confecção de lâmina histológica a partir de um

INSTITUTO DE DESENVOLVIMENTO
EDUCACIONAL DO ALTO URUGUAI
FACULDADES IDEAU
CONFECÇÃO DE LÂMINA HISTOLÓGICA A PARTIR DE UM
FRAGMENTO DE TRAQUEIA BOVINA
BANDIERA, Christian1
[email protected]
ECKER, Diego Luiz1
[email protected]
FRIES, Andressa1
[email protected]
GIARETTON, Eduarda1
[email protected]
RITTER, Aline1
[email protected]
FILHO, José Roberto da Silva2
[email protected]
OLIVEIRA, Daniela dos Santos2
[email protected]
SCOLARI, Lidinara Castelli2
[email protected]
SILVA, Lisiane Borges da2
[email protected]
ROSÉS, Tiago2
[email protected]
URIO, Elisandra Andreia2
[email protected]
RITTER, Filipe³
[email protected]
1
Discentes do Curso de Medina Veterinária, Nível I 2016/1- Faculdades IDEAU – Getúlio Vargas/RS.
Docentes do Curso de Medicina Veterinária, Nível I 2016/1 - Faculdades IDEAU – Getúlio Vargas/RS.
³Coordenador do Curso de Medicina Veterinária,Nível I 2016/1- Faculdades IDEAU – Getúlio Vargas/RS.
2
RESUMO: Com o uso da histologia, que é caracterizada como um ramo da ciência que estuda tecidos animais e
vegetais, não somente a estrutura microscópica, mas também a das células, órgãos e seus sistemas, realizou-se a
coleta de um fragmento de traqueia bovina, que passou pelo processo de fixação para preservar sua morfologia,
em seguida foi realizada o processo de desidratação afim de que não houvesse lesões na estrutura dos tecidos.
Após a desidratação realizou-se a diafanização ou clareamento para remoção de água e álcool. Após estes
processos, a amostra foi colocada na estufa em um recipiente contendo parafina líquida a 60°, num total de dois
banhos para a evaporação do xilol e a ocupação de parafina nos espaços teciduais. Em seguida ocorreu o
emblocamento, onde a amostra juntamente com a parafina, foi depositada em um recipiente adequado para
posteriores cortes com o micrótomo. A amostra após ser emblocada e cortada na espessura de 7µ (mícras) foi
colocada em um suporte e levada a estufa a 60°, para o derretimento da parafina ainda presente. Antes do
processo de coloração a lâmina passou por um banho de xilol para a desparafinizaçao. Em seguida ocorreu a
hidratação, após realizou-se uma coloração de contraste com dois corantes para melhor identificação das
estruturas. A montagem da lâmina histológica finalizou-se com a aplicação de uma lamínula juntamente com
cola (ErvMount) para a fixação no órgão e a possível observação da lâmina no microscópio com um aumento de
400X. Concluindo o processo de confecção da lâmina, foi constatada uma ótima observação microscópica do
órgão, assim sendo possível o estudo do mesmo.
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Palavras-chave: traqueia, lâmina histológica, histologia, tecidos, cartilagem.
ABSTRACT: Withthe use ofhistology, which is characterized as a branch of science that studies plantand
animal tissues, not only the microscopic structure, bu tal so the cells, or gansand organ systems, collecting a
fragmento bovine trachea was performed, which has passed the fixing process to preserve the morphology, was
then performed as de hydration process in order that there were no lesions in tissue structure after de hydration
was carried out at diafanization or bleaching for removal of water and alcohol. After these processes, the sample
was placed in the oven in a container containing liquid paraffinat 60 ° for a total of two baths for the evaporation
of the xylene and paraffin place ment in tissue spaces. Then occurred embedment, where the sample with
paraffin, was placed in a suitable container for subsequent cutting with microtome. The sample after being
cutand emblocada 7μ in thickness (microns) was placedon a supportand brought to 60 ° oven for melting the
paraffin still present. Before the coloring process the blade went through a xylene bath for deparafinization. Then
hydration occurred after carried out a contrast staining with two colors for better identification of the structures.
The assembly of the histological slide was finalized by applying a cover slip to get her with glue (MountErv) for
fixing the body andcan slide in the microscope observation with a magnification of 400X. Completing the
process of making the blade, a great microscopic observation of the body, so it is possible the studyof it was
found.
Keywords: trachea, histologicalblade, histology, tissue, cartilage
1. INTRODUÇÃO
As células, estruturas consideradas as menores unidades morfológicas e funcionais dos
organismos, são responsáveis pela formação de todos os seres vivos. Alguns seres apresentam
apenas uma célula (unicelulares) e outros apresentam vários conjuntos dessas estruturas
(multicelulares), nesses organismos multicelulares, as células com características semelhantes
e que exercem a mesma função geral formam os tecidos.
