Avaliação dos efeitos biológicos do extrato etanólico

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS DO EXTRATO ETANÓLICO
DAS CASCAS DO CAULE DE Ziziphus joazeiro Mart.
Rayanne Maciel Vilarim
Prof.ª Dr.ª Hilzeth de Luna Pessôa
João Pessoa
2015
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS DO EXTRATO ETANÓLICO DAS CASCAS
DO CAULE DE Ziziphus joazeiro Mart.
Rayanne Maciel Vilarim
Profª. Dr.ª Hilzeth de Luna Freire Pessôa
Monografia apresentada ao Curso de Ciências
Biológicas (Trabalho Acadêmico de Conclusão
de Curso), como requisito parcial à obtenção do
grau de Bacharel em Ciências Biológicas.
João Pessoa
2015
Catalogação na publicação
Universidade Federal da Paraíba
Biblioteca Setorial do CCEN
V697a Vilarim, Rayanne Maciel.
Avaliação dos efeitos biológicos do extrato etanólico das cascas do
caule de Ziziphus joazeiro Mart. / Rayanne Maciel Vilarim. – João
Pessoa, 2015.
52f. : il. –
Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas) Universidade Federal da Paraíba.
Orientador: Profª. Drª. Hilzeth de Luna Freire Pessôa.
1. Juazeiro (Ziziphus joazeiro). 2. Citotoxicidade.
3. Atividade antibacteriana. I. Título.
FPB/BS-CCEN
UNIVERSIDADE
CDU: 634.662 (043. 2)
FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR
CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Rayanne Maciel Vilarim
Avaliação dos efeitos biológicos do extrato etanólico das cascas do caule de Ziziphus
joazeiro Mart.
Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas, como requisito parcial à obtenção
do grau de Bacharel em Ciências Biológicas.
Data: _____________________________________________________
Resultado:__________________________________________________
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________________
Prof. Dr.ª Hilzeth De Luna Freire Pessôa – Departamento de Biologia
Molecular/UFPB
____________________________________________________________
Profª. MSc. Camila de Albuquerque Montenegro - Departamento de
Farmácia/UEPB
_____________________________________________________________
Profª Dr.ª Maria do Socorro Vieira Pereira – Departamento de Biologia
Molecular/UFPB
_____________________________________________________________
Prof. Dr. Abrahão Alves de Oliveira Filho – Unidade Acadêmica de Ciências
Biológicas/UFCG
À ciência, por ser uma bela e poderosa ferramenta que
o homem dispõe para fazer o bem.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter se manifestado várias vezes em minha vida.
Aos meus pais, Robson Vilarim e Ana Neide Maciel, e a minha irmã, Raynelle Maciel, por
serem meu apoio em todas as horas.
A minha ilustre orientadora, Dr.ª Hilzeth de Luna Freire Pessôa, pelo apoio, paciência e
disponibilidade.
A minha grande amiga Anne Falcão, que sempre foi muito prestativa, me ajudando na
universidade e fora dela.
Ao CNPq, pelo apoio científico e financiamento da bolsa de estudo.
Aos membros da banca, Profª. MSc. Camila de Albuquerque Montenegro, Profª. Drª. Maria
do Socorro Vieira Pereira e Prof. Dr. Abrahão Alves de Oliveira Filho, por terem aceitado o
convite e pela importante contribuição enriquecedora para o meu trabalho.
Aos meus amigos do curso, Caetano Filho, Cristine Prates, Janaína Oliveira, Maíra Leite e
Sara Pordeus, pelos bons momentos compartilhados.
“Sábio é aquele que conhece os limites da própria ignorância.”
Sócrates
RESUMO
Ziziphus joazeiro Mart. é uma árvore frondosa que pertence à família Rhamnaceae e é típica
do nordeste brasileiro. Popularmente conhecida como juazeiro, joazeiro, joá, juá-espinho ou
laranjeira-de-vaqueiro, suas cascas e folhas tradicionalmente são empregadas na medicina
popular, na forma de extrato aquoso, por deter propriedades como analgésica, antiinflamatória, antibacteriana, febrífuga e cicatrizante. O presente trabalho teve como objetivo
investigar os efeitos biológicos do extrato etanólico (EETOH) das cascas do caule de Ziziphus
joazeiro Mart. em células procarióticas e eucarióticas com a finalidade posterior de assegurar
sua utilização como fonte de drogas que tenham potencial terapêutico ou que atuem como
ferramentas farmacológicas para a população. Para tanto, avaliou-se a atividade antibacteriana
através do método de incubação em caldo Luria Bertani (LB) frente a bactérias Gram
negativas e Gram positivas de importância clínica, potencial citotóxico utilizando como
parâmetro a atividade hemolítica e a fragilidade osmótica (anti-hemolítica), atividade
hemaglutinante e anti-hemaglutinante, assim como o potencial oxidante e antioxidante em
eritrócitos humanos dos tipos sanguíneos A, B e O. Os resultados mostraram que o EETOH
das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. nas concentrações de 1000 μg , 100 μg, 10 μg e 1 μg
não apresentou atividade antibacteriana frente às linhagens de bactérias Gram positivas e
Gram negativas testadas: E. coli ATCC 2536, E. coli ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC
8027, P. aeruginosa ATCC 25619, S. aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 25925 e B.
subtilis TCC 0516. Na investigação citotóxica, o EETOH não induziu hemólise nas menores
concentrações testadas e foi capaz de proteger a membrana dos eritrócitos contra hemólise
(atividade anti-hemolítica). O extrato etanólico não aglutinou os eritrócitos humanos nas
concentrações testadas e foi capaz de impedir a hemaglutinação na concentração de 10
μg/mL. Nos testes de atividade oxidante e antioxidante o EETOH não provocou oxidação da
hemoglobina em todas as concentrações testadas e ainda se comportou como um poderoso
agente antioxidante nas mesmas concentrações. Assim, pode-se concluir que o EETOH das
cascas do caule de Z. joazeiro Mart. não possui atividade antibacteriana frente às linhagens
testadas, possui baixa citotoxicidade, efeito citoprotetor, aprenta efeito anti-hemaglutinante e
é um agente antioxidante.
Palavras-chave: Ziziphus joazeiro, citotoxicidade, atividade antibacteriana, hemaglutinação,
antioxidante.
ABSTRACT
Ziziphus joazeiro Mart. is a large tree that belongs to the family Rhamnaceae and is typical of
northeastern Brazil. Popularly known as jujube, joazeiro, Joah juá-thorn or
orange-of-cowboy, its bark and leaves are traditionally used in medicine popular in the form
of aqueous extract, to hold properties including analgesic, anti-inflammatory, antibacterial,
wound healing and febrifuge. This study aimed to investigate the biological effects of ethanol
extract (EETOH) of skins Ziziphus joazeiro Mart. stem in prokaryotic and eukaryotic cells
with the subsequent order to encourage safe, their use as a source for drugs that have
therapeutic potential or to act as pharmacological tools for the population. Therefore, we
evaluated the antibacterial activity by incubation broth method Luria Bertani (LB) against
Gram negative and Gram positive clinical importance, cytotoxic potential using the hemolytic
activity as the parameter, and the osmotic fragility (anti-haemolytic), hemagglutinating
activity and anti-hemagglutinating, as the oxidant and antioxidant potential in human
erythrocytes of blood types A, B and O. The results showed that the shells EETOH Z.
joazeiro Mart stem. at concentrations of 1000 μg , 100 μg, 10 μg and 1 μg not presented
antibacterial activity to strains of Gram positive and Gram negative tested: E. coli ATCC
2536, E. coli ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, S.
aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 25925 e B. subtilis TCC 0516. In cytotoxic research,
EETOH did not induce hemolysis in the lower concentrations and was able to protect
erythrocytes membrane against hemolysis (anti-hemolytic activity). The ethanol extract not
agglutinated human erythrocytes in concentrations and was able to prevent the
hemagglutination in the concentration of 10 μg/mL. The oxidant and antioxidant activity tests
the EETOH did not cause oxidation of hemoglobin at all concentrations tested and also acted
as a powerful antioxidant in the same concentrations tested. Thus, it can be concluded that the
EETOH of Z. joazeiro Mart. stem bark has no antibacterial activity compared to the tested
strains have low cytotoxicity, cytoprotective effect, anti-hemagglutinating effect and is an
antioxidant.
