FARMA 8 - Primula Mariana Delaine - Unitri

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO ÓLEO DE
PRÍMULA (Oenothera biennis)
GARVIL, Mariana Pacifico (UNITRI) Correspondência:
[email protected]
ARANTES, Delaine Euripedes (UNITRI) [email protected]
QUEIROZ, Deborah (UNITRI)[email protected]
SILVA, Rayane Borges da (UNITRI) [email protected]
Resumo: O uso de plantas medicinais tem sido uma das alternativas utilizadas
na terapia medicamentosa, sendo uma alternativa a mais, além do uso de
antibióticos. Com o avançar da tecnologia obtém-se, extratos e detalhes
característicos das plantas. Este trabalho teve como objetivo analisar a
atividade antimicrobiana do óleo de Oenotherabiennis (prímula) contra cepas
bacterianas de Staphylococcus aureus e Esherichia coli, foram feitos
antibiogramas, usando a metodologia de difusão de discos em dois testes para
comprovação.Porém o óleo em questão não apresentou capacidade de
controlar o crescimento de uma ou mais espécies de microrganismos,
mostrando não ter aplicação como antimicrobiano.
Palavras-chave: prímula, resistência bacteriana, antimicrobiano.
1
INTRODUÇÃO
Em muitas comunidades e grupos étnicos, o conhecimento sobre plantas
medicinais simboliza geralmente oúnico recurso terapêutico. O uso de plantas
no tratamento e nacura de enfermidades é tão antigo, quanto à espécie
humana(BERTINI et al., 2005).
Com o passar do tempo aumenta-se o número de pesquisas feitas para
o melhor entendimento, modo de uso, precauções, indicações de plantas
medicinais neste caso em específico óleo de prímula, que foi analisado contra
infecções bacterianas.As inúmeros patologias que afetam a saúde pública no
mundo são de origem bacteriana (ALVARENGA et al.,2007).
Um grande problema hoje é a resistência microbiana, que está
aumentando cada dia mais. Para isso, algumas ações devem ser tomadas a
fim de reduzir esse problema, como por exemplo, controlar o uso de
antibióticos, desenvolver pesquisas para melhor compreender o mecanismos
genético de resistência e continuar os estudos de desenvolvimento de novas
drogas, sejam sintéticas, sejam naturais(BERTINI et al., 2005).
O óleo de Oenothera biennis, é mais conhecido como óleo de prímula,
tem algumas finalidades comprovadas, sendo eficaz contra artrite reumatoide,
dor no peito, eczema, diabetes, alívio dos sintomas da tensão pré-menstrual.
Este trabalho tem como objetivo analisar a atividade antimicrobiana do óleo
deOenothera biennis (prímula) contra cepas bacterianas de Staphylococcus
aureus e Esherichia coli, através de experimentos in vitro, realizados no
laboratório de microbiologia do Centro Universitário do Triângulo.
A maioria dos cocos Gram-positivos de importância médica são
membros dos gêneros Staphylococcus e Streptococcus(TORTORA et al.,
2003).O gênero compreende várias espécies, sendo três delas de interesse
médico: S. aureus, S. epidermidis e S. saprophyticus (TRABULSI, 2004)
Os Staphylococcus ocorrem em grupos que se assemelham a cachos de
uva. A espécie estafilocócica mais importante é o Staphylococcus aureus,
denominado assim por causa da pigmentação amarela das colônias
(aureussignifica dourado). Os membros desta espécie são anaeróbicos
facultativos, porém crescem melhor aerobicamente (TORTORA et al., 2003).
O S. aureus é o agente mais comum de infecções piogênicas. Estas
infecções podem se localizar na pele ou em regiões mais profundas. Quando
na pele, recebem diferentes designações, de acordo com a localização e outras
características (TRABULSI, 2004).
O diagnóstico das infecções estafilocóccias é feito pelo isolamento e
identificação do germe. O isolamento é realizado nos meios de cultura comuns,
como ágar sangue. A diferenciação do S. aureus, das outras espécies do
gênero, é feita pela pesquisa de coagulase e pelo teste de sensibilidade à
novobiocina (TRABULSI, 2004).