A histologia, segundo a Apostila de Histologia Básica (2007), caracteriza-se como um
ramo da ciência que estuda os tecidos animais e vegetais, e a organização e relação que
compõe estes diferentes organismos; este ramo tem relação com as disciplinas de bioquímica,
biologia celular, fisiologia, citologia e patologia. A histologia engloba não somente a estrutura
microscópica, mas também a das células, órgãos e sistemas dos órgãos. O termo histologia (de
origem grega, “histos” = tecidos, “logos” = estudos/ciência) começou a ser utilizado em 1819
por Mayer, baseando-se na palavra tecido, proposta anos antes pelo francês Xavier Bichat. O
pesquisador Bichat denominou de tecido as estruturas macroscópicas encontradas no corpo
que apresentavam diferentes texturas.
Nesses avanços ocorridos na histologia, com estudos específicos dos tecidos, estes
foram divididos em grupos utilizando como critério suas diferenças morfológicas e suas
funções no organismo. Segundo JUNQUEIRA e CARNEIRO (2013) dividem-se em Tecido
Epitelial, Tecido Conjuntivo, Tecido Adiposo, Tecido Cartilaginoso, Tecido Ósseo, Tecido
Muscular e Tecido Nervoso. Dentro dessa grande divisão grupal ainda, os tecidos são
classificados de acordo com suas diferentes composições e funções, entre eles estão
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denominados o: Tecido Epitelial de revestimento e glandular (responsáveis pelo revestimento
das superfícies internas e externas de órgãos ou do corpo como um todo, pela secreção de
moléculas e pelo transporte de moléculas ou íons); Tecido Conjuntivo (responsável pelo
estabelecimento e pela manutenção da forma do corpo, funções de preenchimento de espaços
entre órgãos, função de sustentação, função de defesa e função de nutrição); Tecido Adiposo
(considerado maior depósito corporal de energia); Tecido Cartilaginoso Hialino, Elástico e
Fibroso (responsáveis pela sustentação dos tecidos moles, pelo revestimento das superfícies
das articulações e pelo auxílio no deslizamento dos ossos das articulações); Tecido Ósseo
(funções relacionadas à sustentação, proteção de órgãos vitais do organismo e funciona
também como depósito de cálcio, fosfato e íons, absorção de toxinas e metais pesados.);
Tecido Muscular Estriado Esquelético, Estriado Cardíaco, Não Estriado (responsáveis pelo
mecanismo de locomoção, gerando, a partir de moléculas de ATP - adenosina trifosfato
forças necessárias para a contração desse tecido); Tecido Nervoso (responsável pela
coordenação das funções, pela recepção de mensagens dos órgãos e seu consequente estímulo
a respostas e pelo armazenamento de informações).
Para o desenvolvimento dos estudos da histologia, fez-se necessário o uso de
equipamentos para visualização das estruturas microscópicas. No entanto, a histologia
desenvolveu-se juntamente à evolução dos microscópicos e com o desenvolvimento de
técnicas que permitiram o preparo de tecidos mortos e in vivo. Atualmente, o método mais
utilizado é a preparação de lâminas histológicas permanentes. O desenvolvimento e o
aperfeiçoamento das ferramentas de investigação foi algo determinante para o conhecimento
da Histologia e fez com que esta ciência se tornasse mais ampla e profunda.
Com o objetivo de preservar sua morfologia, será efetuada a coleta, realização e
observação do processo de confecção e desenvolvimento de lâminas histológicas permanentes
para microscopia óptica, a partir da utilização de um fragmento da traqueia bovina, tecido
cartilaginoso hialino localizado no sistema respiratório animal.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O processo de construção da lâmina histológica iniciou-se a partir da coleta do
material, na propriedade de um acadêmico, Christian Bandiera Brustolin,da Faculdades
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IDEAU, no interior de Paulo Bento-RS. Foi retirado do aparelho respiratório de um bovino,
que tinha como fins de abate o consumo, uma parte da traqueia, que logo após foi reduzida a
partir de cortes transversais para melhor manejo e utilização do órgão (figura 1).
Figura 1- Coleta e redução do fragmento- Foto: BANDIERA, Christian Brustolin, Propriedade Rural Particular,
Paulo Bento-RS, 2016.
O fragmento coletado, traqueia, depois de retirada e reduzida, aproximadamente em 1cm², foi
fixada imediatamente por métodos químicos, em formol 10 %, para preservar sua morfologia
e composição mais próxima a do tecido in vivo, e também para sua conservação impedindo a
degradação tecidual por qualquer fator existente.
