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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
LUCIANO DANIEL SILVA
EFEITOS DE DIFERENTES INTENSIDADES DO EXERCÍCIO FÍSICO
SOBRE A ATIVIDADE DOS COMPLEXOS DA CADEIA
RESPIRATÓRIA
CRICIÚMA, JANEIRO DE 2009
Livros Grátis
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LUCIANO DANIEL SILVA
EFEITOS DE DIFERENTES INTENSIDADES DO EXERCÍCIO FÍSICO
SOBRE A ATIVIDADE DOS COMPLEXOS DA CADEIA
RESPIRATÓRIA
Dissertação
de
Mestrado
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde para obtenção do título de Mestre em
Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Aurino Pinho
CRICIÚMA, JANEIRO DE 2009
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
S586e
Silva, Luciano Daniel.
Efeitos de diferentes intensidades do exercício físico sobre
a atividade dos complexos da cadeia respiratória / Luciano
Daniel Silva; orientador: Ricardo Aurino Pinho . -- Criciúma:
Ed. do autor, 2009.
54 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo Sul
Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, 2009.
1. Exercícios físicos – Aspectos fisiológicos. 2. Músculos
respiratórios. 3. Metabolismo energético. 4. Estresse
oxidativo. I. Título.
CDD. 21ª ed. 617.1027
Bibliotecária: Flávia Caroline Cardoso – CRB 14/840
Biblioteca Central Prof. Eurico Back – UNESC
Dedico esta dissertação às mulheres da minha
vida: minha mãe Janete, minha avó Otília;
minha namorada Renata, e minhas irmãs
Roberta e Melissa. Obrigado!!!
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais, Luiz Alberto Silva (em memória) e Janete Albertina Daniel,
pelo maravilhoso presente da vida, pelo amor incondicional e pela criação que me
conceberam. Aos meus familiares pela união e incentivo constante na busca pelos
meus ideais. À minha namorada Renata pelo seu amor e apoio constante, sempre
me motivando, especialmente quando percebia que “o vento soprava contra...”. A
todos os meus amigos, simplesmente por serem meus amigos, e que independente
dos momentos bons ou ruins sempre estiveram ou estão comigo. Não vou citar
nomes para não ser injusto caso eu esqueça de algum de vocês... prefiro agradecer
pessoalmente a cada um! Um agradecimento especial aos integrantes do LAFIBE,
um verdadeiro grupo de pesquisa: literalmente, sem o imenso esforço de vocês,
dedicação e disponibilidade eu não teria condições de terminar esse projeto
profissional e de vida. Peço desculpas a todos vocês pelos momentos de ausência
no laboratório, afinal são coisas da vida... Todos vocês são merecedores de sucesso
e felicidade!! Um agradecimento especial à Juliana Daufenbach (Jú) que trabalhou
demais, virou noites a dentro para dar conta do recado! Valeu Jú, agradeço a você
de coração!!! Ao meu xará Luciano Acordi, Lucianinho (só no apelido), pois é um
grande profissional que está no caminho certo: Luciano, pesquisa, é a sua vida! Ao
Dr. Cláudio de Souza que com todo seu conhecimento trouxe mais qualidade ao
LAFIBE. Ao meu orientador Dr. Ricardo Pinho que me deu a oportunidade de
realizar este objetivo, e por não me deixar desistir quando as coisas não iam muito
bem... suas palavras naquelas conversas foram cruciais para que eu não desistisse.
Finalmente, a todas as pessoas que não foram citadas e que contribuíram de
alguma forma para a realização deste sonho. OBRIGADO!!!
“Seja você quem for, seja qual for a posição social que você
tenha na vida, a mais alta ou a mais baixa, tenha sempre
como meta muita força, muita determinação e sempre faça
tudo com muito amor e com muita fé em Deus, que um dia
você chega lá. De alguma maneira você chega lá.”
Ayrton Senna
RESUMO
A cadeia de transporte de elétrons (CTE) é formada por quatro complexos
(complexos I, II, III, IV) capazes de catalisar a transferência de elétrons como uma
reação parcial da cadeia respiratória, enquanto gera uma força próton-motriz através
da membrana mitocondrial interna que leva a síntese de ATP. Exercício físico agudo
e intenso causa aumento no consumo de oxigênio, que é acompanhado pelo
aumento da atividade das enzimas da CTE. O presente estudo investigou os efeitos
de várias intensidades de exercício físico agudo sobre a atividade dos complexos da
cadeia respiratória do músculo sóleo de ratos. Foram utilizados trinta e seis ratos
Wistar machos com idade de 2 meses e pesando entre 200 e 250 gramas. Todos os
animais foram adaptados a esteira por uma semana e foram distribuídos
randomicamente em seis grupos (n=6) com diferentes níveis de intensidade: 1o nível
(0.6 km/h); 2o nível (0.6 e 0.8 km/h); 3o nível (0.6; 0.8 e 1.0 km/h); 4o nível (0.6; 0.8;
1.0 e 1.2 km/h); 5o nível (0.6; 0.8; 1.0; 1.2 e 1.4 km/h); e 6o nível (0.6; 0.8; 1.0; 1.2;
1.4 e 1.6 km/h). Imediatamente após o exercício, o sangue foi coletado e os animais
foram mortos por decapitação. O músculo sóleo (fibras vermelhas) foi removido
cirurgicamente e armazenado a –70ºC. Os níveis de lactato sangüíneo (BL),
conteúdo de glicogênio muscular (MG), creatina quinase (CK), succinato
desidrogenase (SDH) e a atividade dos complexos I, II e IV (C-I, C-II, C-IV) foram
avaliados. Os resultados mostram que a partir da velocidade 1.0 km/h ocorreu
aumento nos níveis de lactato; 1.2 km/h diminuiu o conteúdo de glicogênio e
aumentou o dano muscular (CK). A atividade dos complexos da CTE aumentou de
acordo com a intensidade do exercício (C-I, velocidade 0.8 km/h; C-II e C-III,
velocidade 1.0 km/h; e C-IV, velocidade 1.2 km/h). De acordo com nossos
resultados, concluímos que a atividade das enzimas dos complexos da CTE é
aumentada progressivamente de acordo com a intensidade do exercício, sendo
ativada ordenadamente na seguinte seqüência; C-I; C-II; C-III e C-IV.
Palavras-chave: exercício agudo; músculo-esquelético; cadeia de transporte de
elétrons; mitocôndria.
ABSTRACT
The electron transport chain (ETC) consists of four complexes (complexes I, II, III,
IV), each capable of catalyzing electron transfer in a partial reaction of the respiratory
chain, during generates a proton-motive force across the inner mitochondrial
membrane that drives the synthesis of ATP. Intensive and acute exercise cause
increase oxygen consumption, which is accompanied by increase in muscle the ETC
enzyme activities. The present study investigated the effects of various intensities of
acute physical exercise on the activity of respiratory chain complexes of the soleus
muscle of rats. Thirty-six rats male Wistar weighing 200 to 250g with 2 months of
age, was randomly distributed into six groups (n=6) with differents levels intensity:
Level 1 (control, 0.6 km/h); 2º level (0.6 and 0.8 km/h); 3º level (0.6; 0.8 and 1.0
km/h); 4º level (0.6; 0.8; 1.0 and 1.2 km/h); 5º level (0.6; 0.8; 1.0; 1.2 and 1.4 km/h);
and 6º level (0.6; 0.8; 1.0; 1.2; 1.4 and 1.6 km/h). Immediately after exercise the
blood was removed and animals were killed by decapitation. Soleus muscle (red
fibers) were removed and stored at –70ºC. Level blood lactate (BL), muscular
glycogen contend (MG), creatine kinase (CK), succinate dehydrogenase (SDH),
complexes I, II, and IV (C-I, C-II, C-IV) were measured. Results show that leave
velocity 1.0km/h increased the level of BL; 1.2km/h decreased MG content and
increased damage muscular (CK). The ETC enzymes activities increased with level
to intensity in exercise (C-I, velocity 0.8 km/h; C-II and C-III, velocity 1.0 km/h; and CIV, velocity 1.2 km/h). In conclusion, in soleus muscle the electron transport chain
enzyme activities increased progressive according to the intensity of exercise.
