Investigação. 2011;11:33-38 Investigação ISSN 2177-4080 (on-line) http://publicacoes.unifran.br ARTIGO ORIGINAL Bactérias multidroga resistentes isoladas de formigas hospitalares Multidrug resistant bacteria isolated from hospital ants Gilberto Gilson Alves, Eliana Silva Costa, Carlos Henrique Gomes Martins, Maria Gorete Mendes de Souza, Regina Helena Pires* Laboratório de Pesquisa em Microbiologia Aplicada da Universidade de Franca, Franca, São Paulo, Brasil. ■ Recebido em: 14/2/11 | Revisado em: 27/7/11 | Aceito em: 22/8/11 | Disponível online em: 27/10/11 ■ RESUMO As infecções hospitalares são as mais frequentes e importantes complicações ocorridas em pacientes hospitalizados, pois estão relacionadas com o aumento das taxas de morbimortalidade e ainda apresentam dificuldades de um tratamento eficaz. As pragas, em especial as formigas, são vetores que podem aumentar o risco de infecções devido a sua alta mobilidade e adaptação. Os objetivos deste estudo foram isolar e identificar bactérias presentes em formigas capturadas no ambiente hospitalar e verificar seu perfil de sensibilidade frente aos antimicrobianos. A pesquisa ocorreu em um hospital na região Sudeste do Estado de Minas Gerais no período de março de 2010, onde foram coletados 30 espécimes em diferentes unidades do hospital. Cada formiga foi coletada com swab estéril umedecido em solução fisiológica, transferida para um tubo de ensaio contendo caldo BHI e incubada em estufa a 35 °C por 48 horas. A partir dos tubos que apresentaram crescimento, foi realizada semeadura por esgotamento em placas de meios de cultura seletivos e diferenciais, seguindo-se com o antibiograma. Foram recuperados 20 isolados bacterianos, entre cocos Gram-positivos (45%) e bacilos Gram-negativos (55%), os quais se constituíram de Staphylococcus coagulase-negativa, Flavimonas oryzihabitans, Pseudomonas aeruginosa e Stenotrophomonas maltophilia. A interpretação do antibiograma evidenciou a resistência tanto de cepas bacterianas Gram-positivas como de cepas Gram-negativas. Demonstrou-se no presente estudo que formigas alocadas em ambiente hospitalar podem carrear múltiplas espécies bacterianas, inclusive cepas que apresentam perfil multidroga resistente, fazendo-se necessário o controle sanitário de tais vetores. Palavras-chave: infecção hospitalar; formigas; vetores; multirresistência. ABST R AC T Hospital infections are the most frequent and important complications occurring in hospitalized patients because they are related to increased rates of morbidity, and mortality still present difficulties for effective treatment. Pests, especially ants, are vectors that can increase the risk of infections because of their high mobility and adaptability. The aims of this study were to isolate and identify bacteria from ants captured in the hospital and determine sensitivity profile to antibiotics. The study occurred in a hospital in the southeastern state of Minas Gerais in the period from March 2010, where 30 specimens were collected in different hospital units. Each ant was collected using a swab moistened with sterile saline, transferred to a test tube containing BHI and incubated at 35 °C for 48 hours. Aliquots of the contents of the tubes that showed growth were then spread onto selective and differential medium plates, followed by the antibiogram. We recovered 20 bacterial isolates, including Gram-positive cocci (45%) and Gram-negative bacilli (55%), which consisted of Coagulase-negative staphylococci, Flavimons oryzihabitans, Pseudomonas aeruginosa, and Stenotrophomonas maltophilia. The interpretation of antimicrobial susceptibility testing showed resistance of strains of gram-positive and gram-negative bacteria. This study showed that ants placed in the hospital environment can carry multiple bacterial species, including strains that have multidrug resistant profile, making it necessary sanitary control of these vectors. Keywords: hospital infection; ants; vectors, multiresistance. *AUTOR CORRESPONDENTE Endereço: Av. Dr. Armando Salles de Oliveira, 201, Caixa Postal 82, 14.404-600, Parque Universitário, Franca, São Paulo, Brasil. Telefone: (16) 3711-8756 | E-mail: [email protected] 34 Alves GG et al. • Investigação. 