Prática para executar
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ASSUNTO: Material utilizado nas práticas de Bacteriologia. Técnica e Processos de Assepsia em Bacteriologia. Microscopia. OBJETIVOS: 1- Apresentar a vidraria e outros materiais de uso corrente em um laboratório de Microbiologia. 2- Executar técnicas de preparo de material e montagem para esterilização. 3- Treinar técnicas de distribuição asséptica. 4- Evidenciar a existência de bactérias no ar, roupas, etc. 5- Explanação sobre o microscópio. MATERIAL: - Vidrarias. Outros materiais de uso em um laboratório de Microbiologia. Água peptonada. Placas de Petri com agar simples. Pipetas e tubos de ensaio estéreis. Papel, barbante, algodão cardado, gaze. PRÁTICA PARA EXECUTAR: a. Apresentação da vidraria e outros objetos de uso freqüente nos laboratórios de Microbiologia. b. Demonstração, pelo professor, de uma cadeia de assepsia nos trabalhos microbiológicos. c. Cada grupo de alunos treinar, com água peptonada, as técnicas de distribuição asséptica, usando pipetas. Deixar os tubos em temperatura ambiente por no mínimo 48 horas. d. Expor placas de Agar simples (1 por grupo) ao ar por diferentes espaços de tempo. Deixar à temperatura ambiente o mínimo de 48 horas. e. Evidenciar bactérias da pele, roupa, bancada em meio agar simples. f. Montagem de vários materiais (tubos, placas, pipetas) para esterilização. _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ASSUNTO: Meios de Cultura Técnicas de Semeadura OBJETIVOS: 1- Explanação sobre os principais meios de cultura empregados em laboratórios de Microbiologia 2- Identificação das técnicas de semeadura mais empregadas na rotina bacteriológica 3- Cultivo de bactérias com finalidade de obtenção de cultura pura, ou seja, uma população onde todas as bactérias se originam de uma única célula bacteriana. MATERIAL: - tubos de ensaio com caldo simples, agar simples e agar semi-sólido. Placas de Petri com agar simples. Culturas bacterianas em caldo simples, agar simples (em placa de Petri). Alça e agulha de platina. PRÁTICA PARA EXECUTAR: Definir meio de cultura, cultivo e condições necessárias ao crescimento de microorganismos (pH, pressão osmótica, temperatura de incubação, etc.). Classificação dos meios de cultura quanto a origem, estado físico, força seletiva. Seqüência da preparação dos meios. TÉCNICAS DE SEMEADURA MAIS EMPREGADAS NA ROTINA I- Semeadura em meios sólidos A. Meio Inclinado Em estria sinuosa: semear com alça de platina, em zig-zag, partindo da base para a extremidade da superfície inclinada do meio Este tipo de semeadura permite a obtenção de melhor massa de microoganismos. Em estria reta: semear co agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a extremidade da superfície inclinada do meio, ou em profundidade e superfície. Este tipo de semeadura é utilizada em provas bioquímicas para identificação bacteriana. B. Meios em pé (camada alta) Em picada: com agulha de platina fazer o inoculo penetrar de 0,5 a 1,0 cm no centro do meio de cultura. Este tipo de semeadura é bastante utilizado para conservação de bactérias no meio de cultura e quando o meio utilizado é semi-sólido, esta semeadura é utilizada para a verificação da motilidade. C. Em Placa de Petri: C.1. Em superfície Estrias múltiplas ou esgotamento: fazer o inoculo em um ponto da superfície do meio, flambar a alça, deixar esfriar e daí semear em zig-zag em toda a superfície do meio. Este tipo de semeadura é empregado para o isolamento bacteriano, obtenção de u.f.c. isoladas. Denomina-se técnica se esgotamento. Por distensão: com pipeta, colocar no centro da superfície do meio 0,1 mL da suspensão e espalhar uniformemente com swab ou alça de Drigalski. Com swab, obteremos crescimento confluente. Com alça de Drigalski, utilizamos para contagem. Utiliza-se este tipo de inoculação