Key-words: exercise acute; muscle skeletal; electron transport chain; mitochondrial.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Nível de lactato sanguíneo em ratos submetidos a diferentes intensidades
de exercício físico agudo......…….....……………………………………………………..39
Figure 2: Conteúdo de glicogênio muscular em ratos submetidos a diferentes
intensidades de exercício físico agudo..... ………………….…………………………..39
Figure 3: Atividade da creatina quinase em ratos submetidos a diferentes
intensidades de exercício físico agudo....... ………………...…………………………..40
Figure 4: Atividade da succinato desidrogenase em ratos submetidos a diferentes
intensidades de exercício físico agudo.............……………..…………………………..40
Figure 5A: Atividade da enzima do complexo I da cadeia de transporte de elétrons
em
ratos
submetidos
a
diferentes
intensidades
de
exercício
físico
agudo............……………………………………………...………………………………..41
Figure 5B: Atividade da enzima do complexo II da cadeia de transporte de elétrons
em
ratos
submetidos
a
diferentes
intensidades
de
exercício
físico
agudo............……………………………………………...………………………………..41
Figure 5C: Atividade da enzima do complexo III da cadeia de transporte de elétrons
em
ratos
submetidos
a
diferentes
intensidades
de
exercício
físico
agudo............……………………………………………...………………………………..41
Figure 5D: Atividade da enzima do complexo IV da cadeia de transporte de elétrons
em
ratos
submetidos
a
diferentes
intensidades
de
exercício
físico
agudo............……………………………………………...………………………………..41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Acetil Co-A: Acetil Coenzima A
FADH2: Flavina-Adenina-Dinucleotídeo
ADP: Adenosina Difosfato
reduzida
ATP: Adenosina Trifosfato
Fe-S: Grupos Ferro-Enxofre
CAC: Ciclo do Ácido Cítrico
FMN: Mononucleotídeo de Flavina
CK: Creatina Quinase
GDP: Guanosina Difosfato
CoQ: Coenzima Q
GTP: Guanosina Trifosfato
COX-II: Citocromo oxidase II
H+: Hidrogênio
CO2: Dióxido de Carbono
H2O: Água
CS: Citrato Sintase
MMI: Membrana Mitocondrial Interna
CTE: Cadeia de Transporte de
mtDNA: DNA mitocondrial
Elétrons
NAD+: Nicotinamida-Adenina-
C-I: Complexo I
Dinucleotídeo
C-II: Complexo II
NADH: Nicotinamida-Adenina-
C-III: Complexo III
Dinucleotídeo reduzida
C-IV: Complexo IV
O2: Oxigênio
DNA: Ácido Desoxirribonucléico
O2•–: Ânion superóxido
EROs: Espécies Reativas de Oxigênio
Pi: Fosfato Inorgânico
FAD: Flavina-Adenina-Dinucleotídeo
SDH: Succinato Desidrogenase
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................11
1.1 Justificativa........................................................................................................11
1.2 Metabolismo Energético Muscular ..................................................................12
1.2.1 Glicólise ........................................................................................................13
1.2.2 Ciclo do Ácido Cítrico ..................................................................................14
1.2.2.1 Reações e Enzimas do Ciclo do Ácido Cítrico........................................14
1.3 Cadeia de Transporte de Elétrons ...................................................................16
1.3.1 Complexo I (NADH – Coenzima Q-Oxidorredutase) ..................................17
1.3.2 Complexo II (SDH – Succinato Desidrogenase) ........................................18
1.3.3 Complexo III (Coenzima Q-Citocromo c-Oxidorredutase) ........................19
1.3.4 Complexo IV (Citocromo c-Oxidase) ..........................................................20
1.4 Fosforilação Oxidativa ......................................................................................21
1.4.1 Fosforilação Oxidativa e ATP-sintase ........................................................22
2 OBJETIVOS...........................................................................................................24
2.1 Objetivo Geral....................................................................................................24
2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................24
3 EFFECTS OF DIFFERENT INTENSITIES OF PHYSICAL EXERCISE ON THE
ACTIVITY OF RESPIRATORY CHAIN COMPLEXES ............................................25
4 DISCUSSÃO ..........................................................................................................43
5 CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES ....................................................................47
REFERÊNCIAS.........................................................................................................48
11
1 INTRODUÇÃO
1.1 Justificativa
Há muito, cientistas do exercício buscam compreender os mecanismos
fisiológicos e bioquímicos envolvidos nas respostas agudas e crônicas ao exercício
físico (Holloszy, 1967;Gollnick et al., 1974; Essén & Kaijser 1978; Tonkonogi et al.,
1997; Zoll 2002; Daussin et al., 2008; Green et al., 2008)
Talvez um dos maiores
desafios dos estudos atuais esteja relacionado à possibilidade de descobrir métodos
que possibilitem retardar a fadiga muscular durante a prática do exercício, bem
como acelerar ou diminuir o período de recuperação entre as sessões de
treinamento, visando potencializar a performance ou rendimento dos praticantes.
Para isso, o entendimento do metabolismo energético se faz extremamente
necessário. A avaliação das variáveis metabólicas envolvidas no metabolismo
energético pode contribuir para o entendimento dos fenômenos ocorridos durante ou
após o exercício físico agudo, bem como a adaptação ao treinamento (efeito
crônico).
O exercício agudo intenso causa aumento no consumo de oxigênio, o
qual é acompanhado pelo aumento da atividade das enzimas da cadeia de
transporte de elétrons no músculo (Bejma & Ji, 1999; Kayatekin, 2002); este tipo de
exercício tem o glicogênio como uma das principais fontes para a produção de
energia (Gollnick et al., 1974; Romijn et al., 1993). Durante o exercício físico ocorre
um aumento na atividade das enzimas do metabolismo oxidativo para suprir a
demanda energética requerida pelos músculos esqueléticos na contração muscular.
Como parte desta via energética a Cadeia de Transporte Elétrons (CTE), uma série
12
com quatro complexos protéicos que catalisam reações de oxirredução e doam
elétrons ao oxigênio, tem a função de “acumular” prótons no espaço intermembrana
para posterior produção de energia pela ATP-sintase em um processo denominado
fosforilação oxidativa. (Adhihetty et al., 2003; Devlin, 2003; Champe et al., 2006;
Boekema & Braun, 2007; Smith et al., 2007). Estes mecanismos bioquímicos estão
descritos detalhadamente nos capítulos seguintes.
1.2 Metabolismo energético muscular
A produção de ATP durante o exercício físico pode ocorrer aerobica ou
anaerobicamente, ou seja, na dependência ou não do oxigênio. (Fox, 2003; Nelson
& Cox, 2004). Em exercícios intensos, o metabolismo energético é extremamente
dependente de vias glicolíticas anaeróbicas (através da glicólise), de forma que o
glicogênio é o principal substrato e tem como produto final a produção e acúmulo do
ácido lático. (Saltin & Karlsson, 1971 apud Essén & Kaijser, 1978; Nelson & Cox,
2004). Em condições de repouso e em exercícios leves e moderados a produção de
ácido lático e sua remoção estão equilibradas, o que sugere a oxidação do substrato
para a produção de energia via sistema aeróbico. Ao contrário, o acúmulo de ácido
lático e a conseqüente diminuição no pH reduzem a eficiência muscular e a
recuperação após exercícios físicos. (Romijn et al., 1993; Bangsbo, 1996; Nelson &
Cox, 2004).
A produção aeróbica de energia ocorre no interior de organelas especiais
denominadas mitocôndrias, as quais estão localizadas em dois lugares distintos nas
fibras musculares, sendo eles: subsarcolemal e intermiofibrilar. A mitocôndria
subsarcolemal acumula-se nas fibras oxidativas (de contração lenta ou tipo I e de
13
contração rápida tipo IIa) e encontra-se geralmente adjacente aos capilares dessas
fibras. As fibras de contração rápida do tipo IIb possuem mitocôndrias delgadas que
se estendem perpendicularmente às miofibrilas na região da banda. Como são
organelas extremamente dependentes de oxigênio (O2), possuem etapas catabólicas
que envolvem a beta-oxidação, ciclo do ácido cítrico, cadeia de transporte de
elétrons, e a fosforilação oxidativa. (Cogswell et al., 1993; Bizeau et al., 1998).
