Raccoonpox vírus,
Arganaz
California volepox vírus,
Roedores, lebre, rã
taterapox vírus
Nota: de acordo com essa nomenclatura ainda incompleta, as
seguintes espécies previamente incluídas foram deletadas:
OPV bubali (búfalo), OPV elefaphant (elefante), OPV
equi (cavalo), OPV cuniculi (coelho)
Tabela 3:
Diferenças entre cepas de MVA convencionalmente atenuadas e altamente atenuadas (MVA - Vírus da
Varíola Ankara Modificado)
MVA original (572a passagem em culturas de fibroblasto de embrião de galinha primários) e VERO-MVA
5 (mais 182 passagens em culturas de células VERO permanente (WHO-ATCC, CCL 81))
Marcador
MVA original (FHE)
VERO-MVA
(atenuação convencional)
(altamente atenuado)
3 deleções na região terminal
3 deleções na região terminal direita e 4
Marcadores
esquerda e direita (repetição
deleções na esquerda
genéticos
terminal invertida)
Número de pares de base de 208 a 178
Número de pares de base 172 Kb
Kb
Peso molecular: perda de 15% do
Perda de 20% do genoma original
genoma original
Marcador
MVA original (FHE)
VERO-MVA
(atenuação convencional)
(altamente atenuado)
Adicionalmente, perda adicional de
Perda do receptor de interferon a e
receptores, por exemplo, para IL-1
13 e
Y
células TH 1
Marcadores
celulares
Ativação de células T auxiliares
Intensificação da ativação de linfócitos T
(CD 4, CD 8, CD 25)
citotóxicos não-antígeno-específicos
Ativação de células NK e células
Intensificação de ativação de células NK e da
tronco hematopoiéticas
formação de células tronco hematopoiéticas
Replicação abortiva em células de
Restrição adicional da faixa de hospedeiro em
mamífero (exceção: BHK)
culturas de células
Interferon a ed y,
IL-2, 6 & IL-12,
Interferon a e y, IL-1, 2, 6, 12 e M-CSA, TNF
Citocinas
M-CSA
Titulação de vírus FHE: 10 9 ' 5 CID 50 /m1
intensificados
FHE: 10 4 ' 5 CID50/m1
Marcador
MVA original (FHE)
VERO-MVA
(atenuação convencional)
(altamente atenuado)
VERO: 10" CID 50 /m1
VERO: 10 9 ' 5 CID50 /m1
Nenhuma imunogenicidade específica; atividade
Redução na atividade do sistema
aumentada do sistema imune não específico
Sistema imune
imune específico
(paramunidade)
Virulência para
seres humanos e
animais
fraca
ausente
Tabela 4:
Exemplos de números de passagens em várias culturas de células selecionadas em atenuação
convencional comparado com alta atenuação de várias cepas de poxvírus
Cepa de Vírus
Número de passagens para
Número de passagens para
atenuação convencional
alta atenuação
Vírus da vaccinia MVA
572 passagens em FHE
modificado
(8,9,10,19)
Observações
Mais 182 passagens em
Atenuação
células VERO; total de 754
convencional
passagens
(publicada)
Mais 98 passagens em FHE;
Avipoxvirus HP 1
444 passagens em FHE
(15)
total de 542 passagens
Alta atenuação
Mais 67 passagens em FHE,
Canarypoxvirus KP-1
535 passagens em FHE (4)
total de 602 passagens
Assunto em questão
Cepa de Vírus
Número de passagens para
Número de passagens para
atenuação convencional
alta atenuação
135 passagens em rins
da presente
embriônicos de cordeiro
invenção
(ELN);
Parapoxvirus ORF-D 1701
Observações
37 pass. em pulmões Mais 164 passagens em
embriônicos bovinos (BEL);
células VERO; total de 385