2011;11:33-38 Introdução A infecção hospitalar tem despertado grande interesse no meio científico devido a elevadas taxas de morbimortalidade apresentadas pelos pacientes hospitalizados. Por definição, é qualquer infecção adquirida após a internação do paciente e que se manifesta durante a internação ou mesmo após a alta, quando puder ser relacionada com a internação ou procedimentos hospitalares se enquadram como infecção hospitalar (1). Tais infecções têm crescido na proporção direta do desenvolvimento de tecnologias invasivas (sondas, cateteres, dentre outras), do maior contingente de pessoas imunodeficientes, da adaptação evolutiva de novos microrganismos aos seres humanos e da diminuição da sensibilidade microbiana aos quimioterápicos (2) e sua ocorrência é dependente das condições sanitárias dos serviços de saúde e da presença de vetores de microrganismos patogênicos (3). De modo geral, sabe-se que as mais frequentes são as infecções de vias urinárias, sítios cirúrgicos e vias respiratórias (1), sendo as bactérias os principais microrganismos responsáveis pelas infecções hospitalares, seguidas pelos fungos e vírus (4). Os organismos que causam a maioria das infecções hospitalares provêm geralmente do próprio paciente (microbiota endógena), embora possam vir também de contato com profissionais hospitalares (contaminação cruzada), instrumentos e agulhas contaminadas e do ambiente (microbiota exógena). Sendo os pacientes altamente móveis, devido às internações hospitalares cada vez mais curtas, muitas vezes a infecção não se torna aparente (sintomática). Uma grande parcela das infecções hospitalares em pacientes internados e ambulatoriais torna-se sintomática somente depois da liberação dos mesmos (1). Segundo Fernandes (2), muitas vezes é difícil determinar se a fonte do organismo causador da infecção é endógena ou exógena e, ainda, a transmissão de microrganismos no ambiente hospitalar pode ocorrer de forma direta, aérea ou indireta. Dentre as formas de transmissão de microrganismos associados a infecções hospitalares, a veiculação de agentes patogênicos através de formigas, possibilidade essa primeiramente investigada na Inglaterra (5), tem despertado interesse na literatura científica. As formigas são insetos dotados de grande mobilidade podendo percorrer três centímetros por segundo; também se adaptam a vários ambientes, dentre os quais, domiciliares, silvestres e hospitalares (3, 6). Os fatores que influenciam a presença de formigas em hospitais são: a) a estrutura arquitetônica; b) a proximidade a residências (que estimula a migração desses insetos); c) as embalagens de alguns medicamentos tais como caixas de soros e materiais hospitalares, que podem trazer ninhos de formigas para o ambiente interno; d) a circulação de grande número de pessoas com roupas e objetos que podem conter formigas; e) pessoas portando alimentos que funcionam como atrativo extra (7). Estudo prévio (8) relata que algumas espécies de formigas veiculam em ambiente hospitalar agentes patogênicos como: Serratia marcescens, Citrobacter freundii, Klebsiella ozaenae, Enterobacter aerogenes, Proteus mirabilis, Sthapylococcus aureus e Yersinia pestis, contribuindo com o aumento do risco de infecção hospitalar. Outros gêneros de relevância clínica também já foram identificados, como os Staphylococcus coagulase-negativos, Pseudomonas sp., Enterococcus sp., Acinetobacter sp., Streptococcus sp. e Escherichia coli. Devido aos diferentes mecanismos de patogenicidade, uma infecção pode ser tratada por diversos antimicrobianos, devendo ser escolhido aquele ao qual a bactéria apresente sensibilidade (9). Entretanto, apesar da grande diversidade de estruturas químicas e diferentes mecanismos de ação dos antibióticos, o tratamento de infecções tem