1.2.1 Glicólise
A glicólise, tanto anaeróbica como aeróbica, resulta na produção de duas
moléculas de ácido pirúvico, dois ATP, e duas NADH + H+ por cada molécula de
glicose. A oxidação da glicose ou glicogênio anaerobicamente tem como produto
final a formação do ácido láctico a partir dos hidrogênios liberados durante esse
processo (Nelson & Cox, 2004). Entretanto, na glicólise aeróbia, o ácido pirúvico
será direcionado para a matriz mitocondrial e sofrerá uma série de reações químicas
onde o NADH produzido pela glicólise poderá ser oxidado. Uma vez no interior da
mitocôndria, dióxido de carbono (CO2) é enzimaticamente removido de cada ácido
pirúvico com três carbonos, para formar um ácido com dois carbonos, o ácido
acético. A enzima que catalisa essa reação combina o ácido acético com uma
coenzima chamada Coenzima A, que resulta na produção de Acetil coenzima A
(Acetil Co-A). (Fox, 2003; Nelson & Cox, 2004). Assim, o Acetil Co-A será o
substrato para as enzimas mitocondriais nas vias aeróbicas e dará início ao ciclo do
ácido cítrico. (Mathews et al., 1999; Fox, 2003).
14
1.2.2 Ciclo do Ácido Cítrico
O ciclo do ácido cítrico (CAC) ou do ácido tricarboxílico, é a via final
comum de oxidação aeróbica dos carboidratos, lipídeos e proteínas. (Murray et al.,
2003).
O ciclo consiste em uma série de oito reações que ocorrem na matriz
mitocondrial após o final da glicólise (no citoplasma) com a descarboxilação do
piruvato a acetil Co-A (Campbell, 2005; Pratt & Cornely, 2006) e é parte integrante
do processo no qual grande parte da energia livre liberada durante a oxidação de
combustíveis torna-se disponível. Resumidamente, a função do ciclo é oxidar os
grupos acetila do acetil Co-A, formando duas moléculas de CO2, de maneira que a
energia livre liberada é conservada nas coenzimas Nicotinamida-AdeninaDinucleotídeo reduzida (NADH) e Flavina-Adenina-Dinucleotídeo reduzida (FADH2).
Uma volta completa no ciclo oxida acetil Co-A, produz duas moléculas de CO2, um
composto de “alta energia” (GTP ou ATP), três moléculas de NADH e uma de
FADH2. (Devlin, 2003; Murray et al., 2003; Voet et al., 2008).
1.2.2.1 Reações e Enzimas do Ciclo do Ácido Cítrico
O ciclo tem seu início com a condensação da acetil Co-A com
oxaloacetato um ácido dicarboxílico de quatro carbonos. Esta reação é catalisada
pela enzima citrato sintase, localizada na matriz mitocondrial, e resulta na síntese
de citrato, um composto de seis carbonos (Devlin, 2003; Campbell, 2005; Pratt &
Cornelly, 2006; Murray et al., 2003; Voet et al., 2008).
15
O citrato é convertido em isocitrato por uma reação reversível catalisada
pela aconitase, na qual o grupo hidroxila do citrato é transferido para um carbono
adjacente. Esta reação ocorre na superfície da enzima aconitase, sem liberação do
intermediário proposto cis-aconitato. (Devlin, 2003; Campbell, 2005).
Na etapa seguinte do CAC, a enzima isocitrato desidrogenase catalisa
a descarboxilação oxidativa do isocitrato para formar α-cetoglutarato, com
concomitante redução de NAD+ em NADH. (Devlin, 2003; Pratt & Cornelly, 2006).
Esta enzima catalisa a primeira reação de desidrogenase do ciclo CAC. (Molnar et
al., 2004).
A quarta reação faz a conversão de α-cetoglutarato em succinil-CoA, e é
realizada
por
um
complexo
multienzimático
denominado
α-cetoglutarato
desidrogenase. Durante esta reação outra NAD+ é reduzida a NADH e também a
segunda molécula de CO2 do ciclo é produzida. (Campbell, 2005; Murray et al.,
2003; Pratt & Cornelly, 2006).
Em continuação ao ciclo, o succinil-CoA é convertido a succinato pela
succinil-CoA-sintetase. Esse é o momento do ciclo em que guanosina difosfato
(GDP) é fosforilado a guanosina trifosfato (GTP), uma molécula energeticamente
equivalente ao ATP. (Devlin, 2003; Pratt & Cornelly, 2006).
Succinato é oxidado a fumarato pela succinato desidrogenase, uma
enzima complexa fortemente ligada à superfície interna da membrana mitocondrial
interna. Essa enzima contém FAD e proteína ferro-enxofre e reduz diretamente a
ubiquinona na cadeia respiratória. (Devlin, 2003; Murray et al., 2003).
Em seguida, a fumarase catalisa fumarato à malato ao adicionar uma
molécula de água. (Murray et al., 2003). Esta reação é livremente reversível em
condições fisiológicas. (Devlin, 2003).
16
A
ultima
reação
do
CAC
é
catalisada
pela
enzima
malato
desidrogenase, na qual o malato é convertido a oxaloacetato, ao mesmo tempo em
que a terceira molécula de NAD+ do ciclo sofre redução à NADH. (Devlin, 2003;
Campbell, 2005; Voet et al., 2008).
1.3 Cadeia de transporte de elétrons (CTE)
A etapa final da oxidação geral dos alimentos - carboidratos, lipídeos e
aminoácidos – envolvem diversas reações químicas, libera elétrons e resulta na
produção de água (H2O) e dióxido de carbono (CO2), tendo o O2 como aceptor final
desses elétrons. Na matriz mitocondrial, os intermediários dessas reações, como o
ciclo do ácido cítrico, doam seus elétrons às coenzimas Nicotinamida-adeninadinucleotídeo
(NAD+)
e
Flavina-adenina-dinucleotídeo
(FAD)
tornando-as
reduzidas, formando NADH e FADH2 conseqüentemente. Cada uma destas
coenzimas, por sua vez, pode ser oxidada, ou seja, doar pares de elétrons à cadeia
de transporte de elétrons (CTE) (Boekema & Braun, 2007).
A CTE consiste numa série de 4 complexos protéico-enzimáticos
(complexos I, II, III, IV) com múltiplas subunidades que catalisam diferentes reações
de oxirredução. (Hatefi, 1985; Hinchliffe & Sazanov, 2005). Três desses quatro
complexos (complexos I, III, IV) translocam prótons da matriz mitocondrial para o
espaço intermembrana. (Boekema & Braun, 2007). A CTE ocorre na membrana
mitocondrial interna (MMI) e tem como função oxidar os co-fatores NADH e FADH2
reduzidos, por meio da transferência de elétrons ao mesmo tempo em que forma um
gradiente de prótons (H+) e libera energia livre dos elétrons. Parte dessa energia
livre pode ser captada e armazenada para a produção de ATP a partir da
17
fosforilação da Adenosina Difosfato (ADP) pelo fosfato inorgânico (Pi). Esse
processo é denominado fosforilação oxidativa e ocorre simultaneamente à medida
que os H+ do espaço intermembrana são conduzidos através da ATP-sintase (F1F0ATPase) para a matriz mitocondrial. (Adhihetty et al., 2003; Devlin, 2003; Champe et
al., 2006; Pratt & Cornelly, 2006; Boekema & Braun, 2007; Smith et al., 2007; Voet et
al., 2008).
Cada complexo da CTE aceita ou doa elétrons por meio de carreadores
específicos de elétrons como a Coenzima Q (ubiquinona) e o Citocromo C. Cada
carreador pode receber elétrons de um doador e, subsequentemente, doá-los para o
próximo complexo ou carreador da cadeia. A CTE ocorre na presença do O2 e é
responsável pela maior parte de sua utilização no organismo. (Champe et al., 2006).
Para melhor entendermos a CTE, a seguir será descrito detalhadamente
o funcionamento de cada um dos seus quatro complexos, com suas respectivas
moléculas e enzimas, bem como o funcionamento das moléculas carreadoras
envolvidas no referido processo.
