Avaliação dos efeitos biológicos do extrato etanólico
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS AVALIAÇÃO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS DO EXTRATO ETANÓLICO DAS CASCAS DO CAULE DE Ziziphus joazeiro Mart. Rayanne Maciel Vilarim Prof.ª Dr.ª Hilzeth de Luna Pessôa João Pessoa 2015 UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS AVALIAÇÃO DOS EFEITOS BIOLÓGICOS DO EXTRATO ETANÓLICO DAS CASCAS DO CAULE DE Ziziphus joazeiro Mart. Rayanne Maciel Vilarim Profª. Dr.ª Hilzeth de Luna Freire Pessôa Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas (Trabalho Acadêmico de Conclusão de Curso), como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas. João Pessoa 2015 Catalogação na publicação Universidade Federal da Paraíba Biblioteca Setorial do CCEN V697a Vilarim, Rayanne Maciel. Avaliação dos efeitos biológicos do extrato etanólico das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. / Rayanne Maciel Vilarim. – João Pessoa, 2015. 52f. : il. – Monografia (Bacharelado em Ciências Biológicas) Universidade Federal da Paraíba. Orientador: Profª. Drª. Hilzeth de Luna Freire Pessôa. 1. Juazeiro (Ziziphus joazeiro). 2. Citotoxicidade. 3. Atividade antibacteriana. I. Título. FPB/BS-CCEN UNIVERSIDADE CDU: 634.662 (043. 2) FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA MOLECULAR CURSO DE BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Rayanne Maciel Vilarim Avaliação dos efeitos biológicos do extrato etanólico das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. Monografia apresentada ao Curso de Ciências Biológicas, como requisito parcial à obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas. Data: _____________________________________________________ Resultado:__________________________________________________ BANCA EXAMINADORA __________________________________________________________ Prof. Dr.ª Hilzeth De Luna Freire Pessôa – Departamento de Biologia Molecular/UFPB ____________________________________________________________ Profª. MSc. Camila de Albuquerque Montenegro - Departamento de Farmácia/UEPB _____________________________________________________________ Profª Dr.ª Maria do Socorro Vieira Pereira – Departamento de Biologia Molecular/UFPB _____________________________________________________________ Prof. Dr. Abrahão Alves de Oliveira Filho – Unidade Acadêmica de Ciências Biológicas/UFCG À ciência, por ser uma bela e poderosa ferramenta que o homem dispõe para fazer o bem. AGRADECIMENTOS A Deus, por ter se manifestado várias vezes em minha vida. Aos meus pais, Robson Vilarim e Ana Neide Maciel, e a minha irmã, Raynelle Maciel, por serem meu apoio em todas as horas. A minha ilustre orientadora, Dr.ª Hilzeth de Luna Freire Pessôa, pelo apoio, paciência e disponibilidade. A minha grande amiga Anne Falcão, que sempre foi muito prestativa, me ajudando na universidade e fora dela. Ao CNPq, pelo apoio científico e financiamento da bolsa de estudo. Aos membros da banca, Profª. MSc. Camila de Albuquerque Montenegro, Profª. Drª. Maria do Socorro Vieira Pereira e Prof. Dr. Abrahão Alves de Oliveira Filho, por terem aceitado o convite e pela importante contribuição enriquecedora para o meu trabalho. Aos meus amigos do curso, Caetano Filho, Cristine Prates, Janaína Oliveira, Maíra Leite e Sara Pordeus, pelos bons momentos compartilhados. “Sábio é aquele que conhece os limites da própria ignorância.” Sócrates RESUMO Ziziphus joazeiro Mart. é uma árvore frondosa que pertence à família Rhamnaceae e é típica do nordeste brasileiro. Popularmente conhecida como juazeiro, joazeiro, joá, juá-espinho ou laranjeira-de-vaqueiro, suas cascas e folhas tradicionalmente são empregadas na medicina popular, na forma de extrato aquoso, por deter propriedades como analgésica, antiinflamatória, antibacteriana, febrífuga e cicatrizante. O presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos biológicos do extrato etanólico (EETOH) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. em células procarióticas e eucarióticas com a finalidade posterior de assegurar sua utilização como fonte de drogas que tenham potencial terapêutico ou que atuem como ferramentas farmacológicas para a população. Para tanto, avaliou-se a atividade antibacteriana através do método de incubação em caldo Luria Bertani (LB) frente a bactérias Gram negativas e Gram positivas de importância clínica, potencial citotóxico utilizando como parâmetro a atividade hemolítica e a fragilidade osmótica (anti-hemolítica), atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante, assim como o potencial oxidante e antioxidante em eritrócitos humanos dos tipos sanguíneos A, B e O. Os resultados mostraram que o EETOH das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. nas concentrações de 1000 μg , 100 μg, 10 μg e 1 μg não apresentou atividade antibacteriana frente às linhagens de bactérias Gram positivas e Gram negativas testadas: E. coli ATCC 2536, E. coli ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, S. aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 25925 e B. subtilis TCC 0516. Na investigação citotóxica, o EETOH não induziu hemólise nas menores concentrações testadas e foi capaz de proteger a membrana dos eritrócitos contra hemólise (atividade anti-hemolítica). O extrato etanólico não aglutinou os eritrócitos humanos nas concentrações testadas e foi capaz de impedir a hemaglutinação na concentração de 10 μg/mL. Nos testes de atividade oxidante e antioxidante o EETOH não provocou oxidação da hemoglobina em todas as concentrações testadas e ainda se comportou como um poderoso agente antioxidante nas mesmas concentrações. Assim, pode-se concluir que o EETOH das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. não possui atividade antibacteriana frente às linhagens testadas, possui baixa citotoxicidade, efeito citoprotetor, aprenta efeito anti-hemaglutinante e é um agente antioxidante. Palavras-chave: Ziziphus joazeiro, citotoxicidade, atividade antibacteriana, hemaglutinação, antioxidante. ABSTRACT Ziziphus joazeiro Mart. is a large tree that belongs to the family Rhamnaceae and is typical of northeastern Brazil. Popularly known as jujube, joazeiro, Joah juá-thorn or orange-of-cowboy, its bark and leaves are traditionally used in medicine popular in the form of aqueous extract, to hold properties including analgesic, anti-inflammatory, antibacterial, wound healing and febrifuge. This study aimed to investigate the biological effects of ethanol extract (EETOH) of skins Ziziphus joazeiro Mart. stem in prokaryotic and eukaryotic cells with the subsequent order to encourage safe, their use as a source for drugs that have therapeutic potential or to act as pharmacological tools for the population. Therefore, we evaluated the antibacterial activity by incubation broth method Luria Bertani (LB) against Gram negative and Gram positive clinical importance, cytotoxic potential using the hemolytic activity as the parameter, and the osmotic fragility (anti-haemolytic), hemagglutinating activity and anti-hemagglutinating, as the oxidant and antioxidant potential in human erythrocytes of blood types A, B and O. The results showed that the shells EETOH Z. joazeiro Mart stem. at concentrations of 1000 μg , 100 μg, 10 μg and 1 μg not presented antibacterial activity to strains of Gram positive and Gram negative tested: E. coli ATCC 2536, E. coli ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, S. aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 25925 e B. subtilis TCC 0516. In cytotoxic research, EETOH did not induce hemolysis in the lower concentrations and was able to protect erythrocytes membrane against hemolysis (anti-hemolytic activity). The ethanol extract not agglutinated human erythrocytes in concentrations and was able to prevent the hemagglutination in the concentration of 10 μg/mL. The oxidant and antioxidant activity tests the EETOH did not cause oxidation of hemoglobin at all concentrations tested and also acted as a powerful antioxidant in the same concentrations tested. Thus, it can be concluded that the EETOH of Z. joazeiro Mart. stem bark has no antibacterial activity compared to the tested strains have low cytotoxicity, cytoprotective effect, anti-hemagglutinating effect and is an antioxidant. Keywords: Ziziphus joazeiro, citotoxicity, antibacterial activity, hemaglutinanting, antioxidant. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Distribuição geográfica do gênero Ziziphus representados pelos pontos 19 amarelos. Figura 2. Ziziphus joaeiro Mart.: aspecto geral. 20 Figura 3. Folhas (A) e frutos (B) do Z. joazeiro Mart. 20 Figura 4. Cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. 28 Figura 5. Atividade hemaglutinante com o tipo sanguíneo A+ 38 Figura 6. Atividade anti-hemaglutinante com o tipo sanguíneo A+ 39 Figura 7. Atividade hemaglutinante com o tipo sanguíneo B 39 Figura 8. Atividade anti-hemaglutinante com o tipo sanguíneo B 40 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1. Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo A (n=3) na 34 presença do extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL, 1000 μg/mL) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. As colunas representam o percentual da média simples. Gráfico 2. Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo O (n=3) na 35 presença do extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL, 1000 μg/mL) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. As colunas representam o percentual da média simples. Gráfico 3. Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo B (n=3) na 35 presença do extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL, 1000 μg/mL) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. As colunas representam o percentual da média simples. Gráfico 4. Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. frente a eritrócitos sanguíneo do tipo A. Controle positivo = eritrócitos + Triton X-100; Controle negativo = eritrócitos em salina. Resultado expresso como porcentagem da média simples. 36 Gráfico 5. Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. frente a eritrócitos sanguíneo do tipo B. Controle positivo = eritrócitos + Triton X-100; Controle negativo = eritrócitos em salina. Resultado expresso como porcentagem da média simples. 37 Gráfico 6. Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. frente a eritrócitos sanguíneo do tipo O. Controle positivo = eritrócitos + Triton X-100; Controle negativo = eritrócitos em salina. Resultado expresso como porcentagem da média simples. 37 Gráfico 7. Efeito do EETOH das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. na formação de MetHb em eritrócitos humanos (n=2) do tipo sanguíneo O. As colunas representam o percentual da média de formação da MetHb. Teste “t”, p<0,05. 41 Gráfico 8. Efeito do EETOH das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. na 42 proteção da formação de MetHb em eritrócitos humanos (n=2) do tipo sanguíneo O. As colunas representam o percentual da média de formação da MetHb. Teste “t”, p<0,05. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária EROs – Espécies reativas de oxigênio e.p.m. – Erro padrão da média FOE – Fragilidade osmótica eritrocitária MetHb - Metahemoglobina SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 15 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 17 2.1 Produtos naturais e sua importância 17 2.2 Ziziphus joazeiro Mart. 19 2.3 Relevância da atividade antibacteriana 21 2.3.1 As bactérias 22 2.4 Atividade hemolítica e anti-hemolítica 23 2.5 Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante 24 2.6 Atividade oxidante e antioxidante 25 3 OBJETIVOS 27 3.1 OBJETIVO GERAL 27 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27 4 MATERIAL E MÉTODOS 28 4.1 Local da pesquisa 28 4.2 Material 28 4.2.1 Material botânico 28 4.2.2 Linhagens bacterianas 29 4.2.3 Eritrócitos humanos 29 4.3 Métodos 29 4.3.1 Preparação do extrato etanólico 29 4.3.2 Preparação da amostra teste 29 4.3.3 Meio de cultura 30 4.3.4 Atividade antibacteriana 30 4.3.5 Atividade hemolítica 30 4.3.6 Atividade anti-hemolítica ou fragilidade osmótica 30 4.3.7 Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante 31 4.3.8 Atividade oxidante e atividade antioxidante 31 4.3.9 Análise estatística 32 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 33 5.1 Atividade antibacteriana 33 5.2 Atividade hemolítica 34 5.3 Atividade anti-hemolítica ou fragilidade osmótica 36 5.4 Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante 38 5.5 Atividade oxidante e antioxidante 41 6 CONCLUSÃO 44 REFERÊNCIA 45 15 1 INTRODUÇÃO Desde o decorrer da história humana, as plantas vêm sendo utilizadas na alimentação e na busca da cura de diversas enfermidades. A medicina chinesa, por exemplo, foi desenvolvida através do estudo desses vegetais, através do isolamento dos princípios ativos, buscando entender seu mecanismo de ação (VIEGAS et al., 2006). No Brasil, plantas medicinais podem ser utilizadas em diversas formas, tanto in natura, com suas partes inteiras, ou na forma de preparos caseiros, como extratos brutos e infusos (MUSSI-DIAS et al., 2012). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) 80% da população dos países em desenvolvimento utilizam práticas tradicionais nos seus cuidados básicos de saúde e 85% usam plantas medicinais ou preparações destas (SOUZA, et al., 2013). Porém, apesar de serem naturais e utilizadas há séculos, não é possível garantir a segurança de seu uso e comprovar sua eficácia (TALALAY, 2001). Por isso, o interesse de pesquisadores e serviços de saúde vem crescendo cada vez mais e aumentando o investimento em pesquisas com esses produtos. Os responsáveis pelos efeitos terapêuticos apresentados pelas plantas medicinais são os princípios ativos (MONTANARI, 2002). Desta forma, todos os produtos derivados de plantas que são usados com finalidade terapêutica devem ser avaliados através de métodos idênticos àqueles usados para novos compostos sintéticos, a fim de garantir sua segurança e eficácia (TALALAY, 2001). Segundo a Agência de Vigilância Sanitária – ANVISA, são considerados medicamentos fitoterápicos “os obtidos com emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais cuja segurança e eficácia sejam baseadas em evidências clínicas e que sejam caracterizados pela constância de sua qualidade” (BRASIL, 2014). Pesquisas sobre as plantas medicinais que são utilizadas em uma comunidade podem trazer informações que viabilizem a composição de estudos farmacológicos, fitoquímicos e agronômicos a respeito dessas plantas (SOUZA et al., 2013). O extrato etanólico utilizado em nosso estudo é oriundo das cascas do caule do Ziziphus joazeiro Mart., uma árvore frondosa de porte mediano, pertencente à família Rhamnaceae, que cresce em tabuleiros áridos e pedregosos (TRIGUEIRO, 1981). Típica do nordeste brasileiro, tem suas folhas e cascas empregadas tradicionalmente na medicina popular da região, na forma de extrato aquoso para tratamento de problemas gástricos, de febres, alívio 16 da tosse, como anti-inflamatório, agente de limpeza dos cabelos e dos dentes e como medicamento para doenças de pele (LORENZI; MATOS, 2002). Visto a variedade de indicações terapêuticas atribuídas ao Z. joazeiro Mart., nosso estudo teve como finalidade avaliar a atividade antibacteriana, a citotoxicidade hemolítica, a propriedade hemaglutinante e anti-hemaglutinante e os efeitos oxidante e antioxidante, do extrato etanólico das cascas do caule dessa espécie. 17 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 Produtos naturais e sua importância A natureza é uma fonte rica de um diversificado conjunto de compostos farmacologicamente ativos que podem servir como estruturas básicas para o desenvolvimento de novas drogas (PROKSCH et al, 2002). Os produtos naturais têm sido a base principal para a descoberta de novos compostos e por milênios vêm sendo utilizados para o tratamento de inúmeras doenças (GHOSH; PLAYFORD, 2003). Sendo assim, muitos estudos contribuíram para a descoberta de drogas conhecidas no mercado, como o anticancerígeno paclitaxel, o analgésico morfina e o antibacteriano daptomicina. Morrison e Hergenrother (2013) relataram que desde 1960 até 2010, os produtos naturais ou derivados semissintéticos de produtos naturais serviram como fonte de 41% dos medicamentos anticancerígenos e 65% dos antibacterianos. Os produtos naturais podem ser classificados em três grupos: produtos naturais, produtos naturais semissintéticos ou derivados de produtos naturais (BUTLER, 2008). A maior vantagem da triagem de produtos naturais é a sua diversidade estrutural. Eles são relativamente pequenos (<1000 Da) e apresentam propriedades semelhantes às drogas e são capazes de serem absorvidos e metabolizados pelo organismo (HARVEY, 1999). Enquanto os medicamentos apresentam, em sua grande maioria, apenas um único princípio ativo (responsável pela sua propriedade farmacológica), os extratos derivados de produtos naturais são constituídos por misturas multicomponentes de substâncias ativas, parcialmente ativas e inativas, que, muitas vezes atuam em alvos farmacológicos diferentes (FERREIRA; PINTO, 2010). De acordo com alguns dados, a história da descoberta de drogas provenientes de produtos naturais tem sido bem sucedida (GULLO; HUGHES, 2005). Nos últimos 25 anos cerca de 30% dos novos fármacos aprovados são produtos naturais ou derivados destes, e no que se refere aos fármacos anticancerígenos, esse número passa para 42% (NEWMAN; CRAGG, 2007). Há um ressurgimento do interesse na utilização de produtos naturais pelo público em geral, que formam a base de uma indústria comercial muito lucrativa. Além disso, a indústria farmacêutica permanece estudando o potencial desses produtos para identificar novos fatores 18 de