Keywords: Ziziphus joazeiro, citotoxicity, antibacterial activity, hemaglutinanting,
antioxidant.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Distribuição geográfica do gênero Ziziphus representados pelos pontos
19
amarelos.
Figura 2.
Ziziphus joaeiro Mart.: aspecto geral.
20
Figura 3.
Folhas (A) e frutos (B) do Z. joazeiro Mart.
20
Figura 4.
Cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart.
28
Figura 5.
Atividade hemaglutinante com o tipo sanguíneo A+
38
Figura 6.
Atividade anti-hemaglutinante com o tipo sanguíneo A+
39
Figura 7.
Atividade hemaglutinante com o tipo sanguíneo B
39
Figura 8.
Atividade anti-hemaglutinante com o tipo sanguíneo B
40
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1.
Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo A (n=3) na
34
presença do extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL, 1000
μg/mL) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. As colunas
representam o percentual da média simples.
Gráfico 2.
Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo O (n=3) na
35
presença do extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL, 1000
μg/mL) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. As colunas
representam o percentual da média simples.
Gráfico 3.
Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo B (n=3) na
35
presença do extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL, 1000
μg/mL) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. As colunas
representam o percentual da média simples.
Gráfico 4.
Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de
Z. joazeiro Mart. frente a eritrócitos sanguíneo do tipo A. Controle
positivo = eritrócitos + Triton X-100; Controle negativo = eritrócitos
em salina. Resultado expresso como porcentagem da média simples.
36
Gráfico 5.
Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de
Z. joazeiro Mart. frente a eritrócitos sanguíneo do tipo B. Controle
positivo = eritrócitos + Triton X-100; Controle negativo = eritrócitos
em salina. Resultado expresso como porcentagem da média simples.
37
Gráfico 6.
Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de
Z. joazeiro Mart. frente a eritrócitos sanguíneo do tipo O. Controle
positivo = eritrócitos + Triton X-100; Controle negativo = eritrócitos
em salina. Resultado expresso como porcentagem da média simples.
37
Gráfico 7.
Efeito do EETOH das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. na
formação de MetHb em eritrócitos humanos (n=2) do tipo sanguíneo
O. As colunas representam o percentual da média de formação da
MetHb. Teste “t”, p<0,05.
41
Gráfico 8.
Efeito do EETOH das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. na
42
proteção da formação de MetHb em eritrócitos humanos (n=2) do tipo
sanguíneo O. As colunas representam o percentual da média de
formação da MetHb. Teste “t”, p<0,05.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
EROs – Espécies reativas de oxigênio
e.p.m. – Erro padrão da média
FOE – Fragilidade osmótica eritrocitária
MetHb - Metahemoglobina
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
15
2
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
17
2.1
Produtos naturais e sua importância
17
2.2
Ziziphus joazeiro Mart.
19
2.3
Relevância da atividade antibacteriana
21
2.3.1
As bactérias
22
2.4
Atividade hemolítica e anti-hemolítica
23
2.5
Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante
24
2.6
Atividade oxidante e antioxidante
25
3
OBJETIVOS
27
3.1
OBJETIVO GERAL
27
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
27
4
MATERIAL E MÉTODOS
28
4.1
Local da pesquisa
28
4.2
Material
28
4.2.1
Material botânico
28
4.2.2
Linhagens bacterianas
29
4.2.3
Eritrócitos humanos
29
4.3
Métodos
29
4.3.1
Preparação do extrato etanólico
29
4.3.2
Preparação da amostra teste
29
4.3.3
Meio de cultura
30
4.3.4
Atividade antibacteriana
30
4.3.5
Atividade hemolítica
30
4.3.6
Atividade anti-hemolítica ou fragilidade osmótica
30
4.3.7
Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante
31
4.3.8
Atividade oxidante e atividade antioxidante
31
4.3.9
Análise estatística
32
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
33
5.1
Atividade antibacteriana
33
5.2
Atividade hemolítica
34
5.3
Atividade anti-hemolítica ou fragilidade osmótica
36
5.4
Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante
38
5.5
Atividade oxidante e antioxidante
41
6
CONCLUSÃO
44
REFERÊNCIA
45
15
1 INTRODUÇÃO
Desde o decorrer da história humana, as plantas vêm sendo utilizadas na alimentação e na
busca da cura de diversas enfermidades. A medicina chinesa, por exemplo, foi desenvolvida
através do estudo desses vegetais, através do isolamento dos princípios ativos, buscando
entender seu mecanismo de ação (VIEGAS et al., 2006). No Brasil, plantas medicinais podem
ser utilizadas em diversas formas, tanto in natura, com suas partes inteiras, ou na forma de
preparos caseiros, como extratos brutos e infusos (MUSSI-DIAS et al., 2012).
Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) 80% da população dos países em
desenvolvimento utilizam práticas tradicionais nos seus cuidados básicos de saúde e 85%
usam plantas medicinais ou preparações destas (SOUZA, et al., 2013). Porém, apesar de
serem naturais e utilizadas há séculos, não é possível garantir a segurança de seu uso e
comprovar sua eficácia (TALALAY, 2001). Por isso, o interesse de pesquisadores e serviços
de saúde vem crescendo cada vez mais e aumentando o investimento em pesquisas com esses
produtos.
Os responsáveis pelos efeitos terapêuticos apresentados pelas plantas medicinais são os
princípios ativos (MONTANARI, 2002). Desta forma, todos os produtos derivados de plantas
que são usados com finalidade terapêutica devem ser avaliados através de métodos idênticos
àqueles usados para novos compostos sintéticos, a fim de garantir sua segurança e eficácia
(TALALAY, 2001). Segundo a Agência de Vigilância Sanitária – ANVISA, são considerados
medicamentos fitoterápicos “os obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas
vegetais cuja segurança e eficácia sejam baseadas em evidências clínicas e que sejam
caracterizados pela constância de sua qualidade” (BRASIL, 2014). Pesquisas sobre as plantas
medicinais que são utilizadas em uma comunidade podem trazer informações que viabilizem
a composição de estudos farmacológicos, fitoquímicos e agronômicos a respeito dessas
plantas (SOUZA et al., 2013).
O extrato etanólico utilizado em nosso estudo é oriundo das cascas do caule do Ziziphus
joazeiro Mart., uma árvore frondosa de porte mediano, pertencente à família Rhamnaceae,
que cresce em tabuleiros áridos e pedregosos (TRIGUEIRO, 1981). Típica do nordeste
brasileiro, tem suas folhas e cascas empregadas tradicionalmente na medicina popular da
região, na forma de extrato aquoso para tratamento de problemas gástricos, de febres, alívio
16
da tosse, como anti-inflamatório, agente de limpeza dos cabelos e dos dentes e como
medicamento para doenças de pele (LORENZI; MATOS, 2002).
