aspectos da via de ativação linfocitária relacionados à infecção pelo

UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
NÚCLEO DE SAÚDE- NUSAU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
ASPECTOS DA VIA DE ATIVAÇÃO LINFOCITÁRIA
RELACIONADOS À INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE DELTA
LARISSA DEADAME DE FIGUEIREDO NICOLETE
PORTO VELHO
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
NÚCLEO DE SAÚDE- NUSAU
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
ASPECTOS DA VIA DE ATIVAÇÃO LINFOCITÁRIA
RELACIONADOS À INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE DELTA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia Experimental para Obtenção do Título de
Doutora em Biologia Experimental
Área de Concentração: Relação Parasita-Hospedeiro
ORIENTADA: LARISSA DEADAME DE FIGUEIREDO NICOLETE
ORIENTADOR: JUAN MIGUEL VILLALOBOS SALCEDO
CO-ORIENTADOR: ROBERTO NICOLETE
PORTO VELHO
2016
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Nicolete, Larissa Deadame de Figueiredo
Aspectos da Via de Ativação Linfocitária
Relacionados à Infecção Pelo Vírus Da Hepatite
Delta/ Larissa Deadame de Figueiredo Nicolete,
Porto Velho, 2016.
93 folhas, ilustrado.
Tese apresentada à Universidade Federal
de Rondônia. Porto Velho, 2016.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Larissa Deadame de Figueiredo Nicolete
Aspectos da via de ativação linfocitária relacionados à infecção pelo Vírus da Hepatite Delta
Tese Apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia
Experimental para Obtenção do Título de Doutora em Biologia
Experimental
Área de Concentração: Relação Parasita-Hospedeiro
Orientada: Larissa Deadame de Figueiredo Nicolete
Orientador: Juan Miguel Villalobos Salcedo
Co-orientador: Roberto Nicolete
Aprovada em:
Banca Examinadora
Prof(a) Dr(a): _____________________________________________________________
Instiuição: __________________________________Assinatura:_______________________
Prof(a) Dr(a): _____________________________________________________________
Instiuição: __________________________________Assinatura:_______________________
Prof(a) Dr(a): _____________________________________________________________
Instiuição: __________________________________Assinatura:_______________________
Prof(a) Dr(a): _____________________________________________________________
Instiuição: __________________________________Assinatura:_______________________
Prof(a) Dr(a): _____________________________________________________________
Instiuição: __________________________________Assinatura:_______________________
DEDICATÓRIA
Dedico esta tese a minha Ohana.
Que é minha, só minha.
Que eu achei, sozinha.
Mas que sozinha, eles me acham de volta.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus e a todos que conscientemente, ou não, contribuíram
para a realização deste trabalho. De maneira especial agradeço:
Ao meu orientador Prof Dr Juan Miguel Villalobos Salcedo que, desde quando cheguei,
forneceu oportunidades para desenvolver meu trabalho. Obrigada pela confiança.
Ao Dr Roberto Nicolete que foi o supervisor científico deste trabalho, me ensinou
técnicas e conceitos de Imunologia que foram aprendidos e amplamente aplicados. Obrigada
pela paciência.
Aos colegas do laboratório de Biotecnologia Aplicada à Saúde: João Rafael, João
Gabriel e Monika obrigada pela amizade. Amália, Neuza e Sharon, além da amizade, o auxílio
nos experimentos in vitro e pelos projetos paralelos que desenvolvemos.
À equipe da Virologia Molecular chefiada pela Dra Deusilene de Souza Vieira, obrigada
pela agradável convivência.
Aos pesquisadores Dr Celso Cunha, Dra Ana Varela Coelho e Dr João Tavanez,
Universidade Nova Lisboa, pela imensurável contribuição científica e agradável convivência
durante o período de estágio desenvolvido em Portugal.
À Dra Gabriela Gomes-Sá e seus alunos Armanda Rodrigues, Rita Pedrosa, David
Mateus e Ana Sofia Bolas. Às alunas Débora Almeida e Cátia Pedrosa que me acolheram de
forma carinhosa no IHMT.
Às alunas Joana Martins, Rita Laires e Vera Marques que me acolheram de forma
carinhosa no ITQB.
À Dra Simone Kashima Haddad, e meus amigos de Ribeirão Preto: Aline, Daiane,
Evandra, Mariana, Maurício, Rochele, Rodrigo, Tathiane e Virgínia, vocês são parceiros
pessoais e científicos eternos.
Aos professores e secretária que compõe o colegiado da PGBioExp, representados pelo
coordenador Prof Dr Alexandre Almeida da Silva, pela dedicação e presteza que me atenderam
ao longo destes anos.
Aos colegas de pós-graduação pelos agradáveis momentos nestes anos.
À Fiocruz, CNPq e Capes pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento deste trabalho.
“És um senhor tão bonito quanto a cara do meu filho...
Tempo tempo tempo tempo, vou te fazer um pedido...
Tempo tempo tempo tempo...
Compositor de destinos, tambor de todos os ritmos...
Tempo tempo tempo tempo, entro num acordo contigo...
Tempo tempo tempo tempo...
Por seres tão inventivo e pareceres contínuo,
Tempo tempo tempo tempo, és um dos deuses mais lindos...
Tempo tempo tempo tempo...
Que sejas ainda mais vivo no som do meu estribilho,
Tempo tempo tempo tempo: Ouve bem o que eu te digo
Tempo tempo tempo tempo...
Peço-te o prazer legítimo e o movimento preciso,
Tempo tempo tempo tempo, quando o tempo for propício...
Tempo tempo tempo tempo...
De modo que o meu espírito ganhe um brilho definido,
Tempo tempo tempo tempo, e eu espalhe benefícios...
Tempo tempo tempo tempo...
O que usaremos pra isso fica guardado em sigilo,
Tempo tempo tempo tempo, apenas contigo e migo...
Tempo tempo tempo tempo...
E quando eu tiver saído para fora do teu círculo,
Tempo tempo tempo tempo, não serei nem terás sido...
Tempo tempo tempo tempo...
Ainda assim acredito ser possível reunirmo-nos,
Tempo tempo tempo tempo, num outro nível de vínculo...
Tempo tempo tempo tempo...
Portanto peço-te aquilo e te ofereço elogios,
Tempo tempo tempo tempo, nas rimas do meu estilo...
Tempo tempo tempo tempo...”
Oração ao tempo
Caetano Veloso
SUMÁRIO
RESUMO ....................................................................................................................................I
ABSTRACT ............................................................................................................................. II
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .......................................................................... III
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................VI
LISTA DE QUADROS ........................................................................................................VIII
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................IX
1.
INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
1.1 O Vírus da Hepatite Delta - HDV ................................................................................... 1
1.2 Resposta Imune Celular e Ativação Linfocitária........................................................... 6
2.
JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 14
3.
OBJETIVOS ................................................................................................................... 15
4.
MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 16
4.1 CASUÍSTICA.................................................................................................................. 16
4.2 Tratamento das amostras .............................................................................................. 16
4.3 Quantificação sérica de citocinas inflamatórias .......................................................... 17
4.4 Quantificação sérica de nitritos ..................................................................................... 17
4.5 Extração do RNA total e Transcrição Reversa ............................................................ 18
4.6 Expressão Gênica ............................................................................................................ 18
4.7 Clonagem do Antígeno Delta Pequeno (SDAg) ............................................................ 19
4.8 Cultivo das linhagens Celulares .................................................................................... 22
4.9 Tratamento in vitro com IFN-PEG ............................................................................... 22
4.10 Avaliação da citotoxicidade in vitro .............................................................................. 23
4.11 Análise Estatística ........................................................................................................... 24
5
RESULTADOS ............................................................................................................. 275
CAPÍTULO I – Avaliação de Potenciais Biomarcadores Séricos ...................................... 25
CAPÍTULO II – Investigação do Fator Nuclear das Células T Ativadas ......................... 43
CAPÍTULO III – Ensaios in vitro ......................................................................................... 53
6
CONCLUSÕES ............................................................................................................... 67
7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 68
APÊNDICE A – REPRESENTAÇÃO DA ANÁLISE DE CITOCINAS EM GRÁFICO
DE BARRAS ........................................................................................................................... 75
ANEXO A – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA......................... 76
ANEXO B – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO .................. 78
ANEXO C – ARTIGOS PUBLICADOS RELACIONADOS COM A TESE ................... 80
i
RESUMO
A infecção pelo vírus da hepatite Delta (HDV) apresenta distribuição mundial, sendo a
Região Ocidental da Amazônia Brasileira considerada área de alta endemicidade, o que a torna
um problema de saúde pública no estado de Rondônia. O HDV é um subvírus que depende do
vírus da hepatite B (HBV) para sua infecção, contudo, pacientes HBV/HDV positivos
apresentam um risco três vezes maior de desenvolver carcinoma hepatocelular e duas vezes
mais chances de mortalidade por cirrose quando comparados aos pacientes infectados somente
com HBV. Recentemente, preconiza-se que o tratamento de pacientes crônicos de Delta seja
realizado associando Interferon alfa peguilado (IFN-PEG) com medicamentos que atuam contra
o HBV, a chamada terapia combinada. O ambulatório de hepatites virais do Cepem vem
alcançado resultados excelentes com muitos pacientes atingindo uma Resposta Virológica
(RV), o que reforça a importância do papel da resposta imune do hospedeiro para a resolução
do quadro infeccioso. Estudar o perfil imune de pacientes que completaram o tratamento com
sucesso é um dos passos iniciais para se elucidar a relação do HDV com seu hospedeiro e
entender quais mecanismos de exaustão da resposta imune celular contribuem para o escape do
vírus. Assim, foram constituídos quatro grupos com pacientes que concordaram participar do
estudo, os quais foram divididos pelo seguinte perfil: Pacientes que terminaram o tratamento e
apresentam RV (TTO; n=14); Pacientes que possuem anticorpos contra o HDV, mas são PCR
negativos (PCR – ; n=11); Pacientes que são PCR positivos, mas não iniciaram o tratamento
(PCR+; n=10); Pacientes HBV Monoinfectados com vírus replicante (Mono; n=11) para
servirem de controle de infecção crônica. O sangue periférico dos pacientes foi coletado e o
RNA das células mononucleares foi extraído por Trizol e armazenado a -80ºC. O soro foi
utilizado para avaliação do perfil de produção de Óxido Nítrico, quantificado indiretamente
pela reação de Griess e das citocinas (TNF-ɑ, IFN-γ, IL-12, IL-10 e IL-2) por Elisa e,
posteriormente, analisados estatisticamente pelo teste ANOVA. Dentre os resultados obtidos,
destacaram-se significativamente os níveis de IL-2 (p=0,0003) e sua correlação positiva com a
IL-12 (p=0,03), pelo teste de Pearson, além da menor produção de Óxido Nítrico observada nos
indivíduos tratados (p=0,0369). Com o objetivo de desvendar quais os possíveis mecanismos
que estariam levando ao aumento da IL-2, a via de ativação nuclear de linfócito T (NFAT) foi
investigada. Esta via está relacionada com: produção de IL-2, expansão clonal de linfócitos T,
ativação de células NK, geração de células de memória e possível controle gênico na expressão
de IL-15. Apesar dos achados envolvendo a produção de IL-2 não estarem relacionados com o
aumento significativo na expressão de NFAT, há indícios que pacientes PCR – podem utilizar
a via da IL-15 para o controle da infecção. O próximo passo deste estudo foi validar in vitro as
condições observadas nos pacientes, na tentativa de mimetizar a resposta celular em ensaios de
co-cultivo, frente aos estímulos antigênicos na ausência e presença do tratamento. Foi
observado que os antígenos levaram à morte celular e que o tratamento com INF-PEG, além de
diminuir os danos às células, direciona a resposta para um padrão T H1, com produção de IFNγ, IL-2 e IL-12. Contudo, quando há presença do HBsAg essa resposta não ocorre, sugerindo
que o mecanismo de exaustão pode ter sido desencadeado exclusivamente por este antígeno.
Com esses resultados esperamos avançar no entendimento de como alguns eventos relacionados
à resposta imunológica do hospedeiro podem levar a uma RV eficiente. Sob a luz desses
achados, o protocolo de tratamento poderá ser otimizado, aumentando dessa forma o sucesso
terapêutico.
Palavras-chave: HDV. Tratamento. IFN-PEG. IL-2. Padrão de resposta TH1.
ii
ABSTRACT
The Hepatitis Delta Virus (HDV) infection has a worldwide distribution, including the
Brazilian Northwest Region as an endemic area, becoming this disease as a public health
problem in the state of Rondonia. The HDV is a subviral satellite agent depends upon HBV
envelope proteins for its assembly and ability to infect new cells. However, HBV/HDV positive
patients have a three times greater risk of developing hepatocellular carcinoma and two times
more of cirrhosis mortality than patients infected with HBV only. Recently, the most accepted
therapeutic protocol for the chronic delta patients is performed with pegylated interferon (PEGIFN) and drugs that act against HBV, named combined therapy. This new approach has
achieved excellent results with many patients driving to a Virologic Response (VR), which
reinforces the importance of the host´s immune response to solve the infection. Focusing
effectiveness of combined therapy in combatting the virus, the immune response appears to be
important for infection control. To elucidate the balance of HDV and host's immune system we
formed four groups of patients who agreed to participate in the study, divided by the following
profile: Patients who completed treatment and have VR (TTO; n=14); Patients with antibodies
against HDV, but with PCR negative (PCR – n = 11); Patients who possess positive PCR, but
not started treatment (PCR +; n = 10); Patients HBV monoinfected with replicating virus
(Mono; n = 11) as the calibrator for the chronic infection. The individuals had their peripheral
blood collected and the RNA extracted from PBMC preparations by Trizol and stored at -80°
C. The sera were used to evaluate the profile of nitric oxide production, measured indirectly by
Griess reaction and cytokines (TNF-ɑ, IFN-γ, IL-12, IL-10 and IL-2) by Elisa, the data were
statistically analyzed. Among the results obtained, the levels of IL-2 were significantly (p =
0.0003) with IL-12 positive correlation (p = 0.03) by Pearson test. In addition, the Nitric Oxide
production was lower in treated individuals (p = 0.0369). With the objective of uncovering what
the possible mechanisms that would be leading to increased IL-2, nuclear activation of T
lymphocyte (NFAT) pathway was investigated. This pathway is related to: IL-2 production,
clonal expansion of T lymphocytes, NK cell activation, generation of memory cells and possible
gene control on expression of IL-15. Despite these findings involving the production of IL-2
are not related to the significant increase in the expression of NFAT, there is evidence that
patients PCR – can use via the IL-15 for the control of infection. The next step of this study
was to validate in vitro the conditions observed on cellular response of patients, which could
mimic such co-cultivating tests response to antigenic stimuli front in the absence and presence
of the treatment. It was observed that antigens led to cell death and that treatment with INFPEG, as well as reduce damage to cells, directs the response to a TH1 pattern, with production
of IFN-γ, IL-2 and IL-12. However, in the presence of HBsAg this response does not occur,
suggesting that the mechanism of exhaustion may have been triggered by this antigen. With
these results we hope to advance in the understanding of how some events related to the host's
immune response can lead to an efficient VR. In light of these findings, the treatment protocol
can be optimized, thereby attempting to establish a prognostic indicator of the infection.
Keywords: HDV. Treatment. IFN-PEG. IL-2. TH1 response
iii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ag-S
Antígeno delta pequeno sintético
ACTB
Actina Humana
B2M
Beta 2-Microglobulina
BSA
Albumina de soro bovino
CD
Cluster of Differentiation
cDNA
Ácido Desoxirribonucleico complementar
CEPEM
Centro de Pesquisas em Medicina Tropical
Cq
Quantification cycle
CT
Cycle Threshold
CTL
Linfócito T citotóxico
DCs
Células Dendríticas
ELISA
Ensaio Imunosorbente Ligado à Enzima (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay)
GST
Glutationa S-transferase
GAPDH
Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase
HBsAg
Antígeno de Superfície do Vírus da Hepatite B
HBV
Vírus da Hepatite B
HCV
Vírus da Hepatite C
HDAgs
Antígenos da Hpatite Delta sem diferenciação entre pequeno e
HDV
Vírus da Hepatite Delta
HEPES
Ácido hidroxietil piperazina etanosulfônico
IFN-PEG
Interferon Alfa Peguilado
IFNα
Interferon alfa
IFNγ
Interferon gama
IL
Interleucinas
IPTG
Isopropil-β-D-tiogalacto-piranosídeo
JAK
via Janus Kinase
J+T
Co-cultivo de células Jurkat e THP-1
LB
meio Luria Broth
LCMV
Vírus da Coriomeningite Linfocítica
longo
LDAg
Antígeno Longo do vírus da Hepatite Delta
iv
LPS
Lipopolissacarídeo
MAP quinase
Proteíno-quinases ativadas por mitógenos (Mitogen Activated
