Diversidade genética em populações de Casearia grandiflora no

Universidade Federal do Piauí
Diversidade genética em populações de Casearia grandiflora no
Cerrado do Piauí
Marcones Ferreira Costa
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Piauí como parte das exigências do
Programa de Pós-graduação em Genética e
Melhoramento para obtenção do título de
“Mestre”.
Teresina
2015
Marcones Ferreira Costa
Bacharel e Licenciado em Ciências Biológicas
Diversidade genética em populações de Casearia grandiflora no Cerrado do
Piauí
Orientadora:
Profa. Dra. Ângela Celis de Almeida Lopes
Coorientadores:
Profa. Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes
Prof. Dr. José Baldin Pinheiro
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Piauí como parte das exigências do
Programa de Pós-graduação em Genética e
Melhoramento para obtenção do título de
“Mestre”.
Teresina
2015
Diversidade genética em populações de Casearia grandiflora no Cerrado do
Piauí
Marcones Ferreira Costa
Aprovada em: ____/____/____
Comissão julgadora:
_______________________________________________________
Dr. Miklos Maximiliano Bajay– ESALQ/USP
_______________________________________________________
Prof. Dr. Paulo Sarmanho da Costa Lima– EMBRAPA MEIO NORTE
_______________________________________________________
Profa. Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes – CCA/UFPI
(Coorientadora)
_______________________________________________________
Profª. Dra. Ângela Celis de Alemida Lopes - CCN/UFPI
(Orientadora)
Á minha querida mãe Antônia Ferreira da Costa.
Dedico
Ao meu Deus Senhor da minha vida, nada seria possível se não fosse à
presença do Espírito Santo.
Ofereço
AGRADECIMENTOS
Ao meu amado e misericordioso Senhor Jesus, que em meio de sua soberania e
graça trouxe momentos de alívio e refrigério para que eu conseguisse suportar todas
as adversidades, pois tenho para mim que as aflições deste tempo presente não se
podem comparar com a glória que em nós há de ser revelada (Romanos 8:18);
À Universidade Federal do Piauí, pela oportunidade de realização do curso de
Mestrado em Genética e Melhoramento;
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Piauí (FAPEPI), pela concessão
da bolsa de estudos;
À Embrapa Meio-Norte pela infraestrutura concedida assim como a disponibilização
do espaço físico e auxílio de pessoal para realização das extrações de DNA;
À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” da Universidade de São Paulo,
em especial ao Laboratório de Diversidade Genética e Melhoramento, pelo apoio
técnico na realização das análises moleculares;
À professora orientadora Dra. Ângela Celis de Almeida Lopes, sobre tudo pela
amizade, preocupação, apoio e ensinamentos transmitidos. Sem dúvidas foi um anjo
em minha vida. Como sempre me diz: “Marcones, hoje pode ser difícil, mas o futuro
deve ser de esperança”;
À professora e coorientadora Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes, pelo apoio,
amizade, compreensão, pelos ensinamentos em sala de aula e fora dessa e pela
confiança em mim depositada;
Ao professor Dr. José Baldin Pinheiro e a professora Dra. Maria Imaculada Zucchi,
pelo incentivo, apoio durante o treinamento na ESALQ e pela extrema competência
em me auxiliar;
Aos professores da pós-graduação, Ana Paula Peron, Lidiane de Lima Feitoza, José
Evando Aguiar Beserra Júnior, Sérgio Emílio dos Santos Valente, Fábio Barros Britto
e Kaesel Jackson Damasceno e Silva, pelos ensinamentos obtidos durante o
mestrado;
A todos os alunos do Laboratório de Diversidade Genética e Melhoramento do
Departamento de Genética na ESALQ-USP, especialmente ao Alessandro Alves
Perreira e a Jaqueline Bueno de Campos;
Ao Dr. Marcelo Mattos Cavallari e ao Msc. Fabiano Lucas Araújo, pela
disponibilidade e contribuição no trabalho;
À Dra. Maria Edileide Alencar Oliveira e a bióloga amiga Samara Raquel de Sousa e
seu marido Victor Bezerra, pelo auxílio durante a coleta do material botânico;
À botânica e taxonomista, Dra. Roseli Buzanelli Torres, do Instituto Agronômico de
Campinas (IAC), pela identificação dos exemplares coletados;
À Artemisa Nazaré Borges, por ter se mostrado companheira em todos os
momentos, ajudando-me desde a extração do DNA até as inúmeras caronas
oferecidas, uma grande amiga que pretendo levar por toda vida;
Ao Mário Henrique Rodrigues Mendes Torres, pela parceria além de ter sido a
primeira pessoa a andar comigo assim que comecei a dirigir. Obrigado Mário
Henrique você realmente é corajoso;
À Lívia do Vale Martins (minha morena), foram tantos momentos divertidos juntos,
sacamos a resenha só no olhar, nunca vou esquecer seus conselhos - “Dona dos
meus olhos é você”;
À Bruna Lima Barbosa (meu loiro), pela simplicidade e atenção, temos tanta coisa
em comum, entre elas o bom gosto musical;
Ao Raimundo Carvalho Borges, Karla Annielle Bernardo da Silva e Laíze Raphaelle
Lemos Lima, pelo prazer da convivência durante dois anos;
Aos meus companheiros em Piracicaba João Paulo Gomes Viana, José Ribamar de
Assunção Filho e Josilane Souza da Penha, pela amizade e apoio, foi ótimo morar
esse tempo com vocês;
Aos amigos que conquistei ao longo desta caminhada de estudos e pesquisas, em
especial a Márcia Rocha Ferreira, Raimundo Nonato Oliveira Silva, Camila Campêlo
de Sousa e Iradenia da Silva Sousa;
Ao meus grandes amigos Francisco de Assis Bezerra e Ana Carla da Silva Santos,
pelo companheirismo e momentos de diversão;
À minha namorada, Maria Fernanda da Costa Gomes, pelo amor, paciência,
compreensão, incentivo e auxílio prestado em todos os momentos deste trabalho;
Aos meus três sobrinhos por sempre fazerem barulho quando eu tentava estudar, o
tio ama vocês;
Aos meus pais Antônia Ferreira da Costa e Agenor Ribeiro da Costa e meus irmãos,
Patrícia Ferreira da Costa e Marcos Vinicius Ferreira da Costa por terem sido a
minha base, o principal motivo de minhas conquistas, por acreditarem e sem medir
esforços me apoiarem em cada passo;
A todos que de alguma maneira contribuíram para execução deste trabalho.
“Ó profundidade das riquezas, tanto da sabedoria, como da ciência de
Deus! Quão insondáveis são os seus juízos, e quão inescrutáveis os seus
caminhos (...) Porque dEle e por Ele, e para Ele, são todas as coisas;
glória, pois, a Ele eternamente. Amém.”
(Romanos 11:33-36)
SUMÁRIO
RESUMO.............................................................................................................
IX
ABSTRACT.........................................................................................................
X
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................
XI
LISTA DE TABELAS...........................................................................................
XIII
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................
14
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................................
16
2.1 Aspectos botânicos do gênero Casearia......................................................
16
2.2 Gênero Casearia: importância ambiental e farmacológica............................
16
2.3 Cerrado e Parque Nacional de Sete Cidades................................................
18
2.4 Marcadores moleculares no estudo da diversidade genética.......................
20
2.4.1 Microssatélites cloroplastidiais...................................................................
21
2.5 Distribuição da diversidade genética em populações naturais......................
22
2.6 Métodos multivariados de estudo da diversidade genética...........................
24
2.6.1 Métodos de agrupamento...........................................................................
24
2.6.2 Análise de Componentes Principais (ACP)................................................
25
3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................
27
3.1 Área de estudo.............................................................................................
27
3.2 Coleta do material botânico........................................................................
28
3.3 Caracterização morfológica........................................................................
29
3.3.1 Avaliação biométrica folha, fruto e semente.........................................
29
3.4 Caracterização molecular...........................................................................
31
3.4.1 Extração e quantificação de DNA...........................................................
31
3.4.2
Amplificação
heteróloga
dos
locos
microssastélites
nucleares
(nSSR).................................................................................................................
31
3.4.3 Amplificação dos locos microssatélites colroplastidiais (cpDNA)......
32
3.4.4 Genotipagem dos locos de nSSR e cpSSR............................................
33
3.4.5 Análise estatístico-genético....................................................................
33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................
37
4.1 Caracterização morfológica e divergência genética................................
37
4.2 Caracterização molecular...........................................................................
50
4.2.1 Transferibilidade dos locos microssatélites..........................................
50
4.2.2 Divergência haplotípica...........................................................................
52
5 CONCLUSÕES.................................................................................................
59
REFERÊNCIAS...................................................................................................
60
IX
RESUMO
COSTA, M.F. Diversidade genética em populações de Casearia grandiflora no
Cerrado do Piauí. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento), UFPI,
Teresina, 2015.
Casearia grandiflora (Salicaceae) é uma espécie típica do Cerrado piauiense
adaptada a ambientes antropizados, o que permite que seja utilizada em projetos de
restauração. O conhecimento da diversidade e estrutura genética desta espécie
natural é de grande importância para estabelecimento de práticas e estratégias de
conservação biológica. O presente estudo teve como objetivo avaliar a estrutura
genética e populacional de C.grandiflora em duas áreas de Cerrado do Piauí, em
ambiente natural e antropizado. As populações estudadas foram a unidade de
conservação do Parque Nacional de Sete Cidades, e uma área em torno da BR-341
no município de Cocal de Telha, com distância de 67 km entre as mesmas. A
caracterização morfológica, utilizando quinze descritores de natureza quantitativa, foi
realizada através da medição do caule, folha, fruto e semente, seguida de posterior
análise multivariada (componentes principais e agrupamento). A caracterização
molecular foi realizada através da transferibilidade de dez iniciadores microssatélites
nucleares de C. sylvestris para C. grandiflora, embora apenas três iniciadores foram
transferidos com sucesso. A estrutura genética e a diversidade haplotípica foram
estimadas por sete locos de microssatélites cloroplastidiais. Estas análises
morfológicas e moleculares sugeriram maior variação dentro que entre as
populações. O número de haplótípos foi maior na população situada na unidade de
conservação, quando comparada à outra localizada em ambiente antropizado. A
análise bayesiana realizada no programa Structure indica que as populações não
estão geneticamente estruturadas. Os resultados fornecem informações importantes
que contribuem para melhor compreensão da diversidade genética dessa espécie,
uma vez que a literatura especializada apresenta limitação quanto ao seu perfil
descritivo.
Palavras-chave: caracterização morfológica, análise multivariada, diversidade
haplotípica, estrutura genética.
X
ABSTRACT
COSTA, M.F. Genetic diversity in populations of Casearia grandiflora in
Cerrado of Piauí. Dissertation (Master in Genetics and Breeding), UFPI, Teresina,
2015.
Casearia grandiflora (Salicaceae) is a common specie in Cerrado of Piauí which
occupies anthropic environments, permitting it use in restoration projects. Knowledge
on diversity and genetic structure of its natural species are important to establish
practices and strategies of biological conservation. This study aimed to evaluate the
genetic and population structure of C. grandiflora in two areas in Cerrado of Piauí,
are is a natural area and in human disturbed environment. The populations studied
were the unit conservation Parque Nacional de Sete Cidades, and around BR-341
road in Cocal de Telha´s city, 67 km away each other. Morphological
characterization, using 15 quantitative descriptors, was carried out by measurement
of stalk, leaf, fruit and seed, followed by multivariate analyzes (principal component
analysis and clustering). Molecular characterization was achieved through transfer of
ten nuclear microsatellite primers of C. sylvestris for C. grandiflora, and only three
primers were successfully transferred. The genetic structure and haplotype diversity
were estimated by seven chloroplastidial microsatellite loci. These morphological and
molecular analysis suggested larger differentiation within than among populations.