Depois de concluídos os processos de coleta e fixação, utilizou-se o álcool para a
realização do processo de desidratação do fragmento, sendo empregado numa série crescente
de concentração de etanol 70% a 99%, (70% - 80% - 90% - 99%) deixando-o mergulhado em
cada concentração de álcool por 1 hora, com exceção da última troca de concentração, na qual
ocorre over night (o material fica mergulhado durante uma noite inteira). Esta bateria de
soluções alcoólicas em concentrações graduais e crescentes serve para evitar a retração
pronunciada do tecido ocasionando lesões nas estruturas teciduais.
Após a desidratação, realizou-se a diafanização ou clareamento, que segundo os
autores William J. Bacha Jr e Linda M. Bacha (2003) resume-se numa fase intermediária onde
a amostra é colocada em uma substância miscível com álcool e parafina. Este processo é
necessário, pois a parafina, que será utilizada para o emblocamento, não se mistura com água
e nem com álcool, de modo que ambos devem ser completamente removidos para que esta
possa penetrar eficientemente no tecido. E para realização da etapa foi utilizado como agente
clareador, o xilol, na qual o fragmento ficou mergulhado por 1 hora.
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A fim de torná-la rígida e permitir o processo de microtomia, a amostra foi colocada
na estufa, em um recipiente contendo parafina líquida a 60°, num total de 2 banhos. Nesse
processo objetivou-se, com a parafina juntamente com o calor da estufa, a evaporação do xilol
e a ocupação dos espaços teciduais por parafina. Em seguida, procedeu-se o processo de
emblocamento, onde a amostra juntamente com a parafina foi depositada num recipiente
adequado para posteriores cortes no micrótomo (figuras 2 e 3).
Figura 2- Processo de parafinização.FOTO: BANDIERA, Christian Brustolin, Laboratório de
Histologia,Faculdades IDEAU,Getúlio Vargas,2016.
Figura 3- Processo de emblocamento finalizado. FOTO: RITTER, Aline, Laboratório de Histologia,Faculdades
IDEAU,Getúlio Vargas,2016.
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Após o emblocamento, foram feitos cortes com o auxílio do micrótomo (figura 4) e de
uma navalha (para a regulação da espessura). A lâmina então confeccionada com espessura de
7µ (mícras) foi colocada em um suporte e levada a estufa a 60°, objetivando o derretimento da
parafina ainda presente.
Figura 4- Micrótomo, aparelho utlizado no processo de microtomia. FOTO: ECKER, Diego, Laboratório de
Análises, Hospital São Francisco, Faculdades IDEAU, Getúlio Vargas, 2016.
Antes do processo de coloração e finalização da lâmina, esta passou por um banho de
xilol, de aproximadamente 20 minutos, para a desparafinização, ou seja, a eliminação total de
parafina da lâmina. Em seguida, iniciou-se o processo de coloração, porém antes de
mergulhados no corante a lâmina foi hidratada, pois um dos corantes usados era do tipo
aquoso (solúvel em água); a lâmina foi imersa em álcool com concentrações decrescentes
70%, 50% e 40% por 5 minutos (figura 5), e para conclusão da hidratação mais 5 minutos a
lâmina ficou imersa em água.
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Figura 5-Desidratação em crescentes soluções de álcool- FOTO: FRIES,Andressa, Laboratório de
Histologia,Faculdades IDEAU,Getúlio Vargas,2016.
Realizou-se então, uma coloração de contraste, com o uso de dois corantes (figura 6)
para melhor identificação das estruturas. O primeiro recipiente onde a lâmina foi imersa por
20 segundos, continha o corante hematoxilina (roxo), responsável pela coloração dos núcleos;
após isso, uma lavagem em água por 30 segundos. O segundo corante utilizado foi eosina,
responsável pela coloração do citoplasma, procedida da lavagem em álcool, por ser um
corante alcoólico (figura 7). Após o termino da coloração, a lâmina ficou exposta em
temperatura ambiente para absorver e secar os corantes na qual foi imersa.
Figura 6- Corantes utilizados no processo de coloração da lâmina. FOTO: RITTER, Aline, Laboratório de
Histologia,Faculdades IDEAU,Getúlio Vargas,2016.
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Figura 7- Processo de coloração da lâmina. FOTO: FRIES, Andressa, Laboratório de Histologia,Faculdades
IDEAU,Getúlio Vargas,2016.
A montagem da lâmina histológica conclui-se com a aplicação da lamínula juntamente
com cola (Ervmount) para fixação no órgão e a possível observação desta no microscópio.
Para observação da lâmina histológica confeccionada, utilizou-se o microscópio
óptico, num aumento de 400 x, concluindo-se o processo da confecção e observação destas.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
Na histologia, um procedimento corriqueiro no estudo de tecidos é a elaboração de
lâminas histológicas para pesquisa em microscópio óptico. Devido à espessura destes tecidos
e órgãos (traqueia bovina), os mesmos foram ser seccionados, por um aparelho chamado
micrótomo, assim deixando o tecido com cerca de 7 micras para assim permitir a passagem
dos feixes de luz do microscópio óptico.