Protein Kinases)
MONO
Pacientes HBsAg positivos e anti-HDV negativos utilizados
como um grupo no presente estudo.
MTT
sal de tetrazólio (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo
tetrazólico – Nome IUPAC)
NFAT
Fator nuclear de células T ativadas
NK
célula Natural Killer
NO
Óxido Nítrico
PBMC
Células Mononucleares do Sangue Periférico
PBS
Tampão Salina Fosfato
PCR 
Pacientes com presença de anticorpos IgG contra o HDV e PCR
negativo para o RNA viral do HDV utilizados como um grupo no presente estudo.
PCR+
Pacientes com presença de anticorpos IgG contra o HDV e PCR
positivo para o RNA viral do HDV utilizados como um grupo no presente estudo.
PD-1
Receptor de Morte Programada
PolR2A
Polimerase RNA II
qRT-PCR
Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real Quantitativo
RNA
Ácido Ribonucleico
RNAm
Ácido Ribonucleico mensageiro
RT
Transcrição Reversa
RVS
Resposta Virológica Sustentada
SDAg
Antígeno Pequeno do vírus da Hepatite Delta
SDS-PAGE
Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de
STAT
Sinal Transdutor e Ativador de Transcrição (Signal Transducer
sódio
and Activator of Transcription)
TA
Temperatura Ambiente
TCD4+
Linfócito T CD4 ativado
TCD8+
Linfócito T CD8 ativado
TCR
Receptor de Células T
TLRs
Receptores tipo “Toll”
TNFα
Fator de Necrose Tumoral alfa
v
Treg
Célula T Reguladora
TTO
Pacientes que tiveram o tratamento para Hepatite Delta
finalizado após 48 semanas de tratamento associado com IFN-PEG e Entecavir utilizados como
um grupo no presente estudo.
YTA
ágar de triptona de levedura
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. ESQUEMA DE REPLICAÇÃO DO HDV ............................................................ 2
FIGURA 2. ESQUEMA DE REVERSÃO DD SUPRESSÃO IMUNOLÓGICA .................... 7
FIGURA 3 EXAUSTÃO DE CÉLULAS T EM INFECÇÕES VIRAIS ................................... 9
FIGURA 4. MODELOS DIFERENCIADOS NA SINALIZAÇÃO DE IL-15 E IL-2............ 11
FIGURA 5. ESQUEMA DO VETOR DE CLONAGEM ........................................................ 20
FIGURA 6 PERFIL DE TNF-α E IFN- .................................................................................. 31
FIGURA 7 PERFIL DE IL-12..................................................................................................32
FIGURA 8. PERFIL DE IL-10.................................................................................................33
FIGURA 9. PERFIL DE IL-2................................................................................................... 34
FIGURA 10. GRÁFICO DA CORRELAÇÃO ENTRE IL-2 VS IL-12. ................................. 35
FIGURA 11. QUANTIFICAÇÃO INDIRETA DO NO .......................................................... 35
FIGURA 12. CURVA DE EFICIÊNCIA PARA O GENE GAPDH ....................................... 45
FIGURA 13. EXPRESSÃO GÊNICA DAS PROTEÍNAS DA FAMÍLIA NFAT ................. 46
FIGURA 14. EXPRESSÃO GÊNICA DOS RECEPTORES DE IL-2 .................................... 46
FIGURA 15. CORRELAÇÃO ENTRE IL-2 E SEU RECEPTOR .......................................... 47
FIGURA 16. EXPRESSÃO GÊNICA DE IL-15 E IL-15RA .................................................. 48
FIGURA 17. CORRELAÇÃO ENTRE IL-15 E NFAT2.........................................................48
vii
FIGURA 18. ANÁLISE DOS DIFERENTES PLASMÍDEOS RECOMBINANTES ............ 55
FIGURA 19. LISADOS OBTIDOS APÓS A INDUÇÃO DA EXPRESSÃO PROTEICA ... 56
FIGURA 20. INTEGRIDADE DO ANTÍGENO SDAG ......................................................... 57
FIGURA 21. MORTE CELULAR APÓS ESTIMULAÇÃO COM OS ANTÍGENOS .......... 58
FIGURA 22. MORTE CELULAR CELULAR DAS CÉLULAS EM CO-CULTIVO APÓS
ESTIMULAÇÃO COM OS ANTÍGENOS ............................................................................. 59
FIGURA 23. INTERRUPÇÃO DA MORTE CELULAR CELULAR DAS CÉLULAS EM
CO-CULTIVO APÓS TRATAMENTO COM IFN-PEG........................................................ 60
FIGURA 24. ENSAIO DE CITOTOXICIDADE .................................................................... 61
FIGURA 25. CONCENTRAÇÃO DE IL-2 E IFN- NO SOBRENADANTE DOS
EXPERIMENTOS IN VITRO .................................................................................................. 62
FIGURA 26. CONCENTRAÇÃO DE IL-12 NO SOBRENADANTE DOS
EXPERIMENTOS IN VITRO ................................................................................................. 63
FIGURA 27. REPRESENTAÇÃO DOS POSSÍVEIS MECANISMOS ENVOLVIDOS EM
PACIENTES QUE RESPONDERAM À TERAPIA COM IFN-PEG .................................... 65
viii
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1. ATIVIDADES DO IFN-Α NO SISTEMA IMUNE.............................................6
QUADRO 2. PACIENTES QUE FORAM SELECIONADOS PARA PARTICIPAÇÃO NO
PRESENTE ESTUDO E PARÂMETROS UTILIZADOS PARA AGRUPÁ-LOS................26
ix
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. QUANTIFICAÇÃO DE CITOCINAS................................................................27
Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 O VÍRUS DA HEPATITE DELTA - HDV
Aspectos Gerais da Infecção pelo HDV
Primeiramente descrito por (RIZZETTO et al., 1977), o vírus da hepatite Delta (HDV)
é um vírus de RNA, hepatotrópico e dependente do antígeno de superfície do vírus da hepatite
B, o HBsAg (Karayiannis 1998). Uma de suas singularidades é que para completar a montagem
dos vírions e consequentemente infectar novas células o HDV depende de todas as subunidades
que compõem o antígeno de superfície do HBV (Large -L, Middle - M e Small -S), o que faz
com que seja classificado como subvírus ou vírus satélite dependente. Partículas do HDV
desprovidas da proteína L do HBV não são infectantes, enquanto as desprovidas da proteína S
do HBV não montam as partículas virais, consequentemente, pessoas vacinadas contra a
hepatite B se imunizam indiretamente contra o vírus Delta (TAYLOR, 2006).
Mesmo com a disponibilidade de vacinação contra o HBV, existem aproximadamente
240 milhões de pessoas que são portadores crônicos com HBsAg positivo (revisado por OTT
et al., 2012), o que faz com que a infecção pelo Delta tenha condições de progredir anualmente
neste grupo de indivíduos, uma vez que sua transmissão ocorre pelas vias sexual, parenteral e
vertical. Outro aspecto que dificulta as medidas de controle do HDV se refere à subnotificação
dos infectados, pois, mesmo que os números estejam estimados em 20 milhões de portadores,
diversas áreas não possuem estudos de prevalência (revisado por ALVES; BRANCO; CUNHA,
2013). No Brasil, as áreas endêmicas correspondem aos estados da região Amazônica Ocidental
(Acre, Amazonas, Rondônia e Roraima) com prevalência de 41,9% entre os portadores do
HBsAg (BRAGA et al., 2012).
Com relação aos aspectos virológicos, o HDV é o único vírus da família Deltaviridae
gênero Delta vírus e se apresenta como um vírus pequeno, esférico, de RNA polaridade
negativa, cujos 1700 nucleotídeos que compõe a fita apresente uma complementariedade entre
as bases de 74%, o que faz com que se torne um genoma viral circular (NIRO; SMEDILE,
2012). O genoma de RNA é transcrito pela RNA polimerase II humana e possui somente uma
fase de leitura aberta (ORF) que codifica o Antígeno Delta (HDAg) em duas isoformas distintas:
o Antígeno Delta Pequeno (SDAg) e o Antígeno Delta Longo (LDAg).
Ambos HDAg são formados durante o processo de replicação do vírus, sendo que o
SDAg é formado pela leitura convencional do antigenoma, resultando em uma proteína
composta por 194/195 aminoácidos. A produção do LDAg é mediada por uma enzima humana,
a Adenosina Deaminase tipo 1 (ADAR-1S), a qual atua no RNA viral e converte o stop códon
Introdução
2
(UAG) do SDAg em um códon de Triptofano (UGG). Consequentemente, o LDAg apresenta
uma adição de 19/20 aminoácidos na sua porção carboxi-terminal (HUANG; LO, 2014). Essas
proteínas são imprescindíveis no processo de replicação viral (Figura 1) e a proteína LDAg é
quem coordena a montagem dos novos vírus, pois interage diretamente com o HBsAg
(ALDABE et al., 2015).
Figura 1. Esquema de Replicação do HDV
Ligação ao Receptor NTCP presente nos Hepatócitos Humanos; (2) desnudamento da partícula viral;
(3)Translocação da partícula para o Núcleo; (4) Transcrição do antigenoma no nucléolo; (5) Produção do RNA
genômico no nucleoplasma; (6) Transcrição do RNAm; (7) Tradução do HDAg e retorno ao nucleoplasma; (8)
Montagem da Partícula; (9) Associação com o HBsAg no citoplasma e montagem do vírion; (10) Liberação do
Vírion. (Modificado de ALDABE et al., 2015).
Observando o ciclo do vírus, nota-se que o indivíduo portador de HDV também possua
o HBV, obrigatoriamente. Existem duas formas de se adquirir a infecção: a coinfecção e a
superinfecção. A primeira forma consiste em uma infecção simultânea do HDV e do HBV
resultando em interferência viral, ou seja, ocorre estagnação da replicação dos vírus B e D em
95% dos casos. Porém, quando o título viral de HBV adquirido é alto existem condições para a
síntese do HDV se tornar intensa, o que leva às formas fulminates (FARCI; NIRO, 2012).
Introdução
3
A surperinfecção é quando ocorre uma infecção do HDV em pacientes que já eram
portadores do HBV (sintomáticos, assintomáticos, que possuam ou não replicação viral).
Indivíduos superinfectados oferecem condições biológicas para que o HDV se dissemine
acarretando replicação viral e, deste modo, seja o tipo de infecção mais comum (GUNSAR,
2009). O prognóstico na superinfecção é que o período de progressão para a cronicidade varie
de dois a seis anos, enquanto em crianças a evolução para a cronicidade ocorra mais
rapidamente. (FARCI; NIRO, 2012; GUNSAR, 2009).
Além do tipo de infecção, os antígenos virais circulantes (HBsAg e HDAgs) também
são importantes para os eventos desencadeados. Um destes antígenos, o HBsAg, mesmo não
sendo parte do genoma do HDV, compõe o envelope viral e por analogia pode modular alguns
eventos imunológicos do hospedeiro. Dentre os achados mais recentes, destacam-se estudos
que compararam monócitos/macrófagos isolados do sangue periférico de indivíduos sadios ou
pacientes portadores de HBV. As células vindas do grupo de infectados demonstraram a baixa
expressão de receptor tipo “Toll” 2 – TLR-2 (WANG et al., 2013) e do tipo 9 – TLR-9 (HUANG
et al., 2014). Apesar de serem TLRs distintos, em ambos estudos os autores sugerem que o
HBsAg tem a capacidade de interferir em diversos processos, uma vez que é capaz de interferir
na sinalização das MAP quinases.
Pouco HDAg está circulante no soro dos pacientes, pois o antígeno possui um fator de
localização nuclear, o que deixa essa proteína preferencialmente restrita ao núcleo e ao nucléolo
dos hepatócitos infectados (HUANG et al., 2012). Mesmo no interior do núcleo é possível
observar a interação dos HDAg com sua célula-alvo (hepatócitos), Cao e colaboradores (2009),
através de estudos de co-imunoprecipitação, demonstraram que o SDAg é capaz de interagir
com mais de 100 proteínas celulares, dentre as quais estão subunidades da RNA polimerase II,
partículas de ribonucleoproteínas heterogêneas (hnRNPs), helicases, proteínas de ligação ao
RNA, além de fatores de transcrição. Essa quantidade exacerbada de proteínas do hospedeiro
que podem se ligar ao SDAg é justificada pelos processos pós-traducionais que o antígeno viral
pode sofrer (revisado por (GRECO-STEWART; PELCHAT, 2010).
Os HDAgs podem sofrer muitas modificações, tais como: a fosforilação de serina e
treonina, metilação de arginina, acetilação da lisina e a prenilação de cisteína. Estas
modificações contribuem para as interações intermoleculares que envolvem o SDAg e os
diversos alvos com os quais ele se liga. As modificações pós-traducionais têm mostrado
desempenhar um papel no ciclo replicativo do HDV, sendo que muitas das proteínas celulares
envolvidas neste processo têm sido identificadas (revisado por (GRECO-STEWART;
PELCHAT, 2010).
Introdução
4
Muitos eventos relacionados com a doença acabam dependendo da resposta imune do
hospedeiro. Estudos iniciais mostraram que as células NK, tem um papel importante para
impedir o desenvolvimento do HDV e das lesões hepáticas. Em contrapartida, o aparecimento
de um padrão de resposta TH2 além da produção excessiva de IL-10 são indicativos de mau
prognóstico, uma vez que este perfil está diretamente relacionado com pacientes que não
respondem ao tratamento. Apesar de serem dados iniciais, infere-se que o vírus é capaz de gerar
uma resposta contrária ao padrão TH1, a qual seria necessária para eliminação do mesmo e
geração de células TCD4+ e TCD8+ de memória (revisado por HUGHES; WEDEMEYER;
HARRISON, 2011). Este fato foi importante para mostrar que o vírus causa um sítio
inflamatório, o qual leva ao aparecimento de carcinoma, não por uma resposta inflamatória
celular, mas devido à produção excessiva de TNF-. Esta citocina é produzida pela ativação do
fator de transcrição nuclear κB – NF-κB, o qual é ativado pelo LDAg (PASCARELLA;
NEGRO, 2011).
Por fim, o HDV, assim como outros vírus, também consegue suprimir a sinalização de
IFN- nos hepatócitos, atuando nas vias Janus quinase (JAK) e transdutores de sinal e
ativadores de transcrição (STAT), de uma maneira ainda não totalmente elucidada (revisado
por PASCARELLA; NEGRO, 2011). Sabe-se que, possivelmente o HDAg está envolvido no
processo de inibição da produção de IFN-, mas que o vírus não deve atuar diretamente na
cascata da sinalização JAK/STAT, pois estas proteínas localizam-se no citoplasma e o antígeno
viral concentra-se no núcleo da célula infectada, sugerindo um mecanismo secundário de
inibição (PUGNALE et al., 2009).
Diagnóstico do Vírus Delta
A Organização Mundial da Saúde sugere que qualquer indivíduo com resultado positivo
para o HBsAg também seja testado para a presença do HDV. O diagnóstico é a detecção de
anticorpos contra o HDV (anti-HDV), realizado através de ensaios imunoenzimáticos, ou pela
detecção do RNA viral sérico pela técnica do RT-PCR (WHO, 2001).
Os anticorpos contra HDV não são imunoprotetores, contudo, a importância da sua
identificação é justificável, pois a presença de IgG anti-HDV com ausência de IgM anti-HDV
e/ou de RNA viral, é indicativo de uma cicatriz sorológica no indivíduo. Contudo, assim como
o material genético, os anticorpos não são perenes e tendem a desaparecer após alguns anos,
quando o indivíduo infectado encontra-se em recuperação, devido à cura espontânea ou
tratamento (OLIVERO; SMEDILE, 2012; WEDEMEYER; MANNS, 2010).
Introdução
5
Tratamento dos pacientes com HDV
Revisado por Rizzeto (2016) é possível notar que nenhum medicamento específico
contra vírus pode ser desenvolvido até o momento, devido à ausência de opções terapêuticas e
à falta de alvos nos componentes virais, tais como enzimas e/ou receptores exclusivos do HDV
utilizados para a replicação. Assim, os medicamentos mais promissores, que se encontram em
testes clínicos, são aqueles que atuam de forma indireta sobre o vírus delta. O primeiro exemplo,
que já iniciou os testes em humanos, chama-se Myrcludex B. Trata-se de um peptídeo que
possui como alvo o co-transportador de taurocolato de sódio humano (NTCP), o qual fica
indisponível para realizar a ligação com a proteína de superfície HBsAg e evita-se, com isso, a
entrada do HBV no hepatócito. Como o HDV utiliza o mesmo envelope, o medicamento
indiretamente também evita sua entrada.
Outro medicamento em fase clínica é o BZA-5B, um inibidor de atividade da farnesil
transferase. Esta enzima humana é responsável pela adição de um resíduo de cisteína
(farnesilação) em proteínas que possuem grupos isoprenilados. Essas modificações póstransducionais de proteínas, cujo processo é importante para mediar as interações proteínamembrana. O HDV utiliza esse mecanismo na montagem do vírus com o envelope do HBV
(ABBAS; ABBAS, 2015).
Além dos ensaios experimentais, têm-se a realidade da prática clínica, cujos relatos de
sucesso terapêutico são atribuídos ao uso prolongado de interferon alfa recombinante, sendo
que o Interferon Alfa Peguilado (IFN-PEG) é o mais utilizado. Este imunomodulador parece
ter mais eficiência quando administrado conjuntamente com algum fármaco que impede a
replicação do vírus B (HEIDRICH; MANNS; WEDEMEYER, 2013).
Esses estudos, contudo, deixavam duas lacunas importantes. A primeira era com relação
à população estudada. Embora o vírus apresente com uma distribuição mundial, os pacientes
utilizados no estudo são predominantemente caucasianos, enquanto em nossa região, observase uma tendência mais heterogênea quanto às etnias, sendo que caucasianos, ameríndios e
negros constituem a população da Região Amazônica Ocidental.
A segunda é com relação ao genótipo de HDV que predomina e, que poderia interferir
na terapia combinada. Sabe-se que os diferentes genótipos podem levar a cursos clínicos
distintos, sendo o HDV-3 associado às formas mais graves da doença (BARROS et al., 2011).
Apesar da evidente participação do genótipo nos casos de hepatite fulminante, não se verificou
a influência do mesmo no curso dos tratamentos, a exemplo de outras infecções (Ex: HCV and
DEV) que precisam de uma terapia diferenciada de acordo com o genótipo viral (NAKAMOTO
et al., 2015).
Introdução
6
Assim, o estudo publicado pelo nosso grupo (ANEXO C) mostra que a terapia
combinada pode ser adotada como um protocolo clínico viável no Brasil, com Resposta
Virológica dos pacientes tratados.
1.2
RESPOSTA IMUNE CELULAR E ATIVAÇÃO LINFOCITÁRIA
Como previamente descrito, o protocolo terapêutico para pacientes com HDV envolve
administração de IFN-PEG. O medicamento utilizado é um imunomodulador, cuja modificação
no medicamento comercial é uma conjugação do reagente bis- monometoxipolietilenoglicol
(PEG) com interferon alfa-2A, o qual é produzido através da tecnologia de DNA recombinante.
A função desta conjugação é melhorar a farmacocinética do medicamento (FERENCI, 2003),
contudo, não altera seu mecanismo de ação que é mimetizar os efeitos produzidos pelo IFN-,
o qual é secretado naturalmente por diversas células do organismo com função de induzir um
estado antiviral, além de atuar na transição da resposta inata para adaptativa (Quadro 1).
QUADRO 1 – Atividades do IFN- no Sistema Imune (BRASSARD; GRACE; BORDENS, 2002)
Células NK
IMUNIDADE
INATA
Atividade LAK
Priming
Macrófago
Célula TCD4+
IMUNIDADE
ADAPTATIVA
Célula TCD8+
Célula B