sido cada vez mais difícil devido ao surgimento de cepas bacterianas multidroga resistente e da ocorrência de resistência entre as diferentes espécies de bactérias (10, 11). Em vista do exposto e aliado ao relato de que as formigas têm sido apontadas como vetores de infecções hospitalares (3, 12), este trabalho teve como objetivos identificar as bactérias veiculadas por formigas e determinar o perfil de resistência frente aos antimicrobianos usualmente utilizados no hospital onde se procedeu a coleta dos espécimes. Material e Métodos Amostragem A coleta das formigas foi realizada em seis setores de um hospital localizado na região sudeste do Estado de Minas Gerais no período de março de 2010. Swabs estéreis umedecidos em solução fisiológica foram utilizados para coletar as formigas individualmente. Foram coletadas 30 formigas, sendo cinco espécimes por setor, os quais compreenderam: UTI adulto, UTI neonatal, farmácia, pediatria, maternidade e enfermaria, locais onde a frequência de trilhas de formigas, no piso e/ou parede, era alta em relação a outros setores do hospital. Cada formiga foi mergulhada em caldo Brain Heart Infunsion (BHI - Difco, Sparks, MD, USA) estéril, distribuído em tubos, incubando-se em estufa a 35 °C por 24 horas (13). Ensaio microbiológico A partir dos tubos que apresentaram crescimento, foi realizada semeadura por esgotamento em placas contendo meios de cultura seletivos e diferenciais, seguindo-se incubação em estufa bacteriológica a 35 °C por 24 h. Os meios utilizados foram agar MacConkey, agar Manitol e agar Cetrimide (Difco). Após isolamento dos microrganismos, procedeu-se a coloração de Gram e de acordo com as características morfotintoriais realizou-se a identificação específica. As colônias foram submetidas a provas bioquímicas, objetivando-se a identificação de espécie. Para a identificação dos estafilococos coagulase-negativos, foram seguidos os critérios propostos por Kloos & Bannerman (14), conforme esquema simplificado de provas bioquímicas, os quais estabelecem a realização de testes de utilização de açúcares: xilose, arabinose, sacarose, trealose, manitol, maltose, lactose, xilitol, ribose e frutose, bem como caracterização de hemolisinas, redução de nitrato, urea­ se, ornitina decarboxilase e resistência a novobiocina. Para a identificação dos bacilos Gram-negativos fermentadores e não fermentadores de glicose utilizaram-se provas bioquímicas convencionais (15) e o sistema comercial BBL Crystal Identification 35 Alves GG et al. • Investigação. 2011;11:33-38 Systems Enteric/ Nonfermenters ID Kit (Becton e Dickinson, Sparks, MD, USA). fermaria. Na Tabela 1, estão relacionadas as espécies bacterianas isoladas das formigas segundo o local coletado. Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro Tabela 1 - Distribuição de espécies bacterianas quanto ao local de isolamento. O teste de sensibilidade às drogas antimicrobianas foi realizado pela técnica de difusão em agar, conforme critérios recomendados pelo Clinical and Laboratory Standards Institute – CLSI (16). O inóculo foi preparado em solução salina e a densidade da suspensão foi ajustada a 108 UFC/mL, comparando sua turvação com o padrão 0,5 da escala de MacFarland, e distribuído, utilizando-se swab estéril, na superfície de placas contendo agar Müeller-Hinton (Difco). Após a aposição dos discos, as placas foram invertidas e incubadas a 36 °C por 24 horas. Decorrido este período prosseguiu-se a análise das placas através da medida dos halos de inibição do crescimento do microrganismo frente à droga testada, segundo os critérios preconizados pelo CLSI (16). Frente às bactérias Gram-negativas, foram testados os antimicrobianos: ampicilina+sulbactam (10+10 µg), ciprofloxacina (5 µg), trimetoprim+sulfametoxazol (1,25 µg + 23,75 µg), aztreonam (30 µg), amicacina (30 µg) e ceftazidima (30 µg), levofloxacino (5 µg), imipenem (10 µg), cefotaxima (30 µg), piperacilina+tazobactam (100+10 µg), polimixina B (300 UI) e tobramicina (10 µg). Para as