determinação da diversidade genética em

DETERMINAÇÃO DA DIVERSIDADE GENÉTICA EM CULTIVARES DE ALGODOEIRO HERBÁCEO
POR MARCADORES MICROSSATÉLITES
Cândida H.C. de Magalhães Bertini1, Ivan Shuster(2), Tocio Sediyama(3), Everaldo Gonçalves de
Barros(4) , Maurílio Alves Moreira(5).(1) BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, 36.570-000 Viçosa,
MG; (2) COODETEC, Cx. Postal 301, 85.818-660 Cascavel, PR. (3) Departamento de Fitotecnia,
Universidade Federal de Viçosa, 36.570-000 Viçosa, MG; (4) BIOAGRO, Universidade Federal de
Viçosa, 36.570-000 Viçosa, MG; (5) BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, 36.570-000 Viçosa,
MG
RESUMO
O conhecimento da diversidade genética e a relação entre os materiais melhorados são de
grande importância para o melhoramento das culturas. Para se obter tais informações o presente
trabalho teve como objetivos: (1) estimar a informatividade dos locos SSR de algodão e (2) estimar a
distância genética entre 53 cultivares de algodoeiro herbáceo atualmente cultivados na América do Sul.
Foram usados 31 pares de primers de microssatélites que amplificaram 31 locos polimórficos, num total
de 66 alelos e média de 2,13 alelos por loco. O índice de diversidade (ID) calculado para estimar a
informatividade de cada primer variou de 0,18 a 0,62. O coeficiente de dissimilaridade variou de 0,00 a
0,71, com uma média de 0,40 ± 0,01. Através do método UPGMA observou-se no dendograma a
formação de 7 grupos e 28 subgrupos. Esses resultados são consistentes com as informações do
pedigree e genealogia obtidas para alguns cultivares. Nesse trabalho observou-se que a maioria das
cultivares obtidas nos programas de melhoramento é resultante de seleção dentro de cultivares de
sucesso. Os resultados revelaram o potencial dos marcadores microssatélites em estudos de
diversidade genética entre indivíduos da mesma espécie, uma base genética estreita entre os
cultivares de algodoeiro e a necessidade de se introduzir novos alelos no pool gênico dos algodoeiros
melhorados.
INTRODUÇÃO
O conhecimento relacionado à diversidade genética das espécies traz duas vantagens a um
programa de melhoramento. A primeira diz respeito à heterogeneidade genética que limita a
vulnerabilidade das espécies às pragas e doenças e a segunda está relacionada ao fornecimento de
um amplo suprimento de variação alélica que pode ser usada para criar novas combinações de genes
favoráveis. Muitas variedades de algodoeiro têm sido desenvolvidas a partir de cruzamentos entre pais
proximamente relacionados, mas o ganho de produção limitado tem levado à procura do uso mais
extensivo de germoplasma exótico. Apesar de os métodos de melhoramento terem aumentado a
eficiência na transferência da variação alélica das fontes de germoplasma para o pool gênico dos
algodoeiros melhorados, as fontes de germoplasma ainda permanecem subutilizadas (Van Esbroeck
and Bowman, 1998). Os marcadores moleculares possibilitam várias aplicações e análises genéticas
com grandes oportunidades de utilização no melhoramento genético. Esses marcadores apresentam
várias vantagens sobre os marcadores morfológicos, dentre elas, destaca-se o polimorfismo, a
independência entre os efeitos ambientais e o estádio fisiológico da planta. Desses marcadores, os
microssatélites, também denominados SSR (Simple Sequence Repeat), possibilitam ampla utilização
nos programas de melhoramento. A disponibilidade e abundância desses marcadores ao longo do
genoma do algodoeiro, sua natureza polimórfica, co-dominância e por serem baseados na reação em
cadeia da polimerase (PCR), os fazem bastante úteis em estudos de diversidade genética (Reddy et
al., 2001). Com o intuito de se ter um conhecimento mais aprofundado da diversidade genética de
algumas variedades de algodoeiro, o presente trabalho teve como objetivos: (1) estimar a
informatividade dos locos SSR de algodão e (2) estimar a distância genética entre 53 cultivares de
algodoeiro herbáceo atualmente cultivados na América do Sul.