Aumento da Proliferação
Aumento da Atividade Citolítica
Aumento da Secreção de IFN-
Aumento do Tráfego Celular
Aumento da Atividade
Aumento da atividade para IL-2 e IFN-
Aumento da Diferenciação
Aumento da Atividade de NO
Aumento da Expressão de MHC classe II
Aumento da Secreção de IFN-
Balanço de TH1 vs TH2


Aumento do Tráfego Celular

Aumento da Atividade CTL

Estimulação de Células de Memória

Aumento da Resposta à apresentação MHC
classe I

Aumento do Tráfego Celular

Aumento da Secreção de IgG

Diminuição da Secreção de IgE

Aumento do Tráfego Celular
O fato dos pacientes responderem ao tratamento com IFN-PEG sugere a importância do
Sistema Imunológico do hospedeiro para que a infecção viral seja resolvida ou ocorra uma
progressão da doença. Estudos que desvendem estes mecanismos ainda estão emergindo,
contudo, assim como acontece na monoinfecção pelo HBV, alguns autores sugerem que a
exaustão de células T possa ser um dos mecanismos de escape do HDV (PACKER et al., 2014;
WANG et al., 2007).
Introdução
7
Essa hipótese é reforçada se olharmos como acontece o mecanismo de exaustão celular
produzido pelo HBV (KONDO et al., 2013). Investigações sugerem que o excesso de HBsAg
circulante pode levar à diversos mecanismos de supressão da resposta imune e que a retirada
do antígeno leva à recuperação do Sistema Imune (Figura 2). Sabendo que essa proteína é
utilizada pelo HDV, este vírus poderia compartilhar esses mecanismos.
Figura 2. Esquema de reversão da Supressão Imunológica
Esquema de reversão da supressão imunológica. A redução do HBsAg pode resultar na recuperação de
vários tipos de imunossupressão culminando com a resolução da infecção (KONDO et al., 2013).
As células T são componentes centrais da Resposta Imune Adaptativa, que é
indispensável para a manutenção do Sistema Imunológico e sua homeostase. Dentre as diversas
funções das células T, existe a vigilância imune para eliminar as células transformadas e
suprimir as infecções virais. Ao exercer estas funções dois processos podem ocorrer, pelos quais
as células T podem perder sua capacidade de reagir aos antígenos e que, apesar de distintos,
podem estar correlacionados. São eles: anergia e exaustão. A Anergia ocorre quando as células
T recebem ativação e co-estimulação insuficientes para responder ao reconhecimento do
processo antigênico (revisado por BALKHI et al. 2014). Já a exaustão é um processo em que T
células reativas a antígenos tumorais, ou virais, perdem a sua capacidade para matar as célulasalvo, devido a uma exposição antigênica crônica (SCHIETINGER; GREENBERG, 2014).
Os linfócitos T reativos ao antígeno podem se tornar mais vulneráveis à exaustão
durante a vigilância imunológica, uma vez que essas células T podem entrar em um ambiente
Introdução
8
antigênico extremamente rico e serem estimuladas repetidamente provocando a exaustão. O
processo de exaustão é capaz de afetar tanto as células de memória quanto as T efetoras, levando
a consequências debilitantes sobre as funções imunológicas. Como essa exposição recorrente a
vírus e antígenos tumorais pode não cessar, o pool de células T perde a sua capacidade de
reativação(revisado por BALKHI et al., 2014).
Normalmente o que ocorre durante a infecção inicial é que as células T naïve são
preparadas pelo antígeno, pela co-estimulação e pelo processo inflamatório a diferenciar-se em
células T efetoras. Com o término da infecção e o desaparecimento de antígenos, um
subconjunto destas células T efetoras funcionais se diferenciam novamente, para se tornarem
células T de memória, as quais são altamente polifuncionais capazes de co-produzir e responder
mais fortemente a citocinas como IFN-γ, TNF-ɑ e IL-2 (revisado por WHERRY, 2011). Deste
modo, as células T respondem a uma infecção viral integrando sucessivos sinais celulares e
moleculares que levam a variados níveis de diferenciação.
Contudo, quando ocorrem infecções virais persistentes, há excesso de sinais antigênicos
e mudanças dos componentes inflamatórios presentes no ambiente (KAHAN; WHERRY;
ZAJAC, 2015). O processo de exaustão de células T é caracterizado por uma importante
diminuição das funções efetoras, incluindo queda da atividade citolítica e da secreção de
citocina do tipo padrão TH1, seguida de hiperexpressão de moléculas inibidoras, tais como
receptor de morte programada 1 (PD-1) e produção de IL-10 e TGF-β que criam um
microambiente de supressão (WHERRY, 2011).
Os estudos de expressão gênica têm demonstrado que o perfil molecular de exaustão de
células T esgotadas é semelhante entre processos tumorais e infecções virais crônicas. As
alterações na síntese de citocinas constitui um componente principal do fenótipo de exaustão,
com a perda de secreção de IL-2 ,IFN-γ e TNF-ɑ de forma sequencial, como pode ser observada
na Figura 2 (modificada de WHERRY, 2011).
Introdução
9
Figura 3 Exaustão de Células T em Infecções Virais
Como antígeno e/ou a carga viral aumenta em infecções crônicas, as células TCD4+ auxiliadoras diminuem, sendo
sua presença inversamente proporcional à cronicidade da infecção (duração). A gravidade da exaustão de células
T está correlacionado com o aumento da expressão do receptor inibitório, carga viral elevada (ou antígeno), perda
de auxílio de células T CD4+ e infecção prolongada . A atividade de cada propriedade é apresentada em uma escala
de alta (+++) para baixo (-) e a sigla 'CTL' indica o potencial citotóxico (modificado de WHERRY, 2011).
Uma das mais importantes citocinas, cuja produção é comprometida, durante a exaustão
de células T, é a IL-2, sendo a mesma fundamental para a sobrevivência das células T e ativação
da resposta imune celular robusta contra infecções. (revisado por BALKHI et al., 2014). Os
mesmos autores sugerem, ao final do artigo, que estudar as possíveis vias que modulam a
transcrição de IL-2 (NF-κB, NFAT, e AP1) em células T durante o processo de exaustão celular
podem auxiliar no entendimento da baixa expressão desta citocina em infecções virais crônicas.
A importância das Citocinas IL-2 e IL-15 para a Resposta Imune Celular
A resposta do Sistema Imune aos patógenos envolve a participação dos Linfócitos T como
mediadores da Resposta Imune Celular. Essas células podem defender o hospedeiro matando
as células infectadas ou liberando citocinas que irão interferir na sobrevivência do microorganismo. A apresentação de antígenos leva à migração de Linfócitos T Efetores para os
tecidos periféricos, onde vários eventos ocorrem ao mesmo tempo e culminam com: a geração
das células T de Memória e o controle da resposta inflamatória excessiva pelas células T
reguladoras – Treg; a eliminação do patógeno (DELVES; ROITT, 2000). Contudo, os
Introdução
10
mecanismos que levam a esses eventos favoráveis podem falhar e fazer com que a presença do
patógeno se torne crônica (SCHENTEN; MEDZHITOV, 2011).
Neste contexto, sabe-se que as citocinas são responsáveis por regular o Sistema Imune e
que muitas vezes algumas citocinas se ligam em receptores heterodímeros, cujas subunidades
podem ser compartilhadas entre as citocinas (WALDMANN, 2006).
Por exemplo, os receptores das citocinas IL-2 e a IL-15 são heterodiméricos. Essas
citocinas compartilham as subunidades CD132 e CD122, mas possuem o CD25 (ou IL-2RA) e
o IL-15RA como subunidades exclusivas (representados também com a letra grega ). Nos
estudos que investigam estas citocinas é possível observar que o compartilhamento destas
subunidades desencadeia vias de sinalização que levam à: produção de IFN-γ, geração de
Linfócitos T Citotóxicos (TCLs); estimulação e proliferação de células T; indução, geração e
persistência de células Natural Killer (NK) (WALDMANN, 2006).
Outro estudo que mostra a dependência destas citocinas foi realizado por Feau e
colaboradores (2005). Os autores estudaram Células Dendríticas maduras (DCs) murinas e
humanas, derivadas de precursores plasmocitoides e mieloides. Estas células, além de serem
Células Apresentadora de Antígeno (do inglês APCs) também produzem IL-2 em condições
bem específicas, a qual induz a proliferação alogênica de TCD4+ e TCD8+ em infecções, como
as causadas pelo Citomegalovírus (CMV) e HCV. Os autores relatam que as DCs produzem
IL-2 quando existem estímulos prévios das células T, mas também em um microambiente rico
em IL-15. Eles sugerem que a IL-15 seria capaz de induzir modificações pós-transcricionais
que levam a produção de IL-2, pois na ausência da primeira citocina a quantidade de IL-2
secretada é muito menor (FEAU et al., 2005).
Apesar dessas similaridades, as subunidades específicas não estão expressas de maneira
homogênea, pois a IL-2R é amplamente encontrada em células T e B ativadas, enquanto IL15RA ocorre em monócitos e DCs ativados. Além disso, a expressão de IL-15 só ocorre quando
a mesma está ligada ao IL-15 R através de apresentação trans, conforme ilustrado na Figura
3 (modificada de JABRI; ABADIE, 2015).
Introdução
11
Figura 4. Modelos diferenciados na sinalização de IL-15 e IL-2
A IL-2 se liga à célula-alvo através de uma apresentação cis. Ou seja, a citocina IL-2 é produzida e secretada
por um tipo celular, encontrando-se solúvel no microambiente e posteriormente se ligando ao receptor
heterodímero de IL-2, formado pelas subunidades (,β, ou CD25, CD122 e CD132). A citocina A IL-15 se liga
ao Receptor de IL-15 subunidade α (IL‑15Rα) através de uma complexação que intracelularmente ocorre no
retículo endoplasmático (RE). Deste modo, é expresso na superfície celular por uma apresentação do tipo trans e
posteriormente se liga à célula-alvo pelos receptores CD 122 e CD 132 (modificada de JABRI; ABADIE, 2015).
As diferenças de apresentação explicariam porque em algumas situações a IL-2 e a IL-15
podem possuir papéis antagônicos. Como um exemplo, existem relatos que, em humanos, a
hiperexpressão de IL-2 está relacionada com morte celular induzida por ativação, enquanto a
hiperexpressão de IL-15 inibe este evento, sugerindo uma ação antiapoptose e geração de
células TCD8+ de memória (JABRI; ABADIE, 2015).
Fator Nuclear de Células T Ativadas (NFAT)
NFAT é uma família de proteínas composta por cinco membros, denominados
sequencialmente (NFAT-1, NFAT-2, NFAT-3, NFAT-4 e NFAT-5). Todos são fatores de
transcrição nuclear, contudo os NFAT-1, NFAT-2 e NFAT-4 são aqueles responsáveis por
desencadear eventos de importância imunológica (MACIAN, 2005).
A ativação deste fator de transcrição ocorre após a defosforilação mediada pelo influxo
de cálcio intracelular. Apesar de presentes em vários tipos celulares, os eventos que o NFAT é
capaz de desencadear são mais estudados em linfócitos T, uma vez que a sinalização induzida
pelo receptor de célula T (TCR) é a mais amplamente conhecida (revisado por MACIAN,
2005).
Introdução
12
Outra curiosidade a respeito do NFAT é o fato de ser um fator de transcrição monomérico,
ou seja, sem subdivisões em sua estrutura proteica, o que o torna capaz de interagir com outros
fatores
de
transcrição
conhecidos
gerando
sinergismos
positivos
ou
negativos.
Consequentemente, o NFAT acaba sendo uma via que influencia de alguma forma na produção
de diversas citocinas, dentre elas: IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-10, IL-15, TNF-ɑ, IFN-γ, GM-CSF,
CD40L e FasL (KIANI et al., 2001; LEE et al., 2009; MACIAN, 2005).
O NFAT também apresenta função relevante na diferenciação dos Linfócitos T auxiliares.
A apresentação de antígenos pelas APCs faz com que células T auxiliares naïve liguem-se
através do TCR ao MHC. Como consequência, ocorrerá a diferenciação em células T efetoras
gerando uma população linfocitária com padrão de resposta T H1 ou TH2 (MURPHY; REINER,
2002). Os fatores responsáveis pelo desvio da resposta imunológica do hospedeiro para um tipo
de padrão específico são o tipo de antígeno, a intensidade do estímulo e o tipo da APC envolvida
na apresentação inicial. Além destes fatores, existe o papel das citocinas que desencadeiam
sinais e eventos específicos nestes linfócitos que irão se diferenciar (MURPHY; REINER,
2002).
Em células TH1, o NFAT atua conjuntamente com o STAT-4 para induzir a expressão de
IFN-γ, o que resulta em ativação de macrófagos e outros eventos subsequentes que culmina
com o processo inflamatório (KIANI et al., 2001). No caso da resposta T H2, o NFAT induz a
expressão de IL-4, principal interleucina envolvida neste padrão (AGARWAL; AVNI; RAO,
2000).
Outra característica importante deste fator de transcrição é a regulação da síntese de IL-2
em linfócitos T auxiliares efetores e de memória (SERFLING; BERBERICH-SIEBELT;
AVOTS, 2007). Quando o NFAT é translocado até o núcleo para transcrição de alguns genes,
um dos sítios de ligação desta proteína resulta na expressão de IL-2. Experimentos
demonstraram que linfócitos de memória produzem interleucina via NFAT enquanto os naïve
não (DIENZ et al., 2007). Posteriormente, descobriu-se que a IL-2 secretada pelos linfócitos T
efetores também era regulada principalmente pela via NFAT (SERFLING; BERBERICHSIEBELT; AVOTS, 2007). Consequentemente, a regulação de NFAT e produção de IL-2
relacionam-se com proliferação e diferenciação celular de células NK e linfócitos T e B,
eliminação de células T autorreativas e manutenção de células T reguladoras - TREG
(WALDMANN, 2006).
Já estudos envolvendo IL-15, demonstraram que a citocina é capaz de desencadear a
migração do NFAT-1 para o núcleo celular e desencadear eventos que envolvem a regulação
Introdução
13
de quimiocinas imprescindíveis para adesão de leucócitos (BARLIC et al., 2004; MACIAN,
2005).
Com relação à participação do NFAT em hepatites virais, estudos demonstraram o
aumento do fator de transcrição NFAT-2 em células da linhagem Jurkat que expressam o core
de HCV (DOMÍNGUEZ-VILLAR et al., 2007). Os autores sugerem que as proteínas do core
do HCV são suficientes para causar a translocação do NFAT para o núcleo. Como resultado
desta translocação, os linfócitos entram em um estado semelhante ao de anergia, o que
influenciaria na persistência viral observada em pacientes infectados. No mesmo ano, Wherry
e colaboradores (2007) separaram populações de linfócitos murinos TCD8+ expostos
cronicamente ao LMCV. As populações de TCD8+ foram separadas em efetoras, anérgicas ou
exausta e foram analisadas conforme sua assinatura gênica. Os autores descobriram que um
balanço na proporção entre NFAT:AP-1 leva à ativação do Linfócito, entretanto, quando ocorre
a ativação de NFAT sem a presença de AP-1 a célula entra em estado de anergia e o aumento
exacerbado do NFAT-2 pode levar à exaustão.
A participação deste fator de transcrição em infecções virais crônicas torna-se evidente e
a ausência de estudos em outras hepatites virais, torna-se um importante alvo para nossa
investigação.
Justificativa
14
2. JUSTIFICATIVA
A hepatopatia crônica causada pelo HBV não está diretamente associada aos danos
hepáticos causados pelo vírus, uma vez que ele não é citopático e a patogênese da doença é
mediada pela imunidade do hospedeiro, na qual a resposta celular e humoral estão envolvidas.
Diversos estudos conduzidos com esse vírus mostram uma forte correlação entre a resposta de
linfócitos T, os hepatócitos e o clearance do HBV, sendo a maioria das investigações
concentradas em alterações em subpopulações de linfócitos no sangue periférico de pacientes
com infecção crônica (CIUPE et al., 2007; LI et al., 2014; MIZUKOSHI et al., 2004). Foi
demonstrada intensa participação e desequilíbrio em eventos periféricos, tais como produção
de citocinas, ou diminuição da resposta celular por mecanismos de exaustão.
Em se tratando da infecção pelo HDV, a mesma apresenta distribuição mundial, sendo
a região ocidental da Amazônia brasileira considerada área de alta endemicidade, o que a torna
um problema de saúde pública no estado de Rondônia. Além da alta prevalência do vírus
associa-se o fato que este pode determinar quadros de Doença Hepática Crônica devido à
atividade necro-inflamatória contínua no local da infecção, que são os hepatócitos. Pacientes
HBV/HDV positivos apresentam um risco três vezes maior de desenvolver carcinoma
hepatocelular e duas vezes mais chances de mortalidade por cirrose quando comparados
pacientes infectados somente com HBV (PASCARELLA; NEGRO, 2011). Aliado a este efeito
citotóxico inerente ao HDV, observa-se que fatores relacionados ao hospedeiro podem levar a
padrões paradoxais da resposta imunológica, uma vez que em alguns casos o paciente
desenvolve uma resposta inflamatória exacerbada e, em outros casos, estudos demonstram que
há geração de um padrão de resposta TH2 atípico com aumento de IL-10.
Visto alguns dados publicados e revisados recentemente nota-se uma enorme lacuna a
ser preenchida, incluindo estudos que sugerem como a resposta imune celular do hospedeiro
poderia participar, ao mesmo tempo, da patogênese e do controle da infecção. Deste modo,
acreditamos que o presente trabalho contribuirá na tentativa de elucidar qual o perfil da secreção
linfocitária de interleucinas indispensáveis para resposta TH1 imprescindíveis para a resolução
da infecção viral e, consequentemente, para os mecanismos de inflamação tecidual, além de
sugerir possíveis efeitos que demonstrem exaustão do Sistema Imune. Por fim, será um estudo
que poderá auxiliar no entendimento da resposta imune celular do hospedeiro e que
potencialmente auxiliará no desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas, tão necessárias
para o controle da infecção pelo HDV.
Objetivos
15
3. OBJETIVOS
Objetivo Geral
Avaliar aspectos da ativação leucocitária, relacionados com a via NFAT, na infecção pelo
HDV.
Objetivos Específicos

Selecionar pacientes portadores de HBV sem coinfecção e pacientes HBV/HDV
através de diagnóstico sorológico;

Separar a população estudada em: Pacientes monoinfectados com HBV,
pacientes HBV/HDV divididos entre: aqueles que não iniciaram o tratamento antiviral e
são PCR positivos; aqueles que não iniciaram o tratamento antiviral e são PCR negativos
e anti-HDV IgG positivos; aqueles que concluíram o tratamento clínico;

Observar o perfil de resposta inflamatória através da quantificação de citocinas
por Elisa;

Comparar a expressão gênica da via NFAT em pacientes HBV sem coinfecção
e pacientes HBV/HDV em PBMC;

Analisar estatisticamente os resultados obtidos para os indivíduos HBV
positivos sem coinfecções e compará-los com os resultados obtidos para HBV/HDV;

Clonagem, expressão e Purificação do SDAg;

Ensaios in vitro de citotoxicidade que envolvam células na presença do SDAg
tratadas ou não com IFN-PEG;

Correlação dos dados in vivo com os dados in vitro.
Material e Métodos
16
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1
CASUÍSTICA
Os pacientes foram escolhidos conforme o seguinte delineamento experimental:

11 pacientes portadores somente de HBV com carga viral acima de 100 UI/mL;

11 portadores de HBV/HDV que nunca realizaram tratamento clínico e estão
PCR negativo para HDV;

14 portadores de HBV/HDV que foram tratados com esquema terapêutico de 48
semanas. Durante todo período foi administrado uma vez por semana, via subcutânea, 180µg
de IFN-PEG mais o análogo de nucleotídeo entecavir, na dose de 0,5 mg, via oral, diariamente.
Após 24 semanas, ou mais, que o tratamento foi finalizado a coleta dos indivíduos foi realizada;