Do mesmo modo, este tecido passou por tratamentos precedentes, para que seu estudo
fosse possível. O material para estudo carece de ser adquirido com agilidade, para evitar a
morte do tecido e permanência intacta de suas células,sempre observando o pretexto de
cuidado com a manipulação do material a ser estudado.
A traqueia é um canal composto por anéis de cartilagem hialina, inicia na faringe e se
bifurca nos brônquios direito e esquerdo, acima desta bifurcação, em bovinos e suínos existe
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um brônquio a mais chamado de Brônquio traqueal que se localiza o Lobo Cranial Direito.Sua
porção final é de fibras elásticas a qual atribui ao tubo uma respectiva flexibilidade,
internamente ela é coberta por uma mucosa respiratória e externamente por uma camada de
tecido conjuntivo frouxo designado de Túnica Adventícia. Seus anéis são abertos dorsalmente
e unidos pelo ligamento anular traqueal. Nos suínos, bovinos e equinos o músculo anular
traqueal e interno à cartilagem (HORST E. K; HANS. G. L. 2011).
Segundo Konig. Horst Erich (2011), o epitélio respiratório é pseudo-estratificado
cilíndrico ciliado com células caliciformes, com tecido conjuntivo frouxo rico em fibras
elásticas. Na submucosa há tecido conjuntivo com diferentes glândulas seromucosas e uma
rica rede vascular.Anéis em forma de C, constituídos por cartilagem hialina e cobertos por um
pericôndrio, fornecem sustentação ao órgão e são encontrados na adventícia, rica em tecido
conjuntivo, suas extremidades estão voltadas para a parte posterior e são preenchidas por
tecido conjuntivo fibroelásticos e muscular liso (KONIG 2011).
O epitélio é ditado como pseudo-estratificado, já que causa a impressão de ter mais de
uma camada de células, logo seus núcleos se arranjam em níveis distintos, designando a
ilusão de estrato. De fato, é um epitélio simples porque todas as células pousam sobre a
membrana basal, apesar de que nem todas consigam chegar ao lúmen.
As células basais são mais baixas que as outras não alcançando o lúmen. São células
com demasiada capacidade de divisão celular e se diferenciam nos demais tipos celulares do
epitélio.As células ciliadas atingem o lúmen e contem cílios na superfície apical. As células
caliciformes, igualmente denominadas de células mucosas, são células dilatadas em sua parte
apical próxima ao lúmen, responsáveis pela excreção de muco. Este muco é responsável pela
detenção de partículas que adentraram junto com o ar, como por exemplo, o pólen, pó e
diversos micro-organismos. O muco é conduzido em direção ao aparelho digestório pela
oscilação dos cílios das células ciliadas. Assim resumidamente as células caliciformes
secretam muco com desempenho lubrificante e, além disso, conferem aderência às partículas.
Este epitélio encontra-se presente no revestimento da traqueia, brônquios e cavidade
nasal. As principais células são cilíndricas, com cílios, núcleo alongado e muitas vezes de
localização basal. As células basais possuem formato piramidal com núcleo arredondado e
central, além de se dividirem por mitose para renovação do epitélio. As células caliciformes
secretam muco com desempenho lubrificante e que, além disso, admite a aderência de
partículas.
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Com base na confecção e observação das lâminas histológicas da traqueia bovina,
obtivemos como resultado a visualização microscópica: Tecido epitelial (Ep), tecido
conjuntivo (Tc), Glândulas mistas (Gl). A representação do esquema de visualização está
representada na figura 1.
Figura 8- Fotomicrografia da traqueia , aumento de 400X; coloração He. Gl glândulas; Ep: epitélio; TC: Tecido
Conjuntivo. FOTO: ECKER, Diego, Laboratório de Histologia, Faculdades IDEAU,Getúlio Vargas, 2016.
Segundo MARTINEZ (2016), o tecido epitelial de revestimento cobre toda a
superfície externa do corpo (epiderme) e as cavidades corporais internas. Caracteriza-se por
ser um tecido avascular, ou seja, sem a presença de vasos sanguíneos e por possuir um
aglomerado de células epiteliais poliédricas e justapostas, com o mínimo ou nenhum espaço
intracelular entre elas. Uma das principais funções do tecido epitelial de revestimento é a de
proteção. Ele funciona como uma verdadeira armadura para o corpo (INFOESCOLA 2016).
4. CONCLUSÃO
Mediante finalização da lâmina histológica confeccionada, a partir da utilização das
técnicas necessárias, foi constatada uma ótima observação microscópica do órgão, com
preservação de sua morfologia original e possibilitando a visualização de estruturas
específicas, assim sendo possível realizar estudos do mesmo.
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