49 pass. em células MA;
passagens
total de 221 passagens
(14)
Assunto
2 passagens em ELN; 5
Mais 263 passagens em VERO;
Orthopoxvirus cameli, M
passagens em VERO; 114
27
passagens em MA; total de
total de 384 passagens (h-
em questão
M 27)
121 passagens
Cepa de Vírus
Número de passagens para
Número de passagens para
atenuação convencional
alta atenuação
Mais 50 passagens em FHE;
Observações
da
3 CAM passagens ; 250 FHE
104 pass. em MA; 93
Orthopoxvirus muris,
passagens , total de 253
passagens em VERO; total de presente invenção
Ectromelia vírus Mü 1
passagens
500 passagens
3 pass. em CAM; 24 pass,
Mais 179 passagens em VERO;
Myxomavirus M 2
em AVIVER; 277 pass. em
(mixomatose)
VERO; 114 pass. em MA;
total de 597 passagens (hM 2)
total de 418 passagens
69
Tabela 5:
Regime de administração para tratamento com indutor de
paramunidade
Modo de administração
Procedimento de
administração
2 injeções em intervalo de
Modo 1
24 horas, 1-3 dias antes de
(Profilaxia, curto prazo)
exposição
2-3 injeções em intervalo
Modo 2
de 24 horas.
"cursos" em
(Profilaxia, longo prazo)
intervalos mensais
2 injeções em intervalo de
Modo 3
24 h; uma vez por mês
(Profilaxia, tratamento
durante meses ou anos,
adjuvante de tumores e
possivelmente também mais
outros distúrbios crônicos)
freqüentemente
1-2 injeções/dia durante 3Modo 4
5 dias ou ate que os
(Terapia parenteral de
sintomas desapareçam;
infecções agudas)
adicionalmente, 1
injeção/dia até recuperação
Modo 5
(Profilaxia ou terapia
Administrar liofilizado não
dissolvido profundamente no
70
Modo de administração
Procedimento de
administração
nasal/oral)
nariz ou bochecha - para
distúrbios pelo menos duas
vezes ao dia;
- apenas para distúrbios
das membranas mucosas (aplicação profilática
conforme requerido)
Dissolver o indutor em um
pouco de pomada (notar pH);
mistura de pomada dever ser
Modo 6
usada sempre recentemente
(administração cutânea)
preparada
- apenas para distúrbios
crônicos da pele
71
Tabela 6:
Indicações para paramunização com o myxomavírus h-M 2 (b-PIND-MYXO) altamente atenuado
(Exemplos de caso da família)
Exemplo
Paciente
Resultado
Herpes zoster (Modo 4)
R.E., homem, 57 anos
Cicatrização das pústulas dentro
W.E., homem, 22 anos
de 3-4 dias, sem encefalite pós-
Infecção influenzal
W.E., homem, 75 anos
zoster se o período de pausa é
Infecções
incipiente
B.S., mulher, 67 anos
observado, desaparecimento
agudas
1 injeção i.m. quando os B.M., mulher, 65 anos
Indicação
completo dos sintomas (febre,
primeiros sintomas
H.E., mulher, 63 anos
cansaço, em alguns casos dores de
aparecem, descanso no
B.B., homem, 62 anos
cabeça e dor nos membros)
leito durante 2-3 horas
Terapia de
Operações (suporte à
W.E., homem, 75 anos
Cicatrização de feridas
reposição e
cicatrização de feridas)
(Joelho OP. 3 semanas
incomumente rápida; nenhuma
72
Indicação
Exemplo
Paciente
Resultado
adjuvante
Modo 5
após zoster)
infecção secundária (de acordo com
E.B., mulher, 45 anos
os comentários dos médicos que
(útero)
fizeram o tratamento)
B.M., mulher, 60 anos
(quadril)
Estomatite, espontânea
A.M., homem, 82 anos
B.M., mulher, 66 anos
Lesões após visita ao
Após esfregar no liofilizado.