10 portadores de HBV/HDV que não iniciaram o tratamento antiviral e são PCR
positivos para HDV.
Aspectos Éticos
A pesquisa foi realizada de acordo com os princípios estipulados pela Assembleia
Médica Mundial de 1975 e do Ministério de Saúde (Resolução 196/1996) sob aprovação no
CEP (Parecer: 146.474 de 14/11/2012 CAAE 08485112.4.0000.5300-ANEXO A). As amostras
de sangue foram colhidas somente após a assinatura, pelos pacientes, do termo de
consentimento livre e esclarecido (ANEXO B).
4.2
TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
Os pacientes que concordaram em participar da pesquisa tiveram 15mL de sangue
periférico coletado na ausência ou presença de anticoagulante o qual foi submetido a
centrifugação a 1400  g por 10 min a Temperatura Ambiente (TA) para separação do soro. O
soro foi aliquotado em dois tubos de 1,5 mL, sendo um deles estocado a -20ºC para realização
da quantificação de citocinas inflamatórias e nitritos (item 4.3).
A porção sanguínea figurada coletada na presença de anticoagulante foi ressuspensa em
PBS 1X e separada por centrifugação em gradiente de densidade (Ficoll-Paque® d= 1,077 GE
Healthcare, Uppsala, Uppsala län, Suécia) para obtenção da camada de células mononucleadas
de sangue periférico (PBMC). As células presentes na interfase plasma-Ficoll-Paque® foram
cuidadosamente coletadas, lavadas duas vezes a 200  g com PBS (1X), ressuspensas em 1 mL
de PBS (1X) e contadas em câmara de Neubauer com com corante vital Azul de Trypan (0,3%).
Material e Métodos
17
Da quantidade total de células obtidas, 1x10 7 células tiveram seu RNA preservado em
Trizol® (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Caliofórnia, EUA) a uma temperatura de 80ºC para posterior extração de RNA Total.
4.3
QUANTIFICAÇÃO SÉRICA DE CITOCINAS INFLAMATÓRIAS
Empregando o método de ELISA com os reagentes, padrões e soluções comerciais (BD
OptEIA™, BD Biosciences Franklin Lakes, NJ, EUA) foi realizada a quantificação das
citocinas: IL-2, IL-10, IL-12, IFN- e TNF-α empregando anticorpos específicos e biotinilados
e citocinas-padrão para construção da curva-padrão de quantificação, de acordo com instruções
do fabricante (BD OptEIA™, BD Biosciences Franklin Lakes, NJ, EUA). Os anticorpos de
captura foram diluídos em tampão de diluição nas proporções indicadas na bula e distribuídos
em uma placa de 96 poços, sendo o volume de 100 μL/poço. Procedeu-se a incubação das placas
por 16 horas a 4°C e posterior lavagem com solução PBS 1X acrescida de 0,05% de Tween –
tampão de lavagem, também fornecida pelo fabricante. Após as sucessivas lavagens e secagem
da placa, foram adicionados 300 μL/poço de tampão de bloqueio seguido de incubação à
temperatura ambiente no mínimo por 1 hora. Após o bloqueio, os poços foram novamente
lavados três vezes com o tampão de lavagem e adicionados 100 µL das amostras, branco ou
curva-padrão para a quantificação das citocinas. Depois de duas horas repetiu-se o
procedimento de lavagem da placa, posteriormente adicionando 100 μL/poço dos anticorpos de
detecção biotinilados, na concentração indicada pelo fabricante. Após uma hora de incubação
foi repetido novo ciclo de lavagem, para adição de 100 μL/poço da solução de substrato, com
incubação por 30 minutos à temperatura ambiente. A reação foi bloqueada adicionando-se 50
μL/poço de stop solution. A densidade ótica (D.O.) foi avaliada em leitor de microplacas com
filtro de 450 nm (ASYS UVM340 Biochrom, Cambridge, Inglaterra) e a concentração de
citocinas foi calculada a partir da equação da reta, com os valores extrapolados da curva de
calibração.
4.4
QUANTIFICAÇÃO SÉRICA DE NITRITOS
A produção de Óxido Nítrico pelas células do Sistema Imune foi calculada de maneira
indireta, sendo que o metabólito final da reação (nitrato/nitrito) foi quantificado pelo método
de Griess em placas de 96 poços. Um volume 100 uL/poço de amostra ou padrão ou branco foi
distribuído e incubado com 100 uL/poço do reagente de Griess preparado no momento do uso
na proporção 1:1:1:1 de água destilada: ácido fosfórico5%: solução A: solução B. O preparo
das soluções A e B foi realizada conforme segue: A solução A foi preparada pesando-se 0,5 g
Material e Métodos
18
de sulfonilamida e diluindo em 25 mL de ácido fosfórico 5%, e a solução B é composta de 0,05
g de NEDD (cloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina) diluída em 25mL de água. Ambas foram
preparadas no dia da quantificação. Após 15 minutos observou-se a formação de cor
proporcional a quantidade de nitrito presente no soro. A leitura foi realizada a 540 nm (ASYS
UVM340 Biochrom, Cambridge, Inglaterra) e a concentração de nitrito foi calculada a partir
da curva de calibração.
4.5
EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL E TRANSCRIÇÃO REVERSA
O RNA total, do material obtido das PBMCs, foi extraído pelo método do TRIzol®
Reagent, conforme especificações do fabricante (Life Technologies, Carlsbad, California EUA). Após precipitação, o RNA extraído foi diluído em tampão adequado e estocado a -80ºC.
O RNA foi quantificado e avaliado quanto à integridade e pureza por meio de leitura em
espectrofotômetro
NanoDrop®
(ThermoScientific, Wilmington,
Delaware
-
EUA).
Posteriormente, o RNA total do PBMC foi transcrito em cDNA utilizando-se o kit Superscript
III (Life Technologies, Carlsbad, California – EUA). A reação foi preparada para utilização de
random primers conforme as instruções do fabricante, sendo que foram utilizados 3,5 g de
RNA com o volume final de 25 L ajustados com água DEPC.
4.6
EXPRESSÃO GÊNICA
Para a quantificação relativa de alguns genes envolvidos na via NFAT utilizou-se PCR
quantitativa em tempo real (qRT-PCR). A metodologia empregada para esta análise foi a
TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies, Foster City, California, EUA) para os
genes de interesse genes listados a seguir: NFATc1 (Hs00905451_m1); NFATc2
(Hs00542678_m1);
NFATc3
(Hs00542571_m1);
CD25
(Hs00190046_m1);
(Hs0000907779_m1);
IL-2
CD122
(Hs00174114_m1);
(Hs01081697_m1);
IL-15
CD132
(Hs00953624_m1); IL15RA (Hs00542604_m1). Os genes de referência (endógenos ou
constitutivos) utilizados foram: ACTB (Hs99999903_m1); GAPDH (Hs02758991_g1); B2M
(Hs00984230_m1); PolR2A (Hs00172187_m1). Os ensaios foram realizados em duplicata,
com desvio máximo permitido entre as duplicatas de até 0,5 Ct (meio Cycle Threshold).
4.6.1 Eficiência de Amplificação
Além de ensaios para definir as concentrações ideais de reagentes, também foi
confeccionado um pool de cDNA das amostras analisadas neste trabalho, e posteriormente
foram realizadas diluições seriadas com a seguintes concentrações de cDNA: puro; 1:10; 1:100;
Material e Métodos
19
1:1000 e 1:10.000. Assim, garantiu-se que a eficiência de amplificação dos genes envolvidos
fosse a mesma, e as quantidades por reação ficaram padronizadas para: 10L de TaqMan
Universal PCR Master Mix (2X); 0,8 L de sonda gene específica FAM (20X); 0,8 L de sonda
endógeno específica VIC; 1,0 L de cDNA puro (na concentração de 1µg) e água para volume
final de 20L.
Para garantir a ausência de resultados falso-negativos, cada amostra possuía um controle
endógeno dentro do ensaio com o objetivo de validar os resultados cujos genes não estavam
sendo expressos, isso foi possível pois os genes de interesse foram marcados com fluorocromo
FAM e os genes endógenos foram marcados com fluorocromo VIC. Deste modo, os genes
endógenos serviram como um controle interno da reação (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).
4.6.2 Cálculo da Expressão Relativa
A expressão dos genes endógenos foi utilizada para obtenção da média geométrica dos
valores obtidos (VANDESOMPELE et al., 2002). Posteriormente, calculou-se o Ct para
obtenção da expressão relativa dos genes em estudo (PFAFFL, 2001).
Rapidamente, deve-se lembrar de que a fase exponencial da reação de PCR origina uma
curva de amplificação linear e se pode estabelecer o quantification cycle (Cq), onde a cada novo
ciclo de reação, o dobro de amplicon é formado. Com a garantia da eficiência de reação e a
determinação de um mesmo Ct, para todas as corridas realizadas, é possível explicar a fórmula
conforme segue:
Ct = Cq do gene alvo  média geométrica dos Cqs dos genes endógenos (referência)
Ct = Ct do gene alvo – Ct da mediana dos calibradores*
Expressão relativa = 2-Ct
* Neste ensaio, utilizamos como calibradores indivíduos crônicos não tratados para o
HBV
4.7
CLONAGEM DO ANTÍGENO DELTA PEQUENO (SDAG)
Esses experimentos foram realizados no período de 1 de outubro a 26 de outubro de
2014 no Instituto de Higiene e Medicina Tropical, sob supervisão do Dr Celso Vladimiro
Cunha.
4.7.1 Ligação do gene  Ag-S no Vetor pGEX-6P-2
Uma quantidade 10 ng/µL do vetor pGEX-6P-2 Figura 2 (GE Healthcare, Uppsala,
Uppsala län, Suécia) foi linearizado com as enzimas de restrição XhoI e BamHI
Material e Métodos
20
(Fermentas/ThermoScientific, Vilnius – Lituânia). O cDNA Ag-S, que codifica o antígeno
pequeno do vírus da hepatite Delta, foi sintetizado conforme sequência publicada por (DINGLE
et al., 1998) e disponível no GenBank sob número de acesso U88619.1.
Procedeu-se à reação de ligação do inserto a 40 ng/µL com o vetor a 10 ng/µL
(proporção de 4:1) em presença de T4 ligase (1 U) e 2 L tampão de ligação (10X) fornecido
pelo fabricante (Fermentas/ThermoScientific, Vilnius – Lituânia) e água para o volume final de
20L. Os componentes foram homogeneizados e incubados por 2 horas em TA, após esse
período, retirou-se 10 L da mistura para dar continuidade ao processo de clonagem e os 10 L
restantes foram armazenados em -20ºC até o final dos experimentos.
Figura 5. Esquema do Vetor de Clonagem
O vetor de Clonagem pGEX foi utilizado para clonagem do SDAg. A figura ressalta as enzimas que podem ser
utilizadas e os locais de abertura do vetor.
4.7.2 Transformação de Células Competentes
A cepa utilizada para os experimentos de clonagem foi a BL21 (MCLAB, São Francisco,
Califórnia, EUA). Os 10L da mistura de ligação, obtida no subitem anterior, foram
adicionados a um tubo tipo eppendorf de 2,0 mL, contendo 100L de bactérias competentes.
Os tubos foram agitados levemente e foram colocados em gelo por 10 minutos. Após este tempo
os tubos foram colocados em banho-maria a 42ºC durante 2 minutos, para efetuar o choque
térmico. O tubo foi novamente colocado em gelo e 900 L de meio LB -Luria Broth
(temperatura ambiente) foram adicionados, para um volume final de 1000 L, deste modo,
Material e Métodos
21
havia uma proporção de plasmídeo de 1:100 no tubo. Após este período, o tubo foi incubado
por 1 hora a 37ºC a 250 rpm no aparelho Eppendorf Thermomixer (Eppendorf, Hamburgo,
Alemanha).
Após este período de incubação, as alíquotas do produto de transformação foram
plaqueadas em meio ágar LB contendo ampicilina (Merck, Whitehouse Station, Nova Jérsei,
EUA) a uma concentração final de 100 L/mL de para a seleção dos clones transformados. As
colônias cresceram overnight a 37ºC e, posteriormente, foram selecionados seis clones para dar
continuidade ao processo. Estas seis colônias foram devidamente enumeradas e crescidas
separadamente em 10 mL de meio LB líquido a 37ºC por doze horas. Depois deste período de
crescimento metade do volume foi devidamente numerado e armazenado (5mL), enquanto a
outra metade (5mL) foi centrifugada a 2280x g para obtenção do pellet que foi utilizado para a
extração do DNA plasmidial com o kit QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Germantown,
Maryland, EUA).
Para confirmar a correta inserção do cDNA do Ag-S no vetor, os quatro diferentes
grupos extraídos foram digeridos com a enzima HincII (Fermentas/ThermoScientific, Vilnius
– Lituânia). A enzima Hinc II possui sítios de restrição que clivam o vetor pGEX-6P-2,
conforme
pode
ser
visualizado
no
site
do
fabricante
(https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/131477444
3672/litdoc28918451AB_20110831091708.pdf). Se a inserção do Ag-S for realizada na
orientação correta e com sucesso, os fragmentos gerados possuirão tamanhos de 896 e 1183 pb.
4.7.3 Expressão e Purificação do Antígeno Delta Pequeno
Colônias de E coli BL21 resistentes a ampicilina, que possuíam a orientação correta do
fragmento, foram utilizadas para a expressão da proteína, conforme as recomendações do kit
Microspin GST Purification Kit (GE Healthcare, Uppsala, Uppsala län, Suécia). Rapidamente,
após a transformação as bactérias foram colocadas em meio 2x YTA e deixadas para crescer
em agitação de 250 rpm overnight. Após este período de crescimento, 0,5mL da suspensão
bacteriana foi adicionada a 4,5 mL de meio LB mais ampicilina, ou seja, realizou-se uma
diluição 1:10 para um volume final de 5 mL de meio. O crescimento de foi acompanhado até
que a Densidade Ótica em 600nm atingisse valores entre 0,6 a 0,8. Ao atingir estes valores,
duas alíquotas foram separadas, uma delas foi utilizada para controle e à outra foi adicionado o
agente indutor IPTG (Isopropil-β-D-tiogalacto-piranosídeo) na concentração de 1 mM durante
3 horas. Após a indução, o tubo foi centrifugado a 2280xg e o precipitado foi ressuspenso em
Material e Métodos
22
5mL de PBS e o material ressuspenso foi sonicado durante 60 minutos, alternando 1 minuto de
sonicação e 5 minutos em banho de gelo.
Após uma hora, o material foi aquecido até 30 ºC e posteriormente centrifugado. O
sobrenadante foi recolhido e teve seu volume reduzido ao total de 1 mL, sendo que uma alíquota
de 20 L foi retirada para verificação da expressão em gel de poliacrilamida corado com
Comassie Blue. O volume restante foi levado para a purificação com colunas comerciais
Microspin GST Purification Kit (GE Healthcare, Uppsala, Uppsala län, Suécia).
Depois de preparadas, aplicou-se o sobrenadante nas colunas, as quais ficaram
incubando durante 15 minutos à temperatura ambiente e posteriormente foram centrifugadas a
735xg. Em seguida, a coluna foi lavada duas vezes com PBS 1X. Adicionou-se 100 L de
tampão de eluição e após 15 minutos a temperatura ambiente, as colunas foram novamente
centrifugadas durante 1 minuto a 735xg e o eluído (que contém a proteína de fusão) foi
purificado através da digestão com 2 unidades da protease PreScission (GE Healthcare,
Uppsala, Uppsala län, Suécia).
4.8
CULTIVO DAS LINHAGENS CELULARES
As linhagens utilizadas para os experimentos in vitro foram THP-1 (ATCC TIB-202) e
Jurkat (ATCC TIB-152). Ambas foram expandidas e mantidas em meio RPMI completo
(acrescido de 10% de Soro Bovino Fetal e 0,1% de antibiótico Gentamicina) em estufa de CO 2
a 5% e 37ºC. Para a realização dos ensaios as mesmas foram lavadas com meio RPMI completo
e coletadas após a centrifugação (400 x g, 15 min, 10ºC). A suspensão foi acertada para 8x106
céls/mL para a linhagem de linfócitos (Jurkat) e 2x106 para a linhagem de monócitos (THP-1).
A contagem foi realizada em câmara de Neubauer na presença do corante vital azul de Tripan
0,3% e procedeu-se com os experimentos em microplacas.
4.9
TRATAMENTO IN VITRO COM IFN-PEG
As células cultivadas e expandidas no item 4.8 foram distribuídas em placas de 24 poços
na presença de HBsAg (Diasorin The Diagnostic Specialist – Salugge, Itália), SDAg (clonado
e purificado conforme item 4.7) ou ambos. Quando os antígenos foram incubados
simultaneamente, utilizou-se duas concentrações da mistura HBsAg+SDAg (100 ng/mL e 25
ng/mL) para verificar se haveria indícios de concentração dependência nos efeitos celulares.
Como controle positivo utilizamos LPS na concentração de 500 ng/mL e como controle
negativo utilizamos PBS 1X. As placas foram incubadas 24 horas a 37ºC em estufa de em estufa
de CO2 a 5%.
Material e Métodos
23
Após esse período, em metade das placas foi adicionado IFN-PEG (HoffmannLaRoche, Rio de Janeiro, Brasil) diluído para a concentração de 100 ng/mL. Essas placas foram
chamadas de Tratamento
As placas, cujo tratamento não foi adicionado, foram retiradas da estufa e adicionados
20L de PBS 1X – volume correspondente ao IFN-PEG. Novamente, incubou-se o material
por 24 horas a 37ºC em estufa de CO2 a 5%.
Transcorridas as 48 horas totais do experimento, as placas de 24 poços foram
fotografadas e seu sobrenadante recolhido e estocado para análise de citocinas (item 4.3).
Resumidamente, para os experimentos in vitro seguiu-se o fluxograma abaixo.
4.10
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE IN VITRO
Concomitante ao tratamento in vitro, foi realizado o ensaio de citotoxicidade utilizando
o sal de tetrazolium-MTT para avaliar se o HBsAg e /ou SDAg seriam tóxicos para as células
Material e Métodos
24
com as quais estavam sendo incubadas e se o tratamento com IFN-PEG poderia reverter esse
efeito citotóxico.
A redução do MTT é um método colorimétrico rápido, frequentemente usado para medir
proliferação celular e citotoxicidade (MOSMANN, 1983). Neste ensaio, o MTT é acumulado
pelas células por endocitose e a redução do anel tetrazólico deste sal resulta na formação de
cristais de formazan de cor azul que se acumulam em compartimentos endossomais e/ou
lisossomais, sendo depois transportados para fora das células por exocitose. Assim, após as 48
horas das culturas celulares, contendo ou não o tratamento com IFN-PEG, foram removidos os
sobrenadantes e as células foram incubadas com uma solução de MTT (5 mg/ml) em PBS 1X,
durante 4 horas a 37°C em estufa de CO2 a 5%. Após esta incubação, os cristais de formazan,
resultantes da redução do MTT, originaram composto colorido e sua a absorbância foi medida
num leitor automático de placas de cultura (ASYS UVM340 Biochrom, Cambridge, Inglaterra)
a um comprimento de onda de 570 nm. Os valores da viabilidade celular foram expressos em
porcentagem relativa à absorbância determinada nas células-controle mortas com solução de
SDS 10% (m/v).
4.11
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para avaliar a diferença significativa entre os grupos estudados foi aplicado o teste de
Kruskal-Wallis, seguido do pós-teste de Dunn. Em todas as análises, foram considerados como
resultados significativos aqueles cujo P valor foi menor do que 0,05.
Para verificar a presença de correlação entre as citocinas avaliadas e também entre o
perfil de expressão gênica, realizou-se o teste de correlação de Pearson e foram considerados
resultados significativos aqueles cujo p valor foi menor do que 0,05.
Para os dados in vitro foi aplicado o teste two-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni
e foram considerados resultados significativos aqueles cujo p valor foi menor do que 0,05.
CAPÍTULO I – AVALIAÇÃO DE POTENCIAIS BIOMARCADORES SÉRICOS
Resultados - Capítulo I
27
5
RESULTADOS
5.1
CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES
Neste trabalho, foram selecionados indivíduos reagentes para HBsAg (monoinfectados
com HBV), positivos para anti-HDV podendo ou não ter a PCR do respectivo vírus positivo.
Os pacientes foram agrupados conforme Quadro 2.
QUADRO 2 – Pacientes que foram selecionados para participação no presente estudo e
parâmetros utilizados para agrupá-los
HDV Tratamento Finalizado
HDV PCR Negativo
HBV Monoinfectados
GRUPO
Identificação
Sexo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
M
M
M
F
M
M
F
F
F
F
F
M
F
M
F
M
M
M
M
F
F
M
M
F
F
M
F
F
M
F
M
M
M
M
HBV
Replicando
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
AntiHDV
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
PCR
Delta
-
Tratamento
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Resultados - Capítulo I
28
GRUPO
Identificação
Sexo
HDV PCR +
QUADRO 2 – Pacientes que foram selecionados para participação no presente estudo e
parâmetros utilizados para agrupá-los
(continuação)
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
F
M
F
M
M
F
M
M
M
F
HBV
Replicando
+
+
+
+
+
+
+
-
AntiHDV
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
PCR
Delta
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Tratamento
-
Dentre os pacientes analisados, nota-se que somente o 1153 e o 3953 estavam sendo
tratados para HBV, contudo, no momento da coleta eles ainda possuíam carga viral para o HBV
detectável. Para ser incluído ao grupo TTO, os pacientes deveriam ter concluído o tratamento
e no período da coleta os mesmos apresentavam PCR negativo para HDV, carga viral de HBV
abaixo do limite de detecção de (75 UI/mL de sangue) e ausência de anticorpos IgG contra o
vírus delta.
5.2 PERFIL DE CITOCINAS
O soro dos pacientes coletados tiveram suas citocinas quantificadas pela técnica de
Elisa, conforme descrito nos itens 4.3, onde se realizou um screening para as citocinas IL-2,
IFN-, TNF-, IL-12 e IL-10e conforme demonstrado na Tabela 1. Os resultados foram obtidos
