Protocolo TRANSFORMAÇÂO DE BACTÉRIAS

BacBio
Crescimento, Renovação Celular e Reprodução:
da teoria à prática
Coimbra, 2012/2013
Sandra Gamboa
Andreia Quaresma
Fernando Delgado
Escolher Ciência PEC282
ESCOLA SUPERIOR AGRÁRIA DE COIMBRA
Crescimento, Renovação Celular e Reprodução: da teoria à prática
BacBio
Introdução
Nesta actividade laboratorial realizar-se-á uma transformação genética, isto é,
uma mudança causada por genes, envolvendo a inserção de um gene num organismo de
forma a modificar uma característica desse organismo. A transformação genética é
usada em inúmeras áreas da biotecnologia: na agricultura, os genes que codificam
características como, resistência à geada, peste ou deterioração podem ser
geneticamente transformados nas plantas; na bioremediação as bactérias podem ser
transformadas com genes que permitem a digestão de derrames de petróleo; na
medicina, doenças causadas por mutações genéticas estão a começar a ser tratadas
através da terapia génica, transformando geneticamente as células de uma pessoa doente
com cópias saudáveis desse gene.
Nesta actividade, será usado um gene que codifica a proteína de fluorescência
verde (GFP – Green Fluorescent Protein) para transformar bactérias E. coli. Este gene é
proveniente da medusa bioluminescente Aequorea victoria que confere fluorescência
verde a este organismo. O gene para a GFP será inserido no genoma bacteriano e a
bactéria irá expressar o seu mais recente gene e produzir a proteína fluorescente que
originará bactérias brilhantes, de cor verde, quando colocadas sob a luz ultravioleta.
Para a inserção do gene em questão no genoma da bactéria vamos utilizar um
plasmídeo. Um plasmídeo é um segmento circular de DNA, mais pequeno que o
cromossoma bacteriano, que se encontra nas bactérias. Um plasmídeo contém genes
para uma ou mais características que podem beneficiar a sobrevivência das bactérias.
Como exemplo temos os genes que conferem resistência aos antibióticos. As bactérias
podem transferir os plasmídeos entre si de forma a partilhar esses genes. Este
mecanismo permite-lhes adaptarem-se a novos ambientes, sendo que a existência de
bactérias resistentes a antibióticos é um exemplo de transmissão de plasmídeos. Esta
actividade permite, assim, estudar o processo de movimento de genes de um organismo
para outro através de um plasmídeo.
A empresa Bio-Rad construiu o plasmídeo pGLO que codifica o gene para a
GFP e outro para a resistência ao antibiótico ampicilina. O plasmídeo incorpora, ainda,
um sistema de regulação de genes que pode ser usado para controlar a expressão da
proteína de fluorescência nas células transformadas. Este sistema de regulação funciona
como um interruptor que é acionado pelo açúcar arabinose. Sendo assim, o gene GFP
pode ser “ligado” adicionando ao meio de nutrição das bactérias o açúcar arabionose. A
selecção das células transformadas pelo pGLO é concluída com o seu crescimento nas
placas que contêm o antibiótico. As células transformadas aparecerão brancas nas placas
que não contêm arabinose e fluorescentes nas que incluem este açúcar.
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Laboratório de Reprodução Animal Dr. França Martins
Sector de Genética, Reprodução e Melhoramento Animal
Departamento de Ciências Zootécnicas
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Protocolo
1ª Aula:
Preparação das placas de Petri iniciais
1. Inserir uma ansa de inoculação estéril na cultura bacteriana rehidratada. Com a
ansa plaquear as placas de Petri (1/grupo). O plaqueamento é feito em quatro
quadrantes (ver figura abaixo) Ao finalizar, tapar rapidamente a placa para evitar
contaminações.
2. Colocar as placas, com a tampa para baixo, a incubar durante a noite, a 37ºC
durante 2-3 dias.
2ª Aula:
Transformação
1- Etiquetar um eppendorff com +pGLO e outro com –pGLO e também com o
nome/número do grupo;
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2- Com uma micropipeta transferir 250 µl da solução de transformação (CaCl2)
para cada tubo;
Solução de transformação
3- Colocar os tubos em gelo;
Gelo
4- Com uma ansa de inoculação, pegar numa única colónia de bactérias
provenientes da placa inicial e colocá-la no tubo +pGLO; agitar até que toda a
colónia fique dispersa na solução de transformação. Colocar, novamente, o tubo
no gelo e repetir o processo para o tubo – pGLO.
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5- Mergulhar uma ansa de inoculação esterilizada no tubo com o plasmídeo pGLO.
Misturar o plasmídeo da ansa na suspensão de células do tubo +pGLO. Fechar o
tubo e voltar a colocá-lo no gelo. (Não adicionar o plasmídeo no tubo –pGLO)
Plasmideo pGLO
6- Incubar os tubos no gelo durante 10 minutos.
Gelo
7- Enquanto os tubos estão no gelo, marca as placas de Petri com agar (marcar as
placas por baixo) da seguinte forma:
a. Placa 1: (+pGLO) LB/amp
b. Placa 2: (+pGLO) LB/amp/ara
c. Placa 3: (-pGLO) LB/amp
d. Placa 4: (-pGLO) LB
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8- Choque térmico. Usando um suporte de espuma, transferir os tubos +pGLO e –
pGLO para um banho-maria a 42ºC, durante 50 segundos exactos. Passados os
50 segundos volta a colocar os tubos no gelo. Incubar os tubos no gelo durante 2
minutos. (Para que os resultados da transformação sejam bons a transferência do
gelo para os 42ºC e novamente para o gelo deve ser rápida.)
Banho-Maria
Gelo
42ºC, 50 segundos
Gelo
9- Remover o suporte com os tubos do gelo e coloca-los na bancada. Usando uma
pipeta esterilizada, adiciona 250 µl do caldo de nutrientes LB. Repetir o mesmo
para o outro tubo com uma nova pipeta. Incubar os tubos durante 10 minutos à
temperatura ambiente.
Nutrientes LB
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10- Dar pancadinhas no tubo com os dedos para misturar a solução. Usando uma
pipeta esterilizada, colocar 100 µl das suspensões de transformação e controlo
nas placas apropriadas.
Placas transformadas
Placas controlo
11- Espalhar as suspensões pela superfície do meio, usando uma ansa de inoculação
esterilizada para cada placa. (não fazer muito pressão para não furar o meio)
12- Colocar as placas numa estufa a 37ºC.
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3ª Aula:
Recolha e análise de dados
Observar os resultados obtidos da transformação laboratorial sob luz normal. A seguir,
desligar as luzes e segurar uma luz ultravioleta por baixo das placas.
1. Observar e desenhar o que se vê em cada placa. Colocar os desenhos na coluna
da direita da tabela de dados. Registar os dados para permitir a comparação entre
as observações feitas às células “+pGLO” e às células não transformadas (pGLO).
2. Qual o crescimento bacteriano observado em cada placa?
3. Qual a cor das bactérias?
4. Quantas colónias bacterianas existem em cada placa.
Observações
+pGLO
LB/amp
+pGLO
LB/amp/ara
Observações
-pGLO
LB/amp
-pGLO
LB
Bibliografia
Biotechnology Explorer™, pGLO™ Bacterial Transformation Kit, Catalog Number
166-0003EDU, Bio-Rad laboratories Inc., explorer.bio-rad.com
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