bactérias Gram-positivas, foram utilizados: oxacilina (1 µg), vancomicina (30 µg), clindamicina (2 µg), ciprofloxacina (5 µg), trimetoprim+sulfametoxazol (1,25 µg + 23,75 µg), eritromicina (15 µg), linezolida (30 µg), mupirocina (5 µg), teicoplanina (30 µg), penicilina (10 U), tetraciclina (30 µg) e gentamicina (10 µg). Todos os discos utilizados foram adquiridos do Centro de Controle e Produtos para Diagnóstico (CECON, São Paulo, Brasil). As cepas E. coli ATCC 25922 e P. aeruginosa ATCC 27853 foram usadas como controle. Resultados Foram coletadas cinco amostras de cada local avaliado, perfazendo o total de 30 amostras, sendo que 18 (60%) apresentaram crescimento de microrganismos. Isolaram-se 20 cepas bacterianas constituídas de cocos Gram-positivos (9/20 ou 45%) e bacilos Gram-negativos (11/20 ou 55%). A identificação bacteriana revelou serem os isolados constituídos por bacilos Gram-negativos, os quais eram constituídos por Flavimonas oryzihabitans (5/20), Pseudomonas aeruginosa (5/20) e Stenotrophomonas maltophilia (1/20) e cocos Gram-positivos classificados como Staphylococcus coagulase-negativa, os quais compreenderam: S. warneri (6/20), S. hyicus (1/20), S. haemolitycus (1/20) e S. saprophyticus (1/20). A espécie S. warneri predominou entre as bactérias Gram-positivas enquanto as espécies F. oryzihabitans e P. aeruginosa, equitativamente, entre as bactérias Gram-negativas. Quanto aos locais de coleta, na UTI neonatal foi onde se recuperou maior diversidade de isolados, ao passo que tanto na farmácia como na maternidade recuperou-se apenas um isolado microbiano de cada local. S. warneri, que representou 30% do total de isolados, foi recuperado na pediatria, UTI adulto e en- Setores hospitalares Farmácia UTI neonatal Pediatria Espécies isoladas Número de isolados Staphylococcus saprophyticus 01 Flavimonas oryzihabitans 03 Pseudomonas aeruginosa 03 Staphylococcus haemolyticus 01 Stenotrophomonas maltophilia 01 Staphylococcus warneri 02 Maternidade Pseudomonas aeruginosa 01 UTI adulto Staphylococcus warneri 02 Enfermaria Flavimonas oryzihabitans 01 Pseudomonas aeruginosa 01 Staphylococcus warneri 02 Staphylococcus hyicus 01 Flavimonas oryzihabitans 01 Quanto à resistência bacteriana aos antimicrobianos (Tabela 2 e 3), pode-se observar o perfil multidroga resistente de várias espécies, tanto entre cocos Gram-positivos quanto entre os bacilos Gram-negativos. As amostras coletadas na UTI adulto e UTI neonatal apresentaram uma maior quantidade de espécies bacterianas resistentes, contudo, amostras provenientes da pediatria e enfermaria também apresentaram resultados relevantes. Na Tabela 2 observa-se a percentagem de resistência (quantidade de espécie bacteriana resistente ao antimicrobiano testado por quantidade coletada da mesma espécie) das cepas de S. warneri a diversos antimicrobianos, dentre eles: eritromicina, oxacilina (meticilina), penicilina, tetraciclina, e algumas cepas resistentes a clindamicina. A cepa de S. haemolyticus isolada de uma amostra coletada na UTI neonatal apresentou resistência simultânea a eritromicina, gentamicina, oxacilina e penicilina. Dentre os bacilos Gram-negativos (Tabela 3) pode-se observar elevada percentagem de resistência das cepas de F. oryzihabitans a ampicilina+sulbactam, aztreonam, cefotaxima, ceftazidima e piperacilina+tazobactam. Discussão Formigas são insetos que caminham nas mais diversas superfícies, sendo considerados vetores potenciais de propagação bacteriana, fato descrito neste estudo e igualmente em estudos anteriores relatados por Pesquero et al. (6), Zarzuela et al. (7), Boursaux-Eude & Gross (8) e Campos-Farinha et al. (17). O resultado de 60% (18/30) de formigas portadoras de microrganismos, encontrado neste estudo, está em acordo com os relatos de Araújo et al. (18), que ao realizarem estudo semelhante, em uma maternidade pública da cidade de Recife, relataram que 54,5% 36 Alves GG et al. • Investigação. 