1.3.1 Complexo I (NADH – Coenzima Q-Oxidorredutase)
O complexo I é o maior complexo protéico da CTE, pois contém
aproximadamente 43 subunidades (polipeptídeos) diferentes e uma massa
molecular total de 900 kD. (Hatefi, 1985; Devlin, 2003; Hinchliffe & Sazanov, 2005).
Esse complexo, freqüentemente denominado NADH desidrogenase, transfere
elétrons a partir de NADH para um de seus carreadores específicos, a ubiquinona,
também denominada coenzima Q (CoQ). (Devlin, 2003; Boekema & Braun, 2007).
18
O
complexo
I
inclui
vários
grupamentos
prostéticos,
também
denominados centros redox, sendo eles uma molécula de mononucleotídeo de
flavina (FMN) e seis a oito grupos ferro-enxofre (Fe-S) que participam do
transporte de elétrons. (Devlin, 2003; Pratt & Cornelly, 2006; Voet et al., 2008).
A oxidação de NADH envolve a transferência de dois elétrons e dois
prótons de NADH para FMN, que imediatamente transfere os elétrons, um de cada
vez, aos grupos Fe-S, e estes, por sua vez, doam os elétrons à coenzima carreadora
CoQ. (Devlin, 2003; Hinchliffe & Sazanov, 2005; Champe et al., 2006; Pratt &
Cornelly, 2006; Voet et al., 2008). Os centros redox não precisam estar em íntimo
contato uns com os outros, pois os elétrons podem se mover através de um “túnel”
de ligações covalentes da proteína (Pratt & Cornelly, 2006). O FMN está firmemente
ligado a proteínas; entretanto, a CoQ possui uma cauda hidrofóbica que a torna
solúvel na camada lipídica da MMI. (Voet et al., 2008).
À medida que os elétrons são transferidos do NADH para a CoQ, o
complexo I transfere quatro prótons da matriz mitocondrial para o espaço
intermembra. O mecanismo exato desse processo ainda não é bem entendido, mas
provavelmente é executado por alterações de conformação da proteína, que
ocorrem
quando
os
grupamentos
redox
são
reduzidos
e
reoxidados
temporariamente. (Champe et al., 2006; Pratt & Cornelly, 2006; Smith et al., 2007;
Voet et al., 2008).
1.3.2 Complexo II (SDH – Succinato Desidrogenase)
O complexo II, que contém a enzima do CAC succinato desidrogenase
(SDH) e três outras pequenas subunidades, transfere elétrons do succinato a CoQ.
19
A SDH é a única enzima do ciclo do ácido cítrico que não é solúvel na matriz
mitocondrial, pois está embutida na MMI. Seus grupos redox incluem o FAD ligado
covalentemente à succinil-desidrogenase, para a qual os elétrons são inicialmente
transferidos, um grupo (4Fe-4S), um grupo (3Fe-4S) e o citocromo b560. (Devlin,
2003; Pratt & Cornelly, 2006; Voet et al., 2008).
A energia livre desse complexo é insuficiente para promover a síntese de
ATP, pois este complexo não empreende a translocação de prótons, por não
atravessar por completo a MMI. Porém, o complexo é importante porque permite que
elétrons de potencial relativamente alto entrem na CTE por uma via independente do
complexo I. Apesar de seus nomes, os complexos I e II não operam em série, mas
ambos transferem elétrons para a CoQ a partir de substratos reduzidos (NADH ou
Succinato). (Champe et al., 2006; Pratt & Cornelly, 2006; Voet et al., 2008).
1.3.3 Complexo III (Coenzima Q-Citocromo c-Oxidorredutase)
O complexo III, também conhecido como citocromo bc1, catalisa a
transferência de elétrons da CoQ reduzida (ubiquinol) para o citocromo c acoplado
ao deslocamento de prótons através da MMI. Esse complexo possui 9 a 10
subunidades das quais três tem grupos prostéticos que funcionam como centros
redox, sendo eles: citocromo b, citocromo c1, cada um contendo um grupo heme,
e a proteína ferro-enxofre Rieske, que contém um grupo 2Fe-2S. Os hemos dos
citocromos sofrem redução reversível por um elétron, com o átomo de Fe central
alternando-se entre os estados Fe3+ (oxidado) e Fe2+ (reduzido). (Devlin, 2003;
Champe et al., 2006; Pratt & Cornelly, 2006; Voet et al., 2008).
20
A função do complexo III é permitir que uma molécula de CoQH2, um
transportador dieletrônico, reduza duas moléculas de citocromo c, um transportador
monoeletrônico. Isso ocorre por meio de uma “bifurcação” do fluxo de elétrons da
CoQH2 para o citocromo c1 e para o citocromo b. Esse é o chamado ciclo Q, que
permite que o complexo III bombeie prótons da matriz mitocondrial para o espaço
intermembrana. (Voet et al., 2008).
O citocromo c funciona como um transportador móvel da CTE que
transfere os elétrons do complexo III ao complexo IV. A proteína é mantida ligada à
face externa da MMI, onde se liga ao citocromo c1 do complexo III e aceita elétrons.
Por sua vez, o citocromo c reduzido aparentemente se move ao longo da superfície
da membrana, onde interage com a subunidade II da citocromo c oxidase, e
finalmente doa elétrons ao centro CuA. (Devlin, 2003; Navarro & Boveris, 2007).
1.3.4 Complexo IV (Citocromo c-Oxidase)
A função do complexo IV é oxidar o citocromo c e reduzir o O2 a H2O.
(Boekema & Braun, 2007; Navarro & Boveris, 2007). Este complexo contém quatro
centros redox, sendo eles: citocromo a, citocromo a3, um átomo de cobre
conhecido como CuB e um par de átomos de cobre conhecido Centro CuA. O centro
CuA, o qual liga à subunidade II, está localizado logo acima da superfície da MMI, e
tem seus dois íons de cobre conectados por dois átomos de enxofre de resíduos
Cisteínas, representando uma geometria similar à de um centro (2Fe-2S). Os outros
grupos redox – CuB e os citocromos a e a3 – estão ligados à subunidade I e
localizam-se abaixo da superfície da MMI. (Voet et al., 2008).
21
A transferência de elétrons no complexo IV é linear, procedendo do
citocromo c para o centro CuA, daí para o heme a e finalmente ao heme a3 e CuB. O
Fe do heme a3 fica muito próximo do CuB; esses grupos redox, que podem ser
interligados por uma molécula de H2O, formam um único complexo binuclear. Os
elétrons parecem mover-se entre os centros redox do Complexo IV, por meio de
uma rede de ligações de hidrogênio que envolve as cadeias laterais dos
aminoácidos, o esqueleto polipeptídico e as cadeias laterais do proprionato dos
grupos heme. A redução do O2 a 2 H2O pela citocromo c-oxidase ocorre no
complexo binuclear citocromo a3-CuB e requer a transferência quase simultânea de
quatro elétrons, dois prótons para cada par de elétrons. (Devlin, 2003; Champe et
al., 2006; Pratt & Cornelly, 2006; Navarro & Boveris, 2007; Voet et al., 2008).
1.4 Fosforilação Oxidativa
Durante a transferência de elétrons para o O2 via cadeia de transporte de
elétrons ocorre uma bomba de prótons, ou seja, prótons são deslocados da matriz
mitocondrial para o espaço intermembrana através da MMI, aumentando a
concentração de prótons fora da matriz, tornando este local mais ácido. (Devlin,
2003; Murray et al., 2003). Este desequilíbrio de prótons tem uma energia livre
associada que será utilizada pela ATP-sintase para gerar ATP na matriz mitocondrial
em um fenômeno denominado fosforilação oxidativa. (Devlin, 2003; Voet et al.,
2008).
A MMI é impermeável a prótons que se acumulam do lado externo
criando um gradiente eletroquímico através da membrana. A energia armazenada
nesse gradiente eletroquímico, também chamado de força próton-motriz, pode
22
impulsionar a atividade de uma ATP-sintase a formar ATP a partir de ADP + Pi.
(Devlin, 2003; Dudkina et al., 2005; Murray et al., 2003; Pratt & Cornelly, 2006).
Estima-se que, para cada NADH oxidada, o complexo I transloca quatro
prótons e os complexos III e IV translocam, entre si, 6 prótons. (Murray et al., 2003).
Então, para estabelecer o gradiente eletroquímico, dez prótons são bombeados
através da MMI durante a transferência de cada par de elétrons do NADH para o O2.