Visto a variedade de indicações terapêuticas atribuídas ao Z. joazeiro Mart., nosso estudo
teve como finalidade avaliar a atividade antibacteriana, a citotoxicidade hemolítica, a
propriedade hemaglutinante e anti-hemaglutinante e os efeitos oxidante e antioxidante, do
extrato etanólico das cascas do caule dessa espécie.
17
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 Produtos naturais e sua importância
A natureza é uma fonte rica de um diversificado conjunto de compostos
farmacologicamente ativos que podem servir como estruturas básicas para o desenvolvimento
de novas drogas (PROKSCH et al, 2002). Os produtos naturais têm sido a base principal para
a descoberta de novos compostos e por milênios vêm sendo utilizados para o tratamento de
inúmeras doenças (GHOSH; PLAYFORD, 2003).
Sendo assim, muitos estudos contribuíram para a descoberta de drogas conhecidas no
mercado, como o anticancerígeno paclitaxel, o analgésico morfina e o antibacteriano
daptomicina. Morrison e Hergenrother (2013) relataram que desde 1960 até 2010, os produtos
naturais ou derivados semissintéticos de produtos naturais serviram como fonte de 41% dos
medicamentos anticancerígenos e 65% dos antibacterianos. Os produtos naturais podem ser
classificados em três grupos: produtos naturais, produtos naturais semissintéticos ou
derivados de produtos naturais (BUTLER, 2008).
A maior vantagem da triagem de produtos naturais é a sua diversidade estrutural. Eles são
relativamente pequenos (<1000 Da) e apresentam propriedades semelhantes às drogas e são
capazes de serem absorvidos e metabolizados pelo organismo (HARVEY, 1999). Enquanto os
medicamentos apresentam, em sua grande maioria, apenas um único princípio ativo
(responsável pela sua propriedade farmacológica), os extratos derivados de produtos naturais
são constituídos por misturas multicomponentes de substâncias ativas, parcialmente ativas e
inativas, que, muitas vezes atuam em alvos farmacológicos diferentes (FERREIRA; PINTO,
2010).
De acordo com alguns dados, a história da descoberta de drogas provenientes de produtos
naturais tem sido bem sucedida (GULLO; HUGHES, 2005). Nos últimos 25 anos cerca de
30% dos novos fármacos aprovados são produtos naturais ou derivados destes, e no que se
refere aos fármacos anticancerígenos, esse número passa para 42% (NEWMAN; CRAGG,
2007).
Há um ressurgimento do interesse na utilização de produtos naturais pelo público em
geral, que formam a base de uma indústria comercial muito lucrativa. Além disso, a indústria
farmacêutica permanece estudando o potencial desses produtos para identificar novos fatores
18
de crescimento, imunomoduladores e antimicrobianos (GHOSH; PLAYFORD, 2003). As
pesquisas realizadas com plantas medicinais envolvem várias etapas, como: investigações da
medicina tradicional e popular (etnofarmacológico); isolamento, purificação e caracterização
de princípios ativos (química orgânica, fitoquímica); investigações farmacológicas de extratos
vegetais e constituintes químicos isolados (farmacologia); transformações químicas de
princípios ativos (química orgânica sintética); estudo da relação estrutura/atividade e dos
mecanismos de ação dos princípios ativos (química medicinal e farmacológica) e finalmente a
operação de formulações para a produção de fitoterápicos (MACIEL et al, 2002).
No Brasil, a utilização dos produtos naturais através da fitoterapia vem se adequando às
necessidades de vários municípios no atendimento primário à saúde (ELDIN; DUNFORD,
2001). A expansão da fitoterapia deve-se, de uma forma geral, à preferência dos
consumidores por tratamentos mais “naturais”; a crescente validação científica das
propriedades farmacológicas existente nas espécies vegetais; o desenvolvimento de novos
métodos analíticos para ter o controle de qualidade; o desenvolvimento de novas formas de
preparações e administração dos produtos e o custo mais baixo (HOMAR, 2007).
O interesse na diversidade molecular das plantas tem estimulado a busca pelo
entendimento do seu metabolismo secundário, que é responsável pela síntese dos compostos
vegetais com atividade biológica, dentre as quais estão propriedades medicinais, aromáticas e
curativas (ALVES, 2001). Algumas pesquisas têm mostrado prescrições médicas nas quais os
produtos naturais e drogas relacionadas são usados para tratar 87% de todas as doenças
humanas (CHIN et al, 2006). Esses produtos representam uma esperança na prevenção contra
a carcinogênese, atuando através da sua atividade antioxidante e suprimindo a oncogênese
mediada por espécies reativas do oxigênio, já que o estresse oxidativo é a chave moduladora
na indução da carcinogênese humana (ZIECH et al, 2012).
Apesar de todos os benefícios, a toxicidade de plantas medicinais é algo que merece
atenção, pois efeitos adversos dos fitomedicamentos, possíveis adulterações e toxidez, assim
como sua interação com outras drogas podem ocorrer e levar o usuário a óbito. Portanto,
todos os produtos que são derivados de plantas e usados como drogas devem ser avaliados
para que se garanta a segurança e eficácia por métodos idênticos àqueles usados para novos
compostos sintéticos (TALALAY, 2001).
19
2.2 Ziziphus joazeiro Mart.
O Ziziphus joazeiro Mart. (= Ziziphus guaranitica Malme; Ziziphus gardeni Reissek) está
classificado
taxonomicamente
como
uma
espécie
vegetal
pertencente
à
divisão
Magnoliophyta, classe Magnoliopsida, ordem Rhamnales, família Rhamnaceae e gênero
Ziziphus (CARVALHO, 2007). O gênero Ziziphus Mill. possui cerca de 100 espécies
amplamente distribuídas pelo mundo (Figura 1) dentre as quais está o Ziziphus joazeiro Mart.
espécie nativa do Brasil cuja distribuição está compreendida em todo o Nordeste, com grande
ocorrência no bioma Caatinga e em Minas Gerais (SILVA et al., 2011).
Conhecido popularmente por juá, juazeiro ou laranjeira-do-vaqueiro, o Z. joazeiro Mart. é
uma árvore frondosa (Figura 2) de porte mediano, podendo atingir até 16 metros de altura, seu
tronco pode chegar a 30-50 cm de diâmetro, possui ramos armados com fortes espinhos,
flores pequenas amarelo-esverdeadas e fruto drupáceo (Figura 3) com caroço grande envolto
por polpa branca e mucilaginosa (LORENZI; MATOS, 2002). Sua casca tem espessura de até
14 mm, a parte externa é de cor cinza-escuro a levemente castanho e a parte interna é
amarelada (CARVALHO, 2007). Suas folhas medem de 3 cm a 10 cm de comprimento por 2
cm a 6 cm de largura, com três a cinco nervuras inferiormente pubescentes, partindo da base.
Essa espécie possui a capacidade de sobreviver nos períodos de seca, pois é uma árvore
perenifólia, característica decorrente de seu amplo sistema de raízes. Portanto, o Z. joazeiro
Mart. é, muitas vezes, uma importante fonte de água e alimentos para os animais da região
(CARTAXO et al, 2010).
Figura 1. Distribuição geográfica do gênero Ziziphus representados pelos pontos amarelos.
Fonte: www.discoverlife.org.
20
Figura 2. Ziziphus joazeiro Mart.: aspecto geral.
Fonte: http://www.cnpf.embrapa.br/publica/circtec/edicoes/Circular139.pdf
Figura 3. Folhas (A) e frutos (B) do Z. joazeiro Mart. Fonte: Lorenzi, Matos, 2002.