The haplotypes´s number was higher in unit conservation´s population than in
anthropic environment. The bayesian analysis performed indicates that populations
are not structured genetically. The results provide powerful information that
contribute to better comprehension of genetic diversity of this species, since
specialized literature has limitation as to descriptive profile.
Keywords:
morphological
diversity, genetic structure.
characterization,
multivariate
analyses,
haplotype
XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ilustração C. sylvestris Sw. A- Ramo, B- Flor, C- Fruto..........................
17
Figura 2 Estrutura química de Casearina B........................................................... 18
Figura 3 Representação esquemática do gradiente fisionômico da vegetação
de Cerrado.............................................................................................................
19
Figura 4 Mapa com a localização das áreas de coleta marcadas em seus
respectivos municípios..........................................................................................
27
Figura 5 Exemplar de C. grandiflora (a) detalhe da inflorescência; (b) detalhe
do fruto e sua abertura..........................................................................................
28
Figura 6 Caracterização morfológica em genótipos de C. grandiflora (a)
medidas físicas da folha........................................................................................
30
Figura 7 Dendrograma resultante da análise multivariada em duas populações
de C. grandiflora, com base em 15 descritores morfológicos, pelo método de
agrupamento UPGMA...........................................................................................
45
Figura 8 Gráfico biplot entre os dois primeiros componentes principais para os
quinze descritores avaliados em duas populações de C. grandiflora...................
49
Figura 9 Perfil do gel correspondendo ao primer SSR nuclear Csy 11,
genotipados no estudo de duas populações de C. grandiflora. Número ao lado
na vertical indica tamanho do marcador por pares de bases................................
50
Figura 10 Perfil do gel correspondendo ao loco ccSSR-22 avaliado no estudo
de duas populações de C. grandiflora...................................................................
52
Figura 11 Rede de haplótipos, o tamanho de cada círculo é proporcional a
frequência geral de cada haplótipo. As cores dos círculos indicam a ocorrência
destes haplótipos em 2 grupos populacionais (azul claro: Parque Nacional de
Sete Cidades; azul escuro: Cocal de Telha) ........................................................
55
Figura 12 Valores de ΔK, calculado de acordo com o proposto por EVANNO et
al. (2005). O maior valor de ΔK corresponde ao K mais provável, que no gráfico
corresponde a K=2................................................................................................
56
Figura 13 Análise discriminaste de componentes principais (DACP). Em verde
população do Parque Nacional de Sete Cidades e em azul população de Cocal
de Telha.................................................................................................................
57
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Características dos microssatélites nucleares testados.........................
32
Tabela 2 Caracterização dos microssatélites cloroplastidiais usados nas
análises das populações de C. grandiflora............................................................ 34
Tabela 3 Morfometria foliar de duas populações de C. grandiflora do Cerrado
piauiense...............................................................................................................
38
Tabela 4 Caracterização morfológica de frutos e sementes das populações C.
grandiflora analisadas...........................................................................................
40
Tabela 5 Contribuição relativa de caracteres para divergência genética entre
duas populações de C. grandiflora do cerrado piauiense, com base em 15
características
morfológicas,
pelo
método
de
SINGH
(1981)....................................................................................................................
41
Tabela 6 Agrupamento dos genótipos das duas populações de C. grandiflora
coletadas no Parque Nacional de Sete Cidades (G-1 a G-40) e Cocal de Telha
(G-41 a G-80), com base em 15 descritores morfológicos, pelo método de
Tocher...................................................................................................................
43
Tabela 7 Distância inter e intragrupos pelo método de Tocher de duas
populações de C. grandiflora coletadas no Cerrado piauiense com base em
caracteres morfológicos..................................................................................
44
Tabela 8 Estimativa dos autovalores associados aos componentes principais e
sua variância percentual e acumulada dos 15 caracteres morfológicos, em C.
grandiflora..............................................................................................................
46
Tabela 9 Frequência de haplótipos por populações de C. grandiflora................
53
Tabela 10 Análise da variância molecular entre e dentro de populações de
Casearia grandiflora..............................................................................................
54
Tabela 11 Estimativa de parâmetros de diversidade genética para haplótipos
cloroplastidiais nas populações de C.grandiflora..................................................
54
14
1 INTRODUÇÃO
O Cerrado brasileiro comporta formações florestais, savânicas e campestres
totalizando 11 tipos fitofisionômicos principais (RIBEIRO; WALTER, 2001). Devido à
riqueza de espécies e do seu elevado grau de endemismo, este bioma é
considerado hotspot para a conservação da biodiversidade mundial (KLINK;
MACHADO, 2005).
Se por um lado, o Cerrado destaca-se por apresentar grande diversidade de
tipos de ambientes, abrigando alta diversidade de espécies endêmicas e passíveis
de serem comercializadas, por outro, é o bioma brasileiro mais ameaçado de
destruição (ANGELO et al., 2012).
Uma estimativa sobre vegetação natural remanescente indica que o Cerrado
brasileiro sofreu um grande impacto. Cerca de 78,7% de sua área está sob
influência antrópica (CONSERVATION INTERNATIONAL, 2005), sendo que a taxa
de desmatamento é de 22.000 a 30.000 Km2 por ano (BRASIL, 2010).
Os efeitos desses impactos trazem danos ambientais, os quais são
responsáveis pela diminuição da variabilidade genética das espécies. À vista disso
há necessidade de estabelecer metodologias para a preservação e manutenção da
diversidade genética de populações do Cerrado.
Nesse contexto, marcadores morfológicos e moleculares são ferramentas
importantes utilizadas em pesquisas genéticas para explicar a distribuição da
diversidade em populações naturais. Entre os marcadores moleculares que tem
contribuído para esta finalidade estão os microssatélites (SSR), que podem estar
relacionados com o DNA nuclear (nSSR) ou cloroplastidial (cpSSR).
O Piauí é o estado brasileiro com a maior representatividade do Cerrado na
região Nordeste, o estado ocupa cerca de 12 milhões de hectares dos quais 70,4%
estão em sua área de domínio e 29,6% em sua área de transição (MATOS; FELFILI,
2010). Apresenta três Unidades de Conservação de Cerrado (Estação Ecológica de
Uruçuí-Uma, Parque Nacional das Nascentes do Rio Parnaíba e Parque Nacional de
Sete Cidades).
A espécie Casearia grandiflora (Salicaceae), é uma espécie relativamente
importante para o Cerrado, aparecendo em diversos levantamentos fitossosiológicos
(GUILHERME et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2007). Sabe-se que algumas espécies
do gênero Casearia (C. decandra Jacq.; C. obliqua Spreng.; C. sylvestris Sw.)
15
podem ser utilizada para recuperação de áreas degradadas (KLEIN; SLEUMER,
1984; GRIS; TEMPONI; MARCON, 2011).
Apesar de apresentar uma ampla distribuição, ainda não há relatos na
literatura especializada sobre as características biológicas e genéticas desta
espécie. Além da falta de informações genéticas sobre C.grandiflora, existem
poucos estudos relacionados à distribuição da diversidade de populações naturais
do Cerrado piauiense.
Assim, pesquisas relacionadas a esta espécie são necessárias para o
entendimento de sua estrutura e diversidade, o que aponta para o conhecimento e
esclarecimento de sua importância biológica, contribuindo com o aumento de
informações sobre a organização da diversidade genética das espécies nativas
presentes no Cerrado piauiense.
Considerando a importância dos estudos de diversidade genética e a
escassez de informações nesse âmbito sobre esta espécie, o objetivo do presente
trabalho foi desenvolver estudos genéticos com C. grandiflora em duas populações
no Cerrado do Piauí, com utilização de marcadores morfológicos e moleculares.
Uma população está situada dentro da unidade de conservação do Parque Nacional
de Sete Cidades e a outra no município de Cocal de Telha, em torno da BR-343,
apresentando uma maior influência antrópica.
De forma específica, os objetivos foram testar a amplificação de iniciadores
de microssatélites nucleares desenvolvidos para C. sylvestris em C. grandiflora, uma
vez que ainda não foram desenvolvidos iniciadores para a espécie em estudo;
caracterizar duas populações de C.grandiflora do Cerrado piauiense; estimar a
diversidade haplotípica das populações por meio de marcadores cloroplastidiais e
verificar se os índices de diversidade são maiores nos indivíduos da unidade de
conservação do que nos indivíduos que estão presentes na área de
antrópica.
influência
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos botânicos do gênero Casearia
Os representantes do gênero Casearia, estão agrupados na família botânica
Salicaceae, composta por árvores e arbustos amplamente distribuídos, desde
regiões tropicais a temperadas e árticas, caracterizada por folhas decíduas,
alternadas, espiraladas ou dística, simples, serreadas a dentadas e com estípulas
geralmente presentes (JUDD et al., 2009).
Esse gênero foi tradicionalmente considerado como pertencente á família
Flacourtiaceae (CRONQUIST, 1981). Contudo, com base em análises filogenéticas
de sequências de rbcL, os taxonomistas perceberam que a família Salicaceae não
inclui apenas os gêneros Populus e Salix, mas também numerosos gêneros de
Flacourtiaceae, entre eles Casearia. Esta relação monofilética é bem sustentada por
sequências de DNA, que apoiam uma relação próxima entre estes táxons.
Segundo Machado e Oliveira (2000), a espécie C. grandiflora apresenta flores
branco-esverdeadas com cerca de 7mm de diâmetro, dispostas em capítulos sésseis
axilares. Possuem 10 estames férteis livres entre si e unidos à corola na base. Entre
os estames existem estruturas pilosas originárias do receptáculo floral.
O pólen é liberado nas horas mais quentes do dia, com alta viabilidade
(96,6%). O visitante mais frequente é a mosca Ornidia obesa (Syrphidae), embora
tenham outros visitantes casuais como abelhas Meliponinae e borboletas, a planta é
auto-incompatível e não apomítica.
2.2 Gênero Casearia: importância ambiental e farmacológica
As espécies agrupadas no gênero Casearia, podem ser utilizadas para
recuperação de áreas degradadas, pois seus frutos são comestíveis e muito
procurados por aves, responsáveis por sua dispersão (KLEIN; SLEUMER, 1984).
Segundo Carvalho (2007), a madeira de C. decandra é utilizada na confecção de
utensílios leves, brinquedos e também para lenha e carvão, sendo considerada
moderadamente pesada (0,7 g cm-3).
Durante a primavera, ainda quando está sem folhas, C. decandra produzem
uma grande quantidade de flores brancas, que exalam um aroma forte e particular
que atrai abelhas, fornecendo uma grande quantidade de mel de excelente
qualidade (HALISKI et al., 2013).
17
A espécie C. sylvestris Sw, popularmente conhecida como guaçatonga
(Figura 1) é uma das plantas mais bem conhecidas e estudas desse táxon botânico.