crescimento, imunomoduladores e antimicrobianos (GHOSH; PLAYFORD, 2003). As pesquisas realizadas com plantas medicinais envolvem várias etapas, como: investigações da medicina tradicional e popular (etnofarmacológico); isolamento, purificação e caracterização de princípios ativos (química orgânica, fitoquímica); investigações farmacológicas de extratos vegetais e constituintes químicos isolados (farmacologia); transformações químicas de princípios ativos (química orgânica sintética); estudo da relação estrutura/atividade e dos mecanismos de ação dos princípios ativos (química medicinal e farmacológica) e finalmente a operação de formulações para a produção de fitoterápicos (MACIEL et al, 2002). No Brasil, a utilização dos produtos naturais através da fitoterapia vem se adequando às necessidades de vários municípios no atendimento primário à saúde (ELDIN; DUNFORD, 2001). A expansão da fitoterapia deve-se, de uma forma geral, à preferência dos consumidores por tratamentos mais “naturais”; a crescente validação científica das propriedades farmacológicas existente nas espécies vegetais; o desenvolvimento de novos métodos analíticos para ter o controle de qualidade; o desenvolvimento de novas formas de preparações e administração dos produtos e o custo mais baixo (HOMAR, 2007). O interesse na diversidade molecular das plantas tem estimulado a busca pelo entendimento do seu metabolismo secundário, que é responsável pela síntese dos compostos vegetais com atividade biológica, dentre as quais estão propriedades medicinais, aromáticas e curativas (ALVES, 2001). Algumas pesquisas têm mostrado prescrições médicas nas quais os produtos naturais e drogas relacionadas são usados para tratar 87% de todas as doenças humanas (CHIN et al, 2006). Esses produtos representam uma esperança na prevenção contra a carcinogênese, atuando através da sua atividade antioxidante e suprimindo a oncogênese mediada por espécies reativas do oxigênio, já que o estresse oxidativo é a chave moduladora na indução da carcinogênese humana (ZIECH et al, 2012). Apesar de todos os benefícios, a toxicidade de plantas medicinais é algo que merece atenção, pois efeitos adversos dos fitomedicamentos, possíveis adulterações e toxidez, assim como sua interação com outras drogas podem ocorrer e levar o usuário a óbito. Portanto, todos os produtos que são derivados de plantas e usados como drogas devem ser avaliados para que se garanta a segurança e eficácia por métodos idênticos àqueles usados para novos compostos sintéticos (TALALAY, 2001). 19 2.2 Ziziphus joazeiro Mart. O Ziziphus joazeiro Mart. (= Ziziphus guaranitica Malme; Ziziphus gardeni Reissek) está classificado taxonomicamente como uma espécie vegetal pertencente à divisão Magnoliophyta, classe Magnoliopsida, ordem Rhamnales, família Rhamnaceae e gênero Ziziphus (CARVALHO, 2007). O gênero Ziziphus Mill. possui cerca de 100 espécies amplamente distribuídas pelo mundo (Figura 1) dentre as quais está o Ziziphus joazeiro Mart. espécie nativa do Brasil cuja distribuição está compreendida em todo o Nordeste, com grande ocorrência no bioma Caatinga e em Minas Gerais (SILVA et al., 2011). Conhecido popularmente por juá, juazeiro ou laranjeira-do-vaqueiro, o Z. joazeiro Mart. é uma árvore frondosa (Figura 2) de porte mediano, podendo atingir até 16 metros de altura, seu tronco pode chegar a 30-50 cm de diâmetro, possui ramos armados com fortes espinhos, flores pequenas amarelo-esverdeadas e fruto drupáceo (Figura 3) com caroço grande envolto por polpa branca e mucilaginosa (LORENZI; MATOS, 2002). Sua casca tem espessura de até 14 mm, a parte externa é de cor cinza-escuro a levemente castanho e a parte interna é amarelada (CARVALHO, 2007). Suas folhas medem de 3 cm a 10 cm de comprimento por 2 cm a 6 cm de largura, com três a cinco nervuras inferiormente pubescentes, partindo da base. Essa espécie possui a capacidade de sobreviver nos períodos de seca, pois é uma árvore perenifólia, característica decorrente de seu amplo sistema de raízes. Portanto, o Z. joazeiro Mart. é, muitas vezes, uma importante fonte de água e alimentos para os animais da região (CARTAXO et al, 2010). Figura 1. Distribuição geográfica do gênero Ziziphus representados pelos pontos amarelos. Fonte: www.discoverlife.org. 20 Figura 2. Ziziphus joazeiro Mart.: aspecto geral. Fonte: http://www.cnpf.embrapa.br/publica/circtec/edicoes/Circular139.pdf Figura 3. Folhas (A) e frutos (B) do Z. joazeiro Mart. Fonte: Lorenzi, Matos, 2002. Quanto à composição química, é citada a presença dos triterpenoides, ácido betulínico e lupeol, do alcaloide anfibina-D além de grande riqueza em saponinas, os jujubosídeos (ESTEVAM, 2012). Em um ensaio fitoquímico para detectar as principais classes de metabólitos secundários presentes no extrato das folhas e cascas de Ziziphus joazeiro Mart., verificou-se uma maior presença de fenóis, flavonoides, esteroides e terpenoides nas cascas dessa espécie (SILVA; LIMA, 2010). 21 Sabe-se que os triterpenos atuam como bactericida, antivirótico, cicatrizante, analgésico, relaxante, expectorante e antiespasmódico, e os taninos possuem uma ação adstringente e antimicrobiana (PAIVA-MARTINS et al, 1995) e atuam também como sequestradores de radicais livres que interceptam o oxigênio ativo formando radicais estáveis (MELLO; SANTOS, 2001). Os flavonoides além de desempenharem funções biológicas como a defesa a herbivoria, também desempenham atividades farmacológicas, nas quais as principais são a antioxidante, antidiabética e hipocolesterolemiante (HARBORNE; WILLIAMS, 2000). As saponinas são referidas como glicosídeos triterpênicos ou esteroides e muitas delas têm sido isoladas de plantas para estudos com interesses fitoquímicos (produção de espumas, emulsificação e solubilização) e biológicos (potencial hemolítico, antimicrobiano e inseticida); propriedades que são exploradas comercialmente em aplicações farmacêuticas e biorremediações (RIBEIRO et al, 2013). Na entrecasca da planta é relatada a presença de ácido betulínico, ácido oleanólico e saponina (SILVA et al, 2011). De acordo com Oliveira et al. (2003), a cera epicular das folhas do Z. joazeiro Mart é bastante rica em n-alcanos, cuja função é reter água na planta, e triterpenoides (lupeol, beta-amirina, epifriedelinol e ácido ursólico). Na cultura popular o Z. joazeiro Mart. apresenta vasto uso para o tratamento de problemas de pele, como dermatites e micoses (CRUZ et al., 2007). A planta inteira também possui diversos usos medicinais como antisséptico bucal, contra problemas do sistema digestório (estomatite, úlceras gástricas, má-digestão e constipação) e do sistema respiratório (ALBUQUERQUE et al, 2007), também sendo relatado seu uso como cicatrizante por Almeida et al (2005). De acordo com Kato (1998), as folhas e o córtex do caule são ricos em saponinas, tendo sua utilização na forma de xampu anticaspa e na lavagem de vidros e tecido de algodão. 2.3 Relevância da atividade antibacteriana Uma das características das bactérias é a capacidade genética de adquirir e transmitir resistência às drogas que são utilizadas nos tratamentos de enfermidades e devido ao uso indiscriminado de agentes antimicrobianos, essa resistência tem aumentado (COHEN, 1992). Dessa forma, com o surgimento frequente de novas doenças e o desenvolvimento da 22 resistência a drogas, tornou-se necessária a busca por agentes que possuam atividade antimicrobiana e, assim, promover o desenvolvimento de novos fármacos (FLORENCE, 2008). Então, as estratégias encontradas para minimizar esse problema envolvem o controle na utilização dos antibióticos, um melhor entendimento do mecanismo genético de resistência, assim como a pesquisa e o desenvolvimento de novos medicamentos de origem natural ou sintética (NASCIMENTO et al, 2000). Diante dessa realidade, os pesquisadores vêm buscando novas substâncias tóxicas para as bactérias, a fim de que funcionem como antimicrobianas, a partir de várias fontes como as plantas medicinais. Sendo assim, a triagem de extratos de plantas, como de compostos sintetizados no metabolismo secundário, tentando evidenciar a presença de novos compostos com atividade antimicrobiana é uma potencial fonte para medicamentos mais efetivos (KARAMAN et al, 2003). 2.3.1 As bactérias As bactérias são organismos classificados em Gram negativos ou Gram positivos de acordo com as diferenças na estrutura da parede celular. A parede das bactérias Gram positivas apresenta várias camadas de peptidioglicano, um polissacarídeo que forma uma rede através de ligações cruzadas entre seus aminoácidos. Já nas bactérias Gram negativas a parede celular contém apenas uma camada de peptidioglicano e uma membrana externa complexa, composta de lipopolissacarídios, lipoproteínas e proteínas. A variação na sensibilidade a substâncias exógenas advém das modificações na permeabilidade da parede celular, que por sua vez, se originam das diferenças estruturais. Normalmente as bactérias Gram positivas são mais sensíveis aos antimicrobianos do que as Gram negativas (MADIGAN; MARTINKO, 2004). Algumas bactérias de importância clínica são as espécies: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus: Bacillus subtilis: é uma bactéria Gram positiva pertencente à família Baccillaceae. As células têm forma de bacilos grandes, geralmente móveis, formando esporos que lhes conferem a capacidade de sobreviver em condições desfavoráveis. É uma saprófita comum do solo e da água, porém algumas espécies, acidentalmente provocam infecções (TRABULSI, 2004). 