em pg/mL.
TABELA1 – Quantificação de Citocinas
CITOCINAS (pg/mL)
HBV Monoinfectados
Pacientes
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
TNF-
0,00
0,00
0,00
6,63
1,34
3,56
4,50
1,19
0,00
3,02
0,54
IFN-γ
18,46
36,08
0,15
0,00
0,15
2,31
0,00
0,27
9,62
1,58
0,15
IL-12
1222,78
627,00
809,00
1450,00
1454,67
1568,00
1416,67
1541,00
894,00
1087,00
82,67
IL-10
17,81
7,29
14,27
4,38
9,48
3,96
6,25
3,23
0,00
26,25
5,63
IL-2
9,50
0,00
0,00
0,00
0,00
1,50
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
Nitritos
(M)
nq
96,08
236,18
194,65
54,35
nq
235,16
209,96
47,90
nq
nq
Resultados - Capítulo I
29
TABELA1 – Quantificação de Citocinas
(continuação)
CITOCINAS (pg/mL)
Nitritos
(M)
TNF- IFN-γ
IL-12
IL-10
IL-2
12
0,00
0,00
1459,67
11,21
0,00
104,76
13
4,21
8,00
114,67
4,38
6,50
nq
14
41,33
nq
nq
nq
nq
139,45
15
0,45
0,50
80,67
11,56
0,00
90,67
16
39,57
5,88
112,67
9,27
5,75
nq
17
16,33
nq
nq
nq
nq
67,28
18
0,00
0,00
854,68
37,70
0,00
3,91
19
10,78
nq
nq
nq
nq
90,53
20
1,49
1,85
109,00
3,65
5,83
126,80
21
1,39
3,92
99,33
3,23
2,33
110,98
22
3,56
3,69
112,67
5,00
6,00
105,78
23
0,00
0,00
1529,33
4,38
22,17
81,20
24
1,04
1,15
715,00
1,56
12,75
24,11
25
1,49
0,58
1434,67
5,73
84,53
132,10
26
0,00
2,54
1513,33
7,08
21,33
16,95
27
0,89
4,46
1422,33
29,58
39,67
44,18
28
0,84
3,54
1098,00
3,33
30,92
17,82
29
1,68
0,12
1500,67
2,19
27,44
40,93
30
1,29
0,88
1464,67
11,25
32,58
185,57
31
0,69
36,92
83,67
4,06
0,00
74,96
32
0,15
2,85
1540,33
6,25
93,83
13,57
33
1,34
3,81
660,67
6,25
25,36
23,23
34
0,94
1,73
90,33
13,65
1,00
61,59
35
0,00
0,00
1239,67
6,00
0,00
84,92
36
0,00
0,00
60,78
67,49
nq
nq
37
0,89
1,38
92,00
9,69
1,67
133,43
38
7,38
10,12
1578,67
15,42
4,50
43,40
39
2,77
2,77
820,48
7,40
14,75
7,56
40
4,70
9,62
1325,00
11,15
0,00
nq
41
2,62
514,33
4,90
0,00
97,61
nq
42
0,79
0,65
1564,00
1,46
0,00
210,78
43
9,06
62,85
1526,33
4,69
4,33
82,92
44
0,59
0,00
1442,00
302,60
0,00
122,71
45
1,24
2,31
89,33
0,00
0,00
86,80
46
1,39
0,77
94,67
4,48
3,08
102,00
Legenda da Tabela: As amostras de cada paciente estão identificadas individualmente e
também agrupadas em HBV Mono (Pacientes Monoinfectados com HBV); PCR – (Pacientes
HBV/HDV PCR negativo para HDV); TTO (Pacientes HBV/HDV que finalizaram o
tratamento) e PCR + (Pacientes HBV/HDV que são PCR positivos para o HDV)
nq = Amostras não quantificadas
HDV PCR +
HDV Tratamento Finalizado
HDV PCR Negativo
Pacientes
É possível notar que nem todas as amostras coletadas foram quantificadas, estas estão
identificadas com a sigla nq (não quantificadas), isto ocorreu devido a quantidade de soro
Resultados - Capítulo I
30
disponível para as análises. As amostras consideradas 0,00 são aquelas que foram quantificadas,
contudo, os valores da DO obtidos são iguais ao do branco da reação.
O perfil obtido para cada grupo será detalhado nos itens subsequentes.
5.3 DIFERENÇAS NO PERFIL DE CITOCINAS ENTRE OS GRUPOS
Após a quantificação, as citocinas foram agrupadas para que houvesse uma análise
comparativa e estatística entre os grupos do estudo.
Os gráficos de escolha para análise dos resultados foi do tipo dot plot, onde cada ponto
representa um único paciente, contudo, no Apêndice A pode ser observado os mesmos
resultados com a forma de representação gráfica de barras, evidenciando a média e o desviopadrão.
Independente da representação gráfica foi aplicado o teste estatístico não paramétrico de
Kruskal-Wallis, seguido pelo pós teste de Dunn para avaliar diferença estatística entre os grupos
analisados.
Primeiramente, é possível observar que, dentre todas as citocinas analisadas, o TNF-ɑ e
o IFN-γ são as citocinas com o menor nível de produção detectado no soro dos pacientes,
conforme pode ser visto na Figura 6.
A média de valores obtidos para o TNF- é de 0,74 pg/mL para os pacientes tratados,
enquanto nos demais grupos as médias foram: 3,14 (PCR+); 6,33 (PCR-); 1,89 (mono). Assim,
as maiores médias foram observadas no grupo de pacientes PCR- , porém sem significado
estatístico (Figura 6A).
Com relação ao IFN-γ, os valores médios obtidos para os grupos TTO, PCR+, PCR – e
Mono são 4,18; 10,05; 2,98 e 6,25, respectivamente. Apesar de não haver significado estatístico,
é possível notar a produção desta citocina é ao menos o dobro em alguns grupos (Figura 6B).
A
B
Resultados - Capítulo I
31
Figura 6. Perfil da produção de TNF-a e IFN-g
Perfil de TNF-ɑ (A) e IFN-γ (B) dos pacientes coletados. Não houve resultado estatístico entre os grupos
analisados (Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn).
Outra citocina analisada foi a IL-12, conforme mostrado na Figura 7.
Resultados - Capítulo I
32
Figura 7. Perfil da produção de IL-12
Perfil de IL-12 dos pacientes coletados. Apesar do teste estatístico não ter sido significativo (KruskalWallis seguido do pós-teste de Dunn), nota-se que o grupo de pacientes tratados apresenta um valor médio 1,5
vezes maior que o grupo de monoinfectados.
Apesar da sugestiva diminuição desta citocina entre o grupo de pacientes delta PCR
negativo (concentração média de citocina de 367,92 pg/mL) frente aos demais grupos de
pacientes (1099,44 – TTO; 904,68 – PCR+; 1104,80 – Mono) não foi observada diferença com
significado estatístico entre eles.
A IL-10 também foi analisada seguindo os mesmos parâmetros estatísticos e não houve
diferença entre os grupos (Figura 8). Devido a quantificação de um paciente ficar muito acima
dos demais, o eixo y foi segmentado para melhor visualização de todos os grupos.
Resultados - Capítulo I
33
Figura 8. Perfil da produção de IL-10
Perfil de IL-10 dos pacientes coletados. A análise estatística não revelou diferença significativa (KruskalWallis seguido do pós-teste de Dunn)
Pode-se sugerir que, grupos quando retiramos o paciente que teve superexpressão de IL10 no grupo PCR +, a média de produção de IL-10 foi relativamente homogênea com valores
de 7,79 (TTO); 6,57 (PCR+); 10,75 (PCR – ) e 8,96 (Mono).
Com relação a IL-2, nota-se que a citocina encontra-se aumentada em diferentes níveis
nos grupos analisados (Figura 9), sendo que a maior produção média observada ocorreu no
grupo de pacientes TTO (32,31 pg/mL) seguida dos pacientes PCR – (8,62 pg/mL), os pacientes
PCR + e Mono apresentaram valores médios mais baixos (2,83 e 1,00 pg/mL, respectivamente).
A análise estatística revela um p significativo (0,0003) entre os pacientes.
Resultados - Capítulo I
34
Figura 9. Perfil da produção de IL-2
Perfil de IL-2 dos pacientes coletados. A análise estatística revela um p=0,0003 pelo teste de KruskalWallis seguido pelo pós teste de Dunn. Nota-se que a produção de IL-2 sugere um aumento proporcional à ausência
de HDV
5.4 CORRELAÇÃO DOS DADOS OBTIDOS
O teste estatístico de Pearson bicaudal foi utilizado para correlacionar os dados obtidos
entre todas as citocinas analisadas nos soros dos pacientes.
Deste modo, os valores dos pacientes foram pareados e em seguida foram realizadas
análises para cada par de citocinas quantificadas ou seja: IL-2 vs IL-12; IL-2 vs IL-10; IL-2 vs
IFN-γ; IL-2 vs TNF-α e assim sucessivamente.
Cada indivíduo teve seu resultado devidamente pareado para observar se as produções de
citocinas obedeciam algum padrão. A única análise que retornou uma tendência foi a correlação
entre IL-2 e IL-12 (p=0,03), conforme demonstrado na Figura 10. Como o valor de r2 possui
valor positivo, significa que os valores obtidos são proporcionais, ou seja, infere-se que quanto
maior a quantidade de IL-2, maior será a quantidade de IL-12 no soro do mesmo paciente.
Resultados - Capítulo I
35
Figura 10. Gráfico da correlação entre IL-2 vs IL-12.
O teste de Pearson mostra, além de um p valor significativo (0,03), uma relação proporcional entre as
citocinas analisadas, devido ao r2 ser positivo.
5.5
QUANTIFICAÇÃO DE NITRITOS
Os níveis de nitritos produzidos foram quantificados pela técnica de Griess para todos os grupos,
como medida indireta da produção de NO celular. Os valores médios foram de 153, 47 uM para o grupo
Mono, seguido de 102,00 uM para o grupo PCR +. Os grupos PCR – e TTO apresentaram valores médios
de 90,53 uM e 61,59 uM, respectivamente (Figura 11). A análise estatística foi significativa (p= 0,0369).
Figura 11. Quantificação Indireta do NO
Quantificação de nitritos (M) presente no soro dos pacientes que compõem os diferentes grupos. O
teste de Kruskal-wallis, seguido pelo pós teste de Dunn retornou um p valor significativo (0.0369).
Discussão – Capítulo I
36
DISCUSSÃO
A prática clínica é extremamente complexa dentro do Brasil, sendo que várias leis
permeiam o âmbito da saúde. A Lei nº 12.401, de 28 de abril de 2011 versa sobre a “Assistência
Terapêutica e da Incorporação de Tecnologia em Saúde” e estabelece dentro do artigo 19N, a
seguinte definição:
“Protocolo clínico e diretriz terapêutica: documento que estabelece critérios para o
diagnóstico da doença ou do agravo à saúde; o tratamento preconizado, com os medicamentos e
demais produtos apropriados, quando couber; as posologias recomendadas; os mecanismos de
controle clínico; e o acompanhamento e a verificação dos resultados terapêuticos, a serem seguidos
pelos gestores do SUS.”
Deste modo, a caracterização e todos os procedimentos realizados com os pacientes
inseridos neste estudo, está em cumprimento com o Protocolo Clínico e Diretrizes Terapêuticas
para o Tratamento da Hepatite Viral Crônica B e suas Coinfecções (BRASIL, 2010) e revela a
importância do trabalho realizado no Ambulatório de Hepatites Virais do Cepem, pois a
caracterização clínica que realizamos dos pacientes monoinfectados ou portadores de Hepatite
Delta é um tópico tratado dentro do referido protocolo.
O grupo de profissionais médicos do Cepem, além de cumprir com as determinações do
Protocolo, também trouxe benefícios aos portadores desta infecção, pois as modificações que
estão sendo realizadas no protocolo clínico aumentam as chance do paciente controlar a
infecção de maneira efetiva. Isto ocorreu, pois os pacientes tratados que foram utilizados para
compor o grupo TTO, fazem parte de um Estudo Clínico () que tenta incrementar o tratamento
oferecido atualmente para o HDV. O Ministério da Saúde preconiza o tratamento com
Interferon Peguilado Alfa em monoterapia e a associação com a Lamivudina, em pacientes com
a carga viral do HBV acima de 2.000 UI/mL (BRASIL, 2011). Entretanto, os estudos clínicos
mais recentes defendem que os sucessos alcançados com o tratamento são de uma terapia
combinada para HBV e HDV.
Assim, o Estudo Clínico consistiu no tratamento de Hepatite D Crônica com IFN-PEG
combinado com análogo de nucleosídeo (Entecavir) durante 48 semanas. Após a confirmação
da negativação para ambos os vírus, os pacientes foram acompanhados por mais seis meses e,
somente após a confirmação dessa resposta virológica sustentada é que eles foram inseridos no
presente trabalho. A hipótese principal envolve estes pacientes RV e a tentativa de colocarmos
em perspectiva alguns mecanismos imunológicos que possam estar envolvidos para o possível
sucesso terapêutico (BORZACOV et al., 2016).
Discussão – Capítulo I
37
O fato da terapia combinada ter aumentado a eficácia no tratamento das coinfecções das
hepatites B e C (HOOFNAGLE; DI BISCEGLIE, 1997), levou a investigar se a associação do
IFNα convencional com Lamivudina (ou ribavirina) também seria benéfica para o tratamento
da hepatite crônica Delta. Um pequeno aumento na resposta sustentada foi obtida em pacientes
tratados com estes dois medicamentos (28%) quando comparados com aqueles que foram
tratados com IFN somente (17%), porém, não se demonstrou uma diferença estatisticamente
significativa (CANBAKAN et al., 2006).
A associação entre IFN-PEG e antivirais orais, usados no tratamento da infecção pelo
HBV, mostrou-se mais eficaz que a monoterapia. Não se sabe os mecanismos envolvidos nesta
abordagem, mas sugere-se que a supressão da replicação por períodos prolongados diminui as
chances de descompensação hepática (HEIDRICH; MANNS; WEDEMEYER, 2013).
Deste modo, em nosso trabalho, o grupo de pacientes cujo tratamento foi finalizado não
apresentou carga viral detectável. Com relação ao grupo PCR+, devemos destacar que os
pacientes que possuem o HDV replicando apresentam níveis baixos ou indetectáveis na
quantificação da carga viral de HBV e valores facilmente detectáveis de antígeno delta
(GHAMARI et al., 2013). Isto ocorre, pois o HDV inibe a replicação do HBV, fazendo com
que haja utilização da maquinaria celular somente pelo vírus satélite. Nossos resultados
condizem com o descrito por (GHAMARI et al., 2013), uma vez que os pacientes deste grupo
possuem carga viral de HBV indetectável.
Outro ponto a ser destacado é que faltam estudos sobre os efeitos do IFN-ɑ na resposta
imune celular em pacientes HDV. O mais completo deles, foi realizado por (GRABOWSKI et
al., 2011). Brevemente, os autores separaram os pacientes tratados com IFN-PEG em dois
grupos, um de respondedores (n=7) e outro de não-respondedores (n=5). Além desses dois
grupos principais, houve ainda um terceiro formado por pacientes tratados com Adefovir (n=5).
O número de pacientes utilizados neste artigo experimental, somado a outros artigos clínicos
que utilizam pacientes tratados para o HDV (ASLAN et al., 2006; HEIDRICH et al., 2014;
LUNEMANN et al., 2015) demonstra que o quantitativo de pacientes utilizados nesta tese
apresenta um número adequado e compatível com estudos que não são multicêntricos.
Resumidamente, podemos inferir que utilizamos as seguintes preposições aos analisar
os diversos pacientes, que compõe cada grupo. Aqueles que conseguem controlar a infecção
pelo HDV e estão PCR negativo, sem a utilização de medicamentos, é o nosso modelo mais
próximo do que seria uma resposta desejável frente a uma infecção viral. Os pacientes tratados
são aqueles que tiveram uma resposta virológica, porém após a utilização de IFN-PEG e
entecavir. Os pacientes HDV com PCR positivo não está conseguindo suprimir a replicação do
Discussão – Capítulo I
38
HDV, sendo que o HBV pode estar replicando em baixos níveis ou não estar replicando e por
fim, o grupo de pacientes monoinfectados, cujos pacientes são considerados os calibradores por
possuir uma doença com prognóstico mais favorável e com mais estudos imunofisiopatológicos
já realizados.
Outro ponto que deve ser destacado é a importância das quantificações que realizamos no
sangue periférico e que deram resultados significativos. Esses dados podem sugerir alguns
mecanismos imunológicos de pacientes que estão conseguindo controlar a quantidade de vírus
no sítio primário da infecção, ou cuja doença crônica possa estar evoluindo de modo favorável
ou não. Essa hipótese de extravasamento dos eventos celulares é sustentada por diversos
hepatologistas. Uma revisão recente realizada por (FAHEY; DEMPSEY; LONG, 2014) sobre
o HCV destaca a microanatomia e a imunologia do fígado, o que faz com que o órgão seja único
em alguns aspectos imunológicos e que isso reflita em vários achados comuns às infecções
crônicas virais que acometem esse órgão. Mais especificamente, os autores descrevem:
“Portanto, é importante discutir brevemente a estrutura original e propriedades imunológicas
do fígado. A vascularização hepática é realizada pelas artérias hepática e veia porta, que drenam para uma rede de
capilares especializados denominados sinusoides. Os sinusoides são revestidos com células endoteliais fenestradas
(ECS) e células de Kupffer (KCS), e através do parênquima hepático permitem a perfusão do tecido com sangue
oxigenado, nutritivo e rico em antígenos. Ao retornar para a circulação sistêmica, o sangue passa pelas veias
hepáticas antes de sair através da veia cava extra-hepática inferior. Entre o endotélio sinusoidal e o parênquima
hepático está o espaço de Disse que contém as células hepáticas estreladas (HSC) e células dendríticas residentes
(DCs). A vigilância imunológica e a tolerância dentro do fígado é mediada por um sistema de defesa inata que
dispõe de células -sentinelas, tais como natural killer (NK) e Linfócitos T natural killer (NKT). Além disso, o
fígado possui uma população de células T e B efetoras e de memória, bem como células T reguladoras CD25+
FoxP3+ (Tregs).”
Essas características refletem o órgão com grande poder de perfusão e faz com que os
eventos imunológicos celulares alcancem rapidamente a circulação periférica do paciente, o
que nos encoraja a correlacionar os resultados obtidos, com os eventos advindos do sucesso
terapêutico do paciente.
Dentre os resultados que obtivemos, o primeiro diz respeito ao TNF-. Foi observado
que os pacientes HDV PCR negativo é o grupo que apresenta maior média desta citocina (6,33
pg/mL).
A investigação desta citocina foi aprofundada após relatos recentes da reativação do vírus
HBV em pacientes que possuíam doenças autoimunes e estavam sendo tratados com terapias
anti-TNF- (NARD et al., 2015; PÉREZ-ALVAREZ et al., 2011). De acordo com os estudos,
a terapia com Infliximab (ou outros medicamentos com ação anti-TNF) fez com que esses
Discussão – Capítulo I
39
pacientes desenvolvessem lesões hepáticas graves associadas ao aumento de HBsAg, sugerindo
a importância desta citocina para manter o controle da replicação viral.
Deste modo, investigou-se em modelo animal se haveria aumento da carga viral de HBV
durante a terapia anti-TNF-. Os autores terminam o estudo sugerindo que a falta de TNF no
sítio inflamatório desencadeia um mecanismo de exaustão de células TCD 8+, reduzindo o tempo
do clearance viral e contribuindo para a cronicidade da doença (CHYUAN et al., 2015). Deste
modo, os nossos resultados poderiam sugerir que mais estudos envolvendo células TCD 8+ e
mecanismos de exaustão em pacientes HDV devem ser realizados, pois se os pacientes PCR
negativos poderiam controlar a infecção de uma maneira mais eficaz que os demais grupos
devido aos níveis maiores de TNF-.
Com relação a detecção de IFN-γ, os grupos PCR+ (10,05 pg/mL) e Mono (6,25 pg/mL)
apresentram os níveis mais elevados da citocina mesmo com alguns pacientes pertencentes a
estes grupos não produzindo IFN-γ. Alguns autores relatam que pacientes crônicos de HBV
apresentam níveis de IFN-γ na tentativa de combater a infecção viral (DIMITROPOULOU et
al., 2013) Já Grabowski e colaboradores (2011) também demonstra que ocorre a flutuação desta
citocina durante o tratamento com IFN-PEG.
Por fim, o estudo mais recente e intrigante associando esta citocina mostra que células T
específicas contra HBV, após estimulação com epítopos virais produz baixa quantidade de IFNγ, não importando se os linfócitos foram obtidos de pacientes crônicos ou que resolveram a
infecção (BRINCK-JENSEN et al., 2015).
Deste modo, apesar de ser esperada maior quantidade desta citocina nos pacientes que
estão conseguindo combater a infecção viral, isso não foi observado em nossos experimentos,
uma vez que nossos pacientes estão com baixos níveis de IFN-γ, mesmo aqueles que estão
respondendo à infecção viral. Como os artigos sugerem que a secreção desta citocina não se faz
necessária em grandes quantidades, não é o a citocina-chave para levar a resolução das hepatites
virais que estamos estudando e pode não estar presente fora do local da infecção, nossos
achados encontram-se condizentes com a literatura.
Ao quantificar as citocinas de alguns pacientes é possível observar a detecção de IL-12
em todos os indivíduos, entretanto, nota-se uma tendência de elevação da mesma no grupo de
pacientes tratados, excetuando-se o grupo PCR – . Sabe-se que durante uma infecção viral a via
do IL-12 desencadeia a produção de IFN- pelos linfócitos TCD8+ e que esta ativação é
responsável pelo clearance do micro-organismo (NOVELLI; CASANOVA, 2004). Entretanto,
nossos dados mostram que não existe correlação entre a produção de IL-12 e IFN- nos
Discussão – Capítulo I
40
pacientes. Esses achados condizem com os de (IM et al., 2009), pois pacientes que possuem
hepatite crônica causada pelo HBV apresentam elevados índices de IL-12 e da fração p40 desta
citocina no soro, mas não se correlaciona com níveis de IFN- detectáveis. Apesar dos autores
não conseguirem determinar o porquê da falta de correlação nos pacientes eles sugerem que a
quantificação de IFN- deve ser monitorada durante todo tratamento para observar se não ocorre
elevação em períodos iniciais. Um artigo mais antigo publicado por (LEIFELD et al., 2002)
demonstra que, em biópsias hepáticas de pacientes que morreram com hepatite fulminante
causada pelo HBV, a correlação entre IL-12 e IFN- é significativa.
Os
mesmos
autores
demonstram
pelos
cortes
hepáticos
e
marcações
de