2011;11:33-38 Tabela 2 - Distribuição da percentagem de resistência das cepas de Staphylococcus coagulase-negativos frente aos antimicrobianos testados. Espécies Bacterianas Antimicrobianos CIP CLI ERI GEN LIZ MUP OXA PEN SFT TEC TET VAN S. warneri 0 33 66 0 0 16 66 66 0 0 66 0 S. haemolyticus 0 0 100 100 0 0 100 100 0 0 0 0 S. saprophyticus 0 0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 S. hyicus 0 0 100 0 0 0 100 0 0 0 0 0 CIP: ciprofloxacino; CLI: clindamicina; ERI: eritromicina; GEN: gentamicina; LIZ: linezolida; MUP: mupirocina; OXA: oxacilina; PEN: penicilina; SFT: trimetoprim+sulfametoxazol; TEC: teicoplanina; TET: tetraciclina; VAN: vancomicina. Tabela 3 - Distribuição da percentagem de resistência (%) a antimicrobianos dos bacilos Gram-negativos isolados. Espécies Bacterianas Antimicrobianos AMI SBA ATM CTX CAZ CIP IPM LVX PPT POL SFT TOB F. oryzihabitans 0 100 100 100 100 P. aeruginosa 0 100 40 20 20 0 0 0 100 0 0 0 40 60 0 60 0 0 0 S. maltophilia - - - - - - - 0 - 0 0 - AMI: amicacina; SBA: ampicilina+sulbactam; ATM: aztreonam; CTX: cefotaxima; CAZ: ceftazidima; CIP: ciprofloxacino; IPM: imipenem; LVX: levofloxacino; PPT: piperacilina+tazobactam; POL: polimixina B; SFT: trimetropim+sulfametaxazol; TOB: tobramicina. - não testado para o microrganismo. das amostras analisadas apresentaram crescimento bacteriano. Apesar de todos os Staphylococcus sp. recuperados neste estudo serem sensíveis a vancomicina, encontrou-se grande percentual de cepas de Staphylococcus coagulase-negativa resistentes aos antibióticos, de rotina em uso hospitalar. Esses resultados são concordantes com os trabalhos de Mohan et al. (19), que ao avaliarem o perfil de sensibilidade de 192 cepas verificaram que 90% eram resistentes à penicilina; mais que 50%, à cefalexina e ciprofloxacina e 20%, à meticilina. Também os estudos de Turkyilmaz & Esklizmitliler (20), os quais avaliaram 90 cepas de Staphylococcus coagulase-negativa, relatam que o percentual de resistência contra penicilina, meticilina, ampicilina, e gentamicina foi 49.0%, 24.5%, 23.6%, e 13.6%, respectivamente. A literatura tem relatado aumento e emergência de cepas Staphylococcus coagulase-negativa resistentes a oxacilina, principalmente em hospitais (12, 21). O encontro também, na presente pesquisa, de cepas Staphylococcus coagulase-negativa resistentes a oxacilina (Tabela 2), são semelhantes aos encontros de Barberis et al. (22), que ao analisarem 120 cepas constituídas de S. epidermidis (21.6%), S. haemolyticus (40.0%), S. saprophyticus (33.4%) e S. simulans (5%) relatam que 48% destas eram resistentes à oxacilina. O encontro também, na presente pesquisa, de cepas Staphylococcus coagulase-negativa resistentes a eritromicina (Tabela 2), são concordantes com Bernardi et al. (23), que estudaram 27 cepas de Staphylococcus, das quais 4 eram de S. haemolyticus, sendo que 100% foram resistentes a eritromicina, gentamicina, penicilina G e 75,0% a oxacilina. A resistência aos macrolídeos em Staphylococcus sp. pode ser devido à modificação do alvo ribossomal, e pode ser ainda constitutiva ou induzida após a exposição a esta classe de antimicrobiano (24). O relato de bacilos Gram-negativos multidroga resistente encontrado neste estudo, são coerentes aos descritos por Moreira et al. (25), que avaliaram a resistência aos antimicrobianos de espécies bacterianas isoladas a partir de formigas em ambiente hospitalar e encontraram cepas multirresistentes tanto de bactérias Gram- -negativas (Acinetobacter, Gemella, Klebsiella) quanto de bactérias Gram-positivas (Enterococcus faecalis e Streptococcus sp.). Os gêneros Stenotrophomonas e Flavimonas constituem-se de microrganismos aeróbios, não esporulados e não fermentadores que apesar de produzirem infecções oportunistas em certas ocasiões, estão emergindo como importantes patógenos adquiridos no ambiente hospitalar (26). Segundo Morrison et al. (27), que estudaram o espectro de doenças clínicas em pacientes infectados por S. maltophilia adquirida em hospital, a taxa bruta de mortalidade era de 43% entre os pacientes