PowerPoint Presentation - Documented Gene Transfer in Bacteria
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Transferência da informação genética Ana Beatriz Santoro [email protected] Replicação do DNA • Características universais do mecanismo de replicação -Semi-conservativo -Bidirecional -Semi-descontínua Replicação semi-conservativa 1958: Matthew Meselson e Franklin Sthal Replicação bidirecional Replicação semi-descontínua Replicação do DNA bacteriano Estrutura Ɵ Vídeo Replicação do DNA bacteriano • Etapas: Início Elongação Término Estrutura da origem de replicação bacteriana • Apenas uma origem de replicação (E. coli: oriC 245 pb) • Origem de replicação muito conservada • Seqüências consenso de 9 e 13 pb rica em A-T • Seqüência GATC: alvo de metilação na adenina Origem de replicação em bactérias Somente origens completamente metiladas podem iniciar a replicação Proteínas presentes na origem de replicação Replicação do DNA bacteriano • Etapas: Início Elongação Término Proteínas presentes na forquilha de replicação DNA polimerases em E. coli A velocidade da forquilha de replicação bacteriana é de 50.000 pb/min Vídeo Atividade da DNA girase Replicação do DNA bacteriano • Etapas: Início Elongação Término Seqüências terminadoras • Terminação ocorre na região ter do cromossomo de E. coli • Região ter rica em G e T • Proteína Tus (terminus utilization substance) liga-se à região ter • Tus pára a forquilha de replicação através da inibição da atividade de helicase Resolução dos concatâmeros Transferência horizontal de genes • Organismo transfere material genético para outra célula que não é sua descendente (≠ transferência vertical) • Importante mecanismo genética de procariotos na evolução e variabilidade • Interações genéticas entre bactérias permitem a evolução de seus genomas mais rapidamente que as mutações apenas Descoberta da transferência gênica bacteriana 1946: Joshua Lederberg e Edward Tatum Transferência gênica bacteriana: necessidade de contato Bernard Davis Características gerais da transferência gênica em bactérias Unidirecional - Doador → receptor Pode ocorrer entre diferentes espécies Transferência parcial do genoma Interações genéticas entre bactérias • Tipos: Conjugação Transformação Transdução Conjugação • Definição: transferência de DNA de uma célula doadora para uma célula receptora através de contato direto entre elas • Mating types em bactérias: • Doador: - fator F (fator de fertilidade): plasmídeo circular que se replica de forma independente - Pilus F Doador • Receptor: - Ausência do fator F Receptor Pilus F e exclusão de superfície • Filamento extracelular que se extende da superfície da célula doadora; componentes: pilina e uma proteína na ponta que faz contato com a superfície da receptora. • O pilus reconhece vários receptores na superfície da célula receptora (LPS, protein) • Células F+ não conjugam com outra F+ devido ao fenômeno de “exclusão de superfície” • TraT– proteína da membrana externa bloqueia a formação do par e a proterína TraS bloqueia a transferência do DNA. Vídeo Estados fisiológicos do fator F • Autônomo (F+) – Características do cruzamento F+ x F• F- → F+ e F+ permanece F+ • Não há transferência de genes cromossomais da doadora F+ Estados fisiológicos do fator F • Integrado (Hfr: high-frequency recombination) – Características do cruzamento Hfr x F• F- raramente se transforma Hfr e Hfr permanece Hfr • Alta transferência de genes cromossomais da doadora F+ Hfr Estados fisiológicos do fator F • Autônomo com genes do doador (F’) – Características do cruzamento F’x F• F- → F’ e F’ permanece F’ • Alta transferência de genes da doadora presentes em F’ e baixa transferência de outros genes cromossomais Hfr F’ Inserção e excisão de F Cruzamento F+ x F• Formação do par • Transferência de DNA - Origem de transferência - Replicação círculo rolante F+ F- F+ F- F+ F+ F+ F+ Cruzamento F+ x F- Cruzamento Hfr x F• Formação par • Transferência de DNA - Origem de transferência - Replicação círculo rolante • Recombinação homóloga Hfr Hfr F- F- Hfr Hfr F- F- Cruzamento Hfr x F- Different Alleles Cruzamento Hfr x F- Mapeando a posição de genes por conjugação Mapeando a posição de genes por conjugação Mapeando a posição de genes por conjugação Cruzamento F’ x F• Formação do par • Transferência de DNA – Origem de transferência – Replicação círculo rolante F’ F- F’ F- F’ F’ F’ F’ Transformação • Definição: conversão de um genótipo para outro pela introdução de trechos de DNA exógeno • Fatores que afetam a transformação: - Competência do receptor: habilidade de incorporar o DNA