O S. aureus é sensível a vários antibióticos, porém adquiri facilmente
uma resistência praticamente irreversível aos mesmos. Sendo a saída para
este problema o uso de extratos vegetais.
Do ponto de vista médico, os bastonetes Gram-negativos anaeróbicos
facultativos são um grupo muito importante de bactérias. Muitos deles causam
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doenças do trato gastrintestinal e de outros órgãos. Aqui será analisada a
Enterobacteriacea Escherichia coli(TORTORA et al., 2003).
O gênero Escherichia compreende as espécies E. coli, E. fergsonii, E.
hermanii, E. vulneris. Porém a única espécie de importância prática é a E. coli.
Esta espécie compreende grande número de grupos e tipos sorológicos,
identificados por meio de anti-soros (TRABULSI, 2004).
A bactéria anaeróbica facultativa E. coli é um dos habitantes mais
comuns do trato intestinal, e provavelmente o organismo mais familiar da
microbiologia. Sua presença na água e nos alimentos é um importante
indicador de contaminação fecal. A E. coli não é normalmente considerada
patogênica. Entretanto, pode ser uma causa comum de infecções do trato
urinário, e certas linhagens produzem enterotoxinas que comumente causam
diarreia e ocasionalmente causam doenças graves de origem alimentar
(TORTORA et al., 2003)
Para se prescrever um antimicrobiano é necessário determinar
previamente se a amostra bacteriana, responsável pela infecção, é sensível ou
resistente a ele. Esta informação é muito importante, principalmente com
relação às espécies bacterianas que englobam muitas amostras resistentes,
como os estafilococos e as enterobacteriáceas(TRABULSI et al., 2000).
A concentração inibitória dos antimicrobianos pode ser determinada
direta ou indiretamente. A determinação é feita pelos chamados métodos de
diluição, e, a indireta, pelo método de difusão em placa (métodos dos discos).O
método de diluição pode ser realizado em meios de cultura líquidos ou sólidos.
Consiste em preparar diluições sucessivas do antimicrobiano, semeando frente
a cada diluição o inóculo bacteriano em número padronizado, e, após a
incubação, verificar a menor concentração do antimicrobiano que inibiu a
multiplicação bacteriana. Esta concentração é chamada concentração inibitória
mínima. As concentrações nas quais não existe multiplicação bacteriana
devem ser ressemeadas em meios isentos do antimicrobiano para se
determinar se houve nelas um efeito bactericida (falta de crescimento na
ressemeadura) ou bacteriostático (crescimento a partir das concentrações onde
bactéria foi inibida) (TRABULSI et al, 2000).
A determinação da sensibilidade pelo método de difusão em placa tem
por base dois fatos bem estabelecidos:
•
Quando se coloca um disco de papel filtro impregnado com um
antimicrobiano na superfície de um meio de cultura sólido, em placa
previamente semeada com uma bactéria, o crescimento bacteriano poderá ser
inibido, formando-se então um halo de inibição em torno do disco (zona onde
há crescimento bacteriano), cujo diâmetro varia de acordo com a velocidade de
difusão do antimicrobiano e a sensibilidade da bactéria. Se a bactéria for muito
resistente, não haverá formação de halo de inibição(TRABULSI, 2004).
•
O diâmetro do halo de inibição é inversamente proporcional à
concentração inibitória mínima do antimicrobiano, isto é, quando maior é o
diâmetro do halo, menor a concentração inibitória(TRABULSI, 2004).
Tomando-se por base o tamanho do halo de inibição, é possível inferir
se a bactéria é sensível, moderadamente resistente, ou resistente a este
microbiano, comparando os halos obtidos com tabelas padronizadas
internacionalmente.O método de difusão em placa pode ter numerosas
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variáveis na tecnologia empregada. Por este motivo, para poder-se obter
resultados comparáveis entre os diferentes laboratórios, foi padronizada
internacionalmente a técnica descrita por Bauer e Kirby. Nesta técnica são
estabelecidas normas para as concentrações a serem utilizadas nos discos de
cada antimicrobiano, padronização do inóculo bacteriano testado e tipo de meio
de cultura a ser utilizado. Também recomenda-se fazer um rigoroso controle de
qualidade da técnica empregada, utilizando-se cepas bacterianas de
sensibilidade conhecida, frente às quais os antimicrobianos devem ser produzir
determinados halos de inibição se a técnica empregada foi correta (TRABULSI
et al, 2000).