Desaparecimento da apatia e das
Região ENT
dentista
R.H., mulher, 67 anos
B.M., mulher, 65 anos
Modo 5
lesões após 1-2 horas.
73
REFERÊNCIAS:
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20. Pastoret, P.-P. and Vanderplasschen, A., 2003:
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(2003), 343-355.
REIVINDICAÇÕES
1. Poxvírus animal altamente atenuado baseado em uma
cepa de poxvírus animal da família poxviridae caracterizado
pelo fato de que o poxvírus animal não tem mais quaisquer
5 propriedades virulentas e de imunização e que o poxvírus
animal altamente atenuado tem um menor peso molecular do
ácido nucléico viral, deleções mais freqüentes na região
terminal e uma perda aumentada de receptores de citocina em
comparação com cepas de varíola animal convencionalmente
10 atenuadas.
2. Poxvírus animal altamente atenuado, de acordo com a
reivindicação 1,
caracterizado pelo fato de que o poxvírus
animal exibe uma perda de receptores de citocina para
interferon a e y.
15
3. Poxvírus animal altamente atenuado, de acordo com a
reivindicação 1,
fato de que o genoma
caracterizado pelo
viral do poxvírus animal é cerca de 20% menor do que aquele
do genoma viral do tipo selvagem.
4. Poxvírus animal altamente atenuado, de acordo com a
20 reivindicação 1,
caracterizado pelo
fato de que a cepa de
poxvírus é uma cepa do vírus camelpox.
5. Poxvírus animal altamente atenuado, de acordo com a
reivindicação 4,
caracterizado pelo fato de que a cepa do
vírus camelpox é a cepa h-M 27 com o número de depósito
2
05040602 (ECACC).
6. Poxvírus animal altamente atenuado, de acordo com a
reivindicação 1,
caracterizado pelo fato de que a cepa de
poxvírus é uma cepa do myxomavírus.
5
7. Poxvírus altamente atenuado, de acordo com a
reivindicação 6,
caracterizado pelo
fato de que a cepa do
myxomavírus é a cepa h-M 2 com o número de depósito
05040601 (ECACC).
8. Poxvírus animal altamente atenuado, de acordo com a
10 reivindicação 1,
caracterizado pelo
fato de que a cepa de
poxvírus altamente atenuado é a cepa de fowlpox h-HP1.
9. Poxvírus animal altamente atenuado, de acordo com a
reivindicação 1,
caracterizado pelo
fato de que a cepa de
poxvírus altamente atenuada é a cepa de ectromelia h-Mü-l.
15 10. Poxvírus animal altamente atenuado, de acordo com
a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa de
poxvírus animal altamente atenuada é obtenível através do
seguinte método:
(a) adaptação da varíola de animal a um sistema de
20 células ou culturas de célula permissivas;
(b) transferência e conjugação dos poxvírus animais
para atenuação através de passagens a longo prazo em vários
sistemas de célula permissivas, o que torna titulações
infecciosas ótimas possíveis;
3
(c) transferência e manutenção dos poxvírus animais
para atenuação em um sistema de célula ótimo durante cerca
de 100-300 passagens;
(d) transferência e manutenção dos poxvírus animais em
5 células VERO durante pelo menos 90 passagens.
11.
Indutor de paramunidade baseado em cepas de
poxvírus animal da família poxviridae
caracterizado pelo
fato de as cepas de poxvírus serem altamente atenuadas e
não terem mais quaisquer propriedades virulentas e de
10 imunização.
12.
Indutor de paramunidade, de acordo com a
reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser baseado em
uma cepa de poxvírus animal de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 1 a 10.