em que o microrganismo fora isolado. Além disso, conforme relata Fernandes (2), em pacientes com câncer, este microrganismo também pode produzir enfermidades, nas quais se incluem pneumonia, bacteremia, endocardite, colangite, infecções do trato urinário, meningite e infecções graves de feridas. A espécie F. oryzihabitans também já foi isolada de uma variedade de amostras, tais como as de feridas, escarros, ouvido, olhos, urina, líquido peritoneal, equipamentos de terapia de inalação e sangue (28). A utilização de cateteres intravasculares permanentes, enxertos artificiais, uso abusivo de drogas endovenosas, traumatismos cranianos graves e transplante de medula óssea são fatores predisponentes para a infecção de F. oryzihabitans (26). Além disso, neste estudo, o encontro de P. aeruginosa resistente ao carbapenem sugere que a cepa pode ser produtora de metalo-betalactamase (MBL), enzima com atividade sobre vários Alves GG et al. • Investigação. 2011;11:33-38 betalactâmicos, incluindo cefamicinas e carbapenens, e ainda sobre os inibidores de betalactâmicos, como ácido clavulânico e sulbactam (29), embora seja uma das limitações desse trabalho, a indisponibilidade de detecção de tais enzimas, a qual utiliza como método padrão a técnica de amplificação do DNA com iniciadores específicos (30). São poucos os estudos com essa nova classe de betalactâmicos, na literatura nacional (31, 32, 33, 34) e internacional (35, 36) sendo que as primeiras amostras no Brasil foram isoladas a partir de Pseudomonas sp. no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro (32). Os carbapenens são antimicrobianos usados geralmente como drogas de reservas no tratamento de infecções causadas por bactérias Gram-negativas resistentes a outros agentes betalactâmicos, fato que restringe o uso de cefalosporinas e de carbapenens como medida de prevenção da disseminação de bactérias Gram-negativas do tipo P. aeruginosa com capacidade de produzir MBLs (33). Em conclusão, as formigas podem contribuir com o aumento do risco de infecções hospitalares, em decorrência da possibilidade de disseminação de cepas bacterianas multidroga resistente de um local para outro, porém seriam necessários novos estudos relacionando as espécies encontradas nos locais avaliados e o índice de contaminação pela mesma espécie bacteriana. O surgimento de novas resistências aos antimicrobianos de amplo espectro nos atenta cada vez mais a medidas profiláticas, sendo o controle de tais vetores uma atitude fundamental. (5) Beatson SH. Pharaoh’s ants as pathogen vectors in hospital. Lancet. 1972;1:425-7. (6) Pesquero MA, Elias-Filho J, Carneiro LC, Feitosa SB, Oliveira MAC, Quintana RC. Formigas em ambiente hospitalar e seu potencial como transmissoras de bactérias. Neotrop Entomol. 2008;37:472-7. (7) Zarzuela MFM, Ribeiro MCC, Campos-Farinha AEC. Distribuição de formigas urbanas em um hospital da Região Sudeste do Brasil. Biológico. 2002;69:85-7. 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Não houve conflitos de interesse de qualquer natureza, ou seja, econômicos, pessoais, científicos, assistenciais, educacionais, religiosos e sociais que possam ter interferido nos resultados da pesquisa. (14) Kloos WE, Bannerman TL. Staphylococcus and Micrococcus. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH, editors. Manual of clinical microbiology, 7th ed. Washington, D. C.: ASM Press; 1999. p. 264-82. Agradecimentos Os autores agradecem à equipe do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia Aplicada (LAPEMA) e à Universidade de Franca (UNIFRAN) a colaboração e apoio financeiro, respectivamente. Referências (1) Martins MA. Manual de infecção hospitalar: epidemiologia, prevenção e controle. 2. ed. Rio de Janeiro: Medsi; 2001, 1116 p. (2) Fernandes AT. Infecção hospitalar e suas interfaces na área da saúde. São Paulo: Atheneu; 2000, 2001 p. (3) Fontana R, Wetler RM, Aquino RSS, Andrioli JL, Queiroz GRG, Ferreira SL, et al. 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