Fluoroquench AO-EB

FLUOROQUENCH AO/EB
Reagente Corante Fixador
Instruções de Uso
APRESENTAÇÃO DO PRODUTO
Código
FQAE-100
FQAE-500
Descrição
Fluoroquench AO-EB – 100 mL
Fluoroquench AO-EB – 500 mL
USO PRETENDIDO
Esse reagente é usado para corar fluorescentemente e fixar linfócitos
em uma placa teste do tipo Terasaki, em ensaios de microlinfotoxicidade.
Os produtos FluoroQuench AO/EB incluem uma mistura de reagentes para
facilitar a avaliação microscópica das células e para prolongar a
conservação das placas para uma posterior avaliação.
PRINCÍPIO DE AÇÃO E REAÇÃO
Em testes HLA, um reagente fixador pode reduzir significativamente o
plano de fundo fluorescente. O EDTA é usado para parar a reação
complemento-dependente de lise celular. O brometo de etídio (EB) é usado
para corar as células mortas. O laranja de acridina (AO) é usado para corar
células vivas. Consulte o esquema a seguir para melhor entendimento do
princípio:
1
PRINCÍPIOS
O corante, após a lise celular, penetrará nas células mortas (corandoas de vermelho) e nas células vivas (corando-as de verde). O processo de
coloração das células é a etapa final do teste sorológico HLA.
Na figura abaixo damos uma ideia de como as leituras devem ser
feitas:
O procedimento prático é resumido conforme diagrama abaixo:
2
MATERIAIS FORNECIDOS
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



Hemoglobina bovina
Ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)
Brometo de etídio (EB)
Laranja de acridina (AO)
Azida sódica
FluoroQuench AO/EB pode ser apresentado pronto para uso em dois
frascos diferentes: um com 100 mL (FQAE-100) e outro com 500 mL
(FQAE-500)
MATERIAIS NECESSÁRIOS E NÃO FORNECIDOS