15
13. Método para produção de indutores de paramunidade
a partir de poxvírus animais altamente atenuados
caracterizado pelo fato de compreender:
(a) adaptação da varíola de animal a um sistema de
células ou culturas de célula permissivas;
20
(b) transferência e manutenção dos poxvírus animais
para atenuação através de passagens a longo prazo em vários
sistemas de célula permissivas, o que torna titulações
infecciosas ótimas possíveis;
(c) transferência e manutenção dos poxvírus animais
4
para atenuação em um sistema de célula ótimo durante cerca
de 100-300 passagens;
(d) transferência e manutenção dos poxvírus animais em
células VERO durante pelo menos 90 passagens.
5
14. Método para produção de indutores de paramunidade
a partir de myxomavírus altamente atenuados
caracterizado
pelo fato de compreender:
(a) isolamento de poxvírus animal de animais doentes
via a membrana corioalantóica de embriões de galinha de 10
10 dias de idade (CAM) e manutenção nesse sistema de células
durante pelo menos 2 passagens;
(b) transferência e manutenção dos poxvírus animais
isolados durante pelo menos 300 passagens em culturas de
células AVIVER e VERO dos embriões de galinha incubados
15 durante 10 dias (FHE);
(c) transferência e manutenção dos poxvírus animais em
células MA durante pelo menos 100 passagens;
(d) transferência e manutenção dos poxvírus animais em
células VERO durante pelo menos 170 passagens.
20
15. Método, de acordo com a reivindicação 14,
caracterizado pelo
fato de os vírus de myxoma altamente
atenuados terem uma titulação infecciosa de 10 675 CID 50 /ml.
16. Método, de acordo com a reivindicação 14,
caracterizado pelo fato de os myxomavírus serem a cepa h-M2
5
de myxoma com o número de depósito 05040601 (ECACC).
17. Método para produção de indutor de paramunidade a
partir de vírus camelpox altamente atenuados caracterizado
pelo fato de compreender:
5
(a) isolamento de poxvírus animal de animais doentes
via a membrana corioalantóica de embriões de galinha de 10
dias de idade (CAM) e manutenção do camelpox isolado
durante pelo menos 2 passagens na CAM;
(b) transferência e manutenção dos poxvírus animais
10 isolados durante pelo menos 120 passagens em células VERO
(ATCC CCL-81, WHO, American Type Culture Collection);
(c) transferência e manutenção dos poxvírus animais
durante cerca de 24 passagens em células AVIVER;
(d) transferência e manutenção dos poxvírus animais
15 durante cerca de mais 157 passagens em células VERO;
(e) transferência e manutenção dos poxvírus animais
durante mais 114 passagens em células MA;
(f) transferência e manutenção dos poxvírus animais
durante mais 179 passagens em células VERO.
20
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,
caracterizado pelo
fato de os vírus camelpox altamente
atenuados gerados terem uma titulação infecciosa de cerca
de 10 7 CID 50 /ml.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17,
6
caracterizado pelo fato de o vírus camelpox ser a cepa h-M
27 de camelpox com o número de depósito 05040602 (ECACC).
20. Vacina de vetor
caracterizada pelo
fato de
compreender o ácido nucléico deletado de um poxvírus animal
5 de não imunização, não virulento, altamente atenuado de
acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10 e
seqüências de ácido nucléico inseridas nas deleções do
mesmo para expressão de um peptídeo ou proteína de
imunização.
10
21. Vacina de vetor, de acordo com a reivindicação 20,
caracterizada pelo
fato de o ácido nucléico deletado do
poxvírus animal de não imunização, não virulento, altamente
atenuado e as seqüências de ácido nucléico do peptídeo ou
proteína de imunização estarem presentes em um plasmídeo.
15 22. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de
compreender um ou mais indutores de paramunidade de acordo
com qualquer uma das reivindicações de 11 a 12.
23.
Composição farmacêutica, de acordo com a
reivindicação 22,
caracterizada pelo
fato de ser para
20 administração local ou parenteral.
24.
Composição farmacêutica, de acordo com as
reivindicações 22 a 23,
caracterizada pelo
fato de ainda
compreender um veículo farmaceuticamente aceitável.