MATERIAL E MÉTODOS
Para a determinação da diversidade genética foram usadas 53 variedades de algodoeiro
herbáceo, desenvolvidas e lançadas por instituições públicas e privadas do Brasil e países como
Argentina e Paraguai. A extração do DNA foi feita com base no protocolo descrito por McDonald et al.
(1994), com algumas modificações. Foram utilizados os “primers” microssatélites de algodão
disponibilizados pela Research Genetics. As reações foram realizadas em 15 µL de solução contendo
10 ng de DNA genômico, tampão 1X (10 mM de Tris-HCl, pH 8,3 e 50 mM de KCl), 2,5-3,0 mM de
MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 0,2 µM de cada primer e uma unidade de enzima Taq DNA polimerase. A
reação de PCR foi realizada em termociclador com um programa do tipo touch down. Os fragmentos
amplificados foram separados em gel desnaturante de poliacrilamida 7% contendo formamida e
visualizado sob luz ultravioleta, após serem corados com brometo de etídio. O índice de diversidade de
cada microssatélite foi obtido através da freqüência dos alelos utilizando a fórmula proposta por Weir
(1990). A distância genética foi calculada com base na matriz de dissimilaridade obtida a partir do
cálculo do complemento do coeficiente de coincidência simples (Cruz, 2001). Os métodos usados para
realizar a análise de agrupamento feita com base na matriz de dissimilaridade foram os do tipo
hierárquico aglomerativo, sendo estes o método do vizinho mais próximo, vizinho mais distante e
UPGMA. A eficiência do método de agrupamento foi avaliada através do coeficiente de correlação
cofenética, observando a concordância entre a matriz de dissimilaridade original e o dendograma.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
DIVERSIDADE ALÉLICA DOS MARCADORES SSR
Nesse trabalho 31 pares de primers amplificaram 31 locos polimórficos. Apesar de dois primers
(BNL 1694 e BNL 3408) terem amplificado dois locos cada, apenas um foi polimórfico. Liu et al. (2000a)
realizando um trabalho de mapeamento de marcadores SSR em algodão encontraram alguns primers
com esse mesmo comportamento, dentre eles o primer BNL 3408. Os primers amplificaram um total de
66 alelos com uma média de 2,13 alelos por loco. Resultado semelhante foi obtido por Gutiérrez et al.
(2002) que obtiveram uma média de dois alelos por loco SSR. Por outro lado Liu et al. (2000b)
encontraram uma média de 5 alelos por loco SSR. O índice de diversidade (ID) calculado para estimar
a informatividade de cada primer variou de 0,18 a 0,62 com uma média de 0,40. No trabalho realizado
por Liu et al. (2000b) o valor médio do PIC (equivalente ao ID) foi de 0,31. Os primers mais informativos
foram BNL 3257, BNL 3590, BNL 3408, BNL 2986, BNL 2921 e BNL 1694.