De modo geral, é bastante alta a correlação entre os resultados obtidos
no antibiograma e os da terapêutica. Quando a bactéria infectante é sensível
ao antimicrobiano e este é escolhido de acordo com suas características
farmacológicas, ocorre cura na grande maioria dos pacientes. Ao contrário,
quando é resistente, a possibilidade de cura é bastante remota. As exceções
que ocorrem podem ser facilmente explicadas, uma vez que as condições
encontradas no laboratório não são as mesmas do organismo humano
(TRABULSI et a.l, 2000).
A Oenothera biennis da família Onagraceae é conhecida como prímula
ou “evening primrose” = estrela da tarde. Este nome provém da característica
de suas flores abrirem ao entardecer.Nativa da América do norte foi introduzida
na Europa no século XVII como planta ornamental. Os índios americanos
usavam a planta como alimento, faziam também extratos ou infusões
adstringentes e sedativas. Cultivada nos jardins dos mosteiros do século XIX
esta planta foi negligenciada por Gregor Mendel, um monge austríaco, na
escolha de plantas para as suas famosas experiências sobre hereditariedade.
Contudo ela é cultivada por geneticistas na demonstração de princípios
hereditários (TESKE;TRENTINI, 1995).
Esta planta tem sido tema de centenas de estudos científicos, o que tem
tornado um dos fitoterápicos mais largamente prescritos na fitoterapia norte
americana(ROSA;MACHADO, 2007).
Constituintes da planta
•
•
•
•
•
Fitosterol;
Oenoterina;
Taninos;
Compostos flavônicos;
Mucilagens.
Constituintes do óleo da semente de prímula
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•
•
•
•
Ácido oléico 8 – 12%;
Ácido linoleico 65 – 75%;
Ácido gama linolênico 8 – 11%;
Ácido palmítico 5 - 8%;
Ácido esteárico 1,5%;
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As ações descritas para o óleo de prímula são decorrentes de atividade
hepatoprotetora, anti-inflamatória, sedativa, antiespasmódica, demulcente,
nutritiva, adstringente suave, vulnerária, anticoagulante, suplemento nutricional,
vasodilatadora (TESKE;TRENTINI, 1995).
A raiz da prímula é usada em associação com saponina no combate à
bronquite aguda e crônica, em casos raros são administradas as flores. Usada
também em associação com o ácido salicílico e a casca do salgueiro (TESKE;
TRENTINI, 1995).
O óleo da semente de prímula apresenta uma grande quantidade de
ácidos graxos essenciais, em especial o ácido gamolênico responsável pela
atividade terapêutica. O ácido gamolênico está envolvido na biossíntese de
prostaglandinas, com redução da inflamação(ROSA;MACHADO, 2007).
O óleo mantém a elasticidade e controla a oleosidade da pele, intervém
nos mecanismos vasodilatadores e inibe a agregação plaquetária. Atua na
síndrome da hiperatividade infantil, normalizando os níveis de serotonina. A
deficiência ou ausência de precursores das prostaglandinas conduzem a
distúrbios que levam ao envelhecimento ou ressecamento da pele, distúrbios
cardiovasculares, hipertensão e colesterolemia. Poucos alimentos são
fornecedores diretos de ácidos graxos insaturados em quantidades suficientes
para produzir esses precursores. O óleo deOenothera biennis(prímula) é um
agente ideal como fonte de ácido gama linolênico, reduz a perda de água
através da pele, aumenta a tolerância à exposição dos raios ultravioleta,
melhorando a integridade, elasticidade e flexibilidade das membranas
celulares. O ácido gama linolênico é essencial na síntese das prostaglandinas,
e sua reposição a causa primária de alterações metabólicas(TESKE;TRENTINI,
1995).
O óleo deOenothera biennis(prímula), devido a sua constituição,
ameniza a carência de ácidos graxos insaturados, quando a dieta alimentar é
deficiente. A raiz de prímula atua como antiflogística, devido a mucilagente
desenvolve boa ação emoliente. Folhas, flores e caule atuam como sedativos
da tosse e estimulam a circulação sanguínea, sendo, também, importantes
nutrientes capilares e tópicos (TESKE;TRENTINI, 1995).