23 Escherichia coli: é um bacilo Gram negativo pertencente à família das Enterobacteriaceaee, aeróbias ou aeróbias facultativas (HOLT et al., 1994). A E. coli é um patógeno gastrointestinal versátil que pode estar envolvido na diarreia infantil, também pode causar infecções no trato urinário de pessoas mais velhas ou naquelas cuja resistência está diminuída devido a cirurgias ou exposição à radiação ionizante. As linhagens enteropatogênicas de E. coli estão freqüentemente envolvidas nas infecções semelhantes à disenteria e febres generalizadas (TORTORA, 2005). Pseudomonas aeruginosa: caracteriza-se como bastonete Gram negativo linear ou ligeiramente curvo, aeróbio estrito, podendo ser observado como células isoladas, aos pares, ou em cadeias curtas, revelando mobilidade através de flagelo polar. Esta bactéria se comporta como um patógeno oportunista iniciando infecções em indivíduos com baixa resistência e frequentemente está associada com infecções do trato respiratório, urinário e lesões na pele resultantes de queimaduras graves ou outros traumatismos. É comumente encontrada no ambiente hospitalar e pode infectar facilmente os pacientes que estão recebendo tratamento para outras doenças (MADIGAN; MARTINKO, 2004). Staphylococcus aureus: pertence à família Staphylococcaceae e se apresentam como cocos Gram positivos que formam grupos com aspecto de cachos de uvas com cor amarelada, devido à produção de carotenóides. S. aureus tem uma grande importância clínica uma vez que é a principal causa de infecções hospitalares adquiridas nos berçários, em cirurgias e em procedimentos médicos invasivos. Algumas linhagens têm se mostrado muito resistentes a vários antibióticos (HOLT et al., 1994). 2.4 Atividade hemolítica e anti-hemolítica O eritrócito é um tipo de célula que possui altas concentrações de ácidos graxos polinsaturados, oxigênio molecular e íons ferro no estado ligado (NIKI et al., 1991), fazendo com que sua membrana celular fique muito vulnerável a reações envolvendo radicais livres e que também fique muito susceptível a hemólise. Este evento pode ser correlacionado diretamente com o efeito tóxico das substâncias testadas. Dessa forma, os eritrócitos podem ser utilizados como um modelo experimental in vitro com a finalidade de investigar os efeitos tóxicos e protetores de uma grande variedade de substâncias (BRANDÃO et al., 2006). 24 A detecção da atividade citotóxica é uma das medidas primordiais, visto que vários compostos químicos podem ter a capacidade de causar efeitos tóxicos e modificar a informação genética contida no DNA. Portanto, a obtenção de dados sobre a toxicidade desses agentes deve ser assegurada por experimentos que forneçam, com uma razoável margem de segurança, indicações sobre os riscos envolvidos na sua utilização (BENIGNI, 2005). A avaliação citotóxica através da quantificação da hemólise é um modelo simples para estudar o efeito tóxico ou protetor de uma grande variedade de substâncias ou situações que são associadas ao estresse oxidativo (LEXIS et al., 2006). A capacidade de resistência à hemólise é caracterizada pelo teste de fragilidade osmótica eritrocitária – FOE, que avalia a influência qualitativa de substâncias sobre os eritrócitos (MOUSINHO et al., 2008) e expressa a habilidade das membranas manterem sua integridade estrutural quando expostas a um estresse osmótico (ALDRICH, SAUNDERS, 2006). Essa osmolaridade com que a célula sofre a lise está relacionada a fatores intrínsecos e extrínsecos, dos quais se destacam como valores intrínsecos a razão área/volume, forma e tamanho celular, espécie e propriedades inerentes às membranas (MAEDE, 1980). A avaliação da estabilidade de membranas pode ser realizada através da quantificação da FOE (RODRIGUES et al., 2009). Esta quantificação é frequentemente usada no diagnóstico de hemoglobinopatias, principalmente esferocitoses, na avaliação do efeito de drogas sobre a hematopoiese (SIRICHOTIYAKUL et al., 2004) e na identificação de alterações de membrana em portadores de câncer cervical e de apnéia obstrutiva do sono (OZTÜRK et al., 2003). 2.5 Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante As disfunções na coagulação sanguínea estão associadas com a inflamação, complicações cardiovasculares, câncer, trombose venosa, tromboembolismo e outras patologias. Estudos na disfunção da coagulação, como a atividade hemaglutinante e antihemaglutinante, são necessários devido aos efeitos indesejáveis da heparina e ao entendimento da patofisiologia e do estado de hipercoagulação. (AZEVEDO et al, 2009) A heparina não fracionada e as heparinas de baixo peso molecular são os únicos polissacarídeos sulfatados que normalmente são utilizados como agentes anticoagulantes. Porém, esses compostos têm vários efeitos colaterais tais como hemorragia e 25 trombocitopenia. Além disso, há uma procura crescente por terapias contra a trombose o que indica a necessidade de buscar fontes alternativas de agentes anticoagulantes (AZEVEDO et al., 2009). 2.6 Atividade oxidante e antioxidante Sabe-se que o metabolismo normal acarreta a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), responsáveis por desempenhar funções in vivo, como a produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular e na sinalização entre as células (ROTH, 1997). Porém, uma alta produção de EROs pode provocar a oxidação de biomoléculas como proteínas, aminoácidos, lipídios e DNA, levando a danos celulares e a morte (IGNARO, et al., 1999), além de ter ligação com o desenvolvimento da asma, inflamação, artrite, neurodegeneração, doença de Parkinson, síndrome de Down e da demência (PERRY, et al., 2000). Por isso, existe um grande interesse em antioxidantes naturais provenientes de espécies vegetais, já que dados epidemiológicos vem sugerindo o seu efeito protetor frente a diversas doenças (LEONARD, et al., 2002). A principal função do sangue é transportar os gases respiratórios, O2 e CO2, entre os tecidos e os pulmões através da hemoglobina; e para mantê-la como oxihemoglobina - forma reduzida e funcional da proteína - os eritrócitos contêm enzimas responsáveis pela produção de energia (SIEMS; SOMMERBURG; GRUNE, 2000). Entretanto, o íon ferro da hemoglobina está continuamente exposto a altas concentrações de oxigênio, resultando na sua lenta oxidação a metahemoglobina (MetHb) ou ferrihemoglobina, que por sua vez, é incapaz de se ligar ou transportar oxigênio. Em condições normais o nível de MetHb nos eritrócitos é mantido abaixo de 1% da hemoglobina total (MANSOURI; LURIE, 1993). Os eritrócitos humanos constituem um poderoso sistema que pode ser utilizado como um modelo experimental in vitro para investigar o potencial antioxidante de extratos vegetais a partir da quantificação da metHb que é formada (CLARO et al., 2005; ARBOS et al. 2008). A formação de metHb in vivo pode ser reproduzida in vitro pela exposição de uma suspensão de eritrócitos a um agente oxidante e a quantidade de metHB formada está diretamente relacionada com a extensão do stress oxidativo causado pelo agente. Da mesma forma, a exposição de eritrócitos a agentes antioxidantes presentes em misturas complexas, tais como os extratos vegetais, podem evitar a formação de metHb (MANSOURI; LURIE, 1993). 26 Os antioxidantes são substâncias que previnem ou retardam a oxidação de lipídios ou outras moléculas ao inibirem o início ou propagação da reação de oxidação em cadeia (LIMA et al, 2006). Portanto, a efetividade do extrato em inibir a formação de metHb na presença de um agente oxidante pode ser utilizada como a medida da sua atividade antioxidante (CLARO et al., 2005; ARBOS et al. 2008). 27 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar os efeitos biológicos do extrato etanólico das cascas do caule do Ziziphus joazeiro Mart. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar a atividade antibacteriana frente a bactérias Gram positivas e Gram negativas de importância clínica; Avaliar o potencial citotóxico e citoprotetor através da atividade hemolítica e antihemolítica em eritrócitos humanos dos tipos A, B e O; Avaliar a atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante em eritrócitos humanos dos tipos A e B; Avaliar a atividade oxidante e antioxidante em eritrócitos humanos do tipo O. 28 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Local da pesquisa As atividades desta pesquisa foram realizadas no Laboratório de Bioquímica, Genética e Radiobiologia (BioGeR-Lab) do Departamento de Biologia Molecular da Universidade Federal da Paraíba (UFPB). 