25. Uso de um indutor de paramunidade, de acordo com
7
qualquer uma das reivindicações de 11 a 12,
pelo
caracterizado
fato de ser para ativação do sistema imune
paraespecífico em um mamífero ou em um ser humano.
26. Uso de um indutor de paramunidade, de acordo com
5
qualquer uma das reivindicações de 11 a 12,
pelo
caracterizado
fato de ser para produção de uma composição
farmacêutica para a profilaxia e/ou tratamento de um
distúrbio imunodeficiência-associado.
27.
10
Uso,
de acordo com a reivindicação 26,
caracterizado pelo
fato de o distúrbio imunodeficiência-
associado ser selecionado do grupo consistindo de
disfunções do sistema imune, imunossupressão, distúrbios de
imunodeficiência, disfunções da hemodinâmica entre os
sistemas hormonal, circulatório, metabólico e nervoso,
15 ameaça neonatal de infecção, doenças neoplásicas, doenças
virais, doenças bacterianas, doenças com fator infeccioso
resistentes à terapia, infecções virais e bacterianas
misturadas, manifestações crônicas de processos
infecciosos, doenças hepáticas de origem variada, doenças
20 crônicas da pele, doenças herpéticas, hepatite crônica,
infecções de influenza, dano por endotoxina.
28.
Uso,
de acordo com a reivindicação 26,
caracterizado pelo
fato de os indutores de paramunidade
altamente atenuados serem empregados na composição
8
farmacêutica para auxiliar na cicatrização de ferimento,
prevenção de infecções secundárias após procedimentos
cirúrgicos ou lesões.
29. Uso de uma vacina de vetor, de acordo com qualquer
5 uma das reivindicações 20-21,
caracterizado pelo
fato de
ser para indução de uma resposta imune específica e
paraespecífica em um mamífero ou em um ser humano.
30. Método para produção de poxvírus animais altamente
atenuados caracterizado pelo fato de compreender as etapas:
10
(a) adaptação da varíola animal a um sistema de
células ou culturas de célula permissivas;
(b) transferência e manutenção dos poxvírus animais,
para atenuação através de passagens, a longo prazo em
vários sistemas de célula permissivas, o que torna
15 titulações infecciosas ótimas possíveis;
(c) transferência e manutenção dos poxvírus animais
para atenuação em um sistema de célula ótimo durante cerca
de 100-300 passagens;
(d) transferência e manutenção dos poxvírus animais em
20 células VERO durante pelo menos 90 passagens.
Resumo da Patente de Invenção para:
"CEPAS DE PDXVÍRUS
ALTAMENTE ATENUADAS, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DAS MESMAS COMO
INDUTORES DE PARAMUNIDADE OU PARA A PRODUÇÃO DE VACINAS DE
VETOR".
5
A presente invenção se refere a cepas de poxvírus
animal altamente atenuadas e ao uso das mesmas como
indutores de paramunidade ou para a produção de vacinas de
vetor. Como um resultado do processo de alta atenuação, as
cepas de poxvírus animal reivindicadas perdem suas
10 propriedades virulentas e de imunização. A invenção também
se refere a um método para produção de tais cepas de
poxvírus altamente atenuadas e ao uso das mesmas para
indução de paramunidade, isto é, para ativação do sistema
imune não específico em mamíferos e seres humanos ou para
15 produção de vacinas de vetor para imunização específica com
o efeito colateral positivo de paramunização. Os poxvírus
animais altamente atenuados são, assim, adequados para a
prevenção e tratamento de doenças associadas a uma
deficiência imune. Modalidades preferidas se referem a
20 ortopox- (por exemplo, vírus camelpox), leporipox- (por
exemplo, myxomavírus), avipox-, parapox- e outras cepas
virais ortopox, tal como MVA, as quais têm excelentes
propriedades de paramunização e nas quais as propriedades
de imunização foram perdidas.