(Devlin, 2003).
1.4.1 Fosforilação Oxidativa e ATP-sintase
A ATP sintase, também conhecida como F1F0-ATPase, é uma proteína
transmembrana de multi-subunidades com uma massa molecular total de 450 kD.
(Voet et al., 2008). Esta proteína é composta por duas unidades funcionais, F0 e F1.
A ATP-sintase funciona como um motor rotatório para sintetizar ATP, onde o fluxo
de prótons passa através de F0 e causa sua rotação, promovendo a produção de
ATP pela unidade F1. (Murray et al., 2003).
A unidade F0 é um complexo protéico integral de membrana que fica
embutido na MMI e é constituído de uma subunidade a e duas subunidades b que se
estendem para cima interagindo com a unidade F1, e nove ou mais subunidades c
que formam um anel cilíndrico na MMI. (Pratt & Cornely, 2006). A F0 mitocondrial
contém subunidades adicionais cujas funções não estão esclarecidas. (Voet et al.,
2008). A unidade F1 contém sítios de ligação de ATP e ADP, e está envolvida nas
reações catalíticas da síntese de ATP. (Devlin, 2003). A unidade F1 é composta
pelas subunidades α3β3γδε. As subunidades α e β, que possuem seqüências 20%
idênticas e conformações quase idênticas, estão distribuídas alternadamente sobre
23
a porção superior de uma α−hélice formada pelo segmento C-terminal da
subunidade γ. A porção inferior da hélice forma uma espiral antiparalela para a
esquerda com o segmento N-terminal da subunidade γ. Essa espiral é
provavelmente parte do eixo principal que liga F1 a F0. (Voet et al., 2008).
Embora alguns estudos avaliaram as adaptações da CTE ao treinamento
(Tonkonogi et al., 2000; Ponsot et al., 2006; Menshikova et al., 2006; Johnston, et
al., 2008) poucos relatam os efeitos agudos do exercício físico sobre a CTE (Molnar
et al., 2004; Green et al., 2008). Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a
atividade da CTE imediatamente após diferentes intensidades de exercício.
24
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
•
Verificar os efeitos agudos de diferentes intensidades de exercício físico
sobre a atividade dos complexos da cadeia respiratória em músculo
esquelético de ratos.
2.2 Específicos
•
Avaliar os níveis de lactato sanguíneo em diferentes intensidades do exercício
físico.
•
Avaliar o conteúdo de glicogênio muscular em diferentes intensidades do
exercício.
•
Avaliar os efeitos agudos de diferentes intensidades de exercício físico sobre
a atividade das enzimas dos complexos da cadeia transportadora de elétrons.
25
CAPÍTULO 3
Effects of different intensities of physical exercise on the activity of
respiratory chain complexes
1
Luciano D. Silva, 1Cleber A. Pinho, 1Luis G. C. Rocha, 2Juliana F. Daufenbach,
1
Luciano A. da Silva, 2Emílio L. Streck, 1Ricardo A. Pinho
1
Laboratório de Fisiologia e Bioquímica do Exercício, Programa de Pós-graduação
em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, SC, Brazil.
2
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-graduação em
Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, SC, Brazil.
RUNNING TITLE: Differents intensities of physical exercise increase the electron
transport chain enzymes activities.
Keywords: acute exercise, skeletal muscle, electron transport chain, mitochondrial.
Corresponding author: Ricardo A. Pinho, PhD. Laboratório de Fisiologia e
Bioquímica do Exercício, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde,
Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC, Brazil. Fax: +
55 48 3431-2539. E-mail: [email protected]
26
Abstract
The electron transport chain (ETC) consists of four complexes (I, II, III, and IV), each
capable of catalyzing electron transfer in a partial reaction of the respiratory chain.
During the electron transfer, a proton-motive force is generated across the inner
mitochondrial membrane leading to ATP synthesis. Intensive and acute exercise
causes increased oxygen consumption, accompanied by an increase in ETC enzyme
activities in the muscle. The present study investigated the effects of various
intensities of acute physical exercise on the activity of respiratory chain complexes of
the soleus muscle of rats. Thirty-six 2-month-old male Wistar rats weighing 200 to
250 g were used in the experiments and were cared for according to the European
Communities Council Directive of 24 November 1986. All animals were accustomed
to treadmill running for one week. Animals were randomly distributed into six groups
(n=6) that performed differents levels of exercise intensity: first level (0.6 km/h);
second level (0.6 and 0.8 km/h); third level (0.6; 0.8 and 1.0 km/h); fourth level (0.6;
0.8; 1.0 and 1.2 km/h); fifth level (0.6; 0.8; 1.0; 1.2 and 1.4 km/h); and sixth level (0.6;
0.8; 1.0; 1.2; 1.4 and 1.6 km/h). Immediately after exercise, the blood was removed
and animals were killed by decapitation. The soleus muscles (red fibers) were
removed and stored at –70 ºC. Level blood lactate (BL), muscle glycogen content
(MG), creatine kinase (CK), succinate dehydrogenase (SDH), complexes I, II, III and
IV (C-I, C-II, CIII, C-IV) were measured. Results show that the starting speed of 1.0
km/h increased BL level, while 1.2 km/h decreased MG content and increased
muscle damage (CK). ETC enzyme activities increased with the increase of exercise
intensity (C-I, 0.8 km/h; C-II and C-III, 1.0 km/h; and C-IV, 1.2 km/h). In conclusion,
the activities of the ETC enzymes in the soleus muscle increased gradually according
to exercise intensity.
Introduction
Intensive and acute exercise causes an increase in oxygen consumption,
followed by increase in the activities of the electron transport chain enzymes in
muscle (Kayatekin et al. 2002). The electron transport chain (ETC) consists of a
series of electron carriers that function as redox pairs and that are mainly prosthetic
27
groups of integral proteins, resulting in the production of adenosine triphosphate
(ATP). This process is called oxidative phosphorylation (Dudkina et al. 2005).
Mitochondrial oxidative phosphorylation constitutes the major cellular ATP-producing
mechanism under aerobic conditions. The flux of electrons through the complexes of
the respiratory chain from the NADH- and FADH2-linked substrates to O2 is coupled
with the generation of mitochondrial transmembrane electrochemical potential
across the mitochondrial inner membrane (Mitchell, 1966).
During physical exercise, energy turnover in skeletal muscle may increase
400 times compared to that in muscles at rest (Tonkonogi & Sahlin, 2002), and this
depends on number, size and efficiency of a muscle’s mitochondria. However,
physical training, and especially endurance training, has been shown to increase the
number and size of mitochondria (Holloszy & Coyle, 1984).
This adaptation is
associated with increases in the activity and expression of enzymes involved in
oxidative phosphorylation (Green et al. 1999). The effects of intense physical
exercise on muscle biochemical events have been target of several studies. The
main alterations involve the energy metabolism (Tonkonogi & Sahlin, 2002; Aguiló et
al. 2005; Holloway et al. 2006) muscle damages (Duncan Jr. & Prasse, 1986;
Cardinet III, 1997; Millet et al. 2003; Mastaloudis et al. 2006) and oxidative stress
markers (Sentürk et al. 2001; Mastaloudis et al. 2004; Pinho et al. 2006; Powers &
Jackson, 2008; Reid, 2008).
Contractile activity-induced adaptations in muscle are highly specific and
dependent upon the type of exercise (i.e. resistance vs. endurance), as well as its
frequency, intensity and duration (Adhihetty et al. 2003). Depending on the
characteristics of the exercise, studies have shown that ETC enzyme activities and
other oxidative metabolism markers can be increased (Carter et al. 2001; Hawley,
2002; Parise et al. 2005) or decreased (Molnar et al. 2004; Green et al. 2008);
however, the alterations in those markers during different intensities are not clear yet
and the information are limited. Thus, the aim of the present study was to investigate
the effects of treadmill physical exercise at different intensities on oxidative
metabolism markers in the skeletal muscle of rats.
28
Methods
Animal Preparation
Thirty-six 2-month-old male Wistar rats weighing 200 to 250 g were housed in a
temperature-controlled room (24 ºC) with a 12:12-h reversed light-dark cycle (07:0019:0 h dark; 19:00-07:00h light). Tap water and standard rodent laboratory diet were
supplied ad libitum. The animals were looked after in accordance with the “Guiding
Principles in the Care and Uses of Animals” (Olert et al. 1993) and protocols were
approved by the local Ethics committee.