Apresenta princípios farmacológicos, que garantem a existência de propriedades
medicinais importantes. Suas folhas contêm teores elevados de óleos essenciais,
flavonóides, saponinas, taninos, resinas e antocianosídeos (SILVA FIALHO et al.,
2010) com ação antitumoral, antifúngica e antibiótica, enquanto sua ação
antiinflamatória foi considerada similar do piroxicam e meloxicam (MARQUES et al.,
2013).
Há relatos de que os índios tupis utilizavam a guaçatonga para tratar
ferimentos e picadas de cobras. Fundamentado nesse histórico, hoje C.sylvestris é
matéria-prima para vários estudos e fonte de inspiração na busca de novos
fármacos e de terapias alternativas para outras patologias como neoplasias
malignas (ESTEVES et al., 2005; FERREIRA et al., 2010, 2011).
Figura 1
Ilustração C. sylvestris Sw. A- Ramo, B- Flor, C- Fruto. Fonte: MAQUETE
(2001).
Extratos e componentes químicos de C.sylvestris particularmente diterpenos
clerodânicos, apresentam atividade citotóxica contra células tumorais (SANTOS et
al., 2010). Oliveira et al. (2009), em estudo com células do sangue de rato,
mostraram que o extrato etanólico obtido de folhas protegem o DNA contra danos
tanto in vitro e in vivo em baixas concentrações.
18
Prieto et al. (2013) analisaram o efeito quimiopreventivo do composto
casearina B (Figura 2) e obtiveram resultados interessantes, uma vez que esse
composto apresentou características quimiopreventivas importantes em células
HepG2 (linhagem de células obtida a partir de um carcinoma hepatocelular humano),
atuando na proteção do DNA contra diferentes tipos de danos, agindo como
antioxidante.
Figura 2 Estrutura química de Casearina B. Fonte: PRIETO (2013).
2.3 Cerrado e o Parque Nacional de Sete Cidades
Dá-se o nome de Cerrado a um gradiente de fisionomias ou tipos de
vegetação (Figura 3), que vai desde o campo sujo ou cerrado ralo (gramíneas com
arbustos pequenos esparsos) até o cerradão (árvores formando um dossel contínuo,
semelhante a uma floresta seca). Alguns fatores naturais explicam a existência dos
diferentes
tipos
fisionômicos
de
Cerrado.
Por
exemplo, quanto
maior
a
disponibilidade de nutrientes e água, maiores e mais abundantes tendem a ser as
árvores (DURIGAN, et al., 2011).
As plantas de cerrado geralmente apresentam estruturas subterrâneas muito
desenvolvidas (raízes, tubérculos, xilopódios), que possibilitam a rebrota rápida e
vigorosa após impactos como o corte, o fogo ou a geada, dependendo muito menos
da dispersão e germinação de sementes do que as espécies de floresta. Desta
forma, pode-se dizer que o Cerrado tem uma enorme capacidade de resistir às
19
perturbações e recuperar rapidamente sua estrutura e riqueza de espécies, sem que
seja necessária intervenção humana (DURIGAN, et al., 2011).
Figura 3- Representação esquemática do gradiente fisionômico da vegetação de
Cerrado. Adaptado por: DURIGAN et al. 2011.
Esse bioma apresenta uma área nuclear distribuída principalmente pelo
Planalto Central brasileiro, nos Estados de Goiás, Tocantins, na região sul de Mato
Grosso, mato Grosso do Sul, no oeste e norte de Minas Gerais, oeste da Bahia e
Distrito Federal, e em áreas consideradas periféricas, que abragem os estados do
Maranhão, Piauí, Tocantins, São Paulo e Paraná (FELFILI et al., 2005)
O Parque Nacional de Sete Cidades criado em 1961, possui uma área de
6.221,48 ha. Está localizado entre os municípios de Brasileira e Piracuruca (04º02’–
08’S e 41º40’–45’W) no norte do estado do Piauí, com altitudes variando de 100 a
290 m (MENDES et al., 2012). É uma área focal para estudos, principalmente os de
longa duração, por se tratar de uma unidade de conservação Federal de proteção
integral (MATOS; FELFILI, 2010).
O Parque encontra-se inserido em uma região designada como prioritária
para a conservação da biodiversidade do bioma Cerrado, onde ainda existem
lacunas de conhecimento. A vegetação do Parque é caracterizada por grande
variedade de comunidades, distribuindo-se mosaicos, incluídas no domínio do
Cerrado ou de transição Cerrado/Caatinga (MENDES et al., 2012).
Oliveira et al. (2007) mapearam a vegetação do Parque e evidenciaram o
complexo mosaico de tipos estruturais dominados por formações savânicas (Cerrado
sentido restrito e Cerrado rupestre), além de Campo limpo, Cerradão, Floresta
20
ocasionalmente inundada e estacional semidecídua. A área de ocorrência da
vegetação do Cerrado típico ou sensu stricto ocupa 37,6% de extensão total do
Parque.
2.4 Marcadores moleculares no estudo da diversidade genética
A diversidade genética pode ser estimada por meio de marcadores
morfológicos, que estimam a divergência genética através de características
fenotípicas; ou por meio de marcadores moleculares, os quais realizam análise
direta do DNA ou indiretamente pela sequência de uma proteína ou RNA. A
aplicabilidade
da
técnica
dos
marcadores
moleculares
passou
a
incluir
potencialmente todas as espécies de plantas (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
Ferreira e Grattapaglia (1998) definem marcadores moleculares como todo e
qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso, como no caso das
isoenzimas, ou de um segmento específico do DNA correspondente a regiões
expressas ou não. Podem ser classificados em função de sua herança, como
dominantes e co-dominantes.
A escolha do tipo de marcador a ser empregado na análise depende de uma
série de fatores relacionados ao objetivo da pesquisa, recursos financeiros e de
infraestrutura disponível (CIAMPI; VINSON; GAIOTTO, 2007).
Entre os marcadores moleculares que utilizam a técnica de PCR, destacamse os microssatélites ou repetições de sequências simples (SSR). As frequências
dos microssatélites variam significativamente entre os diferentes organismos
(WEISNG et al., 1998) e são desenvolvidos especificamente para uma espécie,
entretanto, podem ser transferidos para espécies estreitamente relacionadas que
normalmente são do mesmo gênero (FINKELDEY; HATTEMER, 2007).
Os microssatélites estão sob alterações mutacionais a taxas muito maiores do
que as observadas nas sequências de cópia única (PINTO et al., 2001), variando de
10-6 a 10-2 mutações por geração, sendo que a maioria é causada por alterações no
número das unidades de repetição (EISEN, 1999). São classificados com base em
sua localização no genoma, vindo a ser nuclear, mitocondrial ou cloroplastidial.
As taxas mutacionais presentes nas sequências de microssatélites podem ser
explicadas por dois modelos: o crossing-over desigual entre as moléculas de DNA,
resultado do pareamento não homológo das sequências durante o crossing-over e o
mecanismo do slippage da DNA polimerase, que ocorre durante a replicação do
21
DNA e conduz o aumento ou diminuição do número de repetições (TAUTZ;
SCHLOTTERE, 1994; EISEN, 1999).
O potencial dos microssatélites como marcadores úteis para plantas foi
reconhecido por possuírem uma série de caracteristicas desejáveis, tais como:
distribuição ao acaso; ocorrência em grande quantidades no genoma eucarioto;
codominância dos alelos; facilidade da detecção via PCR; alta diversidade alélica e
grande reprodutividade (ROSSETTO et al., 2001).
O desenvolvimento de locos microssatélites para uma espécie exige as
seguintes etapas: isolamento, clonagem, sequenciamento e caracterização dos
locos. Entretanto, a conservação de regiões flanqueadoras dos microssatélites pode
ocorrer entre espécies correlacionadas, na qual essas sequências podem ser
transferidas de um grupo para o outro, possibilitando a utilização de iniciadores
específicos em outras espécies pertecentes ao mesmo gênero ou entre gêneros de
uma mesma família (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
Esta característica é conhecida como transferibilidade ou amplificação
heterológa (VARSHNEY, 2005; BRAVO, 2006). A transferibilidade de SSR tem sido
relatada a muitas famílias de plantas, incluindo Fabaceaea (PEAKALL et al. 1998;
KÖLLIKER et al. 2001), Poaceae (SAGHAI MAROOF et al. 1994; RODER et al.
1995; THIEL et al. 2003), Solanaceae (PROVAN; et al. 1996; SMULDERS et al.
1997; NAGY et al. . 2007; MOON; NICHOLSON; LEWIS, 2008); Euphorbiaceae (YU
et al., 2011) e Bromeliaceae (SARTHOU et al., 2003; BARBARÁ et al., 2007; PAGGI
et al., 2008).
Nas espécies do Cerrado, observou-se resultados positivos nos estudos de
Zucchi et al., (2002), que obteve sucesso na transferibilidade de Eucalyptus spp para
Eugenia dysenterica. Martins, et al. (2006) conseguiram transferir iniciadores de
Capsicum spp para Solanum lycocarpum e Ciampi et al., (2008) de Hymenaea
courbaril para Hymenaeae stigonocarpa.
2.4.1 Microssatélites cloroplastidiais
O DNA de cloroplasto (cpDNA) nas Angiospermas apresenta um padrão de
herança predominantemente materna, apresentando um genoma efetivamente
haplóide e não recombinante (PALMER, 1994). Suas sequências são altamente
conservadas e têm sido considerado como uma importante ferramenta para avaliar a
estrutura genética dentro e entre as populações (PADH, 2008).
22
Weising e Gardner (1999) desenvolveram marcadores microssatélites (SSR)
de cloroplastos universais para Angiospermas, os quais produzem informações
importantes no esclarecimento da distribuição da diversidade genética em
populações naturais, além de serem utilizados nos estudos das relações
taxônomicas e filogenéticas.
Nos últimos anos, pesquisas referentes à genética de populações de plantas
utilizando cpDNA tem sido desenvolvidas com maior frequência (AZEVEDO;
KANASHIRO; GRATAPPAGLIA, 2008) apresentando altos níveis de variabilidade
genética intraespecífica em diversos estudos.
Zhang et al. (2011) detectaram considerável divergência genética em
populações de Paeonia delavayi, a partir da análise de seis locus polimórficos de
microssatélites cloroplastidiais (cpSSR).
Yang et al. (2011) testaram cinquenta e cinco primers cpSSR e encontraram
onze marcadores polimórficos, os quais foram úteis na análise de estrutura
populacional e filogeográfica de Liriodendron tulipifera. Apesar desses estudos terem
aumentado nos últimos anos, ainda são poucos os trabalhos referente ao tema, em
especial a populações naturais do Cerrado.
2.5 Distribuição da diversidade genética em populações naturais
Uma população pode ser definida como, do ponto de vista genético, por um
grupo de individuos da mesma espécie, que se cruzam e geram descendentes
férteis, possuindo por si só, propiedades comuns, ocupando o mesmo espaço, bem
como tendo continuidade no tempo (SILVERTOWN; DOUST, 1993). Para adotar
estratégias efetivas de manejo da conservação genética é necessário conhecer a
estrutura genética de populações, que envolve o conhecimento dos níveis de
variabilidade genética e como eles estão distribuidos dentro e entre as populações
(DIAS; KAGEYAMA; CASTRO 1997).