Este trabalho teve como objetivo analisar a atividade antimicrobiana do
óleo de Oenotherabiennis (prímula) contra cepas bacterianas de
Staphylococcus aureus e Esherichia coli.
METODOLOGIA
A metodologia usada para realização desse trabalho foi baseada nos
métodos propostos pela Farmacopéia Brasileira, 5 ed., parte I., 2011. Pode ser
encontrada nos Anexos XIII.1 intitulado Metodologia para o Teste de
Sensibilidade aos Antibacterianos (Antibiograma).
Teste I
O primeiro teste feito foi o método de difusão do disco, onde discos
especiais de papel-filtro com a concentração padronizada do óleo de prímula
foram colocados sobre duas placas de ágar Mueller-Hinton, previamente
semeada com uma suspensão padronizada da bactériaEscherichia coli e outra
com a suspensão padronizada da bactéria Staphylococcus aureus. E a
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utilização de uma placa controle com apenas a concentração do óleo de
Oenothera biennis (prímula
prímula),para
ara verificar a esterilidade do óleo em
questão.Após
Após incubação de 24 horas, o halo de inibição foi medido e
interpretado como sensível, intermediário ou resistente (OPLUSTIL
OPLUSTIL et al., 2004)
Preparo do inóculo
Com o auxílio de um fio bacteriológico foi tocado na superfície de quatro
colônias com a mesma morfologia e inoculou-se
inoculou se em 3ml de caldo MuellerMueller
Hinton. Incubou-se
se a 35°C até a turbidez atingir a escala 0,5 de McFarland, que
ocorreu em 30 minutos. O inóculo foi ajustado com a escala de McFarland
colocando os tubos lado a lado contra um cartão de fundo preto com tiras
brancas.
Inoculação nas placas
Dentro de 15 minutos após o ajuste do inóculo foi feito a semeadura
introduzindo um “swab” estéril na suspensão ajustada, o “swab” foi comprimido
na parede interna do tubo para retirar o excesso do
do inóculo e foi semeado na
superfície do ágar Mueller-Hinton
Mueller Hinton em três direções diferentes. As placas
semeadas foram deixadas por 10 minutos à temperatura ambiente, para que o
inóculo pudesse ser completamente absorvido pelo ágar.
Aplicação dos discos
Foram colocados três discos de óleo de prímula nas placas e
pressionados levemente com o auxílio de uma pinça na superfície de cada
disco.
Incubação das placas
As placas foram transferidas para a estufa na temperatura de 35°C com
o tempo de incubação
ncubação de 24 horas e logo depois foram retiradas para análise.
Figura 1: Placas de petri com meio Miller Hinton inoculadas com
bactérias Gram negativoe Gram positivo contendo óleo de prímula.
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Figura2: Placas de petri com Miller Hinton e Placa Controle.
Teste II
O segundo teste feito foi o método da difusão do disco, onde discos
especiais de papel-filtro com a concentração padronizada do óleo de prímula e
do antibiótico amicacina foram colocados sobre dez placas de ágar MuellerHinton, previamente semeada com suspensão de bactérias não identificadas.
Após incubação de 24 horas, o halo de inibição foi medido e interpretado como
sensível, intermediário ou resistente (OPLUSTIL et al., 2004)
Preparo do inóculo
Com o auxílio de um fio bacteriológico foi tocado na superfície de quatro
colônias com a mesma morfologia e inoculou-se em 3ml de caldo MuellerHinton em 5 tubos . Incubou-se a 35°C até a turbidez atingir a escala 0,5 de
McFarland, que ocorreu em 30 minutos. O inóculo foi ajustado com a escala
de McFarland colocando os tubos lado a lado contra um cartão de fundo preto
com tiras brancas.
Inoculação nas placas
Dentro de 15 minutos após o ajuste do inóculo foi feito a semeadura
espalhando o inoculo com uma alça de drigalski por toda a placa, sendo a alça
de drigalski passada no álcool e flambada, a cada placa, repetindo este
procedimento em dez placas.