imunohistoquímica que somente as células linfocitárias é que foram responsáveis pela produção
de IFN- e que a hepatite fulminante foi causada por uma resposta imune exacerbada, mediada
por estas duas citocinas. Os estudos de Simmonds e Midgley (2005) e (SCHURICH et al., 2013)
demonstraram que em pacientes com infecção crônica pelo HBV é possível observar uma
exaustão de células TCD8+ e que o aumento de IL-12 é imprescindível como terceiro sinal, para
a recuperação destes linfócitos. Este estudo condiz com a nossa hipótese de recuperação da
exaustão nos pacientes que foram tratados, sugerindo que os níveis mais altos da IL-12
poderiam estar relacionados a um bom prognóstico.
Outro estudo feito por (WANG et al., 2013) demonstraram que o HBsAg inibe a produção
de IL-12 e que ensaios in vitro com células de pacientes mostram que a via JNK-MAPK é
afetada pelo antígeno viral. Nossos dados sugerem que as altas concentrações de IL-12
encontradas nos pacientes podem ser proporcionais à quantidade de HBsAg nos pacientes,
predizendo uma condição clínica favorável àqueles com um perfil mais elevado, entretanto, não
podemos descartar efeitos do HDV e mais estudos são necessários para averiguar a participação
do antígeno delta nestes achados.
A citocina IL-10 é amplamente conhecida na hepatite B crônica por seu efeito
imunossupressor em linfócitos T efetores (POOVORAWAN et al., 2013). Na Hepatite Delta,
(GRABOWSKI et al., 2011) mostraram que sua expressão está aumentada em pacientes nãorespondedores ao tratamento com o IFN-PEG. Apesar da IL-10 ter sido detectada em todos os
grupos, nenhum deles obteve resultados significativos para inferirmos como estaria ocorrendo
a interferência desta citocina no pós-tratamento dos pacientes. Os autores citados sugerem que
a produção de IL-10 está relacionada com a diminuição da produção de IL-2 e IFN-γ, o que
sugeriria a falha terapêutica com IFN-PEG no grupo de pacientes respondedores. O teste
Discussão – Capítulo I
41
estatístico de Pearson mostrou que não existe correlação entre a IL-2 vs IL-10 e IL-10 vs IFNγ nos nossos resultados.
Outra característica da IL-10 é que existem evidências que a principal célula secretora
desta citocina, em pacientes crônicos de HBV, seriam as Tregs CD4+CD25+FoxP3+ localizadas
no PBMC (SPRENGERS et al., 2007). A parte experimental destes três trabalhos evidenciam
justamente a produção de citocinas ao longo do tempo de tratamento e correlaciona pacientes
que responderam ou não ao IFN-PEG até 72 semanas de tratamento.(GRABOWSKI et al.,
2011; POOVORAWAN et al., 2013; SPRENGERS et al., 2007). Contudo, olhando de maneira
mais cautelosa os resultados obtidos pelos autores, nota-se que a IL-10 apresenta um aumento
de sua secreção no decorrer do tratamento e este aumento é diferencialmente significativo entre
os grupos respondedores e não-respondedores. Contudo, os valores médios obtidos após o
término do tratamento é de aproximadamente 10 pg/mL, independente do sucesso terapêutico.
Esses achados corroboram nossos resultados, uma vez que o grupo TTO apresenta um valor
médio de 6,68 pg/mL.
Com relação à IL-2, um estudo conduzido por (FALASCA et al., 2006) demonstrou níveis
elevados desta citocina em pacientes HBV crônicos e com uma carga viral variando de 73 a
120 x103 UI/mL. Nossos resultados contradizem este estudo, pois todos os pacientes do grupo
Mono possuíam carga viral acima do limite de detecção, contudo, nenhum dos indivíduos
apresentou níveis detectáveis de IL-2 no plasma. Com relação ao HDV, (GRABOWSKI et al.,
2011) relataram que o grupo de pacientes que respondiam à terapia apresentaram uma
quantidade de IL-2 superior aos pacientes que não respondiam ao IFN-PEG. (LI et al., 2007),
também observaram baixa quantidade de IL-2 no soro de usuários de drogas contaminados com
hepatites virais, não tratados, além ter sido observado aumento de IL-4.
Um estudo não associado a doenças virais crônicas pode sugerir alguns mecanismos
relacionados aos achados dos pacientes. (DAVIS et al., 2008) demonstraram que o IFN-ɑ
consegue aumentar de maneira sinérgica a produção de IL-2 por células T de memória central.
Os autores separaram os linfócitos T de memória em duas populações: uma efetora e outra
central, enquanto a primeira mantém a capacidade de secretar IFN-γ e TNF-α, a segunda circula
através dos tecidos linfoides secundários e não secretam citocinas pró-inflamatórias, mas sim
elevados níveis de IL-2. Os autores concluem que o desenvolvimento desta população de
células T de memória central ocorre após estímulos com a citocina IL-12 em um microambiente
rico em IFN-α/β. Esses achados condizem com a situação dos nossos pacientes tratados, uma
vez que a secreção de IL-12, apesar de não ter resultado estatístico, evidencia um aumento no
grupo TTO frente aos demais grupos.
Discussão – Capítulo I
42
Por fim, neste trabalho, foram conduzidos ensaios para avaliar a quantidade sérica de
nitritos, como medida indireta da produção de NO pelas células dos pacientes. Sabe-se que o
Óxido Nítrico pode ser produzido por macrófagos e hepatócitos que estejam expostos a um
ambiente inflamatório (TNF-, IFN- e IL-1β), contudo, somente esses estímulos não são
suficientes para a manutenção da produção prolongada de NO (GELLER et al., 1993).
Por outro lado, Chen e colaboradores. (2013), em estudos clínicos com pacientes crônicos
do vírus B, observaram que a produção de iNOs está relacionada ao aparecimento do
Hepatocarcionoma e sua produção é proporcional ao grau de severidade da doença.
Posteriormente, descobriu-se que a produção de óxido nítrico elevada em tecido hepáticos é
devido à presença da proteína X do HBV (HBx) em experimentos realizados com camundongos
humanizados (PARK et al., 2013). Nossos dados revelam que os pacientes Mono, seguido dos
pacientes PCR +, foram os que produziram maior quantidade de NO devido a presença de
nitratos/nitritos que foram quantificados. Sabendo que o HBV está replicando na maioria dos
pacientes que compõem estes grupos, poderíamos sugerir que a produção de NO realmente
estaria aumentada devido a presença de HBx, o que não aconteceria nos outros grupos.
Com isso, finalizamos um dos objetivos desta tese, que foi avaliar possíveis alterações
nos perfis de citocinas dos diferentes grupos, achados que começam a desvendar possíveis
propriedades antivirais do IFN-ɑ frente ao HDV, sugerindo mecanismos de como alguns
pacientes alcançaram uma resposta virológica efetiva.
.
CAPÍTULO II – INVESTIGAÇÃO DO FATOR NUCLEAR DAS CÉLULAS
T ATIVADAS
Resultados – Capítulo II
45
5.6
EXPRESSÃO GÊNICA POR QRT-PCR
Como a via NFAT é considerada uma das vias mais importantes para a expressão de IL2, ela foi escolhida inicialmente para investigar se a presença desta citocina detectada no soro
dos pacientes tratados estaria sendo produzida por células do sangue periférico. Assim, para
uma investigação inicial, priorizamos a análise dos pacientes tratados, e foi utilizada a
quantificação relativa da expressão gênica nas amostras individuais empregando-se o método
de 2-Ct.
Abaixo, as figuras das corridas sendo a Figura 12 representado as curvas de eficiência
dos genes analisados, neste caso a análise do pool para a expressão do GAPDH. As amostras
foram corridas em duplicata.
Figura 12. Curva de Eficiência para o gene GAPDH
Em A e B estão apresentados as curvas de eficiência, as queias foram construídas a partir de diluições
seriadas de razão 10, utilizando um pool de cDNA. Em A tem-se a curva de amplificação de cada ponto e
em B visualiza-se as curvas de regressão linear fornecidas pelo software do aparelho
Sabendo que o HBV leva a uma infecção crônica mais branda quando comparado ao
HDV, utilizamos a média do padrão de resposta imunológica dos pacientes infectados somente
com este primeiro vírus para ser o calibrador frente aos pacientes HDV/HBV.
Portanto, avaliamos a expressão das três principais moléculas da via NFAT, a qual regula
a transcrição de várias interleucinas indispensáveis para gerar um padrão de resposta
imunológica, bem como a ativação de células importantes que culminam com a resolução, ou
não, de diversas infecções virais (Figura 13).
Resultados – Capítulo II
46
Figura 13. Expressão Gênica das proteínas da família NFAT
Fatores de Transcrição NFAT1, NFAT2, NFAT4, nos diferentes grupos analisados. Não houve resultado
estatístico entre os grupos analisados (Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn).
Nota-se que existe um desvio entre os resultados obtidos, o que resulta em análises sem
significados estatísticos, porém é possível notar algumas tendências entre os grupos. O NFAT1 poderia ser considerado o fator de transcrição mais expresso no grupo PCR -, enquanto o
NFAT-2 estaria hiperexpresso no grupo TTO. Já o NFAT-4 possui uma maior expressão no
grupo Mono.
Outros perfis analisados foram dos dois principais receptores de IL-2: o CD25 (IL-2RA)
e o CD122 (IL-2RB), cuja expressão é possível ver na Figura 14.
Figura 14. Expressão Gênica dos Receptores de IL-2
Expressão Gênica dos Receptores IL-2RA (CD25) e IL-2RB (CD122) nos diferentes grupos analisados.
Não houve resultado estatístico entre os grupos analisados (Kruskal-Wallis seguido do pós-teste de Dunn).
Novamente, não foi obtido um valor significativo, apesar de ser observado o aumento
do IL-2RA em pacientes do grupo mono.
Resultados – Capítulo II
47
Os perfis obtidos nas expressões gênicas foram analisados pelo teste não-paramétrico de
Kruskal-wallis, seguido pelo pós-teste de Dunn. Nenhum dos perfis avaliados foi
estatisticamente significativo.
Por fim, realizamos a correlação entre a IL-2 encontrada no soro dos pacientes com os
níveis de expressão de seu receptor, o IL-2RA (CD25). Nota-se que não existe uma correlação
entre a quantidade desta citocina circulante no plasma e a expressão de seus receptores nas
células do PBMC (Figura 15).
Figura 15. Correlação entre IL-2 e seu Receptor
Gráfico de correlação entre IL-2 e seu receptor IL-2RA (CD25). Nota-se a ausência de uma correlação
entre ambos. Não houve resultado estatístico entre os grupos analisados (Análise da Correlação de Pearson).
Por fim, sabendo que o IL-15 também regula a via NFAT e está correlacionado com a
citocina IL-2, observamos sua expressão e também de seu receptor específico, o IL-15RA,
conforme Figura 16.
Resultados – Capítulo II
48
Figura 16. Expressão Gênica de IL-15 e IL-15RA
Nota-se que os altos desvios retornaram o resultado sem significado estatístico entre os grupos (KruskalWallis seguido do pós-teste de Dunn).
Os altos desvios impedem que haja um significado estatístico, contudo, é possível notar
que o grupo PCR – é aquele que apresenta a maior expressão da citocina e do seu receptor.
Por fim, ao realizar a análise de correlação de Pearson entre a expressão gênica de IL15 e a família NFAT, observamos uma correlação negativa (r=-0,5523) e um p significativo (=
0,0058) entre a expressão da IL-15 e o NFAT-2, conforme Figura 17.
Figura 17. Correlação entre IL-15 e NFAT2.
Gráfico de correlação entre IL-15 e NFAT2. Nota-se correlação negativa (r= -0,5523) e um p significativo
(0,0058) quando utilizada a análise de correlação de Pearson.
Discussão – Capítulo II
49
DISCUSSÃO
A produção de IL-2 pode ser modulada através de diversos mecanismos possíveis, uma
vez que para a produção desta citocina é complexa e envolve uma cascata de moléculas,
adaptadores, quinases e fatores de transcrição, os quais conduzem a um mecanismo efetor da
resposta inata e auxilia na resposta imune adaptativa (revisado por Cha et al. 2014). Deste modo,
colocamos em perspectiva alguns dados concretos: O grupo PCR – é formado por pacientes que
até o momento conseguem controlar a infecção viral, o que seria uma resposta imune desejável.
Também temos indícios que produção significativa de IL-2 nos pacientes tratados
correlacionada com a elevação sugestiva de IL-12 neste mesmo grupo poderia levar à Resposta
Virológica dos Pacientes que finalizaram o tratamento. Estes fatos tomados em conjunto,
instigaram a investigação da via NFAT, que é uma via extremamente interessante para eventos
relacionados com células T de memória e produção de IL-2 (revisado por FRIC et al., 2012;
QIN et al., 2014).
Para testarmos nossa hipótese, escolhemos a metodologia de PCR quantitativo em Tempo
Real para as quantificações iniciais. A rapidez do método, sua sensibilidade, a possibilidade de
realizar ensaios em duplicata e utilizar um controle endógeno dentro de cada reação, somados
ao baixo desperdício de material biológico, faz com que vários autores comentem sobre as
vantagens desta metodologia para testar as hipóteses iniciais de expressão gênica (LIVAK;
SCHMITTGEN, 2001; PANEPUCCI et al., 2010; VALASEK; REPA, 2005).
Escolhemos avaliar as subunidades NFAT-1, NFAT-2 e NFAT-4, pois somente essas
subunidades estão sendo transcritas em linfócitos maduros, sendo, portanto, as proteínas que
apresentam funções imunológicas que nos interessavam nesta segunda etapa, segundo revisado
por (MACIAN, 2005). E caso nossa hipótese estivesse correta, esperaríamos o NFAT
diferencialmente expresso no grupo TTO e que essa diferença de expressão se correlacionasse
com a produção de IL-2. Nossos resultados apresentaram expressões não significativas nas
análises realizadas entre os grupos e também nas correlações. Existem duas interpretações
possíveis para estes achados. A primeira, levando em conta somente os resultados estatísticos,
sugere que o PBMC não seria a população responsável pela produção da IL-2 no momento em
que foi realizada a coleta dos pacientes, o que contradiz uma das ideias de que ocorre um
homing de células T para o local da infecção (GRABOWSKI et al., 2011).
Outra possível especulação seria observar que o gene NFAT-2 estaria com expressões
distintas em pacientes tratados, pois o primeiro encontra-se diminuído e o segundo aumentado.
Sabe-se que enquanto o NFAT-1 encontra-se de forma abundante no citoplasma de células T
do sangue periférico e o NFAT-2 só começa a ter sua expressão induzida durante a ativação das
Discussão – Capítulo II
50
células T (ZHOU et al., 2002), sugerindo uma maior ativação em pacientes tratados, conforme
observado na Figura 12 dos resultados apresentados.
Nossa próxima etapa envolveu analisar se a IL-2 secretada estaria interagindo com o
PBMC dos pacientes. Essa pergunta é pertinente, uma vez alguns autores sugeriram que a
resolução da infecção dependia da presença de células TCD4+ citotóxicas circulantes (ASLAN
et al., 2006; MAINI; BERTOLETTI, 2000; NISINI et al., 1997). Sabe-se que para ocorrer a
sinalização pela IL-2 ela precisa se ligar ao seu receptor celular.
Segundo revisão feita por (LÉTOURNEAU et al., 2009) o receptor desta citocina não é
uma única cadeia proteica, ao contrário, é uma proteína heterodimérica formada pelo arranjo
de 3 subunidades distintas, chamadas de ɑ, β e γ . O receptor IL-2Rγ é um receptor de ligação
comum às citocinas IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21. O IL-2Rβ também não é específico à
IL-2, pois também é utilizado como receptor da IL-15, e está presente em várias linhagens
celulares, como Linfócitos naïves, células NK entre outros. O receptor IL-2Rɑ (conhecido como
CD25), além de específico para o reconhecimento da IL-2, está presente em células efetoras e
Tregs.
Nossos resultados, demonstram que poucas células do PBMC estão expressando CD25,
porém essa expressão não se relaciona com a IL-2 encontrada nos pacientes. Este resultado é
possível, pois muitas células possuem afinidade intermediária pela citocina, ou seja, neste caso
a ligação ocorre entre os receptores IL-2Rγ e IL-2Rβ, sem a participação do IL-2Rɑ (revisado
por ROCHMAN et al. 2009). Contudo, a participação do CD25 está associado a receptores de
alta afinidade para a IL-2, além de ser um receptor expresso em Tregs e células efetoras
(LÉTOURNEAU et al., 2009). Isso pode sugerir que os pacientes que responderam ao IFNPEG secretam IL-2, mas que essa citocina não está se ligando fortemente às células do PBMC
e que estas células não expressam o CD25 em sua superfície.
Frente aos nossos achados, também deve-se pensar que a secreção de IL-2 está
acontecendo no fígado (local da infecção) e as células presentes no ambiente hepático são
aquelas que estão sendo influenciadas por este microambiente de citocinas e outros mediadores
da resposta imune, levando os pacientes a manterem a RV. Outra hipótese, seria que mesmo
com a monitorização da viremia, e ela sendo considerada um dos parâmetros para a cura do
paciente em diversas infecções virais, artigos sobre o HBV vem demonstrando que a sua
ausência não significa eliminação completa do vírus no organismo. Autores relataram que
pacientes com baixos níveis de HBsAg no plasma apresentavam uma quantidade alta de HBsAg
no local da infecção, ou seja, os hepatócitos e que o DNA do vírus continua sendo
detectado(CHU; YEH; LIAW, 1998). Os mesmos autores mais recentemente (Chu e Liaw,
Discussão – Capítulo II
51
2012) demonstram que 25% dos pacientes que apresentam níveis indetectáveis de HBsAg na
periferia, ainda não soro-converteram totalmente durante um período de dez anos de
acompanhamento. E quando analisado a presença de DNA viral no soro dos pacientes sem
HBsAg quase 20% deles ainda apresentavam material genético viral. Esses achados
demonstram que os pacientes do nosso estudo podem não possuir HBsAg detectável, mas que
eles ainda podem ter o antígeno presente nas células hepáticas. Com relação ao HDV, nenhum
estudo correlacionando presença de antígeno viral nos hepatócitos com viremia foi realizado
até o momento.
Por fim, notamos que o grupo PCR - apresentou níveis mais elevados de IL-15 e seu
receptor IL-15RA. Esta citocina só é apresentada ligada ao receptor (PERERA et al., 2012) e
nossos dados sugerem que isso pode estar ocorrendo com os pacientes analisados.
A IL-15 vem sendo estudada em pacientes com HCV e HBV, sendo relacionadas a um
bom prognóstico dos pacientes tratados com IFN do tipo I (PERERA et al., 2012; TAN et al.,
2014). Em ambas infecções, nota-se que o IFN-PEG administrado aos pacientes aumenta a
quantidade de IL-15 produzida nos bons respondedores. Os estudos na infecção pelo HCV são
mais abundantes e relatam que ocorre ativação de células NK nos pacientes que produzem a
IL-15 e que esta citocina estimula a produção natural de IFN-α/β nas linhagens monocíticas
(revisado por PERERA et al., 2012).
Recentemente, outro mecanismo foi proposto para a importância da IL-15 na resposta
imune nas infecções virais. Sabe-se que ocorre uma baixa expressão de moléculas MHC-I em
células infectadas com vírus, o que faz que a resposta imune celular mediada por Células T seja
menos eficiente. Assim, a ativação de células via trans pela IL-15 faria com que a essa
deficiência na expressão de MHC-I fosse “compensada” e os linfócitos conseguissem eliminar
de maneira eficiente as células infectadas (JABRI; ABADIE, 2015). Nossos dados, podem
sugerir que os pacientes PCR –realizam a expressão de IL-15 de uma maneira mais evidente, o
que sugeriria combate à infecção viral de maneira mais efetiva que os outros grupos.
Assim, pouco se sabe da dinâmica entre eventos relacionados ao sítio primário da
infecção (o fígado) e os eventos que ocorrem neste mesmo local. O Ministério da Saúde, através
da Portaria nº 602, de 26 de Junho de 2012, aprovou as Diretrizes Diagnósticas e Terapêuticas
do Câncer de Fígado no Adulto. Nesta diretriz, procedimentos de biópsia só são permitidos
quando outras técnicas por imagem falharam ou geraram dados inconclusivos. E o item 6.1
constante no Anexo desta diretriz, versa sobre a monitorização do tratamento, onde se lê : “A
avaliação da resposta ao tratamento do hepatocarcinoma deve ser feita pelo uso de métodos
radiológicos dinâmicos...”, o que impede a biópsia no grupo TTO.
Discussão – Capítulo II
52
O modelo experimental in vivo é feito com marmotas (CASEY; GERIN, 2006; FREITAS
et al., 2012) ou camundongos humanizados (revisado por DANDRI; LÜTGEHETMANN,
2014). O primeiro tipo de modelo limita e impossibilita muitos ensaios imunológicos, uma vez
que não existem muitos marcadores e anticorpos desenvolvidos para este tipo de roedor, já os
camundongos humanizados representam um alto custo de aquisição e manutenção. Deste modo,
a etapa final deste projeto visa validar in vitro os achados correspondentes a IL-2 e que podem
estar ocorrendo nas células do fígado. Diversos grupos de pesquisa em HDV utilizam modelos
de co-cultura para validação de seus estudos ((ALVES; FREITAS; CUNHA, 2008; CASACA
et al., 2011; GRECO-STEWART; PELCHAT, 2010; MOTA et al., 2008), uma vez que os