Exercise Protocol
All animals were accustomed to treadmill running for one week (10 m.min-1, 0.6 km/h,
without inclination for 10 min.day-1). They were randomly distributed into six groups
(n=6) with different levels of exercise intensity: first level (0.6 km/h); second level (0.6
and 0.8 km/h); third level (0.6, 0.8 and 1.0 km/h); fourth level (0.6, 0.8, 1.0 and 1.2
km/h); fifth level (0.6, 0.8, 1.0, 1.2 and 1.4 km/h); and sixth level (0.6, 0.8, 1.0, 1.2,
1.4 and 1.6 km/h). Preliminary data in our laboratory show that 6 km/h for 3 minutes
does not alter the oxidative metabolism markers in skeletal muscle of rats (data not
shown). Therefore, the first level was taken as control.
Test exercise and sacrifice
After an adaptation period, the animals were submitted to a test with a starting speed
of 0.6 km/h and a gradual increase (0.2 km/h) every 3 minutes, without inclination
(adapted of Gava et al. 1995). The rats did not receive any electric stimuli to run.
Immediately after each level of exercise, blood was collected and animals were killed
by decapitation. The soleus was then surgically removed, processed and
immediately stored at -70 ºC for later analysis.
Homogenate preparation
The soleus muscle was homogenized (1:10, w/v) in SETH buffer (250 mM sucrose, 2
mM EDTA, 10 mM Trizma base, 50 IU/mL heparin, pH 7.4). The homogenates were
centrifuged at 800×g for 10 min and the supernatants were stored at −70 °C until
being used for determining succinate dehydrogenase (SDH) and mitochondrial
respiratory chain enzyme activities. The maximal period between homogenate
preparation and enzyme analysis was always less than 5 days.
29
Reagents and animals
Thiobarbituric
acid,
adrenaline,
trichloroacetic
acid,
dinitrophenylhydrazide,
phenazine methosulfate, succinate, 2, 6-dichloroindophenol, potassium phosphate;
ferricyanide, NADH, rotenone, succinate, sodium azide, cytochrome c, n-dodecyl-βD-maltoside, 2–4 lactate kit were purchased from Labtest (Brazil). The male Wistar
rats were obtained from the animal house of the Universidade do Extremo Sul
Catarinense (Criciúma, Santa Catarina, Brazil).
Blood lactate
Lactate level was determined in a blood sample drawn from the tail vein and
analyzed by lactimeter (ACCUSPORT lactimeter, Boehring Mannheim) immediately
after each exercise level, as an indicator of exercise intensity (Favier et al. 1986).
Lactate level was expressed in mmol/L blood.
Creatine kinase (CK)
CK activity was used as an indicator of muscle damage. A specific kit supplied by
Labtest Diagnóstica SA was used. The serum samples were submitted to CK level
testing, following instructions of the manufacturers.
Muscle glycogen content (MG):
MG was used as a marker of glycolytic metabolism and was quantified by the
reaction with Kb+l2 (Krieger et al. 1980). Briefly, 300 mg of tissue was boiled for 20
min in 30% of KOH and after that, muscle glycogen was precipitated by the addition
of 60% of ethanol. The solution was heated during 10 min at 70 ºC, followed by
incubation in ice for 15 min and centrifugation for 9 min at 600×g. Then the
supernatant was dissolved again in Milli Q water and an 100µl aliquot was mixed in a
solution of Kb-l2 in saturated solution of CaCl2. MG content was determined by the
absorbance at 460 nm.
Succinate dehydrogenase (SDH):
Phenazine oxireductase (soluble succinate dehydrogenase - SDH) was measured by
the decrease in absorbance due to the reduction of 2, 6-dichloroindophenol (DCIP) at
600 nm, with 700 nm as the reference wavelength, in the presence of phenazine
methosulfate (Fischer et al. 1985).
30
Electron transport chain enzymes activities:
On the day of the assays, the samples were frozen and defrosted three times in
hypotonic assay buffer to fully expose the enzymes to substrates and achieve
maximal activities. NADH dehydrogenase (complex I) was evaluated according to the
method described by Cassina & Radi (1996), by measuring the rate of NADHdependent ferricyanide reduction at 420 nm. The activities of succinate:DCIP
oxidoreductase (complex II) and succinate:cytochrome c oxidoreductase (complex II–
III) were determined according to the method of Fischer et al. (1985). Complex II
activity was measured by following the decrease in absorbance due to the reduction
of 2,6-DCIP at 600 nm. Complex II-III activity was measured by cytochrome c
reduction from succinate. The activity of cytochrome c oxidase (complex IV) was
assayed according to the method described by Rustin et al. (1994), measured by
following the decrease in absorbance due to the oxidation of previously reduced
cytochrome c at 550 nm. The activities of the mitochondrial respiratory chain
complexes were expressed as nmol/min mg protein.
Protein content:
Protein concentration was estimated by the method of Lowry et al. (1951), using
bovine serum albumin as standard.
Statistics:
Means ± S.E.M. were calculated, and multiple comparisons were performed by using
one-way ANOVA with Tukey's post-hoc tests. A P value <0.05 was considered
significant. The software used for data analysis was the Statistical Package for the
Social Sciences (SPSS) version 16.0 for Microsoft Windows.
Results
Blood lactate (BL)
Results in Figure 1 show a significant gradual increase in blood lactate from third
level of exercise intensity on when compared to the first level.
31
Creatine kinase (CK)
According to Figure 2, the results show a significant increase in CK activity (serum)
from fourth level on when compared to the first level.
Muscular glycogen content (MG)
The results (Figure 3) indicate a significant decrease in MG content from fourth level
on when compared to first level.
Succinate dehydrogenase (SDH)
Results in Figure 4 show a significant increase in SDH activity from the third level
when compared to the first level. However, the third level was significantly increased
in relation to the subsequent levels.
Electron transport chain enzymes activities
The results show a significant increase in Complex I activity from the second level
when compared to the first level. In addition, the activity in the fifth and sixth levels
was higher when compared to the previous levels (Figure 5A). Similarly, results of
activities in Complex II and III (Figures 5B and 5C, respectively) show a significant
increase starting from third level when compared to the previous levels and in
Complex IV (Figure 5D) starting from the fourth level of exercise intensity when
compared with first level.
Discussion
One of the key adaptations to endurance exercise training is the increase in
mitochondrial oxidative enzymes of the muscles involved in exercise (Holloszy, 1967;
Holloszy & Coyle, 1984; Booth & Baldwin, 1996; Essig, 1996). Previous studies have
indicated that skeletal muscle enzymes of the citric acid cycle, of the electron
transport chain, and also of fatty acid oxidation, all increase in response to an
endurance training program or to chronic electrical stimulation (Holloszy, 1967;
Holloszy & Coyle, 1984; Booth & Baldwin, 1996; Essig, 1996). However, there have
been few studies with a special focus on ETC alterations in rats immediately after
different exercise intensities. In this study, we have shown that ETC enzyme activities
32
increased gradually according to exercise intensity. We have further shown that
between 1.0 and 1.2 km/h seems to be a speed of metabolic transition where
significant alterations occur in muscle metabolism, e.g. a significant reduction in
muscle glycogen content, an important increase in lactate levels and an increase in
ETC enzyme activities.
If the contractile activity is repeated on a regular basis, changes in the protein
content of the enzyme occur that alter the maximal activity of enzymes. The specific
changes that occur to the enzymes are to a large degree dependent on the strain
imposed on the metabolic pathway as dictated by the type of metabolism, the
metabolic rate, and the substrate used (Pette & Dölken, 1975). Level of blood lactate
and MG content depletion were used as indicators of exercise intensity and glycolytic
metabolism. The results shown in figures 1 and 3 (lactate level and muscle glycogen
content) suggest alterations in the energy metabolism starting from the third and
fourth levels (1.0 km/h and 1.2 km/h, respectively) in skeletal muscle of rats, which
might represent a transition in the cellular ATP-producing mechanism. Ferreira et al.