O conceito de diversidade genética refere-se ao nível de heterozigosidade
observada (Ho) obtida a partir das frequências genotípicas e heterozigosidade
esperada (He) obtida a partir das frequências alélicas de uma população. O valor de
He permite mensurar o nível de variação genética em uma população de uma
determinada espécie, independentemente do sistema de reprodução (NEI, 1973).
Além de Ho e He, têm sido empregado também a porcentagem de locos polimórficos
23
(P), o número de alelos por locos (A) e o número efetivo de alelos por loco (Ae).
(FRANKHAM, et al., 2002)
Loveless e Hamrick (1984) definiram estrutura genética como a distribuição
não aleatória de alelos ou genótipos no espaço e no tempo, o qual é resultante de
forças evolutivas como mutação, seleção, migração, deriva genética e mutação.
A investigação sobre a estrutura de populações permite detectar modos de
reprodução e estrutura familiar, estimar níveis de migração e dispersão, ajudar no
manejo de espécies ameaçadas de extinção e na mamutenção de bancos de
germoplasma, além de auxiliar no diagnóstico do histórico evolutivo de um conjunto
de táxons (CRUZ, et al., 2011).
Existem vários métodos estatísticos desenvolvidos para caracterizar a
estrutura genética das populações naturais, os quais podemos citar as estatísticas F
de Wright (WRIGHT, 1949); análise da variância das frequências gênicas e pelo
coeficiente de coancestria (COCKERHAM, 1969); análise da diversidade genética
em populações subdivididas pela distância de NEI (NEI, 1973). Esses três métodos
tem como intuito verificar a distribuição da variabilidade genética entre e dentro as
populações. Essas três abordagens apresentam bases genéticas similares, porém,
são complementares em relação ao significado biológico.
As estatísticas F de Wright possibilitam caracterizar a distribuição da
variabilidade genética entre as populações (FST), assim como dos níveis médios de
endogamia ao nível populacional (FIS) e total (FIT). O coeficiente de endogamia mede
todos os efeitos da estrutura populacional combinada.
Os indices de fixação são importantes para entender a estrutura genética,
bem como o padrão de seleção associado com o polimorfismo alélico. Embora o F ST
tenha um mínimo teórico de 0 (indicando nenhuma divergência genética) e o
máximo teórico de 1 (indicando fixação de alelos alternativos em diferentes
subpopulações), o máximo observado geralmente é muito menor do que 1 (HARTL;
CLARK, 2010).
Wright (1949) sugeriu as seguintes orientações qualitativas para interpretação
de FST: a amplitude de 0 a 0,05 pode ser considerada indicativa de pequena
diferenciação genética; a amplitude de 0,05 a 0,15 pode ser considerada indicativa
de moderada diferenciação genética; a amplitude de 0,15 a 0,25 pode ser
considerada indicativa de grande diferenciação genética; valores de FST acima de
0,25 indicam diferenciação genética muito grande.
24
O conhecimento sobre a estrutura genética populacional de espécies de
plantas é importante para se evitar perdas adicionais de diversidade genética em
populações que são ameaçadas por atividades madeireiras, desmatamento e
fragmentação de habitat (COLLEVATTI; GRATTAPAGLIA; HAY, 2003). Nessa
perspectiva, vários trabalhos de diversidade e estrutura genética de populações
vegetais naturais foram desenvolvidos (WARNER; ALBERTAZZI, 2010; JUGRAN et
al., 2011; RODRIGUES, 2011; SILVA et al., 2011; WEBER; KOLB, 2014; OLEAS;
WETTBERG; NEGRO´N-ORTIZ, 2014).
2.6 Métodos multivariados de estudo da diversidade genética
A conservação de recursos genéticos de espécies vegetais e animais é
considerada um tema de grande relevância, razão pela qual inúmeros estudos têm
sido realizados na quantificação da diversidade genética e no entendimento de sua
magnitude, natureza e distribuição entre e dentro de populações (CRUZ et al.,
2011).
A definição de como avaliar a diversidade genética é dependente do conjunto
de informações disponíveis, na análise dos dados fenotípicos, vários métodos
multivariados são empregados, os quais são capazes de produzir uma estrutura de
grupos.
A análise dos grupos implica em avaliar a capacidade de alocação ou de
discriminação
de
indivíduos,
nos
seus
respectivos
centros
de
referência
(populações), com base nas variáveis avaliadas, bem como formular e testar
hipóteses sobre as causas dessa aglomeração ou dispersão.
Entre as diversas técnicas multivariadas aplicados na predição da diversidade
genética, podemos citar método de agrupamento por otimização e hierarquização,
componentes principais e variáveis canônicas.
2.6.1 Métodos de agrupamento
A análise de agrupamento tem por finalidade discriminar geneticamente os
indivíduos e permite separá-los em grupos pela análise de um conjunto de
características inerentes a cada um, reunindo-os por algum critério de classificação,
de forma que exista homogeneidade dentro do grupo e heterogeneidade entre eles
(HAIR et al., 2005). Basicamente, esse processo relaciona a estimação de uma
medida de similaridade ou dissimilaridade entre os genótipos (CRUZ et al., 2011).
25
Existem vários desses métodos descritos na literatura, que se distinguem pelo
tipo de resultado a ser fornecido pelas diferentes formas de definir a proximidade
entre um individuo e um grupo já formado ou entre dois grupos quaisquer (MARDIA;
KENT; BIBBY, 1997). Dos métodos de agrupamento, os mais utilizados são os de
otimização e os hierárquicos (CRUZ; REGAZZI ; CARNEIRO, 2012).
De acordo com Mohammadi e Prasanna (2003), os métodos hierárquicos são
os mais empregados em estudos de diversidade genética, entre eles o UPGMA é o
mais utilizado, seguido pelo método de Ward. Segundo James e Mcculloch (1990) e
Sneath e Sokal (1973), o método UPGMA é um dos utilizado com maior frequência
em ecologia e sistemática e em taxonomia numérica, respectivamente.
Em relação aos métodos hierárquicos, os genótipos são agrupados por um
processo que se repete em vários níveis, até que seja estabelecido um dendrograma
ou o diagrama de árvore. Com base de exame visual do dendrograma avaliam-se
pontos de alta mudança de nível, que são delimitadores do número de genótipos
para a formação dos grupos (CRUZ et al., 2011).
Os métodos de otimização diferem, basicamente dos hierárquicos, pelo fato
dos grupos formados serem exclusivos (AMARAL JÚNIOR; THIÉBAUT, 1999).
Dentre os métodos de otimização, destaca-se o algoritmo de Tocher, o qual consiste
em uma análise baseada na formação de grupos, os quais as distâncias dentro dos
grupos são menores que as distâncias entre eles.
O método requer a obtenção da matriz de dissimilaridade, sobre a qual é
identificado o par de indivíduos mais similares. Esses indivíduos formarão o grupo
inicial. A partir daí é avaliada a possibilidade de inclusão de novos indivíduos,
adotando-se o critério de que a distância média intragrupo deve ser menor que a
distância média intergrupo (CRUZ; REGAZZI; CARNEIRO, 2012).
2.6.2 Análise de Componentes Principais (ACP)
A técnica de análise de componentes principais foi inicialmente descrita por
Karl Pearson (1901) e posteriormente aplicada por Hotelling (1933, 1936) em
diversas áreas da ciência. O objetivo da análise é tornar p variáveis X1, X2,..., Xp e
encontrar combinações destas para produzir índices Z1, Z2,..., ZP que sejam não
correlacionados na ordem de sua importância, e que descreva a variação nos dados
(MANLY, 2008).
26
Esta análise encontra-se certamente entre as mais importantes ferramentas
da análise multivariada, inclusive por constituir a base na qual se fundamentam a
maioria dos outros métodos multivariados de análise de dados (LYRA et al., 2010).
Cada componente principal é uma combinação linear das variáveis originais. Além
disso, são independentes entre si e estimados com o propósito de reter, em ordem
de estimação, o máximo de informação, em termos de variação total, contida nos
dados iniciais (CRUZ et al., 2011).
A ideia central da análise dessa técnica baseia-se na redução do conjunto de
dados a ser analisado, principalmente quando os dados são constituídos de um
grande número de variáveis correlacionadas. A redução do número de variáveis não
se faz por uma simples seleção de algumas variáveis, mas pela construção de
novas variáveis sintéticas, obtidas pela combinação linear das variáveis iniciais, por
meio dos fatores (MANLY, 2008).
Para fazer o descarte de variáveis, procura-se identificar os componentes cuja
variância seja reduzida ou próxima de zero, os quais representaram combinações
lineares que resultam em valores de escores dados por uma constante, sendo as
variáveis de maiores pesos nos últimos autovetores são consideradas de menor
importância para estudo da diversidade genética. Deste modo, com a posse dos
resultados da análise de componentes principais, podem-se eliminar características
redundantes e de difícil mensuração.
De acordo com o critério de Johnson e Wichern (1992), os autovetores por
serem considerados como os de maior importância para o estudo da diversidade
genética, eles devem explicar no mínimo 80% da variação total.
27
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Área de estudo
O estudo foi desenvolvido em duas áreas de Cerrado no estado do Piauí,
abrangendo o municipio de Cocal de Telha (04º33'32"S 41º58'20"W) e o Parque
Nacional de Sete Cidades (04°02’08’’ S e 41°40’45’’ W), presentes dentro do perfil
fitofisionômico Cerrado scrito sensu e a distância entre elas é de 67 km (Figura 4).
Figura 4 Mapa com a localização das áreas de coleta marcadas em seus
respectivos municípios. Adaptado por: FERREIRA, D.S. 2015.
28
A precipitação pluviométrica média anual do município de Cocal de Telha é
definida no Regime Equatorial Marítimo, com isoietas anuais entre 800 a 1.600 mm,
cerca de 5 a 6 meses como os mais chuvosos e período restante do ano de estação
seca. Os meses de fevereiro, março e abril correspondem ao trimestre mais úmido
da região (AGUIAR et al., 2004).
A escolha destas áreas teve por finalidade comparar a diversidade genética
entre a população da unidade de conservação do Parque Nacional de Sete Cidades
com a população de Cocal de Telha, a qual está sujeita a maiores pressões
antrópicas e localizada em torno da BR-343.
3.2 Coleta do material botânico
A coleta de folhas e frutos de C. grandiflora foram realizadas nos meses de
abril e maio de 2014, quando as plantas apresentavam frutos bem desenvolvidos
(Figura 5). Foram analisados 80 genótipos de C. grandiflora, dos quais 40 foram
coletados no Parque Nacional de Sete Cidades (População 1) e nomeados em G-1 a
G-40. Os demais foram coletados na área fragmentada de Cocal de Telha
(População 2) e nomeados como G-41 a G-80.
Figura 5
Exemplar de C.grandiflora (a) detalhe da inflorescência; (b) detalhe do
fruto e sua abertura. Fonte: COSTA, M.F, 2015.
Foram determinadas as coordenadas geográficas (latitude e longitude), dos
80 genótipos com auxílio de GPS (Global Positioning System) e coletado material
botânico em estádio reprodutivo, os quais foram identificados com base em
bibliografia especializada e enviados para confirmação por especialista e
29
incorporados ao acervo do Herbário Graziela Barroso (TEPB) da Universidade
Federal do Piauí (UFPI).
Após coletados, as folhas e os frutos foram acondicionados em sacos
plásticos, etiquetados e levados ao Laboratório de Tecnologia de Sementes e
Recursos Genéticos da Universidade Federal do Piauí, para caracterização
morfológica.