Quanto à composição química, é citada a presença dos triterpenoides, ácido betulínico
e lupeol, do alcaloide anfibina-D além de grande riqueza em saponinas, os jujubosídeos
(ESTEVAM, 2012). Em um ensaio fitoquímico para detectar as principais classes de
metabólitos secundários presentes no extrato das folhas e cascas de Ziziphus joazeiro Mart.,
verificou-se uma maior presença de fenóis, flavonoides, esteroides e terpenoides nas cascas
dessa espécie (SILVA; LIMA, 2010).
21
Sabe-se que os triterpenos atuam como bactericida, antivirótico, cicatrizante,
analgésico, relaxante, expectorante e antiespasmódico, e os taninos possuem uma ação
adstringente e antimicrobiana (PAIVA-MARTINS et al, 1995) e atuam também como
sequestradores de radicais livres que interceptam o oxigênio ativo formando radicais estáveis
(MELLO; SANTOS, 2001). Os flavonoides além de desempenharem funções biológicas
como a defesa a herbivoria, também desempenham atividades farmacológicas, nas quais as
principais são a antioxidante, antidiabética e hipocolesterolemiante (HARBORNE;
WILLIAMS, 2000).
As saponinas são referidas como glicosídeos triterpênicos ou esteroides e muitas delas
têm sido isoladas de plantas para estudos com interesses fitoquímicos (produção de espumas,
emulsificação e solubilização) e biológicos (potencial hemolítico, antimicrobiano e
inseticida); propriedades que são exploradas comercialmente em aplicações farmacêuticas e
biorremediações (RIBEIRO et al, 2013).
Na entrecasca da planta é relatada a presença de ácido betulínico, ácido oleanólico e
saponina (SILVA et al, 2011). De acordo com Oliveira et al. (2003), a cera epicular das folhas
do Z. joazeiro Mart é bastante rica em n-alcanos, cuja função é reter água na planta, e
triterpenoides (lupeol, beta-amirina, epifriedelinol e ácido ursólico).
Na cultura popular o Z. joazeiro Mart. apresenta vasto uso para o tratamento de
problemas de pele, como dermatites e micoses (CRUZ et al., 2007). A planta inteira também
possui diversos usos medicinais como antisséptico bucal, contra problemas do sistema
digestório (estomatite, úlceras gástricas, má-digestão e constipação) e do sistema respiratório
(ALBUQUERQUE et al, 2007), também sendo relatado seu uso como cicatrizante por
Almeida et al (2005). De acordo com Kato (1998), as folhas e o córtex do caule são ricos em
saponinas, tendo sua utilização na forma de xampu anticaspa e na lavagem de vidros e tecido
de algodão.
2.3 Relevância da atividade antibacteriana
Uma das características das bactérias é a capacidade genética de adquirir e transmitir
resistência às drogas que são utilizadas nos tratamentos de enfermidades e devido ao uso
indiscriminado de agentes antimicrobianos, essa resistência tem aumentado (COHEN, 1992).
Dessa forma, com o surgimento frequente de novas doenças e o desenvolvimento da
22
resistência a drogas, tornou-se necessária a busca por agentes que possuam atividade
antimicrobiana e, assim, promover o desenvolvimento de novos fármacos (FLORENCE,
2008).
Então, as estratégias encontradas para minimizar esse problema envolvem o controle na
utilização dos antibióticos, um melhor entendimento do mecanismo genético de resistência,
assim como a pesquisa e o desenvolvimento de novos medicamentos de origem natural ou
sintética (NASCIMENTO et al, 2000). Diante dessa realidade, os pesquisadores vêm
buscando novas substâncias tóxicas para as bactérias, a fim de que funcionem como
antimicrobianas, a partir de várias fontes como as plantas medicinais. Sendo assim, a triagem
de extratos de plantas, como de compostos sintetizados no metabolismo secundário, tentando
evidenciar a presença de novos compostos com atividade antimicrobiana é uma potencial
fonte para medicamentos mais efetivos (KARAMAN et al, 2003).
2.3.1 As bactérias
As bactérias são organismos classificados em Gram negativos ou Gram positivos de
acordo com as diferenças na estrutura da parede celular. A parede das bactérias Gram
positivas apresenta várias camadas de peptidioglicano, um polissacarídeo que forma uma rede
através de ligações cruzadas entre seus aminoácidos. Já nas bactérias Gram negativas a parede
celular contém apenas uma camada de peptidioglicano e uma membrana externa complexa,
composta de lipopolissacarídios, lipoproteínas e proteínas. A variação na sensibilidade a
substâncias exógenas advém das modificações na permeabilidade da parede celular, que por
sua vez, se originam das diferenças estruturais. Normalmente as bactérias Gram positivas são
mais sensíveis aos antimicrobianos do que as Gram negativas (MADIGAN; MARTINKO,
2004).
Algumas bactérias de importância clínica são as espécies: Bacillus subtilis, Escherichia
coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus:
Bacillus subtilis: é uma bactéria Gram positiva pertencente à família Baccillaceae. As
células têm forma de bacilos grandes, geralmente móveis, formando esporos que lhes
conferem a capacidade de sobreviver em condições desfavoráveis. É uma saprófita comum do
solo e da água, porém algumas espécies, acidentalmente provocam infecções (TRABULSI,
2004).
23
Escherichia
coli:
é
um
bacilo
Gram
negativo
pertencente
à
família
das
Enterobacteriaceaee, aeróbias ou aeróbias facultativas (HOLT et al., 1994). A E. coli é um
patógeno gastrointestinal versátil que pode estar envolvido na diarreia infantil, também pode
causar infecções no trato urinário de pessoas mais velhas ou naquelas cuja resistência está
diminuída devido a cirurgias ou exposição à radiação ionizante. As linhagens
enteropatogênicas de E. coli estão freqüentemente envolvidas nas infecções semelhantes à
disenteria e febres generalizadas (TORTORA, 2005).
Pseudomonas aeruginosa: caracteriza-se como bastonete Gram negativo linear ou
ligeiramente curvo, aeróbio estrito, podendo ser observado como células isoladas, aos pares,
ou em cadeias curtas, revelando mobilidade através de flagelo polar. Esta bactéria se
comporta como um patógeno oportunista iniciando infecções em indivíduos com baixa
resistência e frequentemente está associada com infecções do trato respiratório, urinário e
lesões na pele resultantes de queimaduras graves ou outros traumatismos. É comumente
encontrada no ambiente hospitalar e pode infectar facilmente os pacientes que estão
recebendo tratamento para outras doenças (MADIGAN; MARTINKO, 2004).
Staphylococcus aureus: pertence à família Staphylococcaceae e se apresentam como
cocos Gram positivos que formam grupos com aspecto de cachos de uvas com cor amarelada,
devido à produção de carotenóides. S. aureus tem uma grande importância clínica uma vez
que é a principal causa de infecções hospitalares adquiridas nos berçários, em cirurgias e em
procedimentos médicos invasivos. Algumas linhagens têm se mostrado muito resistentes a
vários antibióticos (HOLT et al., 1994).
2.4 Atividade hemolítica e anti-hemolítica
O eritrócito é um tipo de célula que possui altas concentrações de ácidos graxos
polinsaturados, oxigênio molecular e íons ferro no estado ligado (NIKI et al., 1991), fazendo
com que sua membrana celular fique muito vulnerável a reações envolvendo radicais livres e
que também fique muito susceptível a hemólise. Este evento pode ser correlacionado
diretamente com o efeito tóxico das substâncias testadas. Dessa forma, os eritrócitos podem
ser utilizados como um modelo experimental in vitro com a finalidade de investigar os efeitos
tóxicos e protetores de uma grande variedade de substâncias (BRANDÃO et al., 2006).