para realização de determinados testes, como por exemplo o antibiograma. C.2. Em profundidade ou disseminação. Pour-plate: depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da suspensão bacteriana. Adicionar 10 mL do meio fundido em tubo de ensaio e resfriado a 45-50º C. Homogeneizar com movimentos giratórios da placa sobre uma superfície plana. Utilizado, para isolamento, contagem e identificação bacteriana, conforme o meio de cultura utilizado. D. Repique por pescaria: colônia em placa de Petri retirada através de uma agulha para um meio de cultura líquido ou sólido Método empregado para isolamento bacteriano. II. Semeadura em meios líquidos Difusão: com alça de platina ou pipeta, introduzir o inoculo ( 0,1 mL) na massa do meio. Este tipo de semeadura é empregada para obtenção do crescimento bacteriano. É um repique normal. _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ASSUNTO: Esterilização e Desinfecção Ação dos Agentes Físicos e Químicos sobre as Bactérias Objetivos: 1. Verificar a eficiência de agente químico sobre as bactérias 2. Verificar a eficiência de agente físico sobre as bactérias Material: - Placas de Petri com agar simples ou caldo simples - Culturas de E. coli e Bacillus sp - Soluções antissépticas - Gaze - Tripé, tela de amianto e panela Prática para executar a. Definição de alguns termos utilizados no controle da população microbiana: - agente antimicrobiano, assepsia, asséptico, antissepsia, bactericida, bacteriostático, desinfecção, esterilização, germicida, saneador, sanitização - agentes físicos: radiações, calor, filtração - agentes químicos b. Atividade antisséptica do sabão, álcool e álcool iodado: Observação de existência de bactérias na superfície do dedo: 1. Pegar uma placa de Agar simples e fazer a semeadura utilizando a ponta do polegar (fazer a impressão digital suavemente para não ferir a camada do meio de cultura). 2. Em seguida, lavar o dedo com sabão . 3. Após 1 minuto, fazer a impressão digital no 2º quadrante da placa. 4. Repita a operação com os demais antissépticos. 5. Incubar a placa a 37º C por 24 horas. 1º 4º 2º 3º c. Atividade do agente físico: calor 1. Cultura de E. coli em caldo. Para o primeiro inóculo , marcar t = zero, colocá-lo em água fervente por 5, 10 e 20 minutos. 2. Após cada intervalo de tempo retirar um inóculo marcando t5, t10,e t20. Incubar a 37º C por 24 horas. 3. Repetir a técnica com a cultura de Bacillus sp. 0 5 10 20 d. Atividade de diferentes agentes químicos: 1.Semear uma cultura bacteriana com swab (para crescimento confluente) em uma placa de Petri com agar simples. 2.Assepticamente, com pinça, embeber discos de papel de filtro com diferentes agentes químicos. 3. Colocar os discos eqüidistantes na placa semeada. 4. Incubar a 37º C por 24 horas. 5. Leitura e interpretação dos dados obtidos. _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ASSUNTO: Diluição Contagem de u.f.c.viáveis Obtenção de Cultura Pura Objetivos: 1. Metodologia de Diluições 2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viáveis 3. Contagem de u.f.c. viáveis 4. Obtenção de cultura pura Material: - Tubos com 9mL de salina - Placas de Petri com agar simples - Alças de Drigalski - Cubas com álcool 70º - Agar inclinado - Caldo simples - Cultura bacteriana em caldo - Pipetas de 1mL Prática para executar a. Diluição A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL em 9mL de salina, homogeneizar, retirar 1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina... Obtendo assim, as diluições 1/10, 1/100, 1/1000... b. De cada diluição inocular 0,1mL, em duplicata, na superfície do meio de agar simples. Semear por distensão com alça de Drigalski. Incubar a 37ºC por 24 horas. c. Contagem da u.f.c. com diluição nº placa 1 + nº placa 2 aplicar na fórmula: 2 u.f.c. = nº encontrado x diluição x inoculo d. Repicar u.f.c. para agar inclinado e caldo simples. _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ ASSUNTO: Coloração Simples Morfologia Objetivos: 1. Identificação dos vários tipos de corantes de acordo com os diversos métodos de coloração empregados em Bacteriologia. 