3.3 Caracterização Morfológica
3.3.1 Avaliação biométrica folha, fruto e semente
As medições físicas de folhas, frutos e sementes foram realizadas no período
de maio a junho de 2014.
Os seguintes descritores foram avaliados: diâmetro da altura do caule (DAP),
comprimento do pecíolo (CP), comprimento do limbo (CL), largura do limbo (LL),
índice foliar (IF), peso de massa seca (PMS), peso do fruto (PF), comprimento do
fruto (CF), largura do fruto (LF), relação comprimento e largura do fruto (C/LF),
número de sementes por fruto (NS), relação comprimento e largura da semente
(C/LS), peso de 100 sementes (P100S), comprimento da semente (CS) e largura da
semente (LS).
As medidas de comprimento, largura, espessura e diâmetro foram realizados
com o auxílio de um paquímetro digital e foram expressas em milímetros (Figura 6).
Para as medidas de massa foi utilizada balança digital de precisão expressa em
gramas. O IF foi calculado dividindo-se o comprimento do limbo por sua largura.
Para efeito de medições físicas, utilizaram-se 10 medidas repetidas de folha, fruto e
semente por genótipo estudado.
30
Caracterização morfológica em genótipos de C. grandiflora (a)
medidas físicas da folha: comprimento do pecíolo (CP);
comprimento do limbo (LL); (b) medidas físicas da folha: largura do
limbo (LL); (c): medidas físicas do fruto: largura do fruto (LF);
comprimento do fruto (CF); (d): medidas físicas da semente: largura
da semente (LS); comprimento da semente (CS). Fonte: COSTA, M.
F. (2015).
As análises de divergência genética foram realizadas, utilizando-se da
Figura 6
distância Euclidiana média como medida de dissimilaridade entre todos os pares de
genótipos, sendo a importância relativa dos caracteres estimada pelo método de
Singh (1981).
Os métodos de agrupamento utilizados foram de Tocher e UPGMA. Realizouse análise de componentes principais (ACP), com o intuito de eliminar as variáveis
morfológicas redundantes. Os dados foram padronizados e as análises estatísticas
foram processadas, utilizando o recurso computacional Genes versão 2013.5.1 para
análise do Tocher (CRUZ, 2013) e o software SAS 9.0 (SAS, 2002) para as análises
de UPGMA e Componentes principais.
31
3.4 Caracterização Molecular
3.4.1 Extração e quantificação de DNA
As amostras de folhas jovens foram coletadas, transferidas e armazenadas
em N2 líquido, sendo transportadas até o Laboratório de Biologia Molecular, onde
foram mantidas em freezer até o início da extração do DNA que foi realizado
conforme recomendações do Kit DNeasy Plant Mini (Qiagen Inc., Valencia CA,
USA).
A quantificação do DNA extraído foi realizada por meio de eletroforese em
gel de agarose a 0,8%, preparado em tampão TBE 0,5 x (Tris-Borato-EDTA) e
corado com SYBR® Safe DNA Gel Stain a 1x, através da comparação com bandas
de DNA-λ diluído na concentração de 100 ng/µL. Após estes resultados o DNA foi
diluído à uma concentração de 5 ng/µL e armazenado a -20ºC.
3.4.2 Amplificação heteróloga dos locos microssatélites nucleares (nSSR)
A princípio testou-se a transferibilidade de iniciadores desenvolvidos para
Casearia sylvestris Sw. em C. grandiflora, já que não existem iniciadores específicos
desenvolvidos para esta espécie em estudo. Foram utilizados para o teste de
transferibilidade dez primers (Tabela 1) desenvolvidos por Cavallari et al. (2008).
Para a execução das reações de PCR foram usadas as concentrações de
reagentes de acordo com o proposto por Cavallari et al. (2008). Como parte da
otimização dos iniciadores, foram testados algumas condições de PCR, inclusive o
descrito por Cavallari et al. (2008), que apresentou melhores resultados, porém com
algumas modificações: 95 °C por 5 min, depois 7 ciclos de 94 °C por 30 s, 65 °C por
1min 30 s, 72 °C por 1 min seguido de 30 ciclos de 94 °C por 30 s, 53 °C por 1 min
30 s, 72 °C por 1 min e uma extensão final de 60 °C por 30 min.
32
Tabela 1 Características dos microssatélites nucleares testados.
Locos
Csy04
Csy06
Csy07
Csy08
Csy09
Csy11
Csy14
Csy15
Csy16
Csy18
Sequência dos primers (5  3)
F:CATAACTCTTTGCTTGCCCC
R:TTGAACTCACATCTGCTGCC
F:TACCGTCCCTAGGACATTCG
R:GCAATGCAGGTGATTTCTGA
F:TCATGAACAATGCCAAGCTC
R:TGAAGCGAAATTCTGCCTTT
F: GCCTTTAATTTCCTTTCGCC
R:AAAGAGGTGATGTGCTGCTC
F:GGTTCAATCCTCTTCCAGCA
R: CGGCCTAATTCCTATTGTGG
F:TTGTAGCACCACTTTGGCCT
R:GGTCACTGTTGAAGTTTCTGGA
F: CTTTACATGGAAGGGCAACC
R:TTTTTCCCTCACTGCATTCAT
F: GATGGGTCAATTTCAGGAAC
R: TGTTCGCTCCTAAATGCAAA
F:GCATCTGGTTGGCTCAAAAT
R:TGGCAAAGAGATCGAGGATT
F:CCTAGTCGGTGGCAAACATT
R:GCAAAGGAGCTTGAATCTGG
Motivo
Tamanhos dos
alelos (pb)
(CT)17
117–167
(CT)17
280–322
(TC)19
246–268
(TC)16
145–167
(AG)12
187–201
(AG)18
140–180
(CA)10
218–244
(TC)11
251–285
(TG)10
272–284
(CT)11
273–303
Sequência de iniciadores desenvolvidos por CAVALLARI et al. (2008).
3.4.3 Amplificação dos locos microssatélites cloroplastidiais (cpDNA)
Para as análises com microssatélites cloroplastidiais foram utilizados seis
pares de iniciadores desenvolvidos para angiospermas dicotiledôneas por Weising e
Gardner (1999) e treze iniciadores (Tabela 2) desenvolvidos para Nicotiana tabacum
L. por Chung e Staub (2003). Os pares de iniciadores apresentaram temperatura de
anelamento ideal de 58ºC.
33
3.4.4 Genotipagem dos locos de nSSR e cpSSR
Após as reações de amplificação dos locos de nSSR e cpSSR, o tamanho
dos alelos foi determinado em um sequenciador automático LI-COR DNA Analyser
4300s (LI-COR Corporate), o qual utiliza uma tecnologia sensível de florescência
infravermelha. Foi utilizado ROX-500® como marcador de peso molecular para
verificar o tamanho esperado dos produtos da PCR.
A genotipagem dos indivíduos foi realizada através da análise dos géis
virtuais. As bandas polimórficas e monomórficas foram lidas automaticamente, tendo
como referência os padrões de tamanhos moleculares de 50-350pb (Licor), com
auxílio do programa (Saga™).
3.4.5 Análise estatístico-genético
Para
os marcadores microssatélites nucleares, foram estimados os
parâmetros de diversidade genética, tais como as frequências alélicas e genotípicas,
a diversidade genética por locos e por população, a riqueza alélica, o coeficiente de
endogamia, o número de alelos por loco (A), porcentagem de locos polimórficos,
heterozigosidade observada (Ho) e heterozigosidade esperada ou diversidade
genética (He), utilizando o programa FSTAT (GOUDET, 2002).
Os polimorfismos dos genomas de cloroplastos são herdados sem
recombinação, cada combinação alélica única entre os locos de microssatélite foi
considerada um haplótipo. Cada haplótipo, por sua vez, foi analisado como um alelo
diferente de um único loco haplóide.
Foram computados o número de haplótipos, a quantidade de haplótipos
privados por população, proporção de haplótipos privados, a diversidade haplotípica
e o número efetivo de haplótipos, com o uso do programa GenAlEx 6.5 (Peakall e
Smouse, 2012).
34
Tabela 2 Caracterização dos microssatélites cloroplastidiais usados nas análises
das populações de C. grandiflora.
Locos
ccmp1
ccmp2
ccmp5
ccmp7
ccmp8
ccmp9
ccSSR-1
ccSSR-2
ccSSR-3
ccSSR-4
ccSSR-6
ccSSR-7
ccSSR-9
ccSSR-10
ccSSR-11
Sequências
Referência
F: CAGGTAAACTTCTCAACGGA
Weising e Gardner
R: CCGAAGTCAAAAGAGCGATT
(1999)
F: GATCCCGGACGTAATCCTG
Weising e Gardner
R: ATCGTACCGAGGGTTCGAAT
(1999)
F: CCAAAATATTBGGAGGACTCT
Weising e Gardner
R: TGTTCCAATATCTTCTTGTCATTT
(1999)
F: CAACATATACCACTGTCAAG
Weising e Gardner
R: ACATCATTATTGTATACTCTTTC
(1999)
F: TCTTGCGACCGAGCTTCTCC
Weising e Gardner
R: TTGGCTACTCTAACCTTCCC
(1999)
F: TTCTTTCTTATTTCGCAGDGAA
Weising e Gardner
R: GGATTTGTACATATAGGACA
(1999)
F: TCAAATGATACATAGTGCGATACA
R: AATAAAGGATTTCTAACCATCTT
F: ATACCCACATGCACAAGTTTGG
R: AATCCTGGACGTGAAGAATAA
F: CCAAAAGCTGACATAGATGTTA
R: TTTCATTCGGCTCCTTTATG
F: AGGTTCAAATCCTATTGGACGCA
R: TTTTGAAAGAAGCTATTCARGAAC
F:CGACCAATCCTTCCTAATTCAC
R AGAAAAGMAAGGATATGGGCTC
F CGGGAAGGGCTCGKGCAG
R GTTCGAATCCCTCTCTCTCCTTTT
F GAGGATACACGACAGARGGARTTG
R CCTATTACAGAGATGGTGYGATTT
F TCTAGGATTTACATATACAACAT
R CATCATTATTGTATACTCTTTCA
F TTGGCTACTCTAACCTTCCC
R ACCATAGAAACGAWGGAACCCACT
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
Continua...
35
Conclusão...
Tabela 2: Caracterização dos microssatélites cloroplastidiais usados nas análises
das populações de C. grandiflora.
Locos
ccSSR-16
ccSSr-19
ccSSR-20
Sequências
F TACGAGATCACCCCTTTCATTC
R CCTGGCCCAACCCTAGACA
F CTATGCAGCTCTTTTATGYGGATC
R TCCARGTAAATGCCCAAGTT
F CCGCARATATTGGAAAAACWACAA
R GCTAARCAAATWGCTTCTGCTCC
Referência
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
Chung e Staub (2003)
R GGAAGGTGCGGCTGGATC
*Y= C ou T; R= A ou G; W= A ou T
A análise de variância molecular (AMOVA) (EXCOFFIER; SMOUSE;
QUATTRO, 1992) foi realizada com os 80 indivíduos das populações usando o
software Arlequin 3.5.1.2 (EXCOFFIER et al., 2005), de forma a estimar a variação
genética entre e dentro das áreas de estudo. A AMOVA calcula o valor F ST, que
equivale à proporção da variação genética total fracionada entre populações.