4.2 Material 4.2.1 Material botânico Foram utilizadas as cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart., coletadas na cidade de Passira, estado de Pernambuco, cuja identificação botânica foi realizada no Herbário UFP Geraldo Mariz da Universidade Federal de Pernambuco, onde uma excicata encontra-se depositada sob o número de registro 48.432. Figura 4. Cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. Fonte: Rayanne Maciel Vilarim. 29 4.2.2 Linhagens bacterianas As linhagens bacterianas, oriundas da CCT – Coleção de Culturas Tropicais e ATCC – American Type Culture Colection, utilizadas foram: Bacillus subtilis CCT 0516 Escherichia coli ATCC 2536 Escherichia coli ATCC 10536 Pseudomonas aeruginosa ATCC 8027 Pseudomonas aeruginosa ATCC 25619 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Staphylococcus aureus ATCC 25925 4.2.3 Eritrócitos humanos Os eritrócitos humanos (A, B, O) foram oriundos de bolsas contendo concentrado de eritrócitos que não poderia mais ser utilizado para transfusão, obtido na Unidade Transfusional do Hospital Universitário Lauro Wanderley/UFPB. A manipulação e o descarte dos eritrócitos foram realizados de acordo com as Normas de Segurança seguidas pela referida Unidade. Os procedimentos experimentais foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba (CEP-CCS Nº 493764). 4.3 Métodos 4.3.1 Preparação do extrato etanólico Adicionou-se 100 g de casca do Z. joazeiro Mart. em etanol a 70% por 72 horas. No 1º dia o volume de etanol foi de 400 mL, no segundo, o volume foi de 300 mL, e no terceiro dia, o volume foi de 200 mL. Após as 72 horas, a amostra foi filtrada para retirar os resíduos, e em seguida colocada no rotavapor. A quantidade do extrato etanólico produzida foi de 18,26g. 4.3.2 Preparação da amostra teste A amostra foi preparada solubilizando-se 10 mg do extrato em 1 mL de água destilada. Para a atividade antibacteriana, a esterilidade da amostra foi obtida após a sua filtração em filtro de nitrocelulose (0,22 μm). 30 4.3.3 Meio de cultura O meio de cultura utilizado foi o Luria Bertani (LB) : extrato de levedura (DIFCO) 10 g, triptona (DIFCO) 5 g, NaCl (VETEC) 10 g para 1 L. Após preparado, o meio foi esterilizado por autoclavação a 120 ºC, 1 atm por 20 minutos. 4.3.4 Atividade antibacteriana A triagem para verificar a presença de atividade antibacteriana da amostra frente às linhagens de bactérias Gram negativas e Gram positivas foi realizada pelo método de incubação em 2 mL do caldo Luria Bertani (LB), na presença do EETOH (1000 μg/mL, 100 μg/mL, 10 μg/mL e 1 μg/mL) e 10 μL das linhagens bacterianas. em triplicata. Em seguida, foi realizada a incubação por 18 horas a 37 ºC. Decorrido este tempo, o crescimento bacteriano foi avaliado através da turvação apresentada pelo meio de cultura. O teste foi realizado em triplicata. 4.3.5 Atividade hemolítica Os eritrócitos foram centrifugados a 2500 rpm por 5’ e ressuspensos em NaCl 0,9%. Este procedimento foi repetido 3 vezes. Várias concentrações do EETOH (1 μg, 10 μg, 100 μg e 1000 μg) foram adicionadas a 4 mL de uma suspensão de eritrócitos 0,5% (v/v) em NaCl 0,9%. Estas foram incubadas a 25 ± 2 °C por 1 h e centrifugadas a 2500 rpm por 5’ novamente. O sobrenadante foi avaliado por espectrofotometria (540 nm) para constatar a hemólise. A hemólise total foi obtida com Triton X-100 e a porcentagem de hemólise foi calculada em relação a esse valor (RANGEL et al., 1997). Este experimento foi realizado em triplicata e os resultados foram expressos como porcentagem da média aritmética simples. 4.3.6 Atividade anti-hemolítica ou fragilidade osmótica Os eritrócitos foram centrifugados a 2500 rpm por 5’ e ressuspensos em NaCl 0,9%. Esse procedimento foi repetido 3 vezes. Em seguida, foram adicionados 100 μg/mL e 10 μg/mL do EETOH a 4 mL de uma suspensão de eritrócitos 0,5% (v/v) em NaCl 0,9%. Estas foram incubadas a 25 ± 2 °C por 1 h e centrifugadas novamente. Desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se os eritrócitos em 2 ml de NaCl nas seguintes concentrações: 0,12%; 0,24%; 31 0,36%; 0,48%; 0,60%; 0,72%; 0,84% e 0,96%. Estas foram incubadas a 25 ± 2 °C por 1 h e centrifugadas novamente. O sobrenadante foi submetido à espectrofotometria (540 nm) para caracterizar a atividade anti-hemolítica. As atividades hemolítica e anti-hemolítica foram realizadas em triplicatas e os resultados foram expressos como média aritmética simples. 4.3.7 Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante A amostra, nas concentações de 1 μg/mL e 10 μg/mL, foi diluída em NaCl 0,9% e adicionada a suspensões de eritrócitos 5% (1 mL). Após um período de incubação de 30 minutos, sob agitação lenta (100 rpm) e a temperatura ambiente, foram adicionados, em preparações diferentes, uma gota (50 μL) dos anticorpos monoclonais IgM específicos para os antígenos A e B (BIORAD). Este experimento foi realizado em triplicata e os resultados foram observados a olho desarmado. 4.3.8 Atividade oxidante e atividade antioxidante Para investigar o potencial oxidante das amostras, diferentes concentrações (1 μg, 10 μg, 100 μg e 1000 μg) do mesmo foram diluídas em PBS (11,35 g NaH2PO4.2H2O; 24,36 g Na2HPO4 e 7,18 g NaCl para 1 L; pH 7,4) suplementado com glicose (200 mg/dL), pH 7,6 e adicionadas a suspensões de eritrócitos (1 mL). Após um período de incubação de 1 h, sob agitação lenta e constante (100 rpm) a 22 ± 2 °C, as amostras foram centrifugadas a 2500 rpm durante 5 minutos e a porcentagem de metahemoglobina (metHb) em relação a hemoglobina (Hb) total foi quantificada por espectrofotometria a 630 nm e 540nm. Para determinar o potencial antioxidante, após a incubação das amostras nas diferentes concentrações por 1 h, foi adicionado um agente oxidante, a fenilhidrazina (Ph) 1 mmol/L (SIGMA). As suspensões foram aeradas e mantidas sob agitação lenta e constante (100 rpm) por mais 20 minutos a 22 ± 2 °C. Decorrido este tempo, as amostras foram centrifugadas a 2500 rpm durante 5 minutos, e o sobrenadante diluído em tampão fosfato (9 g Na2HPO4.12H2O, 5,7 g KH2PO4 para 1 L) e a porcentagem de metHb em relação a Hb total foi quantificada por espectrofotometria a 630 nm e 540 nm. A incubação dos eritrócitos na presença de PH gera radicais livres que resultam na formação de altos níveis de 32 metemoglobina (metHb) que estarão diretamente relacionados com a extensão do estresse oxidativo produzido (ARBOS et al, 2008). Os valores de metHb entre 1,5 e 2,0% foram considerados normais enquanto que valores acima de 5% foram considerados elevados (CAMARGO et al., 2007). A porcentagem de metHb formada foi comparada com os valores obtido, através da literatura, para a vitamina C (20 mmol/L), um comprovado agente antioxidante (ARBOS et al, 2008). Este experimento foi realizado em duplicata com o sangue do tipo O. 4.3.9 Análise estatística Todos os dados foram analisados pelo teste “t” Pareado através do programa GraphPad Prism versão 5.01. O nível de significância de 5% foi adotado para comparar dados de um mesmo experimento. Dessa forma, foi adotado como significativas as diferenças que geram p<0,05. Os resultados apresentados corresponderam o percentual da média aritmética simples. 33 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Atividade antibacteriana O extrato etanólico das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. não foi capaz de inibir o crescimento das linhagens de bactérias Gram positivas e Gram negativas testadas: E. coli ATCC 2536, E. coli ATCC 10536, P. aeruginosa ATCC 8027, P. aeruginosa ATCC 25619, S. aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 25925 e B. subtilis TCC 0516, pois foi visualizada a turvação do meio. Um resultado semelhante foi encontrado no estudo realizado por Silva et al. (2011), no qual o extrato das cascas do Ziziphus joazeiro Mart. não apresentou atividade inibitória contra a Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa testadas. No estudo realizado por Melo et al. (2012), a atividade antimicrobiana do extrato hidroalcoólico das cascas de Z. joazeiro Mart. foi testada frente a bactérias como Staphylococcus aureus (ATCC6538), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Bacillus subtilis (ATCC 6633) e outras espécies, através do método de difusão em ágar Mueller-Hinton. Diferentemente do nosso resultado, o extrato hidroalcoólico produziu atividade antimicrobiana contra Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa, apresentando halo de inibição de 12 mm de diâmetro. Em estudos realizados por Alviano et al. (2008) o extrato aquoso da entrecasca de Z. joazeiro Mart. apresentou atividade contra a Prevotella intermédia, Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus mutan e Lactobacillus casei, bactérias da microbiota oral que estão associadas a doenças peridentais. Nunes et al. (1987) avaliaram a atividade antipirética do extrato aquoso das cascas dessa espécie em coelhos infectados com a endotoxina de E.coli e relataram que ocorreu uma diminuição significativa da febre nos animais através da administração oral da infusão. Trabalhos com outras espécies de Ziziphus sobre a atividade antimicrobiana são citados na literatura. Em um estudo com a espécie Ziziphus spinachristi, Ali-Shtayeh et al. (1998) observaram atividade antimicrobiana frente a bactérias como E. coli, P. aeruginosa, S. aureus, dentre outras. De acordo com Melo et al. (2012), “vários fatores podem interferir na atividade biológica de extratos vegetais, principalmente o local e o período da coleta e tipos de solventes utilizados para a extração”; o que nos leva a crer que o tipo de extrato, o método escolhido para a atividade antimicrobiana e as linhagens utilizadas podem proporcionar um resultado diferente. 