Aplicação dos discos
Foi colocado um disco de óleo de prímula, um disco do antibiótico
amicacina nas placas e pressionados levemente com o auxílio de uma pinça na
superfície de cada disco. E foi colocado uma gota do óleo de prímula
perfurando a placa com Mueller-Hinton.
Incubação das placas
As placas foram transferidas para a estufa na temperatura de 35°C com
o tempo de incubação de 24 horas e logo após retiradas para análise.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Teste I
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Foi feito um antibiograma utilizando 4 placas o meio de ágar MuellerHinton é o mais recomendado para os testes de antibiograma, ele contém em
sua composição por litro: infusão de carne 300 g; hidrolisado de caseína 17,5
g; amido solúvel 1,5 g e ágar 10 g; seu pH gira em torno de 7,2-7,4 após a
esterilização (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2011). Ágar padronizado por
Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das
principais bactérias.Por isso sendo o mais compatível pra ser usado neste
teste.
Após as placas serem tiradas da estufa foi visto que o óleo de prímula foi
ineficaz pra matar as bactérias selecionadas Staphylococcus aureus e
Escherichia coli. Não se formou halos em volta do óleo de 20 ml de 50ml e da
gota do óleo de prímula colocados nas placas. As placas que não foram
colocadas às bactérias apenas o óleo, foi comprovado que o mesmo não
estava contaminado.
Questionamentos foram feitos observando detalhes que talvez possam
ter influenciado no resultado negativo.
O erro operacional foi uma opção descartada, poiso teste feito no
laboratório foi executado com a devida cautela e por profissionais habilitados.
Para a confirmação de que o óleo de prímula foi realmente ineficaz e
esclarecer quaisquer dúvidas de que seu uso seria indevido com
antimicrobiano foi feito um segundo teste.
Teste II
No teste I as bactérias utilizadas foram apenas Staphylococcus aureus e
Escherichia coli. Então para um novo teste foram utilizados vários tipos de
bactérias e mais quantidade de amostras de placas foram analisadas sendo
desta vez 10 amostras.Também foi colocado o antibiótico Amicacina na mesma
placa que o óleo de prímula para comparação. O antibiótico matou as bactérias
formando o halo em volta, como era o esperado, e o óleo de prímula teve o
mesmo resultado que o teste I, porém agora sabe-se que ele além de ser
ineficaz para Staphylococcus aureus e Escherichia, também não apresenta
nenhum efeito sobre os demais tipos de bactérias.
Em todas as placas cresceram bactérias normalmente e também sobre
óleo, em algumas placas além do crescimento das bactérias teve o
aparecimento inesperado de fungos.
Figura 3: Crescimento bacteriano em placas com óleo de prímula e
eficácia da Amicacina.
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Um dos questionamentos feitos sobre o óleo de prímula foi sua alta
concentração e sua insolubilidade, então foi realizado a quebra do mesmo com
a substância tween 80, e o teste feito desta vez foi em tubos com bactérias e o
óleo menos concentrado, mesmo assim o resultado continuou sendo o
crescimento bacteriano e a falta de ação antimicrobiana do óleo. Testes mais
detalhados poderão ser feitos no óleo de prímula para comprovar outras ações,
mas a utilização do óleo de prímula com a finalidade antimicrobiana está
descartada. Pois não apresentou nenhum resultado expressivo de ação
antimicrobiana para que possa ser feitos novos testes.
Fatores que podem afetar o resultado de antibiograma
•
Inóculo fora do padrão;
•
Inóculo com mais de um microrganismo;
•
Formulação do meio e pH;
•
Espessura do meio;
•
Tempo e atmosfera de incubação (incubação prolongada pode
resultar em inativação dos antimicrobianos);
•
Concentração inadequada no disco;
•
Armazenamento inadequado dos discos;
•
Critérios inadequados para medir halos de inibição de algumas
drogas.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
As bactérias quando são ameaçadasdentro de seu hospedeiro procura
de todas as formas se defenderem, sofrendo mutações, procurando tornar-se
impermeável, inativando o agente que a agride, sendo assim mais difícil sua
destruição. A preocupação de pesquisadores e cientistas aumenta, que correm
contra o tempo pra obtenção de mais saídas contra a resistência bacteriana,
considerando o efeito que tem na saúde humana e o impacto econômico que
ela representa. Bactérias conhecidas como resistentes a um número maior de
antibióticos como o Staphylococcus aureus e Escherichia coliqueé o alvo mais
comum de pesquisas, o entendimento do funcionamento da patogenicidade
desses perigosos agentes infecciosos pode orientar os profissionais de clínica
na racionalização de sua antibioticoterapia, minimizando, assim, as chances de
seleção de cepas resistentes (e multirresistentes) aos antimicrobianos.