24
A detecção da atividade citotóxica é uma das medidas primordiais, visto que vários
compostos químicos podem ter a capacidade de causar efeitos tóxicos e modificar a
informação genética contida no DNA. Portanto, a obtenção de dados sobre a toxicidade
desses agentes deve ser assegurada por experimentos que forneçam, com uma razoável
margem de segurança, indicações sobre os riscos envolvidos na sua utilização (BENIGNI,
2005). A avaliação citotóxica através da quantificação da hemólise é um modelo simples para
estudar o efeito tóxico ou protetor de uma grande variedade de substâncias ou situações que
são associadas ao estresse oxidativo (LEXIS et al., 2006).
A capacidade de resistência à hemólise é caracterizada pelo teste de fragilidade osmótica
eritrocitária – FOE, que avalia a influência qualitativa de substâncias sobre os eritrócitos
(MOUSINHO et al., 2008) e expressa a habilidade das membranas manterem sua integridade
estrutural quando expostas a um estresse osmótico (ALDRICH, SAUNDERS, 2006).
Essa osmolaridade com que a célula sofre a lise está relacionada a fatores intrínsecos e
extrínsecos, dos quais se destacam como valores intrínsecos a razão área/volume, forma e
tamanho celular, espécie e propriedades inerentes às membranas (MAEDE, 1980). A
avaliação da estabilidade de membranas pode ser realizada através da quantificação da FOE
(RODRIGUES et al., 2009). Esta quantificação é frequentemente usada no diagnóstico de
hemoglobinopatias, principalmente esferocitoses, na avaliação do efeito de drogas sobre a
hematopoiese (SIRICHOTIYAKUL et al., 2004) e na identificação de alterações de
membrana em portadores de câncer cervical e de apnéia obstrutiva do sono (OZTÜRK et al.,
2003).
2.5 Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante
As disfunções na coagulação sanguínea estão associadas com a inflamação, complicações
cardiovasculares, câncer, trombose venosa, tromboembolismo e outras patologias. Estudos na
disfunção da coagulação, como a atividade hemaglutinante e antihemaglutinante, são
necessários devido aos efeitos indesejáveis da heparina e ao entendimento da patofisiologia e
do estado de hipercoagulação. (AZEVEDO et al, 2009)
A heparina não fracionada e as heparinas de baixo peso molecular são os únicos
polissacarídeos sulfatados que normalmente são utilizados como agentes anticoagulantes.
Porém, esses compostos têm vários efeitos colaterais tais como hemorragia e
25
trombocitopenia. Além disso, há uma procura crescente por terapias contra a trombose o que
indica a necessidade de buscar fontes alternativas de agentes anticoagulantes (AZEVEDO et
al., 2009).
2.6 Atividade oxidante e antioxidante
Sabe-se que o metabolismo normal acarreta a produção de espécies reativas de oxigênio
(EROs), responsáveis por desempenhar funções in vivo, como a produção de energia,
fagocitose, regulação do crescimento celular e na sinalização entre as células (ROTH, 1997).
Porém, uma alta produção de EROs pode provocar a oxidação de biomoléculas como
proteínas, aminoácidos, lipídios e DNA, levando a danos celulares e a morte (IGNARO, et al.,
1999), além de ter ligação com o desenvolvimento da asma, inflamação, artrite,
neurodegeneração, doença de Parkinson, síndrome de Down e da demência (PERRY, et al.,
2000). Por isso, existe um grande interesse em antioxidantes naturais provenientes de espécies
vegetais, já que dados epidemiológicos vem sugerindo o seu efeito protetor frente a diversas
doenças (LEONARD, et al., 2002).
A principal função do sangue é transportar os gases respiratórios, O2 e CO2, entre os
tecidos e os pulmões através da hemoglobina; e para mantê-la como oxihemoglobina - forma
reduzida e funcional da proteína - os eritrócitos contêm enzimas responsáveis pela produção
de energia (SIEMS; SOMMERBURG; GRUNE, 2000). Entretanto, o íon ferro da
hemoglobina está continuamente exposto a altas concentrações de oxigênio, resultando na sua
lenta oxidação a metahemoglobina (MetHb) ou ferrihemoglobina, que por sua vez, é incapaz
de se ligar ou transportar oxigênio. Em condições normais o nível de MetHb nos eritrócitos é
mantido abaixo de 1% da hemoglobina total (MANSOURI; LURIE, 1993).
Os eritrócitos humanos constituem um poderoso sistema que pode ser utilizado como um
modelo experimental in vitro para investigar o potencial antioxidante de extratos vegetais a
partir da quantificação da metHb que é formada (CLARO et al., 2005; ARBOS et al. 2008). A
formação de metHb in vivo pode ser reproduzida in vitro pela exposição de uma suspensão de
eritrócitos a um agente oxidante e a quantidade de metHB formada está diretamente
relacionada com a extensão do stress oxidativo causado pelo agente. Da mesma forma, a
exposição de eritrócitos a agentes antioxidantes presentes em misturas complexas, tais como
os extratos vegetais, podem evitar a formação de metHb (MANSOURI; LURIE, 1993).
26
Os antioxidantes são substâncias que previnem ou retardam a oxidação de lipídios ou
outras moléculas ao inibirem o início ou propagação da reação de oxidação em cadeia (LIMA
et al, 2006). Portanto, a efetividade do extrato em inibir a formação de metHb na presença de
um agente oxidante pode ser utilizada como a medida da sua atividade antioxidante (CLARO
et al., 2005; ARBOS et al. 2008).
27
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar os efeitos biológicos do extrato etanólico das cascas do caule do Ziziphus
joazeiro Mart.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Avaliar a atividade antibacteriana frente a bactérias Gram positivas e Gram negativas
de importância clínica;
 Avaliar o potencial citotóxico e citoprotetor através da atividade hemolítica e antihemolítica em eritrócitos humanos dos tipos A, B e O;
 Avaliar a atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante em eritrócitos humanos dos
tipos A e B;
 Avaliar a atividade oxidante e antioxidante em eritrócitos humanos do tipo O.
28
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local da pesquisa
As atividades desta pesquisa foram realizadas no Laboratório de Bioquímica, Genética e
Radiobiologia (BioGeR-Lab) do Departamento de Biologia Molecular da Universidade
Federal da Paraíba (UFPB).
4.2 Material
4.2.1 Material botânico
Foram utilizadas as cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart., coletadas na cidade de
Passira, estado de Pernambuco, cuja identificação botânica foi realizada no Herbário UFP
Geraldo Mariz da Universidade Federal de Pernambuco, onde uma excicata encontra-se
depositada sob o número de registro 48.432.
Figura 4. Cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. Fonte: Rayanne Maciel Vilarim.
29
4.2.2 Linhagens bacterianas
As linhagens bacterianas, oriundas da CCT – Coleção de Culturas Tropicais e ATCC –
American Type Culture Colection, utilizadas foram:







Bacillus subtilis CCT 0516
Escherichia coli ATCC 2536
Escherichia coli ATCC 10536
Pseudomonas aeruginosa ATCC 8027
Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Staphylococcus aureus ATCC 25925
4.2.3 Eritrócitos humanos
Os eritrócitos humanos (A, B, O) foram oriundos de bolsas contendo concentrado de
eritrócitos que não poderia mais ser utilizado para transfusão, obtido na Unidade
Transfusional do Hospital Universitário Lauro Wanderley/UFPB. A manipulação e o descarte
dos eritrócitos foram realizados de acordo com as Normas de Segurança seguidas pela
referida Unidade.