2. Preparação de esfregaços partindo de meio líquido e de meio sólido. 3. Fixação de esfregaço por meios físicos e químicos. 4.Coloração simples. 5. Observar formas e arranjos bacterianos através de preparações fixadas e coradas. Material: - Azul de metileno ou fucsina - Solução salina - Lâminas - Culturas em meios líquido e sólido - Alça e agulha de platina Prática para executar 1. Introdução da técnica sobre corantes, sua classificação (naturais, artificiais, básicos e neutros) e quanto ao veículo. Técnicas de coloração simples, duplas e mistas. 2. Preparo de esfregaços e fixação por meios físicos e químicos. a) Preparo das lâminas As lâminas novas oferecem maior garantia para a confecção de boas preparações coradas, não obstante as mesmas possam ser recuperadas depois de usadas. O processo de limpeza e esterilização dessas lâminas implica numa série de medidas que passaremos a enumerar: lavar com água e sabão, mergulhar em solução detergente e deixar em ebulição por cerca de 1 a 2 horas, lavar novamente em água corrente, escorrer e rinsar com água destilada, escorrer e secar. As lâminas devem ser colocadas em frascos fechados contendo álcool. As preparações coradas são feitas em 3 tempos: 1º esfregaço 2º fixação 3º coloração b) Esfregaço - Tirar do frasco uma lâmina esterilizada e enxugar bem - Flambar, rapidamente, nos dois lados da lâmina - Flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar próximo à chama - Tomar o tubo de cultura (em caldo) com a mão esquerda e com os dedos médio e anular da mão direita remover o tampão de algodão da boca do tubo -Flambar a boca do tubo de cultura - A alça de platina, segura entre o polegar e o indicador da mão direita, será introduzida no interior do tubo até tocar no meio de cultura - Flambar novamente a boca do tubo - Fechar o tubo com o tampão de algodão e colocá-lo na estante - Tomar a lâmina com a mão esquerda e depositar no centro da mesma uma gotícula ( uma ´´alçada``) da suspensão bacteriana - Com movimentos de rotação da alça de platina, o material deve ser bem espalhado a fim de se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme - Deixar secar ao ar e marcar com lápis dermatográfico do lado oposto onde se situa a preparação Em se tratando de material de cultura em meio sólido, deve ser observado o seguinte: - Depositar uma pequena gota de água destilada ou solução fisiológica estéril no centro da lâmina - Tocar a colônia com uma agulha de platina esterilizada e suspender a mesma na gotícula d`água, de forma a obter um esfregaço fino e uniforme c) Fixação do material A fixação evita que o material se desprenda no decurso das manipulações posteriores. Pode ser feita por: # Agentes Físicos (calor) – consiste em passar a lâmina, com a face onde se acha o esfregaço para cima, na chama do bico de Bunsen 2 a 3 vezes rapidamente # Agentes Químicos – utiliza-se uma substância química como álcool metílico, álcool etílico, álcool-acetona, éter-acetona, formol etc., deixando-se em contato com os esfregaços dessecados durante alguns minutos (2 a 10 minutos). O fixador pode ser posto sobre o esfregaço convenientemente protegido contra a evaporação rápida, ou então o preparado será mergulhado no fixador contido em recipientes apropriados. 3. Coloração Simples , Método fixado e corado a. Preparo do esfregaço b. Fixação c. Coloração Cobrir o esfregaço com a solução de azul de metileno ou fucsina diluída durante 5 minutos . Lavar, secar com papel de filtro e observar com objetiva de imersão. _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________