Para verificar o grau de mistura de genótipos entre as áreas, usou-se a
análise bayesiana de estruturação desenvolvida por Pritchard e colaboradores
(2000), implementado pela presença/ausência de marcadores cpSSR no software
Structure 2.3.1
Neste tipo de análise foi gerado um arquivo com dados de genotipagem e
valores de K=1 a K=15. Os arquivos foram submetidos à análise Structure realizadas
com 10 corridas para cada valor de K, 200.000 burn-ins e 500.000 simulações de
Monte Carlo de Cadeias de Markov (MCMC). A seleção de número K mais provável
em relação aos propostos foi realizada por meio de valores de ΔK, de acordo com
Evanno et al. (2005).
A rede de haplótipos foi construída baseada em Median-Joining MJ
(BANDELT; FORSTER; RÖHL, 1999), com a utilização do programa Network 4.610
(Fluxus Technology Ltd. em www.fluxus-engineering.com). Esta estatística de
agrupamento é baseada na teoria de coalescência e tem sido utilizada em
36
alternativa à parcimônia de Wagner (Wagner parsimony), por fornecer melhores
conexões entre haplótipos (EXCOFFIER; SMOUSE, 1994).
Os haplótipos de DNA são relacionados por mutação e arranjados em uma
rede. Os nós da rede representam os haplótipos, enquanto que a distância entre
eles é proporcional ao número de mutações. Pode-se, então, usar o número de
mutações ao longo da rede como uma medida de divergência evolucionária entre
quaisquer dois haplótipos (EXCOFFIER; SMOUSE; QUATTRO, 1992).
A Análise discriminante de componentes principais (DAPC), disponível no
pacote adegenet para R, versão 2.11 (R desenvolvimento Core Team 2010) foi
utilizada para definição dos grupos, pois está técnica não requer uma definição a
priori de grupos genético (Jombart et al., 2010).
37
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Caracterização morfológica e divergência genética
As análises morfológicas realizadas nas 80 plantas selecionadas para este
estudo permitiram a diferenciação das mesmas entre si, bem como agrupá-las de
acordo com a similaridade.
Com relação aos caracteres relacionados à folha da espécie estudada: forma
do limbo, ápice e base, foram respectivamente, elíptica, agudo e arredondada. Os
maiores valores para comprimento médio do pecíolo foram determinados nos
indivíduos do Parque Nacional de Sete Cidades, entretanto essa variável não
apresentou grandes diferenças entre as médias dos genótipos das duas populações
analisadas, sendo 4,7 cm para população do Parque e 4,6 cm para população de
Cocal de Telha (Tabela 3).
O índice foliar (IF) indica a relação entre largura e comprimento da folha,
informando sobre o investimento da espécie em crescimento ou alargamento do
limbo. Folhas com valor de IF ≅ 1 (um) são isodiamétricas; IF < 1 são mais largas
que longas; IF> 1 são, proporcionalmente, mais alongadas.
Quanto a esse caráter todos os genótipos apresentaram valores de IF
maiores que um, indicando que a espécie investe mais no crescimento longitudinal
das folhas do que na largura, em resposta à adequação das condições ambientais,
uma vez que esta característica está fortemente relacionada com a maximização do
aproveitamento da energia luminosa (FALEIRO, 2006).
Os valores observados para os caracteres morfológicos foliares (comprimento
do pecíolo, comprimento do limbo, largura do limbo, índice foliar e peso de massa
seca), nestas áreas são importantes, já que tais características variam com a
distribuição espacial e temporal da espécie, disponibilidade de luz e idade da folha.
As diferenças observadas entre os caracteres foliares refletem a adaptação dessa
espécie ao ambiente e estas informações favorecem a compreensão do papel
ecológico desta planta.
A partir da análise comparativa dos descritores foliares, é possível observar
que não existem grandes diferenças entre as duas populações, sendo que o
descritor que apresentou maior divergência foi peso de massa seca da folha. As
baixas variações observadas para estas características já eram esperadas, pois
ambas estão presentes dentro de um mesmo perfil fitofisionômico, o Cerrado stricto
38
sensu. Em vista disso, o ambiente produz respostas semelhante nas variações
foliares nos indivíduos das duas populações.
A população Cocal de Telha está mais susceptível a ação humana, contudo
não foi possível observar elevadas modificações na morfologia foliar em comparação
ao Parque Nacional de Sete Cidades. Entretanto vale ressaltar que a folha é o órgão
vegetal que responde com maior facilidade às variações ambientais (CHAGAS et al.,
2008).
Tabela 3
Morfometria foliar de duas populações de C. grandiflora do Cerrado
piauiense. Teresina, PI, 2014
Populações
Descritores
Parque Nacional de Sete
foliares
Cidades
Médias
Desvio
Cocal de Telha
Médias
Desvio
Comprimento do
pecíolo (mm)
4,70
1,30
4,60
1,06
72,76
15,12
72,25
13,00
26,12
6,03
27,87
4.71
2,85
0,55
2,62
0,42
1,80
0,60
4,66
0,97
Comprimento do
limbo (mm)
Largura do limbo
(mm)
Índice foliar (mm)
Peso de massa
seca (g)
O fruto de C. grandiflora é do tipo cápsula loculicida, cujas semente tem forma
elipsóide, tegumento cartáceo, creme, levemente estriado, sendo que ao redor
destas ocorre arilo carnoso, alaranjado, que preenche completamente o fruto,
podendo ser confundido com mesocarpo.
Nas duas populações estudadas, os frutos apresentaram grande variação
com relação ao número de sementes em seu interior, variando de 7 a 23 sementes
por fruto.
A produção de grande número de sementes e a habilidade de colonizar
habitat aberto, aliado a outros fatores, sugerem que essa espécie poderia ser uma
39
estrategista-r, ou seja, alocam grande parte de sua energia na reprodução em
detrimento da manutenção dos indivíduos (MELO et al., 2004).
A partir do número de sementes por fruto foi possível determinar o parâmetro
estrategista-r, visto que esse caráter está relacionado com o processo de adaptação
e história de vida da espécie, sendo possível entender que C. grandiflora distribui
sua energia para os processos de crescimento e reprodução. Logo, as plantas de
ambas populações alocam maior esforço energético no processo reprodutivo.
Em relação aos demais descritores fenotípicos referentes ao fruto e a
semente, a população do Parque Nacional de Sete Cidades apresentou, em grande
parte, as maiores médias para os caracteres analisados, apesar de não existir uma
elevada variação entre as médias das duas populações.
A baixa divergência encontrada para tais descritores, entre as populações já
era esperada, uma vez que os dados morfológicos de frutos e sementes são
característicos de cada espécie e apresentam forte influência ambiental (PAULA,
2007). Como o estudo foi realizado com plantas de uma mesma espécie e
distribuídas em um mesmo bioma, os valores de cada descritor para as população
foram semelhantes (Tabela 4).
Considerando-se que C. grandiflora possa a ser uma estrategista-r, espera-se
que apresente estratégias adaptativas a habitat imprevisível, o qual pode sofrer
algum tipo de perturbação, como é o caso da região em estudo de Cocal de Telha.
Dessa forma esta planta pode ocupar ambientes antropizados, o que permite que
possa ser utilizada em projetos de restauração.
Imatomi et al. (2009) realizaram a caracterização morfológica de C. sylvestris
e obtiveram os seguintes valores médios 0,05; 5,40; 4,45 e 1,96 para as variáveis
peso do fruto (g), comprimento do fruto (mm), largura do fruto (mm) e peso de 1000
sementes (g), respectivamente. Haliski et al. (2013) encontraram os valores médios
4,02; 3,28 mm respectivamente, para os descritores comprimento e largura da
semente em Casearia decandra.
Os resultados encontrados por ambos trabalhos referenciados acima
apresentam similaridade com os resultados de mensurações observados na
caracterização de fruto e semente das duas populações de C. grandiflora no
presente estudo, como pode ser observado pela Tabela 4
40
Tabela 4
Caracterização morfológica de frutos e sementes das populações C.
grandiflora analisadas.
Parque Nacional de Sete
Cidades
Cocal de Telha
Descritores
Média
Desvio
Média
Desvio
Peso do fruto (g)
0,06
0,02
0,06
0,02
6,00
0,75
6,30
0,48
3,83
0,52
4,50
0,38
1,60
0,14
1,41
0,10
12,9
1,08
11,71
0,83
2,05
0,35
2,30
0,21
1,18
0,28
1,30
0,11
1,86
0,29
1,72
0,12
0,15
0,15
0,08
0,11
Comprimento do
fruto (mm)
Largura do fruto
(mm)
Relação
comprimento e
largura do fruto
(mm)
Número de
sementes
Comprimento da
semente (mm)
Largura da
semente (mm)
Relação
comprimento e
largura da
semente (mm)
Peso de 100
sementes (g)
A variação observada entre número e o tamanho das sementes, são
informações importantes, uma vez que elas estão diretamente relacionadas com a
germinação e vigor da espécie, o que repercute no estabelecimento da planta no
ambiente, além de influenciar na distribuição e dinâmica da população (ROSA;
FERREIRA, 2001).
A característica que mais contribuiu para a divergência genética entre os
genótipos estudados foi peso de massa seca da folha (Tabela 5), o que indica que
41
existem diferenças em relação à área foliar desses genótipos, visto que o peso de
massa seca é influenciado pelas dimensões foliares da planta, estando intimamente
relacionado com o processo fotossintético.
Contribuição relativa de caracteres para divergência genética entre duas
populações de C. grandiflora do Cerrado piauiense, com base em 15
descritores morfológicas, pelo método de SINGH (1981).
Tabela 5
Descritores
S.j
%
Peso de massa seca da
590,89
16,04
302,39
8,21
281,04
7,63
Comprimento do pecíolo
255,91
6,94
Índice foliar
255,87
6,94
Largura do fruto
235,85
6,40
235,68
6,39
Largura do limbo
218,18
5,92
Largura da semente
213,34
5,79
Peso de 100 sementes
208,78
5,66
Relação comprimento e
204,95
5,56
197,41
5,36
196,64
5,34
Comprimento do fruto
146,06
3,96
Peso do fruto
140,02
3,80
folha
Comprimento da
semente
Diâmetro da altura do
peito
Comprimento do limbo
largura da semente
Relação comprimento e
largura do fruto
Número de sementes
por fruto
O método de agrupamento de Tocher foi eficiente na discriminação dos
indivíduos
geneticamente,
permitindo
agrupá-los
de
tal forma
que
exista
homogeneidade dentro do grupo e heterogeneidade entre grupos. Esta análise
reuniu os genótipos das duas populações em seis grupos distintos (Tabela 6).
42
O grupo I reuniu o maior número de genótipos (87,5%). Todas as plantas da
população de Cocal de Telha concentram-se neste grupo, além de 75% da
população do Parque Nacional de Sete Cidades. Os grupos II, III, IV, V e VI são
constituídos apenas por representantes do Parque, sendo que os grupos III e IV são
formados por dois genótipos e os grupos V e VI apresentam um único representante.
Pelas distâncias intergrupos foi constada maior dissimilaridade genética entre
os grupos V e VI (0,57) (Tabela 7). Como concentram indivíduos pertencentes à
população do Parque Nacional de Sete Cidades, os genótipos mais divergentes
estão presentes nesta unidade de conservação.