34 5.2 Atividade hemolítica O extrato etanólico do Z. joazeiro Mart. não exerceu atividade hemolítica nas concentrações de 1 μg/mL, 10 μg/mL e 100 μg/mL frente aos eritrócitos do tipo sanguíneo A e O, exceto na maior concentração, 1000 μg/mL, na qual a hemólise foi de 100% nos eritrócitos testados (Gráficos 1 e 2). Já nos eritrócitos do tipo sanguíneo B, o extrato não exerceu atividade hemolítica apenas nas concentrações de 1 μg/mL e 10 μg/mL, apresentando hemólise maior que 100% na concentração de 100 μg/mL; e hemólise de 100% na concentração de 1000 μg/mL (Gráfico 3). Através do resultado encontrado, percebe-se que em baixas concentrações, o EETOH das cascas do caule de Z. joazeiro não possui a capacidade de causar danos na membrana eritrocitária dos três tipos sanguíneos do sistema ABO. Isto é bastante relevante, visto que os eritrócitos têm um papel importante no transporte de gases (O² E CO²) e também no controle da formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) no organismo (IGNARO, et al., 1999) Um resultado similar foi encontrado no experimento realizado por Silva e Lima (2010), no qual o efeito hemolítico dos extratos do juazeiro foi avaliado em cultura de eritrócitos de camundongos (2%), em que foi encontrada a ausência de atividade hemolítica dos extratos brutos e subfrações das cascas e folhas em concentrações abaixo de 200 μg/mL. SANGUE A Hemólise % 150 100 50 µg 10 00 10 0µ g 10 µg 1µ g 0 Concentração (g) Gráfico 1. Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo A (n=3) na presença do extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL e 1000 μg/mL) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. As colunas representam o percentual da média simples. 35 Sangue O Hemólise % 150 100 50 µg 10 00 10 0 g g 10 1 g 0 Concentração (g) Gráfico 2. Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo O (n=3) na presença do extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL e 1000 μg/mL) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. As colunas representam o percentual da média simples. Sangue B Hemólise % 15 10 5 µg 10 00 10 0 g g 10 1 g 0 Concentração (g) Gráfico 3. Porcentagem de hemólise em eritrócitos do tipo sanguíneo B (n=3) na presença do extrato etanólico (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL e 1000 μg/mL) das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. As colunas representam o percentual da média simples. 36 5.3 Atividade anti-hemolítica ou fragilidade osmótica O EETOH das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. apresentou atividade antihemolítica na concentração de 100 μg/mL nos eritrócitos do tipo A e O; e na concentração de 10 μg/mL nos eritrócitos do tipo B. À medida que as soluções ficam mais hipotônicas, o resultado esperado seria a ocorrência da hemólise próxima a hemólise total (controle positivo). Porém, o extrato etanólico na presença da solução hipotônica (12% de NaCl), conseguiu reduzir a hemólise, que deveria ser de 100%, em todos os tipos sanguíneos testados (gráficos 4, 5 e 6). Sangue A Hemólise % 100 50 co nt r ol e po si tiv o 0, 12 0, 24 0, 36 0, 48 0, 60 0, 72 co nt 0, 84 ro le ne 0,9 ga 6 tiv o 0 NaCl (%) Gráfico 4. Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. frente a eritrócitos do tipo sanguíneo A. Controle positivo = eritrócitos + Triton X-100; Controle negativo = eritrócitos em salina. Resultado expresso como percentual da média simples. 37 Sangue B Hemólise (%) 100 50 co nt r ol e po si tiv o 0, 12 0, 24 0, 36 0, 48 0, 60 0, 72 co nt 0, 84 ro le ne 0,9 ga 6 tiv o 0 NaCl (%) Gráfico 5. Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. Frente a eritrócitos do tipo sanguíneo B. Controle positivo = eritrócitos + Triton X-100; Controle negativo = eritrócitos em salina. Resultado expresso como percentual da média simples. Sangue O Hemólise (%) 100 50 0 vo 12 24 36 48 60 72 84 96 vo iti 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, ati s g po ne e l e l ro ro nt nt o o c c NaCl (%) Gráfico 6. Atividade anti-hemolítica do extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. Frente a eritrócitos do tipo sanguíneo O. Controle positivo = eritrócitos + Triton X-100; Controle negativo = eritrócitos em salina. Resultado expresso como percentual da média simples. 38 A fragilidade osmótica eritrocitária (FOE) avalia a influência qualitativa de substâncias sobre os eritrócitos (MOUSINHO et al., 2008) e expressa a habilidade das membranas manterem sua integridade estrutural quando expostas a um estresse osmótico (ALDRICH, 2006). O EETOH das cascas do caude de Z. joazeiro Mart., na concentração de 100 μg/mL, apresentou atividade anti-hemolítica, não exercendo, portanto, efeito tóxico sobre o funcionamento da membrana que manteve sua integridade estrutural quando submetida a um estresse omótico. Esses dados são inéditos quando consideramos a utilização da metodologia e o produto avaliado. 5.4 Atividade hemaglutinante e anti-hemaglutinante Os eritrócitos do tipo sanguíneo A+ não apresentaram hemaglutinação nas concentrações de 1 μg/mL e 10 μg/mL de Z. joazeiro Mart. (Figura 5). Na atividade antihemaglutinante, o extrato foi capaz de impedir a hemaglutinação na concentração de 10 μg/mL ao se comparar ao controle positivo (Figura 6). No tipo sanguíneo B+, foram encontrados os mesmos resultados para ambas atividades: não ocorreu hemaglutinação nas concentrações testadas (Figura 7) e na concentração de 10 μg/mL de Z. joazeiro Mart, a substância foi capaz de impedir a hemaglutinação (Figura 8). Figura 5. Atividade hemaglutinante com o tipo sanguíneo A+. C-: controle negativo (eritrócitos); C+: controle positivo (eritrócitos + anti-A). Fonte: Rayanne Maciel Vilarim. 39 Figura 6. Atividade anti-hemaglutinante com o tipo sanguíneo A+. C-: controle negativo (eritrócitos); C+: controle positivo (eritrócitos + anti-A). Fonte: Rayanne Maciel Vilarim. Figura 7. Atividade hemaglutinante com o tipo sanguíneo B. C-: controle negativo (eritrócitos); C+: controle positivo (eritrócitos + anti-B). Fonte: Rayanne Maciel Vilarim. 40 Figura 8. Atividade anti-hemaglutinante com o tipo sanguíneo B. C-: controle negativo (eritrócitos); C+: controle positivo (eritrócitos + anti-B). Fonte: Rayanne Maciel Vilarim. O extrato etanólico das cascas do caule de Z. joazeiro Mart. na concentração de 10 μg/mL tem atividade anti-hemaglutinante frente aos grupos sanguíneos A e B. Este resultado é importante, pois o EETOH pode servir como ferramenta no tratamento de algumas disfunções na coagulação sanguínea. Este resultado é inédito quando consideramos a utilização da metodologia e o produto avaliado. 41 5.5 Atividade Oxidante e atividade antioxidante A quantidade de metahemoglobina formada na ausência (controle negativo) e na presença do extrato etanólico de Z. joazeiro, em todas as concentrações testadas (1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL e 1000 μg/mL) não retratou uma diferença significativa em comparação ao controle negativo, ou seja, ele não causou a oxidação da hemoglobina humana (Gráfico 7). Quando colocado frente a um agente oxidante (fenilhidrazina), o extrato impediu a oxidação da hemoglobina, obtendo uma baixa quantidade de metHb produzida (Gráfico 8). Oxidante metHb (%Hb) 150 100 50 + C 10 00 10 0 1 10 C - 0 [EEtOH Z. joazeiro] g/mL Gráfico 7. Efeito oxidante do EETOH das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. na formação de MetHb em eritrócitos humanos (n=2) do tipo sanguíneo O. As colunas representam o percentual da média de formação da MetHb. Teste “t”, p<0,05. 