Dispensador 5 µL, tampas plásticas
CONDIÇÕES DE ARMAZENAMENTO, TRANSPORTE, LIMITES DE TEMPERATURA,
UMIDADE OU PROTEÇÃO À LUZ
Deve ser armazenado em temperatura entre 2 e 8 °C.
O transporte pode ser realizado em temperatura ambiente ou gelo
reciclável.
Esse produto deve ficar protegido da luz solar e umidade excessiva.
PRECAUÇÕES
Pode causar irritação aos olhos, pele, membranas das mucosas e
trato respiratório superior. Não deixe entrar em contato com olhos, ou pele,
ou vestimenta.
Pode ser tóxico por inalação, em contato com a pele, ou se engolido.
A exposição ao produto pode causar náusea, dor de cabeça e vômito.
Evite exposição prolongada ou repetitiva.
Pode causar dano em herança genética (mutagênese).
Em contato com ácido, libera gás altamente tóxico.
Ao manipular, é preciso adotar precauções de utilização adequada de
EPI – equipamento de proteção individual. Sempre use luvas e evite contato
dos reagentes ou amostras com a pele.
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Controles de Engenharia: A ventilação geral do laboratório deve ser
adequada para a utilização normal.
Proteção respiratória: Normalmente, não é necessária nenhuma.
Proteção das mãos: Utilizar luvas resistentes a produtos químicos.
Proteção para os olhos: É recomendada a utilização de óculos de
segurança.
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
Proteção da pele: Usar vestimenta de laboratório.
Outros Controles: Recomenda-se ducha de segurança e lavagem
ocular.
Ingestão: Pode causar irritação do trato intestinal e outros efeitos
adversos. Contém <0,1% de azida sódica. Há relatos de que a
ingestão de azida sódica pode causar falta de ar, náuseas, vômitos,
agitação, diarreia, queda de tensão arterial (hipotensão) e colapso.
Contato com a Pele: Pode causar irritação. O contato prolongado e
extenso pode resultar em absorção com sintomas sistêmicos
semelhantes à ingestão. O contato repetido com a pele pode causar
reações alérgicas (sensibilidade).
Contato com os Olhos: Pode causar irritação.
CUIDADOS COM A AMOSTRA BIOLÓGICA
Tratar a amostra como potencialmente infecciosa, devido à sua
origem biológica.
PROCESSO DE MEDIÇÃO
Importante: Agite antes de usar. Para evitar contaminação, não reaproveite
o reagente não usado – não o devolva para o frasco mãe de solução.
1. Use seus métodos habituais para isolar e identificar sua amostra teste.
2. Depois da incubação com complemento, dispense 5 µL de
FluoroQuench AO/EB em cada poço. Use a técnica de “softdrop”
(dispensação suave, que é obtida aspirando um pouco de ar antes de
aspirar o reagente – “colchão de ar”).
3. Coloque a lâmina plástica para tampar a placa.
4. Deixe as placas descansarem a 20-25°C por aproximadamente 15
minutos antes da avaliação microscópica.
5. Placas podem ser armazenadas no escuro, a 2 – 5 °C, por 2–3 dias.
Detalhamento da Parte Prática
1. Partir de uma amostra com linfócitos na quantidade de 2 x 106/mL.
2. 1 µL de linfócito é dispensado no interior de cada poço da placa tipo
Terasaki.
3. Ao utilizar uma placa sem o complemento inserido no poço, faça uma
incubação por meia hora, à temperatura ambiente.
4. Adicione 5 µL de complemento de coelho em cada poço.
5. Proceda com a incubação pelo período de uma hora, à temperatura
ambiente.
6. Adicione, então, o corante em cada poço (nesse caso, 5 µL de
Fluoroquench).
7. As placas são, então, lidas em microscópio.
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CALIBRAÇÃO DO PROCESSO
Não se aplica.
OBTENÇÃO DOS RESULTADOS
Os resultados dependerão da análise individual, sendo que a tabela
abaixo deve ser observada:
1
2
4
6
8
0
0% - 10% de células mortas
11% - 20% de células mortas
21% - 50% de células mortas
51% - 80% de células mortas
81% - 100% de células mortas
Poço sem leitura devido a uma de inúmeras razões
Negativo
Negativo
Fraco positivo
Positivo
Positivo
LIMITAÇÕES DO PROCESSO
Dificuldades com a separação das células e contaminação nas
preparações de linfócitos com células vermelhas, leveduras, monócitos,
plaquetas,
ou
granulócitos
podem
causar
resultados
errôneos.
Adicionalmente, resultados errôneos podem ocorrer quando a concentração
celular for acima ou abaixo do nível aceitável.
CONTROLE INTERNO DE QUALIDADE
Sempre deve haver uma segunda pessoa para revisar a primeira
leitura. A quantidade de células deverá ser checada e deve estar dentro do
valor de 2 x 106 linfócitos/mL. Para validação do produto em caso de novo
lote, o laboratório poderá realizar um teste com células com tipagem
conhecida em duplicata, utilizando ambos os produtos: o antigo e o novo.
VALORES DE REFERÊNCIA OBTIDOS EM POPULAÇÕES SADIAS OU VALORES
DEMOGRÁFICOS,
EPIDEMIOLÓGICOS,
ESTATÍSTICOS,
DESEJÁVEIS,
TERAPÊUTICOS OU TÓXICOS
Não existe este tipo de dado para a metodologia em questão.
5
CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO
O plano de fundo fluorescente não específico será reduzido, e a lise
celular complemento-dependente será interrompida. As células mortas
fluorescerão vermelhas, enquanto que células viáveis fluorescerão verdes.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
DOMBRAUSKY, M., “Comparision of 10% Hemoglobin/ 5% EDTA Quench vs.
FluoroQuench”. HLA Technical Workshop, 1994.
IDENTIFICAÇÃO DO DISTRIBUIDOR
Biometrix Diagnóstica Ltda.
Estrada da Graciosa, 1081 - Curitiba – PR - CEP: 82840-360
Tel.: (41) 2108-5250
Fax: (41) 2108-5252
DDG: 0800-7260504
E-mail: [email protected]
Website: www.biometrix.com.br
CNPJ: 06.145.976/0001-39
INFORMAÇÕES DO FABRICANTE
One Lambda, Inc.
21001 Kittridge Street
Canoga Park – CA – EUA
REGISTRO ANVISA
80298490108
RESPONSÁVEL TÉCNICA
Edna Cristina Kurokawa Guimarães Ferreira
CRQ/PR: 09302336
6
REVISÕES
Revisão
Descrição da Alteração
Data
00
Elaboração
Formatação, revisão geral do texto e
alteração de Responsável Técnica
Alteração do DDG
Revisão gramatical e ortográfica,
formatação, alteração de Responsável
Técnica
10/2003
01
02
03
11/2011
09/2012
12/2012
7