A interpretação do método de Tocher indica maior variabilidade genética
dentro das populações de C. grandiflora, com pouca diferenciação entre as
populações, uma vez que a maioria dos indivíduos do Parque Nacional de Sete
Cidades estão agrupados juntos com os de Cocal de Telha.
A baixa diferenciação genética entre as populações, pode estar relacionada à
biologia reprodutiva da espécie, a qual apresenta uma taxa de polinização cruzada
acima de 95% (alógama), portanto esta espécie mantém a maior parte da sua
variação genética dentro das suas populações que entre elas.
43
Tabela 6 Agrupamento dos genótipos das duas populações de C. grandiflora
coletadas no Parque Nacional de Sete Cidades (G-1 a G-40) e
Cocal de Telha (G-41 a G-80), com base em 15 descritores
morfológicos, pelo método de Tocher.
Grupo
Genótipos
G-48, G-73, G-76, G-65, G-56, G-55,
G-78, G-51, G-80, G-71, G-69, G-64,
G-66, G-49, G-50, G-58, G-57, G-62,
G-72, G-70, G-47, G-60, G- 46, G-68,
I
(Parque Nacional Sete Cidades +
Cocal de Telha)
G- 67, G-79, G-44, G-63, G-59, G-77,
G-53. G-54, G-52, G-45, G-74, G-7,
G-61, G-41, G-43, G-1, G-75, G-39,
G- 42, G-23, G-20, G-19, G-28, G-38,
G-29, G-30, G-6, G-18, G-5, G-33, G35, G-32, G-2, G-27, G-37, G-25, G- 4
G- 8, G-12, G-17, G-34, G-10, G- 26,
G-31, G-36, G-3.
II
(Parque Nacional Sete Cidades)
III
(Parque Nacional Sete Cidades)
IV
G-16, G-40, G-14, G-15
G-9, G-11
G-22, G-24
(Parque Nacional Sete Cidades)
V
(Parque Nacional Sete Cidades)
VI
(Parque Nacional Sete Cidades)
G-21
G-13
44
.
Tabela 7 Distância inter e intragrupos pelo método de Tocher de duas
populações de C. grandiflora Camb. coletadas no Cerrado piauiense
com base em caracteres morfológicos.
I
II
III
IV
I
0,24
II
0,33
0,24
III
0,38
0,36
0,23
IV
0,30
0.34
0,43
0,26
V
0,33
0,43
0,49
0,32
VI
0,48
0,33
0,35
0,49
V
0,57
No agrupamento pelo método UPGMA (Figura 7), observa-se a formação de
seis grupos, a mesma quantidade observada no método de otimização de Tocher
(Tabela 6). O sexto grupo do método de Tocher é constituído apenas pelo genótipo
G-13 que pela análise UPGMA pertence ao grupo II. Este grupo, por sua vez, reúne
17,5% dos indivíduos do Parque Nacional de Sete Cidades e 21,25% de Cocal de
Telha, agrupando a maior parte dos genótipos de ambas populações.
Os grupos I, III, IV e V reúnem respectivamente 17,5%, 11, 25%, 1,25% e
3,75% dos genótipos do Parque Nacional de Sete Cidades 16,25%, 7,5%, 1,25% e
2,5%, respectivamente, dos genótipos de Cocal de Telha. Desta forma, todos os
grupos formados a partir do método UPGMA reuniram genótipos das duas
populações, o que fortalece a proximidade genética entre as mesmas e uma
possível complementariedade entre os genótipos.
O desempenho da análise do agrupamento, com base em descritores
morfológicos, foi revelado através do coeficiente de correlação cofenética (ccc).
Segundo Rohlf (1970) valores de correlação cofenética menores que 0,70 indica
inadequação do método de agrupamento. No presente estudo a correlação
cofenética do dendrograma foi igual a 0,73, o que indica que o método de UPGMA
foi adequado no agrupamento dos genótipos.
45
Figura 7
Dendrograma resultante da análise multivariada em duas populações de C.grandiflora, com
base em 15 descritores morfológicos, pelo método de agrupamento UPGMA. (Coeficiente de
Correlação Cofenética=0,72). Fonte: SAS 9.0 (2002)
46
O principal objetivo da análise de componentes principais é revelar as
tendências na variação dos genótipos dentro de todo o conjunto de dados
analisados.
A partir das médias dos quinze descritores morfológicos foram fornecidos
valores para variância, porcentagem da variância e variância acumulada de cada
componente principal (Tabela 8).
O primeiro componente principal respondeu 31,57% da variação total,
enquanto os dois primeiros componentes acumularam 42,09% da variância total. De
acordo com o critério de Kaiser (1960), selecionaram-se os cinco primeiros
componentes principais, já que foram obtidos autovalores superiores a 1,0. Estes
componentes principais explicaram 74,58% da variação.
Cruz et al. (2011), relata que o ideal é que os dois primeiros componentes
principais concentrem a maior quantidade de variância dos dados para que haja
divergência entre grupos de genótipos.
Contudo, há estudos em que a análise tem se mostrado eficaz na avaliação
da diversidade genética, mesmo quando este limite não é atingido. Vieira et al.
(2014), ao utilizarem o método de componentes principais para revelar as principais
tendências de variações da forma da folha de duas espécies do gênero Anacardium,
indicaram que onze descritores são necessários para expressar mais de 80% da
variação e mesmo assim, os escores desses componentes possibilitaram distinguir
os grupos das variáveis.
Tabela 8
Estimativa dos autovalores associados aos componentes principais e sua
variância percentual e acumulada dos 15 caracteres morfológicos, em C.
grandiflora.
Variância
Componente
Autovalor
Variância (%)
1
4,74
31,57
31,57
2
2,06
13,71
45,28
3
1,76
11,71
56,98
4
1,49
9,925
66,91
5
1,15
7,67
74,58
6
0,921
6,14
80,72
acumulada
Continua...
47
Conclusão...
Tabela 8
Estimativa dos autovalores associados aos componentes principais e sua
variância percentual e acumulada dos 15 caracteres morfológicos, em C.
grandiflora.
Variância
Componente
Autovalor
Variância (%)
7
0,782
5,21
85,93
8
0,716
4,77
90,70
9
0,529
3,52
94,23
10
0,442
2,94
97,17
11
0,368
2,45
99,62
12
0,021
0,14
99,76
13
0,019
0,13
99,89
14
0,009
0,06
99,95
15
0,007
0,05
100,0
acumulada
Os caracteres que mais contribuíram para a variabilidade do componente
principal 1 foram a largura da semente, relação comprimento e largura do fruto,
largura do fruto, número de sementes por fruto e comprimento da semente, podendo
serem reunidos no grupo denominado estruturas reprodutivas da planta. No
componente principal 2, os componentes que mais contribuíram para variabilidade
foram comprimento do pecíolo, relação comprimento e largura do fruto e número de
sementes por fruto, que representam os componentes morfométricos de folhas e
frutos.
No gráfico biplot (Figura 8) no qual foram plotados os componentes principais
1 e 2 (Tabela 8), é possível perceber que o genótipo G-13 é o mais divergente em
relação aos demais indivíduos. Pelo método de Tocher, este genótipo não foi
agrupado com nenhum outro, sendo o único representante do grupo VI.
Para os genótipos G-9 e G-11 é possível observar, por meio do gráfico, que
estão próximos e apresentam uma correlação entre as características peso do fruto,
largura da semente, relação comprimento e largura da semente e índice foliar. Pelo
método de Tocher estes genótipos constituem o grupo III (Tabela 7). Tanto o gráfico
biplot quanto o método de agrupamento de Tocher apresentaram semelhanças na
associação de alguns genótipos, por exemplo G-13; G-9 e G-11; G-22 e G-24.
48
A caracterização morfológica de C. grandiflora permitiu conhecer quais os
descritores que mais contribuem para a divergência genética e forneceu subsídios
para o conhecimento dos padrões de variação fenotípica das duas populações,
sendo que maior parte da variação genética está localizada dentro das populações e
a população do Parque Nacional de Sete Cidades apresenta a maior diversidade
genética.
49
Figura 8 Gráfico biplot entre os dois primeiros componentes principais para os quinze descritores avaliados em duas populações de
C.grandiflora. Fonte: SAS 9.0 (2002)
50
4.2 Caracterização Molecular
4.2.1 Transferibilidade dos locos microssatélites.
Dos dez iniciadores microssatélites de C. sylvestris (Tabela 1) testados,
apenas três foram transferidos com sucesso para C. grandiflora (Csy04, Csy08,
Csy11), dos quais apenas os iniciadores Csy04 e Csy 11 (Figura 9) caracterizaramse polimórficos para as populações em estudo. Considerou-se polimórfico o loco
cuja frequência do alelo mais comum é igual ou inferior a 0,99 (FRANKHAN et al.,
2008).
Figura 9 Perfil do gel correspondendo ao iniciador SSR nuclear Csy11,
genotipado no estudo de duas populações de C.grandiflora. Número
ao lado na vertical indica tamanho do marcador por pares de bases.
Fonte: COSTA, M.F., 2015
A transferência interespécies de locos microssatélites nucleares é altamente
desigual entre os táxons, apresentando uma taxa elevada nos animais e sendo
altamente variável em plantas (BARBARÁ et al., 2007).
A transferibilidade de microssatélites entre as espécies do mesmo gênero
botânico, na maioria das vezes, é bem sucedida, com sucesso em 60% nas
eudicotiledôneas e 40% nas monocotiledôneas. No presente estudo, apenas uma
pequena parte dos iniciadores testados amplificaram.
As regiões alvo de anelamento dos indicadores microssatélites nucleares de
C. sylvestris, podem ter sofrido modificações em C. grandiflora, durante o processo
de diferenciação destas espécies, o que confirma que as regiões de ligação destes
sete iniciadores não estão conservadas o suficiente para permitir a amplificação do
loco.
A presença de baixo polimorfismo pode ser decorrente da fixação de alelos
nulos (CHAMBERS e MACAVOY, 2000). Alelo nulo corresponde a falha na
amplificação de um dos alelos devido a ocorrência de mutação na sequência
iniciadora do loco. Alelos nulos tem sido encontrados em mais de 25% de locos
51
microssatélites, chegando a atingir uma frequência superior a 15% (JARNE;
LAGODA, 1996).
Para os 40 indivíduos avaliados, provenientes do Parque Nacional de Sete
Cidades, foram obtidos apenas 6 alelos. O polimorfismo foi baixo para os dois locos
analisados. O número de alelos por locos foi quatro para Csy11 e dois para Csy04 e
o número efetivo de alelos foi de 1,16 a 2,51 para os dois locos Csy04 e Csy11,
respectivamente. O loco Csy11 apresentava-se em Equilíbrio de Hardy-Weinberg
com coeficiente de endogamia significativamente negativo (f = -0,12).
Na população de Cocal de Telha foram também encontrados 6 alelos, e o
número efetivo de alelos foi de 1,02 a 2,74 para os locos Csy04 e Csy11,
respectivamente. Os locos Csy04 e csy11 encontram-se em equilíbrio de HardyWeinberg, ambos com coeficiente de endogamia negativo.
A heterozigosidade observada para a população do Parque Nacional de Sete
Cidades variou de 0,0 (Csy04) a 0,67 (Csy11), já heterozigosidade esperada variou
de 0,14 (Csy04) a 0,60 (Csy11). A heterozigosidade observada para a população de
Cocal de Telha variou de 0,03 (Csy04) a 0,70 (Csy11) e a heterozigosidade
esperada variou de 0,03 (Csy04) a 0,63 (Csy11).