modelos animais são limitados.
Espera-se desta maneira iniciar a elucidação dos possíveis mecanismos envolvendo a
produção de IL-2 pelos pacientes com RV e que os possíveis desdobramentos possam
consolidar este estudo na região Amazônica. Este estudo pode servir como referência para o
protocolo terapêutico da Hepatite Delta na tentativa de personalizar os tratamentos para os
pacientes, diminuindo a falha terapêutica, os efeitos adversos/colaterais observados e
aumentando a porcentagem de cura.
Assim, a terceira e última parte da tese utilizou o antígeno Delta obtido, conforme a
metodologia descrita neste trabalho (item 4.7), para estimular as linhagens celulares, na
tentativa de avaliarmos in vitro como este antígeno pode reprimir ou estimular a produção de
determinadas citocinas pelo sistema imunológico em ensaios que simulam uma infecção
envolvendo linfócitos e monócitos periféricos.
CAPÍTULO III – ENSAIOS IN VITRO
Resultados – Capítulo III
5.7
55
CLONAGEM, EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DO SDAg
Para avaliar a correta orientação do cDNA dentro do vetor, procedeu-se a digestão dos
plasmídeos com a enzima HincII. Essa enzima promove a clivagem do vetor pGEX-6P-2,
gerando fragmentos de965pb, 783pb e 671pb nos vetores vazios, os clones com os plasmídeos
com inserção correta, deveriam produzir um padrão de 1163pb e outro com 896 pb. A Figura
18 mostra o resultado do gel de agarose. No primeiro poço, a digestão feita com plasmídeos
não clonados. Os poços 7, 8 e 12 com as colônias que produziram os plasmídeos esperados. O
M representa o marcador GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas/ThermoScientific, Vilnius
– Lituânia).
Figura 18. Análise dos diferentes plasmídeos recombinantes
Os diferentes plasmídeos recombinantes isolados em gel de agarose 1%. A letra M representa o marcador
GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas) e os poços 7, 8 e 12 representam os plasmídeos com os fragmentos de
tamanhos esperados.
Após essa etapa, somente os três clones que possuíam os insertos com os tamanhos de
fragmentos esperados poderiam ser utilizados para dar continuidade ao processo. Foi escolhido
o clone do poço 7, que possuía maior intensidade de banda, para dar continuidade ao processo
de expressão, induzido por IPTG 1mM.
Após a indução da expressão as bactérias foram lisadas e as proteínas totais separadas em
géis de 12% poliacrilamida por SDS-PAGE (Figura 19). A proteína GST/SDAg antes da
purificação está mostrada na linha 1. Os lisado total de E. coli foi purificado por cromatografia
de afinidade, em colunas GSTrap, e o domínio GST foi separado da SDAg por digestão com a
protease PrecSicion. O resultado desta purificação pode ser avaliado na linha 2. As linhas 3, 4
e 5 correspondem aos extratos totais de E. coli separados por eletroforese para demonstrar os
efeitos dos diferentes tempos de indução de 3, 2 e 1 horas, respectivamente, para a produção do
antígeno. As setas indicam a proteína GST/SDAg ou o SDAg purificado. A letra M representa
o marcador que possui o peso molecular ao lado.
Resultados – Capítulo III
56
Figura 19. Lisados obtidos após a indução da Expressão proteica
Eletroforese em poliacrilamida 12% dos lisados obtidos após a indução da Expressão proteica. A letra M
é o marcador, com os respectivos pesos moleculares indicados ao lado de cada banda. O poço 1 representa o lisado
total e a seta o local onde encontra-se o SDAg ainda fusionado ao GST (GST-SDAg). O poço 2 é o lisado após
purificação parcial em coluna e digestão proteica, sendo a seta indicando o SDAg. Os poços 3, 4 e 5 representam
o GST-SDAg após indução com IPTG nos tempos de 3, 2 e 1 hora, respectivamente.
O SDAg obtido foi liofilizado e transportado para o Brasil. Deste modo, após a
ressuspensão do antígeno em solução PBS 1X, foi corrido um gel de poliacrilamida com malha
de 12,5% em condições desnaturantes para observar possíveis contaminações e/ou degradações
do material antes do início dos experimentos in vitro. A Figura 20 mostra o resultado do gel
com o marcador de peso molecular Full-range Rainbow Marker Amersham (GE Healthcare,
Uppsala, Uppsala län, Suécia).
Resultados – Capítulo III
57
Figura 20. Integridade do antígeno SDAg
Nota-se que o SDAg é uma banda única, pois foi purificado e que o HBsAg possui vários
padrões de banda, uma vez que é composto por todas as subunidades (as proteínas L, M e S).
Deste modo, os antígenos puderam ser utilizados nos ensaios in vitro.
5.8 ANTÍGENOS VIRAIS INDUZEM MORTE CELULAR
A avaliação in vitro descrita nos itens 4.8 e 4.9 serviu para mimetizar os eventos que
estavam sendo observados nos pacientes.
Contudo, foram realizados vários ensaios para padronizar a quantidade de estímulos que
seriam utilizados nos experimentos. Primeiramente, foram utilizadas somente células da
linhagem Jurkat para a padronização.
Os estímulos utilizados foram o PBS 1X para as células controle, o LPS
(lipopolissacarídeo) para as células de controle positivo, o HBsAg, o SDAg e uma mistura na
proporção 1:1 de HBsAg+SDAg. Esses estímulos foram mantidos até o final e nossa primeira
meta era estabelecer a concentração que seria utilizada dos antígenos virais, devido a ausência
de dados na literatura.
Curiosamente, os antígenos na concentração de 100 ng/mL foram capazes de promover
a morte celular destas células em 24 horas, Figura 21.
Assim, os testes preliminares com a Jurkat nos fez reduzir a quantidade de cada antígeno
para 25 ng/mL e com isso reduzir a quantidade de células que sofreu morte celular.
Resultados – Capítulo III
58
Figura 21. Morte Celular após estimulação com os antígenos
As fotomicrografias representativas tiradas a partir de microscópio de inversão (aumento de 10X)
sugerem que as células estimuladas com os antígenos virais (na concentração de 100 ng/mL) por 24 horas induz
morte celular quando comparadas às células que não receberam estímulo ou que foram estimuladas com LPS.
Também é possível notar que a associação do HBsAg e SDAg promove morte celular celular mais evidente quando
comparado aos antígenos isolados.
Posteriormente, foi realizado um novo ensaio de cultura de células, desta vez com a
adição da linhagem THP-1 na proporção de 1:4, mimetizando a proporção de monócitos no
sangue periférico, em forma de co-cultivo. A concentração de antígenos utilizada foi de 25
ng/mL, conforme padronizada no experimento anterior.
Curiosamente, a adição de THP-1 aumentou de maneira relevante a citotoxicidade das
células que foram estimuladas, conforme pode ser observado na Figura 22.
Resultados – Capítulo III
59
Figura 22. Morte Celular em ensaio de co-cultivo após estimulação com os antígenos
As fotomicrografias representativas tiradas a partir de microscópio de inversão (aumento de 10X)
sugerem que as células co-cultivadas estimuladas com os antígenos virais (na concentração de 25 ng/mL) por 24
horas induz morte celular quando comparadas às células que não receberam estímulo ou que foram estimuladas
com LPS. Também é possível notar que a associação do HBsAg e SDAg promove morte celular mais evidente
quando comparado aos antígenos isolados
Diante destas observações, sugeriu-se que a THP-1 poderia estimular o
desencadeamento da morte celular, mesmo com concentrações reduzidas de antígenos. Assim,
optou-se por realizar o tratamento com IFN-PEG e não realizar redução na concentração de
antígenos.
O protocolo de tratamento in vitro foi realizado com células em co-cultivo e 24 horas
de estímulo antigênico (25 ng/mL). Após 24horas, foi adicionado IFN-PEG na concentração de
100 ng/ml e as células foram incubadas novamente por 24 horas, totalizando 48 horas de
experimento. Notou-se que diminuição da morte celular, conforme Figura 23.
Resultados – Capítulo III
60
Figura 23. Interrupção da morte celular em ensaio de co-cultivo após tratamento com IFN-PEG
As fotomicrografias representativas tiradas a partir de microscópio de inversão (aumento de 10X)
sugerem que as células co-cultivadas estimuladas com os antígenos virais (na concentração de 25 ng/mL) por 24
horas e posteriormente incubadas com IFN-PEG (100ng/mL) são mais preservadas.
5.9
O TRATAMENTO COM IFN-PEG REVERTE A TOXICIDADE
APRESENTADA PELAS CÉLULAS ESTIMULADAS COM OS ANTÍGENOS VIRAIS
Para confirmar que a adição do IFN-PEG, além de conseguir inibir a morte celular,
também fez com que as células voltassem a se proliferar, foi realizado o ensaio de
citotoxicidade.
Esse ensaio foi realizado nas primeiras 24 horas quando as células só possuíam os
estímulos e nas 48 horas, quando as células, além dos antígenos, também possuíam o
tratamento. A citotoxicidade dos antígenos virais foi avaliada pelo método de MTT. Compostos
que levam à morte celular fazem com que a atividade mitocondrial seja reduzida e o sal de
tetrazolium-MTT não seja metabolizado pelas células. Deste modo, pode-se observar que os
antígenos virais causam morte celular comparáveis ao LPS, sendo que na presença de células
THP-1 a porcentagem de citotoxicidade fica maior (Figura 24A). Contudo, ao adicionarmos
tratamento de IFN-PEG (100 ng/mL) as células revertem a toxicidade e se proliferam
mostrando valores negativos no eixo y (Figura 24B).
Resultados – Capítulo III
61
Os resultados mostram que os antígenos virais causam morte celular tanto quanto o LPS
e que nos ensaios de co-cultivo de Jurkat com THP-1 (J+T) a citotoxicidade é muito maior
chegando a 30%. Quando o IFN-PEG é adicionado, as células voltam a proliferar em alguns
ensaios (representado pelas barras invertidas no eixo y) e também diminuem a morte celular
nos co-cultivos com os antígenos virais (Figura 23) fazendo que a média da porcentagem de
citotoxicidade fique abaixo dos 10%.
Figura 24. Ensaio de Citotoxicidade
B
A
Morte celular de cada grupo expressa em porcentagem. A figura A mostra a citotoxicidade frente a
diferentes estímulos, enquanto a Figura B mostra as células nas mesmas condições após tratamento com IFN-PEG.
Nota-se que ocorre proliferação ou diminuição da morte celular.
5.10
QUANTIFICAÇÃO DAS CITOCINAS SECRETADAS IN VITRO
Nos experimentos reportados previamente nos Itens 5.8 e 5.9 foi possível observar que
o HBsAg e o SDAg, levaram à morte celular e no co-cultivo de linhagens linfocíticas e
monocíticas isso se tornou mais evidente. Além disso, também foi observado que a
administração de IFN-PEG fez com que a citotoxicidade fosse revertida quando utilizada
somente a Jurkat, e que a morte celular foi bastante diminuída na simulação com o sangue
periférico.
Deste modo, nosso próximo passo foi investigar se as citocinas produzidas
preferencialmente por Linfócitos estariam participando do processo. Deste modo, realizamos o
ensaio de Elisa para averiguar os níveis das citocinas IL-2 (Figura 25A) e IFN- (Figura 25B)
secretadas.
Na primeira citocina investigada notamos que as células que não sofreram nenhum
estímulo e tampouco foram tratadas (Controle) apresentaram uma secreção de IL-2 baixa,
Resultados – Capítulo III
62
porém ainda assim produziram níveis basais. Apesar de não ter significado estatístico nota-se
que as células que foram estimuladas com HBsAg produziram menos IL-2 do que o Controle,
sugerindo uma possível inibição desta via.
Figura 25. Concentração de IL-2 e IFN- no sobrenadante dos experimentos in vitro
A
B
Quantificação de IL-2 e IFN- no sobrenadante das células, estimuladas com diferentes antígenos e na
ausência ou presença de tratamento (IFN-PEG na concentração de 100 ng/mL). Resultados expressos em média e
desvio-padrão de um número de 4 amostras independentes. No gráfico de IL-2 *** p<0.0001 quando comparado
ao Controle; %%% p<0,0001 quando comparado ao LPS; ###p<0,0001 quando comparado ao HBsAg; & p<0,05
comparado ao HBsAg+SDAg. No gráfico de IFN-*** p<0.0001 quando comparado ao Controle; %%% p<0,0001
quando comparado ao LPS; ###p<0,0001 quando comparado ao HBsAg; &&& p<0,0001 comparado ao
HBsAg+SDAg. Foi utilizado o teste estatístico Two-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni.
Resultados – Capítulo III
63
Outra observação foi que a secreção de IL-2 nas células estimuladas com SDAg e
posteriormente tratadas com IFN-PEG aumentou significativamente (p<0,0001) quando
comparada ao grupo Controle, tratado com LPS e HBsAg e com HBsAg+SDAg (p<0,05).
A produção de IFN-, todavia, só ocorreu na situação em que havia o co-cultivo na
presença do SDAg e após o tratamento, conforme pode ser visto na Figura 25 B. Ainda que
nas mesmas condições do grupo com estímulo SDAg, as células que foram estimuladas com os
dois antígenos (HBsAg+SDAg) não foram capazes de secretar IFN-, mesmo após a adição do
tratamento, sugerindo participação do HBsAg neste evento.
Este resultado, levou-nos a investigar a participação da linhagem monocítica e do
tratamento para que os linfócitos fossem estimulados a produzir IFN-. Deste modo, foi
necessário quantificar a citocina IL-12, anteriormente correlacionada com a produção de IL-2
pelos pacientes (Figura 9). Apesar da citocina IL-12 ter sido quantificada no sobrenadante
celular, a maior produção aconteceu nas linhagens estimuladas com SDAg e que foram tratadas
com IFN-PEG. Os valores obtidos foram significativos (p<0,001) quando comparados ao
Controle e LPS, sugerindo uma produção de IFN- aumentada após o aumento da secreção de
IL-12.
Figura 26. Concentração de IL-12 no sobrenadante dos experimentos in vitro
Quantificação de IL-12 no sobrenadante das células, estimuladas com diferentes antígenos e na ausência
ou presença de tratamento (IFN-PEG na concentração de 100 ng/mL). Resultados expressos em média e desviopadrão de um número de 4 amostras independentes. ** p<0,001 quando comparado ao Controle; %% p<0,001
quando comparado ao LPS. Foi utilizado o teste estatístico Two-way ANOVA, seguido do pós-teste de Bonferroni.
Discussão – Capítulo III
64
DISCUSSÃO
Os resultados obtidos nos experimentos in vitro proporcionam dados importantes e
únicos sobre os possíveis mecanismos da resposta imune do hospedeiro envolvendo o HDV e
a exaustão celular.
Primeiramente, nossos dados in vitro suportam que os antígenos HBsAg e SDAg
possuem ação citotóxica. A morte celular observada não fez parte de investigações mais
profundas, pois estávamos buscando a padronização do tratamento in vitro e esses achados
foram relativamente surpreendentes, uma vez que os relatos da citotoxicidade relacionados com
HDV datam dos anos 1990 (MACNAUGHTON et al., 1990). Os autores corroboram a
citotoxicidade do HDV observada em ensaios celulares, contudo, ela é mais presente nos
períodos iniciais da cultura celular e que esses efeitos diminuem com o passar dos dias. Nossos
experimentos tiveram duração máxima de 48 horas, o que condiz com os achados dos autores
que mostram os períodos iniciais relacionados com a morte celular.
Os achados que mostram que o IFN-PEG pode reverter a citotoxicidade são dados
interessantes e que merecem investigações futuras, contudo, o foco dos ensaios in vitro era
entender porque a produção de IFN-γ não foi observada nos pacientes sendo que havia a
presença de IL-2 e IL-12 com correlação significativa.
Nossa suposição principal é que o IFN- estaria sendo produzido nos pacientes tratados
com IFN-PEG. Grabowski e colaboradores (2011) relataram que os níveis dessa citocina podem
declinar com o passar do tratamento e nosso grupo TTO foi constituído de pacientes que
estavam na fase de acompanhamento com seis meses pós-término do tratamento, sugerindo que
a produção da IL-2 e IL-12 estão presentes para manutenção de clones específicos e que a
detecção do IFN- não ocorreu por utilizarmos um período tardio (GRABOWSKI et al., 2011).
Nossa hipótese foi comprovada com os experimentos in vitro, pois a produção de IFN aconteceu nas primeiras 24 horas de tratamento nas mesmas condições que os níveis de IL-2
e IL-12 se tornaram significativos, comparados aos outros grupos. Isso nos permite inferir que
o tratamento e o sinergismo do co-cultivo foram estímulos suficientemente capazes de induzir
um microambiente em cultura favorável para a geração e manutenção de um padrão de resposta
TH1 correlacionada in vivo. A resposta imune a patógenos tem sido atribuída fortemente à
resposta de células TCD4+. As células utilizadas em co-cultivo foram da linhagem THP-1, que
são monócitos de sangue periférico e responsáveis pela secreção da citocina IL-12. A IL-12
atua favorecendo o padrão TH1 induzindo a secreção de IFN- pelo linfócitos (TRINCHIERI;
PERITT; GEROSA, 1996). Neste experimento, os linfócitos utilizados foram da linhagem
Discussão – Capítulo III
65
Jurkat, a qual não possui um perfil de resposta estabelecido, podendo ser levada tanto para o
padrão TH1 quanto para TH2 (MANTEL et al., 2007). Ou seja, nossos ensaios demonstram que
as condições existentes in vitro (estímulo + tratamento) levaram à produção de IFN- e
induziram um perfil inflamatório clássico na presença do SDAg. A secreção de IL-2 sugere que
pode haver uma regulação positiva deste padrão, pois ela é responsável pela indução e
expressão da cadeia β2 do receptor de IL-12 nos linfócitos (LIAO et al., 2011).
Todos estes fatos somados, sugerem que o mecanismo para o sucesso terapêutico dos
pacientes portadores de HDV passa pela resposta clássica de reconhecimentos de patógenos e
posterior regaste de células CTL que estavam em exaustão (Figura 27).
Figura 27. Representação dos possíveis mecanismos envolvidos em pacientes que responderam à
terapia com IFN-PEG
As células Natural Killer (NK) e as Células Apresentadoras de Antígeno (APCs) começam a produzir IFN- e IL12, respectivamente após o estímulo externo do IFN-PEG, que mimetiza o IFN-α
Com base na literatura e nos achados experimentais, pode-se sugerir uma sequência de
eventos para a cronificação da doença e posterior tratamento dos pacientes infectados pelo
HDV. Primeiramente, o HDV suprime a produção de IFN-α produzida pelas células frente à
infecção viral por mecanismos que interferem na via JAK-STAT (PUGNALE et al., 2009) e o
Sistema Imune entra em exaustão devido a grande quantidade de HBsAg circulante, levando a
Discussão – Capítulo III
66
uma queda na resposta imune celular responsável pelo combate da infecção (KONDO et al.,
2013). Os pacientes, ao iniciarem o tratamento com IFN-PEG conseguem restabelecer a
produção de IL-12 e IFN-, com isto o linfócito TCD4+ se diferencia e produz uma quantidade
maior de IFN-, além da produção de IL-2 e uma exacerbação na quantidade de IL-12, evento
este de extrema importância para retirar as células T do estado de exaustão, atuando desta forma
como um terceiro sinal de resgate (FERRARI, 2015; MAINI; BERTOLETTI, 2000;
SCHURICH et al., 2013; YE et al., 2015). Os experimentos in vitro indiretamente comprovam
que a presença de HBsAg induziu um tipo de “estado de exaustão”, pois na presença deste
estímulo não foi detectada produção de IFN- e, por consequência, os eventos subsequentes
ficaram prejudicados. Esses dados podem justificar porque a terapia combinada tem se
mostrada mais eficaz, pois enquanto o IFN-PEG atua recuperando a via do IFN-α que está
inibida pelo HDV, os análogos de nucleosídeos impedem que ocorra uma nova exaustão do
Sistema Imune, suprimindo a replicação do HBV e, consequentemente, evitando a produção de
mais HBsAg.
Por fim, sugere-se que a resposta virológica nos pacientes que responderam ao
tratamento ocorra pelo resgate da resposta da imunidade celular, como descrito num estudo, o
qual demonstra que o IFN-α e IFN- não impedem a replicação do HDV no interior das células
infectadas (MCNAIR et al., 1994). Os autores sugerem que essas citocinas atuam na ativação
do Sistema Imune do hospedeiro e que a resposta celular destruiria as células infectadas.
Os estudos abordados neste trabalho revelaram achados interessantes sobre o papel da
resposta imune envolvendo pacientes com HDV. Os resultados obtidos conduziram a inferir
que a infecção crônica pelo vírus delta leva à exaustão das células T do Sistema Imune e que a
terapia associada diminui quantidade de HBsAg, favorecendo de maneira indireta com que
ocorra a recuperação celular efetiva. Contudo, é possível inferir que a resposta virológica com
as terapias disponíveis atualmente se dá por diversos mecanismos associados e que, o balanço
que leva ao sucesso terapêutico está intimamente ligado à variabilidade que o Sistema Imune
de maneira individual, o que abre diversas possibilidades envolvendo estudos sobre as
principais vias para produção de citocinas e outros parâmetros imunológicos que possam se
encontrar diferenciados nos pacientes com o vírus.
Conclusões
67
6
CONCLUSÕES