(2007), demonstrated lactate levels of 3 mmol/l at a speed of 0.9 km/h in an
incremental exercise test. The model of exercise intensity used in this study is
characterized by a three-fold increase in post-exercise blood lactate concentration,
suggesting an anaerobic component in high intensity exercise sessions. Metabolic
acidosis (Kayatekin et al. 2002) and muscle glycogen depletion (Tonkonogi et al.
1997) themselves may be involved as an anaerobic component after exercise. It is
possible that the exercise intensity above that has a net contribution of energy
associated with lactate accumulation due to an increased glycolysis rate and
exceeds the rate of mitochondrial pyruvate utilization. The decrease in muscle
glycogen is related to increased glycolytic activity produced by an acute increase of
the catabolic hormone during exercise (Kjaer, 1998).
Although several factors could contribute to the apparent decrease in nonmitochondrial cellular constituents, resulting in an apparent increase in enzyme of the
citric acid cycle (CAC), the depletion of endogenous glycogen that occurs with
exercise is the most obvious (Tonkonogi et al. 1997). The results of our study (Figure
4) show a significant increase of SDH at a starting speed of 1.0 km/h. Others studies
show increases in SDH activities of the skeletal muscles of rats in response to
chronic endurance training (Krieger et al. 1980; Chilibeck et al. 1998). In previous
studies reporting increases in CS activity, glycogen depletion in working muscle
33
would be expected to be substantial given the nature of the exercise protocols
employed (Tonkonogi et al. 1997; Leek et al. 2001; Fernström et al. 2003). We
reported that one session exercise is sufficient to increase SDH levels (at a speed of
1.0 km/h) and deplete glycogen levels (at a speed of 1.2 km/h).
Intense exercise-induced increases in enzyme activities in plasma found in
skeletal muscle have been attributed to skeletal muscle damage (Lee & Clarkson,
2003). Results show that CK activity increased significantly starting from the fourth
level, i.e. corresponding to a speed of 1.2 km/h. This suggests the presence of
muscular microlesions, indicating ultrastructural disruption of sarcolema (Millet et al.
2003).
The most documented adaptation has been in response to regular,
submaximal and moderate exercise in which oxidative phosphorylation represents
the dominant form of ATP resynthesis. This form of training results in an increase of
mitochondrial content and increases in the maximal activity of a wide range of
electron transport chain enzymes (Holloszy & Coyle, 1984). Menshikova et al. (2007)
showed the adaptation of skeletal muscle to moderate intensity exercise and
increased enzymatic capacity of NADH-oxidase and ubiquinol-oxidase. Vaynman et
al. (2006), showed that 3 days of free access to wheel running increased activity of
COX-II, while Boveris & Navarro, (2008) suggested that physical exercise was almost
selective on complexes in different organs. However, in intense exercise, results are
still conflicting and inconclusive. In the present study, results show that one single
exercise session is sufficient to increase ETC enzyme activities and that there is a
gradual increase in enzyme activity in all complexes according to exercise speed. In
contrast, some authors demonstrated a decrease in CTE enzymes activity after
intense exercise. Green et al. (2008), find decreases in cytochrome-c oxidase and
succinate dehydrogenase during intermittent exercise. Molnar et al. (2004) showed
that ninety-five minutes of exhaustive physical exercise induced a decrease in
Complex I and Complex IV. It is possible that these differences could be related to
different exercise protocols, different tissues analyzed or animal ages. It has been
reported that in human muscle a single exercise session increased both the mRNA
(Koval et al. 1998; Kraniou et al. 2000) and protein (Koval et al. 1998) levels of this
enzyme within 3 h following exercise. Although those studies present similar results,
none of them has analyzed different levels or phases of exercise.
34
In summary, the results of the present study suggest a differential response of
muscle oxidative metabolism during different speeds of intense exercise. This is
accompanied by a differential modulation of ETC enzymes activities.
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Acknowledgments
This research was supported by grants from CNPq/MCT (Brazil), CAPES/MEC
(Brazil) and UNESC (Brazil).
39
Figures and Legends
Lactate (nmol/L blood)
7
*
6
5
4
*
*
*
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Intensity Level
CK activity (U/L)
Figure 1. Blood lactate level (BL) of rats after different intensity of exercise. The
values are presented as Mean±SEM and expressed in mmol of Lactate/L blood.
p<0.05, *different from Level 1. The animals submitted in test progressive in treadmill
every 3 minutes, without inclination. Level 1 (0.6 km/h); level 2 (0.6 and 0.8 km/h);
level 3 (0.6; 0.8 and 1.0 km/h); level 4 (0.6; 0.8; 1.0 and 1.2 km/h); level 5 (0.6; 0.8;
1.0; 1.2 and 1.4 km/h); and level 6 (0.6; 0.8; 1.0; 1.2; 1.4 and 1.6 km/h).
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
1
2
3
*
*
4
5
*
6
7
Intensity Level
Figure 2. Creatine kinase activity (CK) of rats after different intensity of exercise. The
values are presented as Mean±SEM and expressed in U/L serum. p<0.05, *different
from Level 1 and 2. The animals submitted in test progressive in treadmill every 3
minutes, without inclination. Level 1 (0.6 km/h); level 2 (0.6 and 0.8 km/h); level 3
(0.6; 0.8 and 1.0 km/h); level 4 (0.6; 0.8; 1.0 and 1.2 km/h); level 5 (0.6; 0.8; 1.0; 1.2
and 1.4 km/h); and level 6 (0.6; 0.8; 1.0; 1.2; 1.4 and 1.6 km/h).
Glycogen(mg/100mg tissue-1)
40
6
5
4
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Intensity Level
Figure 3. Muscular glycogen content (MG) of rats after different intensity of exercise.
The values are presented as Mean±SEM and expressed in mg/100mg tissue-1.
p<0.05, *different from Level 1. The animals submitted in test progressive in treadmill
every 3 minutes, without inclination. Level 1 (0.6 km/h); level 2 (0.6 and 0.8 km/h);
level 3 (0.6; 0.8 and 1.0 km/h); level 4 (0.6; 0.8; 1.0 and 1.2 km/h); level 5 (0.6; 0.8;
1.0; 1.2 and 1.4 km/h); and level 6 (0.6; 0.8; 1.0; 1.2; 1.4 and 1.6 km/h).
25
nmol/mg protein
*#
20
*
*
15
*
10
5
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Intensity level
Figure 4. Succinate Dehydrogenase activity (SDH) of rats after different intensity of
exercise. The values are presented as Mean±SEM and expressed in nmol/mg
protein. p<0.05, *different from Level 1 and # different from level 2, 4, and 5. The
animals submitted in test progressive in treadmill every 3 minutes, without inclination.
Level 1 (0.6 km/h); level 2 (0.6 and 0.8 km/h); level 3 (0.6; 0.8 and 1.0 km/h); level 4
(0.6; 0.8; 1.0 and 1.2 km/h); level 5 (0.6; 0.8; 1.0; 1.2 and 1.4 km/h); and level 6 (0.6;
0.8; 1.0; 1.2; 1.4 and 1.6 km/h).
41
nmol/min/mg protein
1200
A
1000
800
*#
*#
5
6
*
600
*
*
2
3
400
200
0
0
1
4
7
nmol/min/mg protein
Intensity Level
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
B
*
*
*
0
1
2
3
4
*
5
6
7
nmol/min/mg protein
Intensity Level
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
C
0
*
1
2
3
*
*
4
5
*
6
7
Intensity Level
nmol/min/mg protein
160
D
140
*
120
*
*
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
Intensity Level
5
6
7
42
Figure 5. Mitochondrial respiratory chain enzyme activities of rats after different
intensity of exercise. The values are presented as Mean±SEM and expressed in
nmol/min/mg protein. p<0.05. A= complex I (*different from Level 1-2; # different
levels 1-4); B= complex II (*different from Level 1-2); C= complex III (*different from
Level 1-2); D= complex IV (*different from Level 1-2). The animals submitted in test
progressive in treadmill every 3 minutes, without inclination. Level 1 (0.6 km/h); level
2 (0.6 and 0.8 km/h); level 3 (0.6; 0.8 and 1.0 km/h); level 4 (0.6; 0.8; 1.0 and 1.2
km/h); level 5 (0.6; 0.8; 1.0; 1.2 and 1.4 km/h); and level 6 (0.6; 0.8; 1.0; 1.2; 1.4 and
1.6 km/h).