extracelular, varia com o estado fisiológico da bactéria Muitas bactérias são naturalmente competentes, mas só o fazem em uma fase do ciclo de crescimento celular. Ex: Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Bacillus. Outras bactérias podem se tornar competentes por tratamentos específicos, Ex: CaCl2 / temperatura ; exposição a pulsos de altas voltagens (eletroporação). -Tamanho do DNA Eficiência de transformação é baixa com fragmentos e plasmídeos grandes - Recombinação entre seqüências homólogas no fragmento do DNA e no cromossoma da receptora- recombinação legítima Transformação - Etapas Transformação - Eletroporação Transformação - Eletroporação E. coli + pAmp/Kan eletroporação Recover at 37oC LB Amp+Kan Incubate at 37oC overnight LB Amp+Kan E. coli Transdução • Definição: transferência de DNA da célula doadora para a célula receptora por meio de bacteriófagos • Bacteriófagos - são vírus bacterianos - se replicam como parasitas bacterianos obrigatórios - partículas extra-celulares metabolicamente inertes - formadas de DNA e RNA (genoma) e proteínas (capsídeo, camada protetora do DNA) - tamanho genoma: 2-200 kb (dsDNA, ssDNA, dsRNA, circular ou linear ) Morfologia dos Fagos Bacteriófago T2 Phage M13 Bacteriófago Fago filamentoso Infecção por fagos • Etapas: 1. Adsorção do fago à célula bacteriana 2. Ligação irreversível 3. Contração da cápsula 4. Injeção do material genético Especificidade da infecção Cada espécie de bactéria é susceptível a uma série própria de fagos Cada fago só infecta um conjunto específico de hospedeiras Ex: fago A só infecta uma cepa de E. coli; fago B, pode infectar muitas cepas diferentes de E. coli. Susceptibilidade depende de receptores específicos na superfície da célula hospedeira- em geral carboidratos - LPS nas Gram - Ácido teicóico nas Gram+ - Alguns fagos se ligam ao pilus sexual (F). Fagos macho-específicos, ex: M13 Tipos de fagos Líticos ou virulentos- são fagos que se multiplicam na bactéria e causam a lise da célula no final do ciclo. Ex: Fagos T2, T4,T1-T7 de E. coli Fagos lisogênicos ou temperados- são fagos que se multiplicam via ciclo lítico e/ou entram em estado quiescente na célula através do qual o DNA do fago pode se integrar ao cromossoma da bactéria hospedeira, como profago. Ex: Fago Lambda () de E. coli. Ciclo lítico -Eclipse- partículas do fago não são encontradas no sobrenadante da cultura ou intracelularmente após inoculação da cultura com os fagos. Expressão de genes da fase inicial e tardia e do material genético - Acúmulo intracelular - Lise bacteriana e liberação dos fagos Number of Infectious Particles Ciclo de multiplicação de um fago lítico Extracellular Phage Total Phage Eclipse Acumulação intracelular Time after Infection Lise Fagos lisogênicos Se multiplicam via ciclo lítico e/ou entram em estado quiescente na célula. Em estado quiescente, material genético do fago está integrado (forma aleatória ou não) ao cromossoma da bactéria. O DNA do fago no estado reprimido é denominado profago A maioria dos genes do fago não é transcrita e está sob repressão. Fagos lisogênicos O DNA integrado no cromossoma é replicado junto ao do hospedeiro e é passado para as células flihas. A célula bacteriana que carreia um DNA integrado é denominada uma bactéria lisogênica, imune a infecção pelo mesmo fago! Conversão lisogênica- alguns fagos temperados além dos genes para o ciclo lítico e lisogênico, possuem genes cuja expressão dão à bactéria hospedeira novas características, Ex: genes virais para produção de toxinas por diversos patógenos bacterianos Ciclo lisogênico Transdução • Definição: transferência de DNA da célula doadora para a célula receptora por meio de bacteriófagos • Tipos -Generalizada: qualquer gene do doador bacteriano pode ser transferido para a receptora -Especializada: apenas certos genes do doador são transferidos à célula receptora Transdução Generalizada • • • • • Infecção da bactéria doadora Replicação do fago e degradação do DNA da hospedeira Montagem e liberação das partículas do fago Infecção da célula receptora Recombinação homóloga Vetor: bacteriófagos líticos- o DNA do doador em pedaços menores é empacotado em seus capsídeos Transdução Generalizada Transdução Especializada • Excisão do profago • Replicação do DNA, montagem das partículas e liberação dos fagos • Infecção da célula receptora • Lisogenização da receptora Vetor: bacteriófagos temperados- diferentes fagos transferem diferentes genes Integração do fago ao genoma bacteriano gal bio gal bio gal bio Transdução Especializada bio gal gal gal bio gal bio bio bio