Os procedimentos experimentais foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa do
Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba (CEP-CCS Nº 493764).
4.3 Métodos
4.3.1 Preparação do extrato etanólico
Adicionou-se 100 g de casca do Z. joazeiro Mart. em etanol a 70% por 72 horas. No 1º dia
o volume de etanol foi de 400 mL, no segundo, o volume foi de 300 mL, e no terceiro dia, o
volume foi de 200 mL. Após as 72 horas, a amostra foi filtrada para retirar os resíduos, e em
seguida colocada no rotavapor. A quantidade do extrato etanólico produzida foi de 18,26g.
4.3.2 Preparação da amostra teste
A amostra foi preparada solubilizando-se 10 mg do extrato em 1 mL de água destilada.
Para a atividade antibacteriana, a esterilidade da amostra foi obtida após a sua filtração em
filtro de nitrocelulose (0,22 μm).
30
4.3.3 Meio de cultura
O meio de cultura utilizado foi o Luria Bertani (LB) : extrato de levedura (DIFCO) 10 g,
triptona (DIFCO) 5 g, NaCl (VETEC) 10 g para 1 L. Após preparado, o meio foi esterilizado
por autoclavação a 120 ºC, 1 atm por 20 minutos.
4.3.4 Atividade antibacteriana
A triagem para verificar a presença de atividade antibacteriana da amostra frente às
linhagens de bactérias Gram negativas e Gram positivas foi realizada pelo método de
incubação em 2 mL do caldo Luria Bertani (LB), na presença do EETOH (1000 μg/mL, 100
μg/mL, 10 μg/mL e 1 μg/mL) e 10 μL das linhagens bacterianas. em triplicata. Em seguida,
foi realizada a incubação por 18 horas a 37 ºC. Decorrido este tempo, o crescimento
bacteriano foi avaliado através da turvação apresentada pelo meio de cultura. O teste foi
realizado em triplicata.
4.3.5 Atividade hemolítica
Os eritrócitos foram centrifugados a 2500 rpm por 5’ e ressuspensos em NaCl 0,9%. Este
procedimento foi repetido 3 vezes. Várias concentrações do EETOH (1 μg, 10 μg, 100 μg e
1000 μg) foram adicionadas a 4 mL de uma suspensão de eritrócitos 0,5% (v/v) em NaCl
0,9%. Estas foram incubadas a 25 ± 2 °C por 1 h e centrifugadas a 2500 rpm por 5’
novamente. O sobrenadante foi avaliado por espectrofotometria (540 nm) para constatar a
hemólise. A hemólise total foi obtida com Triton X-100 e a porcentagem de hemólise foi
calculada em relação a esse valor (RANGEL et al., 1997). Este experimento foi realizado em
triplicata e os resultados foram expressos como porcentagem da média aritmética simples.
4.3.6 Atividade anti-hemolítica ou fragilidade osmótica
Os eritrócitos foram centrifugados a 2500 rpm por 5’ e ressuspensos em NaCl 0,9%. Esse
procedimento foi repetido 3 vezes. Em seguida, foram adicionados 100 μg/mL e 10 μg/mL do
EETOH a 4 mL de uma suspensão de eritrócitos 0,5% (v/v) em NaCl 0,9%. Estas foram
incubadas a 25 ± 2 °C por 1 h e centrifugadas novamente. Desprezou-se o sobrenadante e
ressuspendeu-se os eritrócitos em 2 ml de NaCl nas seguintes concentrações: 0,12%; 0,24%;
31
0,36%; 0,48%; 0,60%; 0,72%; 0,84% e 0,96%. Estas foram incubadas a 25 ± 2 °C por 1 h e
centrifugadas novamente. O sobrenadante foi submetido à espectrofotometria (540 nm) para
caracterizar a atividade anti-hemolítica. As atividades hemolítica e anti-hemolítica foram
realizadas em triplicatas e os resultados foram expressos como média aritmética simples.
4.3.7 Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante
A amostra, nas concentações de 1 μg/mL e 10 μg/mL, foi diluída em NaCl 0,9% e
adicionada a suspensões de eritrócitos 5% (1 mL). Após um período de incubação de 30
minutos, sob agitação lenta (100 rpm) e a temperatura ambiente, foram adicionados, em
preparações diferentes, uma gota (50 μL) dos anticorpos monoclonais IgM específicos para os
antígenos A e B (BIORAD). Este experimento foi realizado em triplicata e os resultados
foram observados a olho desarmado.
4.3.8 Atividade oxidante e atividade antioxidante
Para investigar o potencial oxidante das amostras, diferentes concentrações (1 μg, 10 μg,
100 μg e 1000 μg) do mesmo foram diluídas em PBS (11,35 g NaH2PO4.2H2O; 24,36 g
Na2HPO4 e 7,18 g NaCl para 1 L; pH 7,4) suplementado com glicose (200 mg/dL), pH 7,6 e
adicionadas a suspensões de eritrócitos (1 mL). Após um período de incubação de 1 h, sob
agitação lenta e constante (100 rpm) a 22 ± 2 °C, as amostras foram centrifugadas a 2500 rpm
durante 5 minutos e a porcentagem de metahemoglobina (metHb) em relação a hemoglobina
(Hb) total foi quantificada por espectrofotometria a 630 nm e 540nm.
Para determinar o potencial antioxidante, após a incubação das amostras nas diferentes
concentrações por 1 h, foi adicionado um agente oxidante, a fenilhidrazina (Ph) 1 mmol/L
(SIGMA). As suspensões foram aeradas e mantidas sob agitação lenta e constante (100 rpm)
por mais 20 minutos a 22 ± 2 °C. Decorrido este tempo, as amostras foram centrifugadas a
2500 rpm durante 5 minutos, e o sobrenadante diluído em tampão fosfato (9 g
Na2HPO4.12H2O, 5,7 g KH2PO4 para 1 L) e a porcentagem de metHb em relação a Hb total
foi quantificada por espectrofotometria a 630 nm e 540 nm. A incubação dos eritrócitos na
presença de PH gera radicais livres que resultam na formação de altos níveis de
32
metemoglobina (metHb) que estarão diretamente relacionados com a extensão do estresse
oxidativo produzido (ARBOS et al, 2008).
Os valores de metHb entre 1,5 e 2,0% foram considerados normais enquanto que valores
acima de 5% foram considerados elevados (CAMARGO et al., 2007). A porcentagem de
metHb formada foi comparada com os valores obtido, através da literatura, para a vitamina C
(20 mmol/L), um comprovado agente antioxidante (ARBOS et al, 2008). Este experimento foi
realizado em duplicata com o sangue do tipo O.
4.3.9 Análise estatística
Todos os dados foram analisados pelo teste “t” Pareado através do programa GraphPad
Prism versão 5.01. O nível de significância de 5% foi adotado para comparar dados de um
mesmo experimento. Dessa forma, foi adotado como significativas as diferenças que geram
p<0,05. Os resultados apresentados corresponderam o percentual da média aritmética simples.