O baixo nível de polimorfismo encontrado pode estar relacionado não
somente a ineficácia na transferibilidade, mas também ao alto grau de uniformidade
da população e ao baixo número de populações analisadas. Desta forma, a
amostragem utilizada não foi suficiente para detectar variação genética.
Moreira et al. (2013) tiveram êxito ao transferir nove primers de
microssatélites nucleares de Enterolobium cyclocarpum para E. contortisiliquum,
com oito primers polimórficos para cinco populações da região Central do Brasil,
sendo que o número médio de alelos por loco foram seis e para a maioria dos locos
a heterozigosidade observada foi maior que a heterozigosidade esperada, sob
equilíbrio de Hardy-Weinberg.
O potencial para amplificação heteróloga de microssatélites é limitado
(BARBARÁ et al., 2007). Embora microssatélites possam ser conservados em
distâncias evolutivas maiores, sua transferência para além do nível de gênero,
muitas vezes é limitada (BOUCK; VISION, 2007).
Os locos microssatélites nucleares utilizados no presente estudo não foram
eficientes para avaliar a diversidade genética das populações, já que o número de
locos microssatélites transferidos foi pequeno. Isto levanta questões sobre o papel
52
das taxas de mutações na evolução das sequências de microssatélites entre
espécies diferentes.
Além disso, é necessário que seja desenvolvidos primers específicos para C.
grandiflora, visto que há poucos estudos sobre esta espécie, e por isso, deve ser
melhor avaliada para conhecer a distribuição de sua variabilidade genética.
4.2.2 Diversidade haplotípica
Dos 19 iniciadores universais testados de DNA cloroplastidial (Tabela 2), 12
possibilitaram a amplificação de produtos via PCR: ccpm1, ccpm2, ccpm7, ccSSR-3,
ccSSR-4, ccSSR-5, ccSSR-6, ccSSR-9, ccSSR-10, ccSSR-11, ccSSR-20 e ccSSR22, sendo possível detectar polimorfismo para sete iniciadores ccSSR-3, ccSSR-4,
ccSSR-6, ccSSR-9, ccSSR-10, ccSSR-11 e ccSSR-22 (Figura 10), permitindo a
obtenção de 10 haplótipos para as populações estudadas (Tabela 9).
Figura 10
Perfil do gel correspondendo ao loco ccSSR-22 genotipados no estudo
de duas populações de C.grandiflora. Fonte: COSTA, M.F, 2015.
Cavallari et al. (2009), em estudo sobre amplificação dos locos microssatélites
cloroplastidiais em C. sylvestris, observaram que os pares de primers ccmp1, ccmp7,
ccmp8 e ccmp9 não amplificaram e que o primer ccmp6 foi monomórfico.
O loco ccSSR-10, foi o que mais contribuiu com sítios polimórficos para a
população do PNSC, revelando o maior número de haplótipos em relação aos
demais locos. A provável explicação, está relacionada ao fato de que os sítios
polimórficos do loco ccSSR-10 sofreu um maior número de mutações, culminando
em um maior número de alelos por loco. Para a população de Cocal de Telha a
grande maioria dos locos são monomórficos, sendo apenas o primer ccSSR-3
polimórfico para esta população.
53
Tabela 9 Frequência de haplótipos por populações de C. grandiflora.
Haplótipo de
População PNSC
População Cocal de Telha
1
00,025
0,00
2
00,025
0,00
3
00,025
0,00
4
00,025
0,00
5
00,025
0,00
6
00,025
0,00
7
0,050
0,00
8
0,400
0,00
9
0,400
0,925
10
0,00
0,075
cpDNA
As informações haplotípicas foram incorporadas a uma análise de variância
molecular (AMOVA), derivada de uma matriz de distâncias quadradas entre os pares
de haplótipos, produzindo estimativas dos componentes de variância, refletindo a
diversidade haplotípica em diferentes níveis de subdivisão hierárquica (Tabela 10).
Os resultados da análise de variância molecular mostram que a maior parte
da variação genética está localizada dentro das populações (85%) e apresentam um
índice de estruturação moderado (FST = 0,14). Os dados encontrados nesta análise
indicam a existência de uma conectividade entre as populações, sendo que a
biologia reprodutiva da espécie é um fator importante para explicar a uniformidade
genética observada nas populações, visto que é uma espécie preferencialmente
alógama, ou seja, realizam polinização cruzada em uma taxa acima de 95%.
Espécies alógamas, ao contrário das autógamas, tendem apresentar altos
índices de variabilidade genética dentro de populações e baixa diferenciação
genética entre as populações (ZANELLA et al, 2012).
Com base nos dados das frequências haplotípicas (Tabela 9), é possível
verificar que o haplótipo 9 é o mais frequente em ambas populações com frequência
de 40% para o do Parque Nacional de Sete Cidades e 92,5% para Cocal de Telha,
portanto a baixa diferenciação genética observada entre as duas populações está
relacionada ao compartilhamento deste haplótipo entre as populações. Conforme
54
Moreno (2009), quando populações compartilham um mesmo haplótipo, pode-se
inferir a presença de um ancestral remoto comum entre elas.
O valor observado para o FST (0,14) indica moderada diferenciação genética
entre as populações. Ao analisarmos novamente a Tabela 9, podemos notar que
embora ambas as populações compartilhem o haplótipo 9, a população do Parque
Nacional de Sete Cidades apresenta oito haplótipos que não foram observados em
Cocal de Telha, o que reforça a ideia de uma moderada estruturação populacional,
podendo até ser um indício de uma futura estruturação populacional.
Análise da variância molecular entre e dentro de populações de Casearia
grandiflora.
Tabela 10
Soma de
Fonte de variação
GL
Variação (%)
Entre populações
1
35,875
15
Dentro de Populações
78
354,250
85
Total
79
390,135
100
quadrados
FST
0,14
*GL= grau de liberdade. Significância calculada usando 1.000 permutações.
A população do PNSC houve a formação de nove haplótipos (n = 9), com a
diversidade haplotípica de h= 0,674. O número efetivo de haplótipos (ne = 3,065) foi
menos que a metade do número total de haplótipos. A população de Cocal de Telha
apresentou o menor número de haplótipos (n = 2) e a menor diversidade haplotípica
(h= 0,139), quando comparada com a população da área de conservação do PNSC
(Tabela 11). O número de haplótipos privados foi mais elevado no PNSC (ne= 8) do
que nos indivíduos de Cocal de Telha (ne= 1).
Tabela 11: Estimativa de parâmetros de diversidade genética para haplótipos
cloroplastidiais nas populações de C.grandiflora.
População
n
ne
np
h
PNSC
9
3,065
8
0,674
CCT
2
1,161
1
0,139
* n= número de haplotipos, ne = número efetivo de haplótipos, np = número de haplótipos privados, h =
diversidade haplótipica, PNCS = População do Parque Nacional de Sete Cidades, CCT= População
de Cocal de Telha.
55
Na análise da rede de haplótipos (Figura 11), a posição central indica o
haplótipo mais frequente, neste caso o 9, como já dito anteriormente este haplótipo é
compartilhado entre as duas populações e possivelmente o haplótipo ancestral dos
demais, uma vez que segundo a teoria da coalescência (KINGMAN, 1982) os
haplótipos mais frequentes provavelmente são provenientes dos ancestrais mais
antigos.
O haplótipo 9 diferencia-se dos haplótipos 10, 3 e 8 por um passo mutacional,
o haplótipo 8 diferencia-se dos haplótipos 5,6 e 7 também por um passo mutacional,
enquanto o haplótipo 5 difere do haplótipo 2 por dois passos mutacionais.
Figura 11 Rede de haplótipos, o tamanho de cada círculo é proporcional a
frequência geral de cada haplótipo. As cores dos círculos indicam a
ocorrência destes haplótipos em 2 grupos populacionais (azul claro:
Parque Nacional de Sete Cidades; azul escuro: Cocal de Telha).
Cada traço representa um passo mutacional. Fonte: NETWORK
4.610
56
Em relação à estruturação genética das populações, os resultados da análise
bayesiana indicaram um K = 2 (Figura 12) a partir da estimativa de Evanno et al.
(2005). Apesar desta análise indicar a presença de duas populações, esta estimativa
não foi observada pelo gráfico de barras do Structure, o qual não detectou diferença
genética entre os indivíduos das duas populações, indicando que elas não estão
estruturadas.
Figura 12
Valores de ΔK, calculado de acordo com o proposto por EVANNO et
al. (2005). O maior valor de ΔK corresponde ao K mais provável, que
no gráfico corresponde a K=2.
A DAPC é uma ferramenta excelente para explorar a estrutura genética das
populações sem fazer suposições de panmixia. Assim, esta técnica fornece uma
alternativa ao métodos de agrupamento bayesianos como Structure (Pritchard et al.,
2000). Por meio dessa análise é possível verificar que as populações do Parque
Nacional de Sete Cidades e de Cocal de Telha estão sobrepostas, indicando baixa
diferenciação genética entre as mesmas, confirmando ausência de estruturação
genética.
Apesar das populações não estarem estruturadas, é possível perceber que os
indivíduos
do
Parque
Nacional
de
Sete
Cidades
são
mais
divergentes
geneticamente em relação a população de Cocal de Telha, que apresenta um
padrão de distribuição mais uniforme, como é possível detectar no gráfico de DAPC
(Figura 13). Esse fato pode ser justificado, uma vez que a população de Cocal de
57
Telha está mais susceptível as pressões antrópicas, que podem vir a comprometer a
manutenção da variabilidade genética.
Figura 13 Análise discriminante de componentes principais (DAPC). Em
verde população do Parque Nacional de Sete Cidades e em azul
população de Cocal de Telha. Fonte: Pacote adegenet para R,
versão 2.11.
A caracterização morfológica e a molecular, mostraram-se metodologias úteis
na análise da diversidade genética de populações de C. grandiflora do Cerrado
piauiense. Tanto os métodos de agrupamento baseados nos descritores fenotípicos,
quanto a análise de variância molecular dos locos de microssatélites cloroplastidiais,
apontaram uma maior uniformidade genética entre as populações do que dentro
delas.
58
Pela análise molecular foi possível estimar a diversidade haplotípica, a qual
sugeriu que existem diferenças na diversidade genética de C. grandiflora da
população da unidade de conservação do Parque Nacional de Sete Cidades e da
população da área sob intervenção antrópica do município de Cocal de Telha. Estes
resultados revelam que a população sob menor influência antrópica abriga maior
diversidade genética e confirmam a eficiência das unidades de conservação para a
preservação da diversidade genética da espécie.
59
5 CONCLUSÕES
 Os descritores morfológicos e moleculares detectaram a presença de
variabilidade
genética
principalmente
dentro
das
populações
de
C.
grandiflora.
 Apenas um terço dos iniciadores de microssatélites desenvolvidos para C.
sylvestris foram transferíveis para C. grandiflora.
 A população natural do Parque Nacional de Sete Cidades apresenta uma
maior diversidade haplotípica que a população antropizada de Cocal de
Telha, o que reforça a importância das unidades de conservação na
manutenção da biodiversidade.
 O índice de diferenciação genético entre as populações foi moderado
(FST=0,14).
 As populações não encontram-se geneticamente estruturadas.
.
60
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