Os pacientes que responderam ao tratamento apresentam uma quantidade sérica
de IL-12 e IL-2 aumentadas e correlacionadas frente aos demais grupos de pacientes, sugerindo
o estabelecimento de um padrão de resposta TH1 para a resposta virológica na fase pós
tratamento;

A via NFAT não é a responsável pela hiperexpressão da citocina IL-2, do mesmo
modo que esta citocina não está atuando na proliferação da população de células mononucleares
do sangue periférico dos pacientes estudados;

A expressão de IL-15 está aumenta em pacientes PCR – e deve ser investigada
em trabalhos futuros, pois pode estar relacionada ao controle natural da resposta imune contra
a infecção pelo HDV;

Os ensaios in vitro mostraram que o SDAg e o HBsAg são antígenos citotóxicos
e que a presença de IFN-PEG preserva as células da morte;

As células em co-cultivo estimuladas com SDAg e posteriormente tratadas com
IFN-PEG desencadeiam um padrão de resposta TH1 em ensaios que simularam a infecção aguda
seguida de tratamento;

As células em co-cultivo na presença do HBsAg não conseguiram secretar IFN-
, sugerindo que esta citocina pode levar aos mesmos mecanismos de exaustão celular descritos
nas infecções crônicas do HBV;

Os ensaios in vitro sugerem que diminuir as taxas de HBsAg pode ser importante
para a resposta virológica em pacientes HDV e que esta depende da variabilidade individual do
Sistema Imune para ser alcançada com as terapias atuais.
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Apêndice A – Representação da análise de citocinas em gráfico de barras
Anexo A – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa
Anexo B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Anexo C – Artigos Publicados Relacionados com a Tese
International Journal of Infectious Diseases 46 (2016) 82–88
Contents lists available at ScienceDirect
International Journal of Infectious Diseases
journal homepage: www.elsevier.com/locate/ijid
Treatment of hepatitis delta virus genotype 3 infection with
peg-interferon and entecavir
Lourdes Maria Pinheiro Borzacov a, Larissa Deadame de Figueiredo Nicolete a,
Luan Felipo Botelho Souza, Alcione Oliveira dos Santos, Deusilene Souza Vieira,
Juan Miguel Villalobos Salcedo *
Research Center for Tropical Medicine of Rondônia – CEPEM/SESAU, and Federal University of Rondônia – UNIR, Rua da Beira, 7671 -BR364, Km 3.5 Bairro
Lagoa, Porto Velho, Rondônia, Brazil
A R T I C L E I N F O
Article history:
Received 23 November 2015
Received in revised form 14 March 2016
Accepted 15 March 2016
Corresponding Editor: Eskild Petersen,
Aarhus, Denmark.
Keywords:
HDV
Genotype 3
Treatment
PEG-IFN
Entecavir
S U M M A R Y
Objectives: Hepatitis delta virus (HDV) is recognized as the most pathogenic and infectious among the
hepatotropic viruses. Studies on the treatment of HDV have predominantly included European patients
and carriers of genotype 1 (HDV-1) in their clinical protocols. For the Amazon region, data show that
infected individuals have mainly Native American ancestry and that >90% of HDV carriers have the
genotype 3 (HDV-3). Thus combined therapy clinical protocols do not adequately address the treatment
of these patients.
Methods: A prospective, non-randomized study was conducted in which 22 patients received 180 mg of
pegylated interferon alpha 2a (PEG-IFN) plus entecavir at a dose of 0.5 mg for 48 weeks, with a
subsequent 24-week follow-up. Throughout treatment, the patients were monitored for biochemical
responses and the kinetics of hepatitis B virus (HBV) and HDV viral loads.
Results: Of the 22 patients treated, 15 presented normal alanine aminotransferase values at the end of
treatment (p = 0.002). At week 24 of treatment, 86.4% of the patients did not present detectable HDVRNA; at week 48, the rate of negative patients increased to >95% and remained the same after 6 months.
With regard to HBV, only two patients (9%) still presented detectable HBV genetic material at the end of
treatment, suggesting the effectiveness of combined therapy in combating the two viruses.
Conclusions: These findings support the use of this effective therapeutic protocol for HDV-3 in patients of
non-European ethnicity and suggest a possible ‘easy to treat’ variant when compared to HDV-1.
ß 2016 The Authors. Published by Elsevier Ltd on behalf of International Society for Infectious Diseases.
This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/bync-nd/4.0/).
1. Introduction
Hepatitis delta virus (HDV) was identified by Rizzetto et al.
upon examination of the liver biopsies of patients infected with
hepatitis B virus (HBV) presenting abnormal symptoms of severe
liver disease.1 This virus is recognized as the most pathogenic and
infectious among the hepatotropic viruses.2
Millions of people are susceptible to infection as a result of
already being carriers of HBV, and as the replication of HDV cannot
be inhibited with the same drugs used for mono-infected patients,
* Corresponding author. Tel.: +55 069 3219 6012; fax: +55 069 3219 6000.
E-mail address: [email protected] (J.M.V. Salcedo).
a
Lourdes Maria Pinheiro Borzacov and Larissa Deadame de Figueiredo Nicolete
contributed equally.
the search for an effective treatment is essential. Some authors
have reported the efficacy and safety of pegylated interferon (PEGIFN) use in patients with chronic hepatitis delta. However, the
results obtained after treatment were extremely variable, making
it difficult to assess the true impact of interferon (standard or
pegylated) on the course of this severe liver disease.3–6
The fact that combination therapy increases the effectiveness in
the treatment of co-infections of HBV and hepatitis C virus (HCV),7
led to the investigation of whether or not the association of
conventional interferon alpha (IFN-a) with lamivudine (or ribavirin)
would also be beneficial for the treatment of chronic hepatitis delta.
A small increase in the virological response was obtained in patients
treated with conventional IFN-a plus lamivudine (28%) compared to
those treated with IFN alone (17%), but the difference was not
statistically significant.8 Based on this evidence, new articles have
emerged suggesting that combination therapy for HBV and HDV is
http://dx.doi.org/10.1016/j.ijid.2016.03.017
1201-9712/ß 2016 The Authors. Published by Elsevier Ltd on behalf of International Society for Infectious Diseases. This is an open access article under the CC BY-NC-ND
license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
L.M.P. Borzacov et al. / International Journal of Infectious Diseases 46 (2016) 82–88
the best way to treat hepatitis delta.9 The association of PEG-IFN
with oral antivirals used in the treatment of HBV infection has
become an alternative therapeutic protocol (named combined
therapy), and some clinical studies have suggested several
advantages when compared to IFN treatment alone.10–12 The
mechanisms involved in this approach are not known, but it is
suggested that the suppression of viral replication for prolonged
periods decreases the chances of hepatic decompensation.10
These prior studies have two important shortcomings. The first
is with respect to the population studied. Although the virus
presents a worldwide distribution, the patients recruited in
already published studies have predominantly been Caucasian.12–17 Since Brazil shows a more heterogeneous trend in
ethnic groups, the present study population comprised Caucasians,
Native Americans, and blacks.18,19
The second concerns the prevailing HDV genotype, which could
interfere with combination therapy. It is known that the different
genotypes can lead to different clinical outcomes and that HDV
genotype 3 (HDV-3) is associated with more severe forms of the
disease.20 Despite the apparent participation of the genotype in
cases of fulminant hepatitis, the influence of the genotype on the
course of treatment has not been verified as with other hepatotropic
infections (i.e., HBV and HCV); these other hepatotropic infections
83
have presented different responses to treatment with PEG-IFN
according to the viral genotype.21–23
As there is no effective therapy for chronic hepatitis delta
patients and patients in the authors’ outpatient setting have a
different epidemiological profile from those included in other
reports, it was sought to assess the efficacy of treatment with PEGIFN combined with a nucleoside analog (entecavir) in the
treatment of chronic hepatitis delta, as well as to correlate the
response to treatment with genotype 3 of the virus (HDV-3).
2. Methods
2.1. Study population and experimental design
This study was approved by the local ethics committee (process
number CAAE 0012.0.046.000-11, 2011/Set/09). Informed consent
was obtained from each patient.
A prospective, non-randomized study was performed with a
treatment regimen of 48 weeks in duration for 22 selected patients
(Figure 1). Throughout the treatment period, 180 mg of pegylated
interferon alpha 2a (PEG-IFN) was administered subcutaneously
once a week along with the nucleotide analog entecavir at an oral
dose of 0.5 mg daily.
Figure 1. Flowchart showing the monitoring of patients during the therapeutic protocol.
84
L.M.P. Borzacov et al. / International Journal of Infectious Diseases 46 (2016) 82–88
This clinical study was performed on an outpatient basis under
strict supervision by the research team. The following inclusion
criteria were established: (1) age >18 and <70 years, (2) serological
diagnosis of infection with HBV and HDV, (3) PCR positive for genetic
material from HDV, (4) no antiviral therapy used in the past
6 months, (5) the patient had to present a floating or persistent
elevation of alanine aminotransferase (ALT) on at least two
occasions in the 3 months leading up to the start of treatment,
(6) the patient had to present compensated liver disease classified as
Child–Pugh A <7 points or MELD <12, (7) the patient had to be
negative for hepatocellular carcinoma, and (8) the patient had to
present laboratory criteria that would allow the use of PEG-IFN.
Exclusion criteria were the following: (1) pregnant women or
those who did not acknowledge contraceptive control, (2) patients
who had been treated with PEG-IFN in the 6 months preceding the
start of the study, (3) patients who had used nucleos(t)ide analogs
in the 12 weeks preceding the study, (4) patients who had
undergone anticancer or immunomodulatory therapies in the
5 years prior to the start of the study, (5) those with a positive test
for hepatitis A virus (HAV) IgM antibodies, (6) those testing
positive for antibodies to HIV 1 or 2 (anti-HIV), (7) patients with a
history or clinical evidence of other concomitant liver disease, (8)
those with autoimmune diseases, alcoholic liver disease, or
exposure to toxins, (9) alcohol consumption higher than 30 g
per day, (10) those with decompensated liver cirrhosis, (11) any
other ongoing decompensated disease such as heart disease,
diabetes mellitus, etc., (12) hemophiliac patients, (13) patients
with psychiatric disorders considered serious (evaluation with
psychiatric report), (14) patients with chronic renal failure, (15)
patients with neutropenia, carriers of hemoglobinopathies, and/or
hemolytic anemia, and (16) patients with other diseases that
would prevent them from complying with the established
protocol.
2.2. Clinical monitoring
A treatment period of 48 weeks was completed and a
subsequent 24-week follow-up was performed. Possible adverse
reactions to medications such as itching, nausea, vomiting,
diarrhea, headache, and leukopenia were also monitored, and
the patients were assessed and treated according to the reaction
presented.
2.3. Hematological and biochemical tests
Patients were monitored as outpatients and, when necessary,
complete blood count, prothrombin time, direct bilirubin, creatinine,
alkaline phosphatase, gamma-glutamyl transferase, urea, aspartate
aminotransferase, and blood glucose tests were performed.
In addition to these procedures, the patients had blood
collected in the pre-treatment weeks and at 4, 12, 24, and
48 weeks post-treatment for the quantification of the ALT enzyme
(normal value considered to be below 35 U/l).
than 2 cm; these were fixed in 10% formalin and later embedded in
paraffin. The histopathological technique consisted of serial
histological sections stained with hematoxylin–eosin, complemented with separate sections stained with the following special
stains: PAS (periodic acid–Schiff) with diastase, reticulin, picrosirius, Perls, and orcein.24 The material collected was satisfactory for
18 patients. The liver biopsy results of these 18 patients were
reviewed according to the METAVIR classification,25 which is able
to evaluate the different degrees of inflammation and fibrosis.
2.6. Viral load
For this study, the methodology described by dos Santos et al.
was used to determine the HBV load (sensitivity of 20 IU/ml).26 To
monitor HDV, the quantification method described by BotelhoSouza et al. was used (sensitivity of 75 copies/ml of viral RNA).27
Some of the samples were sent at random to the Genome Center in
São Paulo for external control and to validate the results.
2.7. Genotyping of HDV
For the determination of the HDV genotype, all of the previous
procedures described by Botelho-Souza et al. were followed,
including primers, cycle conditions, nucleotide sequencing, and
phylogenetic analysis.18
2.8. Statistical analysis
GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) was
used for the statistical analysis, as well as the design of the graphs.
Quantitative values were recorded as medians and statistical
differences were assessed using several parametric and nonparametric tests, including column statistics, the t-test, Pearson’s
correlation, and two-way analysis of variance (ANOVA), as
appropriate. For analyses of qualitative data, the Chi-square test
was used. Differences were considered significant at p < 0.05.
3. Results
3.1. Patient population
Twenty-two patient began treatment between July 2011 and
July 2012. Detailed patient characteristics are presented in
Table 1. All patients were treated simultaneously for HBV and
HDV for 48 weeks. Of these 22 patients, none abandoned treatment
or died before completion at week 48. No patient failed to attend
follow-up during the 24 post-treatment weeks. Because this is an
endemic region there was no association with risk factors such as
the use of intravenous drugs, blood transfusions, or tattoos. No
patient was working as a healthcare professional.
Serological tests were performed pre-treatment and all patients
presented positive HBsAg, negative hepatitis B surface antibodies
(anti-HBs), negative HBeAg, positive anti-HBe, positive anti-HDV
IgG, negative HCV antibodies (anti-HCV), and negative anti-HIV.
2.4. Serological tests
3.2. Dual therapy side effects
Immediately before starting treatment, all patients were tested for
the detection of the following viral markers using the ELISA technique
in accordance with the manufacturer’s instructions: hepatitis B
surface antigen (HBsAg), hepatitis B e antigen (HBeAg), hepatitis B e
antibody (anti-HBe), and total HDV antibodies (anti-HDV).
2.5. Histological evaluation
Twenty-two patients underwent percutaneous liver core
needle biopsy blindly. All liver specimens were fragments larger
The most common adverse reactions were related to the
administration of PEG-IFN. Arthralgia, myalgia, and asthenia were
reported in all patients. Weight loss was observed in 83% of
patients, with a mean weight loss of 5 kg during treatment.
Headache, epigastric pain, and fever were reported by 50% of
patients, and other less frequent symptoms such as diarrhea and
dizziness were also mentioned. The drugs used for symptomatic
relief, when present, were dipyrone (at a dose of 500 mg orally
every 6 h for those with no history of allergy to this medication),
L.M.P. Borzacov et al. / International Journal of Infectious Diseases 46 (2016) 82–88
Table 1
Patient characteristics
Patient characteristics
Sex
Male
Female
Race
White
African
Native American
HCV/HIV infections
Age, years
Median
Range
Biopsy characteristics
Activity (A)
A1
A2
A3
Fibrosis (F)
F1
F2
F3
F4
Pre-treatment features
HBV viral load,
log IU/ml
HDV viral load,
log copies/ml
ALT, IU/l
Alpha-fetoprotein,
up to 8.5 ng/ml
HDV genotype
I
III
Other
Previous treatment
85
were considered serious enough to require dose adjustment or
justify the suspension of medications.
Number
%
14
9
61
39
10
1
12
0
44
4
52
0
3.3. Treatment outcomes
45
18–70
Number
%
3
10
5
16
55
29
7
5
5
1
39
28
28
5
Number
%
a
2.10
3.78a
98.00a
22
100
0
22
0
0
0
100
0
0
HCV, hepatitis C virus; HIV, human immunodeficiency virus; HBV, hepatitis B virus;
HDV, hepatitis delta virus; ALT, alanine aminotransferase.
a
Mean values.
paracetamol (at a dose of 750 mg orally every 8 h), omeprazole (at
a dose of 40 mg orally once daily), and metoclopramide (at a dose
of 10 mg orally every 8 h).
Throughout treatment, the patients were monitored at the
frequency stipulated in the protocol. No reported adverse events
3.3.1. Biochemical response
Due to laboratory differences, ALT value results of less than
35 U/l were treated as normal. Of the 22 patients treated,
15 presented normal values at the end of treatment and 14 out of
15 maintained a biochemical response after 24 weeks of follow-up.
Comparing the pre- and post-treatment analyses, a p-value of
0.0015 was obtained (Figure 2A).
Regarding fluctuations in the enzyme (Figure 2B), it was found
that the desired values began to be achieved after 48 weeks of
treatment and remained in tests conducted at 24 weeks after the
completion of treatment. Among the patients who did not achieve
normal values, six showed a reduction in ALT at the end of treatment,
four showed a steady increase of between 10 and 50 U/l during
treatment, and ALT levels remained stable in two (data not shown).
3.3.2. Kinetics of viral loads
The HDV and HBV viral loads of the patients were evaluated at
time points considered important to evaluate the prognosis.17
Thus, the patient viral loads were analyzed during the pretreatment period, at 24 weeks after the start of the treatment
(week 24), at 48 weeks after the start of treatment (week 48), and
at 24 weeks after the end of treatment, as detailed in Table 2.
At week 24, 82.6% of the patients no longer presented detectable
HDV-RNA, and at the subsequent time points, the rate of negative
patients increased to values >95%, remaining the same at 6 months
after treatment completion. Only one subject was positive until the
end of treatment, but the amount of genetic material detected for
this patient at 24 weeks after the completion of treatment was about
half the pre-treatment value. Figure 3 shows the dynamics of the
HDV viral load tracking for each individual patient.
With regard to HBV, 15 patients (60%) had replicating HBV; at
week 24, the number of patients with a detectable viral load
decreased to nine individuals. At the end of treatment, only two
patients (9%) still presented detectable genetic material, suggesting
the effectiveness of combined therapy in combating the two viruses.
Figure 4 shows the kinetics of the two viruses, suggesting that
combination therapy of PEG-IFN with entecavir inhibits HBV from
multiplying when the amount of HDV decreases.
Figure 2. Reduction in the amount of alanine aminotransferase (ALT; IU/l) measured in the patients’ serum. (A) Quantification of patients pre-treatment and at 6 months posttreatment; the Wilcoxon test was used (p = 0.002). (B) The median of all 22 treated patients whose sera were quantified in the weeks before treatment, at 4 weeks, 12 weeks,
24 weeks, and 48 weeks of treatment, and at 6 months after the end of treatment; Pearson’s correlation test showed a significant p-value of 0.0296.
L.M.P. Borzacov et al. / International Journal of Infectious Diseases 46 (2016) 82–88
86
Table 2
Individually assessed kinetics of HDV and HBV viral loads
Patient number
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
HDV, log10 copies/ml
HBV, log10 IU/ml
Pre-treatment
Week 24
Week 48
6 months
post- treatment
Pre-treatment
Week 24
Week 48
6 months
post- treatment
4.58
4.13
3.83
5.54
3.02
2.24
4.28
4.22
3.74
2.45
5.27
3.23
2.06
3.32
4.31
5.39
4.64
3.53
4.85
3.05
3.77
4.07
3.47
0.00
0.00
0.00
0.00
2.21
5.03
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
2.60
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
2.63
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
7.28
2.83
0.00
0.00
3.91
7.82
2.99
2.30
3.51
0.00
0.00
2.37
2.00
2.76
0.00
2.32
2.74
3.04
1.96
2.58
0.00
2.51
0.00
2.55
3.57
0.00
2.15
1.70
0.00
2.47
0.00
0.00
0.00
1.78
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
1.93
2.51
0.00
1.89
2.42
0.00
1.26
2.16
0.00
2.41
1.85
0.00
0.00
1.88
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
2.01
0.00
0.00
0.00
0.00
3.15
6.36
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
HDV, hepatitis delta virus; HBV, hepatitis B virus.
Figure 3. The individual analysis of each patient using the Wilcoxon test, showing
p < 0.0001 between the pre-treatment week and week 24, where one can notice the
absence of viral load in 18 of the 22 patients.
4. Discussion
In the Amazon, hepatitis delta is considered a neglected disease
associated with high morbidity and mortality epidemics that
rapidly leads to chronicity, cirrhosis, and hepatocarcinoma.28 It is
believed that several factors lead to this clinical condition, such as
poor access to health centers, low education level, poor hygiene
conditions, and the high prevalence of HDV-3 in the region.18 In
addition to these factors, there is a lack of published studies on the
efficacy and safety of the clinical protocol of combination therapy
used in patients who are not of the European standard (male,
Caucasian, with HDV -1).12–17 This has led to a clinical gap with
regard to the type of follow-up that patients from the Amazon
region should follow.
Thus, the initial design of this clinical trial was followed by a
total of 22 patients who entirely fulfilled the characteristics
advocated in the inclusion criteria for the selection of the project
population. This sample size is similar to those used in other
Figure 4. Monitoring of the average viral loads of HDV and HBV during the pretreatment phase (Pre), at 24 weeks and 48 weeks of treatment, and at 6 months
post-treatment (Post). The total number of patients included in these results ranged
from a minimum of 18 to a maximum of 22, depending on the availability of
biological material. There was no correlation between the HBV and HDV loads.
However, the t-test showed a p-value of 0.0065 between the different treatment
times, showing a significant reduction in viral load for both viruses over time.
published studies, for example that by Grabowski et al., who
assessed PEG-IFN associated with adefovir in 17 patients,14 that by
Castelnau et al., who treated hepatitis delta in 14 patients,4 and
that by Niro et al., who completed a study on PEG-IFN alone in
16 patients.29
Epidemiologically, the present findings shed some light on the
type of patient found outside of Europe. It was observed that the
patients tolerated the side effects of PEG-IFN well and did not require
dose adjustments. Regarding sex, it has been reported that female
sex is associated with clinical decompensation during the follow-up
period;30 however this was not corroborated in the present study
since men and women responded to the treatment in the same way.
Regarding the race of the patients, it was found that Native
American descendants represented more than half of the patients
(52%) in this study, which may have been a differential in the high
virological response rates achieved. A recent study analyzed the
presence of different polymorphisms in several cytokines responsible for a predominantly Th1 response pattern in this ethnic
L.M.P. Borzacov et al. / International Journal of Infectious Diseases 46 (2016) 82–88
group.31 It is not known how these single nucleotide polymorphisms (SNPs) are passed to future generations, nor the influence
of ancestry on the present work. However, the authors do not
believe that the ethnicity factor was predominant, since the other
43% of patients who responded to treatment had different
ethnicities.
Another population data point concerns cirrhotic patients.
Thirty-three percent of patients in the study had advanced fibrosis
(F3 and F4). These patients were clinically stable before the start of
therapy, classified as Child–Pugh A and with calculated MELD scores
below 12. The percentage of cirrhotic patients in the present study
was higher than that reported in some other studies. Previous
studies have reported varying percentages of cirrhotic patients:
Castelnau et al. included 29% of patients with this condition,4
Yurdaydin et al. studied a population in which approximately 35%
had cirrhosis,32 and Niro et al. reported approximately 75% of
participating patients as being cirrhotic.29 However, these studies
reported a much lower virological response than that found in the
present study (30%, 13%, and 21%, respectively), which suggests that
patients with cirrhosis have a higher chance of being null or poor
responders, thus presenting a lower virological response than
patients without advanced fibrosis.
ALT levels are proposed to represent a good marker of the
prognosis in these patients. In laboratory tests performed before
treatment, it was observed that the values were above normal
(>35 IU/l) in 20 out of 22 patients, indicating potential liver
damage from HBV/HDV. The normalization of this biochemical
parameter occurred at the end of week 48 in 14 patients, and 12 of
these patients continued with ALT levels within the normal range.
Other studies have presented higher values when compared to
those in the present study.4,17,33 However, in the most recently
published study it can be seen that patients who responded to
treatment showed lower levels.17 The only non-responding
patient, patient 1, presented a floating ALT, and post-treatment
follow-up showed values of 47 IU/l. Thus, the present study also
found that this increase in ALT after the end of treatment is
suggestive of a relationship with increasing HBV/HDV viral loads,
ultimately suggesting that liver damage continues to occur even
with medication.
Regarding the monitoring of viral load, all patients who showed
undetectable HDV at week 24 (p < 0.0001) continued to show this
until treatment was completed and also during follow-up. On
comparing these findings to those reported in the single article that
correlates viral load and prognosis, it appears that the data are
consistent with those described by the authors.17 In addition, since
there were only three patients who were still positive at week 48,
and only one patient who did not become negative, it was not
possible to perform a statistical analysis on exact values expected
in week 24, but it is possible to suggest that the article by Keskin
et al.17 can be extrapolated to genotype 3.
These findings help strengthen the idea that combination therapy
is effective in the treatment of HDV-3 in patients of non-European
ethnicity. However, to obtain an answer above initial expectations,
future studies should be conducted in collaboration with other places
so that it can be demonstrated whether or not HDV-3 is an ‘easy to
treat’ variant when compared to genotype 1. Regardless of future
studies, this is the first study to demonstrate an effective therapeutic
protocol that can be followed in patients with genotype 3.
Acknowledgements
The authors are grateful to Amy Nicole Grabner for the language
revision.
This work was supported financially by Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientı́fico e Tecnológico (CNPq), Brazil.
87
Conflict of interest:
None
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275
Correlation between TH1 response standard cytokines as biomarkers
in patients with the delta virus in the western Brazilian Amazon
Larissa Deadame de Figueiredo Nicolete1,2,3/+, Lourdes Maria Pinheiro Borzacov2,
Deusilene Souza Vieira1,2,3, Roberto Nicolete1,3, Juan Miguel Villalobos Salcedo1,2,3
Universidade Federal de Rondônia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental, Porto Velho, RO, Brasil
2
Centro de Pesquisa em Medicina Tropical, Porto Velho, RO, Brasil
3
Fundação Oswaldo Cruz, Laboratório de Biotecnologia Aplicada à Saúde, Porto Velho, RO, Brasil
1
Hepatitis D virus (HDV) is endemic in the Amazon Region and its pathophysiology is the most severe among viral
hepatitis. Treatment is performed with pegylated interferon and the immune response appears to be important for
infection control. HDV patients were studied: untreated and polymerase chain reaction (PCR) positive (n = 9), antiHDV positive and PCR negative (n = 8), and responders to treatment (n = 12). The cytokines, interleukin (IL)-2 (p =
0.0008) and IL-12 (p = 0.02) were differentially expressed among the groups and were also correlated (p = 0.0143).
Future studies will be conducted with patients at different stages of treatment, associating the viral load with serum
cytokines produced, thereby attempting to establish a prognostic indicator of the infection.
Key words: HDV - TH1 cytokines - patients treated
Hepatitis delta is considered the most severe form
of viral hepatitis and is caused by the hepatitis D virus
(HDV) (Pascarella & Negro 2011). This virus is a RNA,
hepatotropic virus, and is dependent on the hepatitis B
virus (HBV), since HDV uses the HBV surface antigen
(HBsAg) for the assembly of new viral particles (Karayiannis 1998). Currently, there are 240 million people
positive for HBsAg worldwide (Ott et al. 2012), making
the prevalence of HDV infection about 15 million carriers. In Brazil, the endemic areas correspond to states
of the western Amazon Region (Acre, Amazonas, Rondônia, and Roraima) with a prevalence of 41.9% among
carriers of HBsAg (Braga et al. 2012).
The most recent studied treatments consist of the association between pegylated interferon (PEG-IFN) and
HBV reverse transcriptase inhibitors, as adefovir and
tenofovir, for extremely long periods (Heidrich et al.
2013, 2014, Lunemann et al. 2015).
In order to reinforce the importance of the host immune response against viral infection, this study investigated whether serum cytokines could indicate some response in the antiviral therapy of patients who achieved
a negative HDV RNA at week 24, consistent with a virological response against HDV. Therefore, the cytokines
interleukin (IL)-2, IL-10, IL-12, IFN-γ, and tumour necrosis factor-alpha were quantified using the ELISA method
(Opteia, USA). Nine untreated patients and polymerase
chain reaction (PCR) positive for HDV RNA (HDV posi-
doi: 10.1590/0074-02760160035
Financial support: CNPq (470455/2013-6), FIOCRUZ
+ Corresponding author: [email protected]
Received 3 February 2016
Accepted 17 March 2016
tive), eight anti-HDV positive and PCR negative for HDV
patients (HDV negative), 12 patients with HDV who ended the specific antiviral treatment remained PCR RNA
negative for the virus six months after the treatment protocol ended (HDV TTO) (Ethical Committee approval:
146.474 of 11/14/2012 CAAE 08485112.4.0000.5300).
After the quantification of cytokines in the patients’
serum, the Kruskal-Wallis test was used followed by
Dunn’s post-test in order to compare the results obtained.
A p-value < 0.05 was considered significant. Among all
the cytokines tested, IL-2 and IL-12 were shown to be differentially expressed with values of p = 0.0008 (A in Figure) and p = 0.02 (B in Figure), respectively. The increase
in IL-2 and IL-12 showed a significant positive correlation
(p = 0.0143) after Spearman analysis (C in Figure).
One study analysed the profile of cytokines in HDV
patients during treatment with PEG-IFN and associated
the virological response of subjects who were responders with those who produced IL-2, IFN-γ, and inducible
protein-10 (Grabowski & Wedemeyer 2010). Our results
also showed that the production of IFN-γ by patients presented medians of 0.69, 2.77, and 1.27 pg/mL (data not
shown) in the groups HDV positive, HDV negative, and
HDV TTO, respectively, suggesting a decrease in production in the groups in which HDV is replicating.
With respect to IL-2, the same above mentioned authors suggest that, despite the effects of treatment with
PEG-IFN, patients who responded and who present decreased HDV viral load must have an antigen-specific
T-cell dependent cellular immune response. Our study
also suggested that the exacerbation of IL-2 is not observed in the other groups and is important in the virological response after the end of treatment. Perhaps this is so
because of the importance of this cytokine in the clonal
expansion of specific cells that fights the virus effectively
(Nijkamp & Parnham 2011, Boyman & Sprent 2012).
Patients who responded to treatment also presented
an elevated quantification of IL-12. Although it is usuonline | memorias.ioc.fiocruz.br
276
Cytokines as biomarkers in HDV patients • Larissa Deadame de Figueiredo Nicolete et al.
A: the significant difference of the interleukin (IL)-2 cytokine (p = 0.0008) in patients who completed treatment. The statistical tests used were
the Krusal-Wallis test followed by the Dunn post-test; B: the same statistical test for the cytokine IL-12. The p-value was significant (p = 0.002);
C: Spearman analysis. The values of IL-2 vs. IL-12 were positively correlated (p = 0.0143); HDV: hepatitis D virus.
ally not a cytokine analysed in patients with HDV, some
authors have correlated the increase of this cytokine in
HBV patients, when treatment of this disease was performed with IFN-α (Cavanaugh et al. 1997, Ozkan et al.
2010). Our results suggest that IL-12 may be important
in those patients in whom the HDV virus is replicating
represented by the HDV positive group.
By analysing the correlation obtained between IL-12
and IL-2, the polarisation of a TH1 standard cell response
is strongly suggested in patients who completed treatment (Boyman & Sprent 2012). Although there are no
reports with HDV, the participation of peripheral cells in
HBV infection is well established (Jung & Pape 2002).
Human leukocyte antigen class II restricted CD4+ helper
T-cells are responsible for the recognition of innumerable viral antigens and also for the mechanisms which
lead to vaccine protection against the virus (Caillat-Zucman et al. 1998). Thus, our results support the T-cell
homing hypothesis (Grabowski et al. 2011) in order
for individuals to remain HDV RNA negative after the
end of the treatment protocol, since the HBV envelope
is essential for delta virus replication and can support
assembly and release of new infectious HDV particles
(Freitas et al. 2014). Thus, the results obtained in this
study suggest that IL-2 is a potential biomarker for the
indication of a good prognosis for the patient. Regarding
the importance of these cytokines for the maintenance of
an effective viral response, we believe that the different
levels of the produced cytokines measured may occur
due to the dynamics of the treatment protocol. Future
studies with IL-2, IL-12, and IFN-γ will be conducted
with patients at different stages of treatment in order to
better understand how the response to treatment may
possibly be dependent on the status of the host immune
system. Therefore, its cellular and humoral parameters
should be further studied and taken into account when
improving the current treatment protocol.
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