33
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Atividade antibacteriana
O extrato etanólico das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. não foi capaz de
inibir o crescimento das linhagens de bactérias Gram positivas e Gram negativas testadas: E.
coli ATCC 2536, E. coli ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC
25619, S. aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 25925 e B. subtilis TCC 0516, pois foi
visualizada a turvação do meio. Um resultado semelhante foi encontrado no estudo realizado
por Silva et al. (2011), no qual o extrato das cascas do Ziziphus joazeiro Mart. não apresentou
atividade inibitória contra a Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa testadas.
No estudo realizado por Melo et al. (2012), a atividade antimicrobiana do extrato
hidroalcoólico das cascas de Z. joazeiro Mart. foi testada frente a bactérias como
Staphylococcus aureus (ATCC6538), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas
aeruginosa (ATCC 9027), Bacillus subtilis (ATCC 6633) e outras espécies, através do
método de difusão em ágar Mueller-Hinton. Diferentemente do nosso resultado, o extrato
hidroalcoólico produziu atividade antimicrobiana contra Bacillus subtilis e Pseudomonas
aeruginosa, apresentando halo de inibição de 12 mm de diâmetro.
Em estudos realizados por Alviano et al. (2008) o extrato aquoso da entrecasca de Z.
joazeiro Mart. apresentou atividade contra a Prevotella intermédia, Porphyromonas
gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutan e Lactobacillus casei, bactérias da
microbiota oral que estão associadas a doenças peridentais. Nunes et al. (1987) avaliaram a
atividade antipirética do extrato aquoso das cascas dessa espécie em coelhos infectados com a
endotoxina de E.coli e relataram que ocorreu uma diminuição significativa da febre nos
animais através da administração oral da infusão. Trabalhos com outras espécies de Ziziphus
sobre a atividade antimicrobiana são citados na literatura. Em um estudo com a espécie
Ziziphus spinachristi, Ali-Shtayeh et al. (1998) observaram atividade antimicrobiana frente a
bactérias como E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, dentre outras.
De acordo com Melo et al. (2012), “vários fatores podem interferir na atividade
biológica de extratos vegetais, principalmente o local e o período da coleta e tipos de
solventes utilizados para a extração”; o que nos leva a crer que o tipo de extrato, o método
escolhido para a atividade antimicrobiana e as linhagens utilizadas podem proporcionar um
resultado diferente.
34
5.2 Atividade hemolítica
O extrato etanólico do Z. joazeiro Mart. não exerceu atividade hemolítica nas
concentrações de 1 μg/mL, 10 μg/mL e 100 μg/mL frente aos eritrócitos do tipo sanguíneo A
e O, exceto na maior concentração, 1000 μg/mL, na qual a hemólise foi de 100% nos
eritrócitos testados (Gráficos 1 e 2). Já nos eritrócitos do tipo sanguíneo B, o extrato não
exerceu atividade hemolítica apenas nas concentrações de 1 μg/mL e 10 μg/mL, apresentando
hemólise maior que 100% na concentração de 100 μg/mL; e hemólise de 100% na
concentração de 1000 μg/mL (Gráfico 3).
Através do resultado encontrado, percebe-se que em baixas concentrações, o EETOH
das cascas do caule de Z. joazeiro não possui a capacidade de causar danos na membrana
eritrocitária dos três tipos sanguíneos do sistema ABO. Isto é bastante relevante, visto que os
eritrócitos têm um papel importante no transporte de gases (O² E CO²) e também no controle
da formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) no organismo (IGNARO, et al., 1999)
Um resultado similar foi encontrado no experimento realizado por Silva e Lima
(2010), no qual o efeito hemolítico dos extratos do juazeiro foi avaliado em cultura de
eritrócitos de camundongos (2%), em que foi encontrada a ausência de atividade hemolítica
dos extratos brutos e subfrações das cascas e folhas em concentrações abaixo de 200 μg/mL.
SANGUE A
Hemólise %
150
100
50
µg
10
00
10
0µ
g
10
µg
1µ
g
0
Concentração (g)
Gráfico 1. Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo A (n=3) na presença do
extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL e 1000 μg/mL) das cascas do caule de
Ziziphus joazeiro Mart. As colunas representam o percentual da média simples.
35
Sangue O
Hemólise %
150
100
50
µg
10
00
10
0
g
g
10
1
g
0
Concentração (g)
Gráfico 2. Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo O (n=3) na presença do
extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL e 1000 μg/mL) das cascas do caule de
Ziziphus joazeiro Mart. As colunas representam o percentual da média simples.
Sangue B
Hemólise %
15
10
5
µg
10
00
10
0
g
g
10
1
g
0
Concentração (g)
Gráfico 3. Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo B (n=3) na presença do
extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL e 1000 μg/mL) das cascas do caule de
Ziziphus joazeiro Mart. As colunas representam o percentual da média simples.
36
5.3 Atividade anti-hemolítica ou fragilidade osmótica
O EETOH das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. apresentou atividade antihemolítica na concentração de 100 μg/mL nos eritrócitos do tipo A e O; e na concentração de 10
μg/mL nos eritrócitos do tipo B. À medida que as soluções ficam mais hipotônicas, o resultado
esperado seria a ocorrência da hemólise próxima a hemólise total (controle positivo). Porém,
o extrato etanólico na presença da solução hipotônica (12% de NaCl), conseguiu reduzir a
hemólise, que deveria ser de 100%, em todos os tipos sanguíneos testados (gráficos 4, 5 e 6).
Sangue A
Hemólise %
100
50
co
nt
r
ol
e
po
si
tiv
o
0,
12
0,
24
0,
36
0,
48
0,
60
0,
72
co
nt
0,
84
ro
le
ne 0,9
ga 6
tiv
o
0
NaCl (%)
Gráfico 4. Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro
Mart. frente a eritrócitos do tipo sanguíneo A. Controle positivo = eritrócitos + Triton X-100;
Controle negativo = eritrócitos em salina. Resultado expresso como percentual da média
simples.
37
Sangue B
Hemólise (%)
100
50
co
nt
r
ol
e
po
si
tiv
o
0,
12
0,
24
0,
36
0,
48
0,
60
0,
72
co
nt
0,
84
ro
le
ne 0,9
ga 6
tiv
o
0
NaCl (%)
Gráfico 5. Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro
Mart. Frente a eritrócitos do tipo sanguíneo B. Controle positivo = eritrócitos + Triton X-100;
Controle negativo = eritrócitos em salina. Resultado expresso como percentual da média
simples.
Sangue O
Hemólise (%)
100
50
0
vo 12 24 36 48 60 72 84 96 vo
iti 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, ati
s
g
po
ne
e
l
e
l
ro
ro
nt
nt
o
o
c
c
NaCl (%)
Gráfico 6. Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro
Mart. Frente a eritrócitos do tipo sanguíneo O. Controle positivo = eritrócitos + Triton X-100;
Controle negativo = eritrócitos em salina. Resultado expresso como percentual da média
simples.
38
A fragilidade osmótica eritrocitária (FOE) avalia a influência qualitativa de
substâncias sobre os eritrócitos (MOUSINHO et al., 2008) e expressa a habilidade das
membranas manterem sua integridade estrutural quando expostas a um estresse osmótico
(ALDRICH, 2006).
O EETOH das cascas do caude de Z. joazeiro Mart., na concentração de 100 μg/mL,
apresentou atividade anti-hemolítica, não exercendo, portanto, efeito tóxico sobre o
funcionamento da membrana que manteve sua integridade estrutural quando submetida a um
estresse omótico. Esses dados são inéditos quando consideramos a utilização da metodologia
e o produto avaliado.