42 Antioxidante metHb (%Hb) 150 100 50 0 C - PH + 1 1 PH + 0 PH PH + + 0 00 10 10 C + [EEtOH Z. joazeiro] g/mL Gráfico 8. Efeito antioxidante do EETOH das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. na proteção da formação de MetHb em eritrócitos humanos (n=2) do tipo sanguíneo O. As colunas representam o percentual da média de formação da MetHb. Teste “t”, p<0,05. O EETOH das cascas do caule de Z. joazeiro Mart., nas concentrações testadas, demonstrou ser um agente antioxidante mais eficaz do que a vitamina C, que protege os eritrócitos em 52,7% na presença da fenilhidrazina (ARBOS et al, 2008). Este é um resultado importante, pois a oxidação da hemoglobina leva a formação de radicais livres, que por sua vez, podem causar danos às células e sistemas do organismo humano (SIEMS, 2000). O resultado encontrado corrobora outros dados da literatura nos quais espécies do gênero Ziziphus exercem atividade antioxidante. Silva et al. (2011) utilizaram o método de captação pelo DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil) para avaliar a atividade antioxidante das cascas e folhas de Ziziphus joazeiro Mart. O DPPH é um radical livre que pode aceitar um elétron ou radical hidrogênio para tornar-se uma molécula diamagnética estável (SILVA, 2009). Nesse estudo os autores verificaram que o extrato bruto da casca e folhas do Z. joazeiro apresentou atividade antioxidante, sendo a das folhas cerca de 400 vezes maior que a das cascas; fato devido provavelmente ao alto teor de taninos presentes nessa espécie. Alviano et al. (2008), também utilizando o método do DPPH, avaliou a atividade antioxidante de Z. joazeiro e verificou que o extrato etanólico da entrecasca apresentou alto potencial antioxidante e baixa toxicidade. 43 Outras espécies do gênero têm demonstrado possuir atividade antioxidante. Um exemplo é a pesquisa desenvolvida por Afolayan e Olajuyigbe (2011), na qual foram utilizados os extratos etanólico, extrato de acetona e extrato aquoso das cascas do Ziziphus mucronata Willd. e todos exerceram atividade antioxidante, sendo o extrato etanólico apresentando a maior atividade. O resultado foi atribuído à presença dos compostos fenólicos. Outra espécie do mesmo gênero foi utilizada por Chen et al. (2014) para tratar uma cultura de astrócitos com o extrato aquoso de Ziziphus jujuba Fruit (Jujube). O resultado encontrado foi que o extrato dessa planta atuou sobre a regulação da expressão de fatores neurotróficos e enzimas responsáveis pela propriedade antioxidante. Por fim, uma pesquisa realizada por Benammar et al. (2010) com o extrato aquoso da polpa, sementes, folhas, raiz e caule de Ziziphus lotus L. (Desf.) também demonstrou atividade antioxidante de todas essas partes, e o caule teve melhor resultado. Tendo em vista os resultados obtidos, sugere-se que o extrato etanólico das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart. possua efeito citoprotetor, anti-hemaglutinante e antioxidante. 44 6 CONCLUSÃO A partir da investigação dos efeitos biológicos ocasionados pelo extrato etanólico das cascas do caule de Ziziphus joazeiro Mart., frente a células procarióticas e eucarióticas, podese concluir que: O extrato etanólico não apresentou atividade antibacteriana frente às linhagens Gram positivas e Gram negativas testadas. O extrato etanólico não induziu hemólise até a concentração de 100 µg/mL, nos sangues dos tipos A e O, portanto não causou danos à membrana celular desses eritrócitos humanos, bem como não apresentou citotoxicidade. Enquanto que para o tipo sanguíneo B, o extrato etanólico não induziu hemólise até a concentração de 10 µg/mL. O extrato etanólico das cascas do caule de Ziziphus joazeiro apresentou efeito sobre os eritrócitos humanos dos tipos sanguíneos A, B e O submetidos a estresse osmótico, protegendo a membrana celular. O EETOH não apresentou efeito aglutinante frente aos eritrócitos dos tipos sanguíneos A e B, entretanto, apresentou um efeito anti-hemaglutinante na concentração de 10 µg/mL frente aos eritrócitos dos mesmos tipos sanguíneos. O extrato etanólico não induziu a formação de metahemoglobina, portanto, não apresentou efeito oxidante em nenhuma das concentrações testadas (1 µg/mL, 10 µg/mL, 100 µg/mL e 1000 µg/mL), entretanto, exibiu efeito antioxidante nas mesmas concentrações já referidas. 45 7. REFERÊNCIAS AFOLAYAN, A. J; OLAJUYIGBE, O. O. Phenolic contente and antioxidante property of bark extracts of Ziziphus mucronata Willd. subsp. mucronata Willd. 2011. Disponível em: <http://www.biomedcentral.com/1472-6882/11/130>. Acesso em: 6 de janeiro de 2015. ALBUQUERQUE, U.P; MEDEIROS, P.M; ALMEIDA, A.L.S; MONTEIRO, J.M; LINS NETOS, E.M.F; MELO, J.G; SANTOS, J.P. Medicinal plants of the Caatinga (semi-arid) vegetation of NE Brazil: A quantitative approach. J Ethnopharmacol. v. 114, p. 325–54, 2007. ALDRICH, K.; SAUNDERS, D. K. Comparison of erythrocyte osmotic fragility among ectotherms and endotherms at three temperatures. Journal of Thermal Biology, v. 26, p. 179 – 182, 2006. ALI-SHTAYEH, M.S; YAGHMOUR, R.M.R; FAIDI, Y.R; SALEM, K; AL-NURI, M.A. Antimicrobial activity of 20 plants used in folkloric medicine in the Palestinian área. J Ethnopharmacol. v. 60, p. 265-71, 1998. ALMEIDA, C.F.C.B.R; SILVA, T.C.L; AMORIM, E.L.C; MAIA, M.B.S; ALBUQUERQUE, U.P. Life strategy and chemical composition as predictors of the selection of medicinal plants from the Caatinga (Northeast Brazil). J Arid Environ: v. 62(1), p. 127-42, 2005. ALVES, H.M. Plantas como fonte de fitofármacos. Cadernos Temáticos de Química Nova na Escola. nº 3, p. 01-06. 2001. Disponível em: <http://sbqensino.foco.fae.ufmg.br>. Acesso em 10 de janeiro de 2015. ALVIANO, W.S; ALVIANO, D.S; DINIZ, C.G; ANTONIOLLI, A.R; ALVIANO, C; FARIAS, L.M; CARVALHO, M.A.R; SOUZA, M.G; BOLOGNESE, A.M. In vitro antioxidant potential of medicinal plant extracts and their activities against oral bacteria based on Brazilian folk medicine. Arch Oral Biol. v. 53, p. 545-52, 2008. ARBOS, K. A.; CLARO, L. M.; BORGES, L.; SANTOS, C. A. M.; WEFFORT-SANTOS, M. Human erythrocytes as a system for evaluating the antioxidant capacity of vegetable extracts. Nutrition Research, v. 28, p. 457-463, 2008. AZEVEDO, T.C.G., et al. Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 63, p. 477-483, 2009. 46 BENAMMAR, C; HICHAMI, A; YESSOUFOU, A. SIMONIN, ANNE-MARIE; BELARBI, M. ALLALI, H; KHAN, N. A. Zizyphus lotus L. (Desf.) modulates antioxidant activity and human T-cell proliferation. 2010. Disponível em: <http://www.biomedcentral.com/1472-6882/10/54>. Acesso em: 20 de janeiro de 2015. BENIGNI, R. Structure activity relationship studies of chemical mutagens and carcinogens mechanistic investigations and prediction approaches. Chemical Reviews, vol. 105, p. 1767-1800, 2005. BRANDÃO, R.; LARA, F.S.; PAGLIOSA, L.B.; SOARES, F.A.; ROCHA, J.B.T.; NOGUEIRA, C.W.; FARINA, M. Hemolytic effects of sodium selenite and mercuric chloride in human blood. Drug and Chemical Toxicology,, v. 28, p. 397-407, 2006. Brasil. Ministério da Saúde-Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução de Diretoria Colegiada RDC nº 26 de 13 de maio de 2014. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais fitoterápicos. BUTLER, M.S. Natural products to drugs: Natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports, v. 25, p. 475–516, 2008. CAMARGO, T. M., ALVES, M. I. F., OLIVEIRA, S. J., OSHIMA-FRANCO,Y. Estudo comparativo entre duas técnicas de dosagem de metemoglobina (MHb). RBAC, v.39, p. 95-98, 2007. CARTAXO, S.L; SOUSA, M. M.A; ALBUQUERQUE, U.P. Medicinal plants with bioprospecting potential used in semi-arid northeastern Brazil. J Ethnopharmacol 13:326342, 2010. CARVALHO, P. Ziziphus joazeiro taxonomia e nomenclatura. Circular Técnica. Embrapa. ISSN 1517-5278. 2007. Disponível em:.<http://www.cnpf.embrapa.br/publica/circtec/edicoes/Circular139.pdf>. Acesso em: 18 de dezembro de 2014. 47 CHEN, J; YAN, A. L; LAM, K. Y. C.; LAM, C.T.W; LI, N; YAO, P; XIONG, A; DONG, T. T.X; TSIM, K. W. K. A chemically standardized extract of Ziziphus jujuba Fruit (Jujube) stimulates expressions of neurotrophic factors and anti-oxidant enzymes in cultured astrocytes. Phytotherapy Research. V. 28: p. 1727–1730, 2014. CHIN, Y.W.; BALUNAS, M.J.; CHAI, H.B.; KINGHORN, A.D. Drug discovery from natural sources. American Association of Pharmaceutical Scientists, v. 8, p. 239–253, 2006. CLARO, L. M.; LEONART, M. S.; COMAR, S. R. NASCIMENTO, A. J. Effect of vitaminsC e E on oxidative process in human erythrocytes. Cell Biochem. Funct. v. 24, p. 531-535, 2005. COHEN, M. L. Epidemiology of drug resistance: implications for a post-antimicrobial era. Science, v. 257, p. 1050-1055, 1992. CRUZ, M.C.S; SANTOS, P.O; BARBOSA, J.A.M; MELO, D.L.F.M; ALVIANO, C.S; ANTONIOLLI, A.R; ALVIANO, D.S; TRINDADE, R.C. Antifungal activity of Brazilian medicinal plants involved in popular treatment of mycoses. J Ethnopharmacol. v.111, p. 409-12, 2007. DUARTE-ALMEIDA, J. M.; SANTOS, R. J.; GENOVESE, M.I.; LAJOLO, F.M. Avaliação da atividade antioxidante utilizando sistema β-caroteno/ácido linoleico e método de sequestro de radicais DPPH. Ciên. Tecnol. Aliment, v.26, p.446-452. 2006. ELDIN, S.; DUNFORD, A. Fitoterapia na atenção primária à saúde. São Paulo: Manole. 2001. ESTEVAM, C.E. Ensaios farmacológicos e toxicológicos pré-clínicos com Zizyphus joazeiro Mart. Dissertação de Mestrado. 