43
4 DISCUSSÃO
Compreender os mecanismos bioquímicos na adaptação da CTE ao
exercício físico crônico tem instigado os cientistas do exercício nas ultimas décadas.
(Tonkonogi et al., 2000; Ponsot et al., 2006; Menshikova et al., 2006; Johnston, et
al., 2008). Uma das principais adaptações ao treinamento de endurance é o
aumento na atividade das enzimas oxidativas mitocondriais do músculo-esquelético
envolvido no exercício. Estudos anteriores têm indicado que as enzimas do ciclo do
ácido cítrico e da CTE tiveram atividade aumentada em resposta ao treinamento de
endurance. (Holloszy, 1967; Holloszy et al., 1984; Essig. 1996; Booth & Baldwin,
1996).
Contudo, há poucos estudos que avaliaram a atividade das enzimas da
CTE imediatamente após diferentes intensidades de exercícios. (Molnar et al., 2004;
Green et al., 2008). Nesse estudo, nós demonstramos que a atividade das enzimas
da CTE aumentou progressivamente de acordo com a intensidade do exercício e
que entre 1.0 km/h e 1.2 km/h parece ser uma velocidade de transição metabólica
em que ocorrem alterações significantes no metabolismo muscular como uma
redução no conteúdo de glicogênio, aumento expressivo nos níveis de lactato e
aumento na atividade das enzimas da CTE.
As alterações na atividade de enzimas envolvidas no metabolismo
energético muscular são extremamente dependentes do trabalho imposto na via
metabólica, e são ditados pelo tipo de metabolismo, a taxa metabólica e o substrato
usado. (Pette & Dölken, 1975). Os níveis de lactato sistêmico e depleção do
conteúdo de glicogênio foram usados como indicadores da intensidade do exercício
e do metabolismo glicolítico. Embora a produção de lactato aconteça no músculo-
44
esquelético, seus níveis sistêmicos são indicadores do metabolismo energético e
implicam em um bom parâmetro de intensidade do exercício. Os resultados
observados no presente estudo sugerem uma alteração no metabolismo energético
muscular dos animais entre 1,0 km/h e 1,2 km/h, que pode representar uma
transição no mecanismo celular de produção de ATP. Ferreira et al., (2007),
demonstrou aumento nos níveis de lactato em velocidade 0,9 km/h de teste de
exercício incremental. O modelo de exercício intenso usado neste estudo é
caracterizado por um aumento de três vezes nas concentrações sanguíneas de
lactato após o exercício, sugerindo que um componente anaeróbico é usado em
uma sessão de exercício de alta intensidade.
Acidose metabólica (Kayatekin et al., 2002) e depleção no conteúdo de
glicogênio muscular (Tonkonogi et al., 1997) podem estar envolvidos como um
componente anaeróbico após exercício. É possível que a intensidade do exercício
em que haja uma demanda energética elevada associada com o acúmulo de lactato
devido a taxa de glicólise aumentada, exceda a taxa de utilização do piruvato
mitocondrial. Kjaer (1998) sugere que a diminuição do conteúdo de glicogênio
muscular durante o exercício está diretamente relacionada com o aumento da
atividade glicolítica, provocada pelo aumento agudo do hormônio catabólico induzido
pelo exercício.
Embora vários fatores possam contribuir para a diminuição dos
constituintes celulares não-mitocondriais, resultando em um aparente aumento das
enzimas do ciclo do ácido cítrico (CAC), a depleção de glicogênio endógeno que
ocorre com o exercício é uma das mais utilizadas. (Tonkonogi et al., 1997). Nossos
resultados mostram um aumento significativo na atividade da enzima do ciclo do
ácido cítrico, succinato desidrogenase (SDH) a partir do terceiro estágio. Outros
45
estudos demonstraram aumento na atividade da SDH de músculos-esqueléticos de
ratos em resposta ao treinamento com exercícios (Krieger et al., 1980; Chilibeck et
al., 1998). Estudos anteriores também relataram aumento na atividade da citrato
sintase (CS) em resposta a variados protocolos de treinamento. (Tonkonogi et al.,
1997; Leek et al., 2001; Fernström et al., 2003). Nós demonstramos que uma sessão
de exercício é suficiente para aumentar a atividade da SDH e reduzir o conteúdo de
glicogênio.
O aumento da atividade induzida pelo exercício intenso em enzimas
encontradas no plasma tem sido atribuído ao dano no músculo esquelético.
(Kayatekin et al., 2002; Lee & Clarkson, 2003). Os resultados mostram atividade
significativamente aumentada da CK a partir de 1,2 km/h. Isso sugere a presença de
microlesões musculares, indicando ruptura estrutural do sarcolema. (Millet et al.,
2003).
Alguns estudos têm demonstrado adaptações positivas da fosforilação
oxidativa, ao treinamento com exercício submáximo. Este tipo de treinamento resulta
em aumento do conteúdo mitocondrial e da atividade de enzimas do CAC e da CTE.
(Holloszy & Coyle, 1984).
A avaliação da fosforilação oxidativa tem sido o componente mais
investigado para verificar as alterações e adaptações induzidas pelo exercício físico.
Contudo, dependendo do tipo e intensidade do exercício os estudos apontam
resultados diferenciados (Menshikova et al., 2007; Vaynman et al., 2006, Aguiar et
al., 2008; Molnar et al., 2004).
Menshikova et al. (2007) mostrou adaptação do músculo-esquelético ao
exercício moderado/intenso ao verificar aumento da capacidade enzimática da
NADH-oxidase e ubiquinol-oxidase. Por sua vez. Vaynman et al. (2006) verificou que
46
os animais que foram expostos a três dias com acesso livre a roda de correr tiveram
aumento da atividade da COX-II. Boveris & Navarro (2008) sugerem que o exercício
físico é, em parte, seletivo nos complexos em diferentes órgãos. Contudo, em
exercícios intensos os resultados ainda são contraditórios e não conclusivos.
No presente estudo os resultados mostram que uma única sessão de
exercício é suficiente para aumentar a atividade das enzimas da CTE e que ocorreu
aumento progressivo da atividade das enzimas em todos os complexos de acordo
com a velocidade do exercício. Em contraste, somente alguns autores mostraram
diminuição da atividade das enzimas da CTE após exercício intenso. Green et al.
(2008), mostrou redução da atividade do citocromo-c oxidase (complexo IV) e da
succinato desidrogenase (CAC) durante o exercício intermitente. Molnar et al.
(2004), mostrou que noventa e cinco minutos de exercício exaustivo induziram uma
diminuição na atividade dos complexos I e IV. É possível que estas diferenças nos
resultados encontrados possam ser uma conseqüência de diferentes protocolos de
exercício, diferentes tecidos analisados ou animais com idades e diferentes. Em
músculo humano uma simples sessão de exercício aumentou os níveis de mRNA
(Koval et al., 1998; Kraniou et al., 2000) e de proteína (Koval et al., 1998) desta
enzima até três horas após o exercício. Embora esses estudos apresentem
resultados semelhantes nenhum deles analisou diferentes níveis ou fases do
exercício.
Em resumo, os resultados do presente estudo sugerem uma resposta
diferencial do metabolismo oxidativo muscular durante as diferentes velocidades de
exercício intenso. Esta é acompanhada por uma modulação diferencial da atividade
das enzimas da CTE.
47
5 CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES
Embora evidências experimentais demonstrem os efeitos adaptativos do
exercício físico em modelos animais e humanos sobre o metabolismo oxidativo
muscular, poucos estudos reportam as alterações que ocorrem nas diversas
intensidades durante uma única sessão de esforço. Assim, esse estudo é o primeiro
a mostrar que diferentes intensidades provocam respostas diferenciadas no
metabolismo oxidativo muscular, principalmente sobre os complexos da Cadeia
Transportadora de Elétrons.
Através desse estudo espera-se contribuir para melhor compreender e
elucidar os mecanismos bioquímicos envolvidos nos processos oxidativos muscular
durante o exercício físico, entretanto, outras investigações devem ser conduzidas
utilizando outros modelos animais e em humanos.
48
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