5.4 Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante
Os eritrócitos do tipo sanguíneo A+ não apresentaram hemaglutinação nas
concentrações de 1 μg/mL e 10 μg/mL de Z. joazeiro Mart. (Figura 5). Na atividade antihemaglutinante, o extrato foi capaz de impedir a hemaglutinação na concentração de 10
μg/mL ao se comparar ao controle positivo (Figura 6). No tipo sanguíneo B+, foram
encontrados os mesmos resultados para ambas atividades: não ocorreu hemaglutinação nas
concentrações testadas (Figura 7) e na concentração de 10 μg/mL de Z. joazeiro Mart, a
substância foi capaz de impedir a hemaglutinação (Figura 8).
Figura 5. Atividade hemaglutinante com o tipo sanguíneo A+. C-:
controle negativo (eritrócitos); C+: controle positivo (eritrócitos +
anti-A).
Fonte: Rayanne Maciel Vilarim.
39
Figura 6. Atividade anti-hemaglutinante com o tipo sanguíneo A+. C-:
controle negativo (eritrócitos); C+: controle positivo (eritrócitos +
anti-A).
Fonte: Rayanne Maciel Vilarim.
Figura 7. Atividade hemaglutinante com o tipo sanguíneo B. C-:
controle negativo (eritrócitos); C+: controle positivo (eritrócitos +
anti-B).
Fonte: Rayanne Maciel Vilarim.
40
Figura 8. Atividade anti-hemaglutinante com o tipo sanguíneo B. C-:
controle negativo (eritrócitos); C+: controle positivo (eritrócitos +
anti-B).
Fonte: Rayanne Maciel Vilarim.
O extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. na concentração de 10
μg/mL tem atividade anti-hemaglutinante frente aos grupos sanguíneos A e B. Este resultado
é importante, pois o EETOH pode servir como ferramenta no tratamento de algumas
disfunções na coagulação sanguínea. Este resultado é inédito quando consideramos a
utilização da metodologia e o produto avaliado.
41
5.5 Atividade Oxidante e atividade antioxidante
A quantidade de metahemoglobina formada na ausência (controle negativo) e na
presença do extrato etanólico de Z. joazeiro, em todas as concentrações testadas (1 μg/mL, 10
μg/mL, 100 μg/mL e 1000 μg/mL) não retratou uma diferença significativa em comparação
ao controle negativo, ou seja, ele não causou a oxidação da hemoglobina humana (Gráfico 7).
Quando colocado frente a um agente oxidante (fenilhidrazina), o extrato impediu a oxidação
da hemoglobina, obtendo uma baixa quantidade de metHb produzida (Gráfico 8).
Oxidante
metHb (%Hb)
150
100
50
+
C
10
00
10
0
1
10
C
-
0
[EEtOH Z. joazeiro] g/mL
Gráfico 7. Efeito oxidante do EETOH das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. na
formação de MetHb em eritrócitos humanos (n=2) do tipo sanguíneo O. As colunas
representam o percentual da média de formação da MetHb. Teste “t”, p<0,05.
42
Antioxidante
metHb (%Hb)
150
100
50
0
C
-
PH
+
1
1
PH
+
0
PH
PH
+
+
0
00
10
10
C
+
[EEtOH Z. joazeiro] g/mL
Gráfico 8. Efeito antioxidante do EETOH das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. na
proteção da formação de MetHb em eritrócitos humanos (n=2) do tipo sanguíneo O. As
colunas representam o percentual da média de formação da MetHb. Teste “t”, p<0,05.
O EETOH das cascas do caule de Z. joazeiro Mart., nas concentrações testadas,
demonstrou ser um agente antioxidante mais eficaz do que a vitamina C, que protege os
eritrócitos em 52,7% na presença da fenilhidrazina (ARBOS et al, 2008). Este é um resultado
importante, pois a oxidação da hemoglobina leva a formação de radicais livres, que por sua
vez, podem causar danos às células e sistemas do organismo humano (SIEMS, 2000).
O resultado encontrado corrobora outros dados da literatura nos quais espécies do
gênero Ziziphus exercem atividade antioxidante. Silva et al. (2011) utilizaram o método de
captação pelo DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) para avaliar a atividade antioxidante das
cascas e folhas de Ziziphus joazeiro Mart. O DPPH é um radical livre que pode aceitar um
elétron ou radical hidrogênio para tornar-se uma molécula diamagnética estável (SILVA,
2009). Nesse estudo os autores verificaram que o extrato bruto da casca e folhas do Z.
joazeiro apresentou atividade antioxidante, sendo a das folhas cerca de 400 vezes maior que a
das cascas; fato devido provavelmente ao alto teor de taninos presentes nessa espécie. Alviano
et al. (2008), também utilizando o método do DPPH, avaliou a atividade antioxidante de Z.
joazeiro e verificou que o extrato etanólico da entrecasca apresentou alto potencial
antioxidante e baixa toxicidade.
43
Outras espécies do gênero têm demonstrado possuir atividade antioxidante. Um
exemplo é a pesquisa desenvolvida por Afolayan e Olajuyigbe (2011), na qual foram
utilizados os extratos etanólico, extrato de acetona e extrato aquoso das cascas do Ziziphus
mucronata Willd. e todos exerceram atividade antioxidante, sendo o extrato etanólico
apresentando a maior atividade. O resultado foi atribuído à presença dos compostos fenólicos.
Outra espécie do mesmo gênero foi utilizada por Chen et al. (2014) para tratar uma cultura de
astrócitos com o extrato aquoso de Ziziphus jujuba Fruit (Jujube). O resultado encontrado foi
que o extrato dessa planta atuou sobre a regulação da expressão de fatores neurotróficos e
enzimas responsáveis pela propriedade antioxidante. Por fim, uma pesquisa realizada por
Benammar et al. (2010) com o extrato aquoso da polpa, sementes, folhas, raiz e caule de
Ziziphus lotus L. (Desf.) também demonstrou atividade antioxidante de todas essas partes, e o
caule teve melhor resultado.
Tendo em vista os resultados obtidos, sugere-se que o extrato etanólico das cascas do
caule de Ziziphus joazeiro Mart. possua efeito citoprotetor, anti-hemaglutinante e
antioxidante.
44
6 CONCLUSÃO
A partir da investigação dos efeitos biológicos ocasionados pelo extrato etanólico das
cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart., frente a células procarióticas e eucarióticas, podese concluir que:
 O extrato etanólico não apresentou atividade antibacteriana frente às linhagens Gram
positivas e Gram negativas testadas.
 O extrato etanólico não induziu hemólise até a concentração de 100 µg/mL, nos
sangues dos tipos A e O, portanto não causou danos à membrana celular desses
eritrócitos humanos, bem como não apresentou citotoxicidade. Enquanto que para o
tipo sanguíneo B, o extrato etanólico não induziu hemólise até a concentração de 10
µg/mL.
 O extrato etanólico das cascas do caule de Ziziphus joazeiro apresentou efeito sobre os
eritrócitos humanos dos tipos sanguíneos A, B e O submetidos a estresse osmótico,
protegendo a membrana celular.
 O EETOH não apresentou efeito aglutinante frente aos eritrócitos dos tipos sanguíneos
A e B, entretanto, apresentou um efeito anti-hemaglutinante na concentração de 10
µg/mL frente aos eritrócitos dos mesmos tipos sanguíneos.
 O extrato etanólico não induziu a formação de metahemoglobina, portanto, não
apresentou efeito oxidante em nenhuma das concentrações testadas (1 µg/mL, 10
µg/mL, 100 µg/mL e 1000 µg/mL), entretanto, exibiu efeito antioxidante nas mesmas
concentrações já referidas.
45
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