2012 FERREIRA, V.F; PINTO, A.C. A fitoterapia no mundo atual. Química Nova, v.33, n.9, p. 1829, 2010. FLORENCE, F.; MARCEL, J.; MARIO, D.; MARC, D. Marine natural products as targeted modulators of the transcription factor NF-kB. Biochemical Pharmacology, 75, 603-617, 2008. 48 GHOSH, S.; PLAYFORD, R. J. Bioactive natural compounds for the treatment of gastrointestinal disorders. Clinical Science, v. 104, p. 547-556, 2003. HARBORNE, J. B.; WILLIAMS, C. A. Advances in flavonoids in research since 1992. Phytochemistry, v.55, p. 481-504, 2000. HARVEY, A. Medicines from nature: are natural products still relevant to drug discovery? TiPS, v. 20, p. 196-198, 1999. HOLT, J. G.; KRIEG, N. R.; SNEATH, P. H. A.; STALEY, J. T.; WILLIAMS, S. T. Bergey’s manual of determinative bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins, 1994. HOMAR, J. C. Medicinas complementarias o alternativas? Un dilema para el Sistema público. Atencíon Primaria, v.35, p. 389-391, 2005. IGNARO, L. J.; CIRINO, G. CASINI, A.; NAPOLI, C. Nitric oxide as a signaling molecule in the vascular system: in overview. J. of Cardiovascular Pharmocology, v. 34, p.879-886, 1999. LEONARD, S. S.; CUTLER, D.; DING, M.; VALLYATHAN, V.; CASTRANOVA, V.; SHI, X. Antioxidant prpperties of fruit and vegetable juices: more to the story than ascorbic acid. Ann. Clin. Lab. Sci. v. 32, p. 193-200, 2002. LEXIS, L.A.; FASSETT, R.G.; COOMBES, J.S. α-Tocopherol and α-lipoic acid enhance the erythrocyte antioxidant defence in cyclosporine Atreated rats. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, v. 98, p. 68-73, 2006. LIMA, A.R; BARBOSA, V.C; SANTOS, F.P.R; GOUVÊA, C.M.C.P. Avaliação in vitro da atividade antioxidante do extrato hidroalcoólico de folhas de bardana. Rev Bras Farmacog. v.16, p. 531-6, 2006. LORENZI, H.; ABREU MATOS, F. J. Plantas Medicinais no Brasil: Nativas e Exóticas. Editora do Instituto Plantarum, p. 396-397, São Paulo, 2002. 49 MACIEL, M.A.M; PINTO, A.C; VEIGA JUNIOR, V.F; GRYNBERG, V.F; ECHEVARRIA, A. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Química Nova, São Paulo, v. 25, n.3, p. 429-38, 2002. MAEDE, Y. Studies on feline haemobartonellosis. VI. Changes of erythrocyte lipids concentration and their relation to osmotic fragility. Japanese Journal of Veterinary Science, v.42 (3), p. 281-288, 1980. MADIGAN, M.; MARTINKO, J. The Bacteria. In: Brock – Biology of Microorganisms. New Jersey: Prantice Hall. p. 718-814, 2004. MANSOURI, A.; LURIE, A. A. Concise review : methemoglobinemia. Am J. Hematol. v. 42, p. 7-12, 1993. MELO, M. S. F; ROCHA, C. Q; SANTOS, M. H; CHAVASCO, J. M; CHAVASCO, J. K. Pesquisa de bioativos com atividade antimicrobiana nos extratos hidroetanólicos do fruto, folha e casca de caule do Zizyphus joazeiro Mart. Revista da Universidade Vale do Rio Verde, Três Corações, v. 10, n. 2, p. 43-51, 2012. MELLO, J. P. C.; SANTOS, S. C. Taninos. In: Farmacognosia: da planta ao medicamento; Simões , C. M. O.; Schenckel, E. P. (Orgs.). Ed. UFSC: Porto Alegre; 3ª ed., p. 527-554, 2001. MONTANARI. I. Aspectos da produção comercial de plantas medicinais nativas. 2002. Disponível em: <http://www.cpqba.unicamp.br/plmed/artigos/producao.htm>. Acesso em: 2 de junho de 2013. MORRISON, K.C; HERGENROTHER, P.J. Natural products as starting points for the synthesis of complex and diverse compounds. Natural Product Report 2013. MOUSINHO, K.C.; CORREIA, M. B. L.; SILVA, J. O.; MAGNATA, S. S. L. P.; SOUZA, I. A.; CATANHO, M. T. J. A. Effect of the extract of Ricinus communis L. on the osmotic fragility, labeling of red blood cells with technetium-99m and morphology of the cells. Braz. arch. biol. technolo. v. 51, p. 1139-1146, 2008. 50 MUSSI-DIAS, V.; ARAÚJO, A.C.O.; SILVEIRA, S.F; ROCABADO, J.M.A.; ARAÚJO, K.L. Fungos endofíticos associados a plantas medicinais. Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.14, n.2, p.261-266, 2012. NASCIMENTO, G. F. G.; LOCATELLI, J.; FREITAS, P. C.; SILVA, G. L. Brazilian Journal of Microbiology, v. 31, p. 247-256, 2000. NEWMAN, D.J.; CRAGG, G. M. Natural products as sources of new drugs over the last 25 years. Journal of Natural Products. v. 70, p. 461-477, 2007. NIKI, E.; YAMAMOTO, Y.; KOMURO, E.; SATO, K. Membrane damage due to lipid oxidation. The American Journal of Clinical Nutrition, v. 53, p. S201-S205, 1991. NUNES, P.H.M; MARINHO, L.C; NUNES, M.L.R.L; SOARES, E.O. Antipyretic activity of an aqueous extract of Zizyphus joazeiro Mart (Rhamnaceae). Braz J Med Biol Res. v. 20(5), p. 599-01, 1987. PAIVA-MARTINS et al. Mol. Nutri. Food Res. v. 53, p. 000-000, 2009. KARAMAN, I.; SAHIN, F.; GÜLLÜCE, M.; ÖGÜTÇÜ, H.; SENGUL, M.; ADIGÜZEL A. Antimicrobial activity of aqueous and methanol extracts of Juniperus oxycedrus L. J. Ethnopharmacology, v.2837, p. 1-5, 2003. KATO, E.T.M; OHARA, M.T; NISHITAMI, M. Evalution of antimicrobial property of Ziziphus joazeiro Martius. Lecta-USF. v. 16(2), p. 75-85, 1998. OLIVEIRA, A.F; MEIRELLES, S.T; SALATINO, A. Epicuticular waxes from Caatinga and cerrado species and their efficiency against water loss. Ann Braz Acad Sci. v. 75(4), p. 431-9, 2003. OZTÜRK, L.; MANSOUR, B.; YÜKSEL. M.; GÖKHAN, N. Lipid peroxidation and osmotic fragility of red blood cells in sleep-apnea patients. Clinica Chimica Acta, 332, 8388, 2003. 51 PERRY, G.; PERRY, A. K.; RAINA, A.; NUNOMURA, T.; WATAYA, L. M. How important is oxidative damage? Lessons from Alzheimer’s disease. Free Radical Biology and Medicine, v.28, p.831-834, 2000. PROKSCH, P.; EDRADA, R. A.; EBEL, R. Drugs from the seas – current status and microbiological implications. Applied Microbiology Biotechnology, v. 59, p. 125-134, 2002. RANGEL, M.; MALPEZZI, E. L. A.; SUSINI, S. M. M.; FREITAS, J. C. Hemolytic activity in extracts of the diatom Nitzschia. Toxicon, v. 35, n. 2, p. 305-309, 1997. RIBEIRO, B. D; COELHO, M. A; MARRUCHO, I.M. Extraction of saponins from sisal (Agave sisalana) and juá (Ziziphus joazeiro) with cholinium‑based ionic liquids and deep eutectic solventes. Eur Food Res Technol 237:965–975, 2013 RODRIGUES, H.G.; BATISTA, M.T.A.; FONSECA, L.C.; AVERSI-FERREIRA, T.A. Efeitos de pesticidas sobre a fragilidade osmótica de eritrócitos – Uma breve revisão. Revista Biotemas, v. 22 (1), 2009. ROTH, E. Oxygen free radicals and their clinical implications. Acta Chir. Hung. V.36, p. 302-305, 1997. SIEMS, W. G.; SOMMERBURG, O.; GRUNE, T. Erythrocyte free radical and energy metabolism. Clin Nephrol, 53, S9-S17, 2000. SILVA, C. F. O; LIMA, C. S. A. Atividade citotóxica e antiproliferativa in vitro de metabólitos secundários de Ziziphus joazeiro (Rhamnaceae). 2010. Disponível em: <http://www.contabeis.ufpe.br/propesq/images/conic/2010/conic/pibic/40/Resumo_CONIC_1 0040348PO.pdf>. Acesso em: 23 de janeiro de 2015. SILVA, T.C.L.; ALMEIDA, C.C.B.R.; VERAS, F.J.; PEIXOTO, T.J.S.; AMORIM, E.L.C.; COSTA, E.P.; ARAÚJO, J.M. Atividades antioxidante e antimicrobiana de Ziziphus joazeiro mart. (Rhamnaceae): avaliação comparativa entre cascas e folhas. Rev Ciênc Farm Básica Apl., v. 32(2), p. 193-199 ISSN 1808-4532, 2011. 52 SILVA, T.C.L. Avaliação comparativa de cascas e folhas de Ziziphus joazeiro Mart (Rhamnaceae) em relação aos perfis fitoquimico e toxicológico e as atividades antioxidante e antimicrobiana. [Dissertação] Recife: Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UFPE; 2009. SIRICHOTIYAKUL, S.; TANTIPALAKON, C.; SANGUANSERMSRI, T.; WANAPIRAK, C.; TONGSONG, T. Erythrocyte osmotic fragility test for screening of alphathalassemia-1 and beta-thalassemia trait in pregnancy. International Journal of Gynecology and Obstetrics, v. 86, p. 347-350, 2004. SOUZA, C.M.P.; BRANDÃO, D.O.; SILVA, M.S.P.; PALMEIRA, A.C.; SIMÕES, M.O.S.; MEDEIROS, A.C.D. Utilização de plantas medicinais com atividade antimicrobiana por usuários do serviço público de saúde em Campina Grande – Paraíba. Rev. Bras. Pl. Med., Campinas, v.15, n.2, p.188-193, 2013. TALALAY, P.; TALALAY; P. The importance of Using Scientific Principles in the Development of Medicinal Agents from Plants. Academic Medicine. v. 76(3), p. 238-247, 2001. TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia, Porto Alegre, Artmed, 2005. TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia, Rio de Janeiro, Atheneu, 2004. TRIGUEIRO, J. A. Contribuição ao estudo químico e farmacológico de Ziziphus joazeiro Mart. Dissertação de mestrado em produtos naturais, Laboratório de Tecnologia Farmacêutica/ UFPB, João Pessoa-PB, 1981. VIEGAS, C.; BOLZANI, V.S. Os produtos naturais e a química medicinal moderna. Quim. Nova, Vol. 29, No. 2, 326-337, 2006. ZIECH, D.; ANESTOPOULOS, I.; HANAFI, R.; VOULGARIDOU, G.P.; FRANCO, R.; GEROGAKILAS, A.G.; PAPPA, A.; PANAYIOTIDIS, M.I. Pleiotrophic effects of natural products in ROS-induces carcinogenesis: The role of plant-derived natural products in oral cancer chemoprevention. Cancer Letters. v. 31, n. 327, p.16-25, 2012.