Um dos maiores benefícios do Brasil é que o país possui uma grande
variedade de espécies vegetais que podem ser exploradas sendo somadas aos
antibióticos ajudando contra várias infecções existentes.
A planta explorada neste trabalho foi aOeneohera biennis(prímula)
sendo testado o óleo que contém um número considerado de finalidades,
porém não apresentou ação bactericida e nem bacteriostática, o que mostra
que as suas propriedades farmacológicas não estão ligadas ao nível
microbiano.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALVARENGA. A. L.; SCHWAN, R. F.; DIAS, D. R.; SCHAWAN-ESTRADA, K.
R. F.; BRAVO-MARTINS, C. E. C. Atividade antimicrobiana de extratos
vegetais sobre bactérias patogênicas humanas. Rev Bras Plant Med, v. 9, p.
86-91,
2007.
Disponível
em:
<www.ibb.unesp.br/servicos/publicacoes/rbpm/pdf.../artigo14_v9_n4.pdf>.
Acesso em: 21 ago. 2011.
BERTINI. L. M.; PEREIRA. A. F.; MENEZES. E. A.; MORAIS. S. M.. Perfil de
sensibilidade de bactérias frente a óleos essenciais de algumas plantas do
nordeste do Brasil. Infarma, v. 17, n. 34, 2005.Disponível em:
www.cff.org.br/sistemas/geral/revista /pdf/17/perfil_bacterias.pdf>. Acesso em:
21 ago. 2011.
Descrição dos meios de cultura empregados nos exames
microbiológicos.
Disponível
em:
<www.anvisa.gov.br/servicosaude/
microbiologia/ mod_4_ 2004.pdf>. Acesso em: 21 ago. 2011.
FARMACOPÉIA BRASILEIRA. Quinta edição, parte I. São Paulo: Atheneu,
2011.
OPLUSTIL. P. C.; ZOCCOLI. M. C.; TOBOUTI. R. N.; SINTO. I. S.
Microbiologia Clínica. 2° Ed. São Paulo: Editorial Sarvier ,2004.
ROSA, Caroline da; MACHADO, Clarice Azevedo. Plantas medicinais utilizadas
no tratamento de doenças reumáticas: revisão. Rev. Bras. Farm, v. 88, n. 1, p.
26-32, 2007.<http://sncsalvador.com.br/artigos/rosa-2007.pdf>. Acesso em: 28
ago. 2011.
SANTOS. L. A.; FREITAS. C. C.; FERREIRA. A. L. B.; AFONSO. F. I.;
RODRIGUES. R. C.; CASTRO. C. H. Staphylococcus aureus: visitando uma
cepa de importância hospitalar. Bras. Patol. Med. Lab, v. 43, p. 413-423,
2007.Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v43n6/v43n6a05.pdf>. Acesso
em: 28 ago. 2011.
TESKE, Magrid; TRENTINI, Anny Margaly Maciel. Compêndio de fitoterapia.
Herbarium Laboratório Botânico, 1995
TORTORA, G. J.; FUNKE, Berdell R.; CASE, Christine L. Microbiologia, 6ª
edição. Editora Artmed, Porto Alegre, 2003.
TRABULSI, Luiz Rachid; ALTERTHUM, Flávio. Microbiologia; Microbiology.
2. ed. São Paulo: Editorial Atheneu, 2004.
WAGNER, Hildebert; WISENAUER, Markus. Fitoterapia: Fitofármacos,
Farmacologia e Aplicações Clínicas. 2°. Ed. São Paulo: Editorial
Pharmabooks, 2006.
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