DISTÂNCIA GENÉTICA E DIVERSIDADE
O coeficiente de dissimilaridade usado para calcular a distância genética entre os 53 cultivares
avaliados a partir dos locos SSR variaram de 0,00 a 0,71, com uma média de 0,40 ± 0,01. A análise de
distribuição dos 1.378 pares de genótipos comparados (Figura 1) mostrou uma concentração dos
valores nas classes de 0,2-0,3 a 0,4-0,5. A distância genética mais alta (0,71) ocorreu entre as
cultivares IAC 20 e BRS Itaúba. Enquanto as distâncias mais baixas (0,00) ocorreram entre as
cultivares Sicala 3-2e ITA 90 e as cultivares Epamig 5 e CD 402. As correlações cofenéticas entre os
dados de dissimilaridade e as matrizes fenéticas obtidas pelos métodos UPGMA, vizinho mais distante
e vizinho mais próximo foram de 68%, 63% e 43%, respectivamente. Portanto, o método UPGMA
apresentou maior eficiência em representar as dissimilaridades entre os genótipos avaliados em
relação aos outros métodos. Através do dendograma (Figura 2) observou-se a formação de 7 grupos e
28 subgrupos. A formação de alguns grupos e subgrupos é consistente com as informações do
pedigree e genealogia obtidas para alguns cultivares. Segundo Carvalho (1999) pouca diversidade
genética é encontrada nas cultivares plantadas no Brasil. Grande parte delas descendem de apenas 3
origens diferentes, o que torna estreita a base genética dessas cultivares e pode torná-las vulneráveis à
ocorrência de doenças. Baixos valores de distância genética também foram encontrados por Multani e
Lion (1995) e Gutiérrez et al. (2002) usando marcadores SSR. Iqbal et al. (1997) também encontraram
uma elevada similaridade genética (0,82 a 0,93) entre 17 cultivares de G. hirsutum com base em
marcadores RAPD. A utilização de apenas alguns cultivares de sucesso e seu uso extensivo como
progenitores em programas de melhoramento têm limitado a diversidade genética (Van Esbroeck et al.,
1998). No presente trabalho observou-se que a maioria das cultivares obtidas nos programas de
melhoramento são resultantes de seleção dentro de cultivares de sucesso e que o outro método mais
adotado é o cruzamento entre cultivares e entre cultivares e linhagens. Van Esbroeck e Bowman (1998)
sugerem a existência de suficiente variação alélica, mutação ou recombinação entre os indivíduos
proximamente relacionados. O grande número de cultivares de sucesso obtidas através de reseleções
indica que uma pequena quantidade de recombinação resultou em uma variância genética suficiente
para se obter progresso genético dentro dos programas de melhoramento. Apesar dessa constatação
um grande esforço para introgredir um germoplasma mais diverso que não acarrete efeitos negativos
na produção, em cultivares já adaptados às regiões do País, pode oferecer maiores recompensas ao
melhoramento da cultura e reduzir a vulnerabilidade genética destas cultivares.
CONCLUSÕES
0,
8
7-
0,
7
0,
6-
0,
6
0,
5-
0,
5
0,
4-
0,
4
0,
3-
0,
3
0,
2-
0,
2
0,
1-
0,
0-
0,
1
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
0
Nº de pares de genótipo
Os resultados revelaram o potencial dos marcadores microssatélites em estudos de diversidade
genética entre indivíduos da mesma espécie, uma base genética estreita entre os cultivares de
algodoeiro e a necessidade de se introduzir novos alelos no pool gênico dos algodoeiros melhorados.
Coeficiente de dissimilaridade
Figura 1- Distribuição das distâncias genéticas calculadas para 1.378 pares de genótipos.
Unweighted pair-group average (UPGMA)
0,5
0,3
0,2
0,1
0,0
49.CD98-87
36.BRS96-227
30.BRS197
15.IAC23
32.BRSAroeira
52.CD98-383
18.IPR96
51.CD98-225
46.CD403
29.CNPAITA92
21.OroBlanco
53.CD98-440
19.GuazunchoII
44.CD401
43.IAN338
50.CD98-101
20.Cacique
16.IPR94
48.CD405
25.CNPA8H
47.CD404
17.IPR95
12.IAC20
45.CD402
40.Epamig5
38.Alva
41.Liça
26.CNPAP1
24.CNPA7H
42.MG/UFU
39.Redenção
14.IAC22
13.IAC21
11.IAC19
10.IAC17
5.BRSAntares
28.CNPAP3
27.CNPAP2
4.BRSFacual
9.FM986
3.ITA96
6.SATURNO
8.FM966
37.FETAGRI
31.BRSItaúba
35.BRS96-148
23.Fabrika
22.Makina
34.BRSSucupira
7.DeltaOpal
33.BRSIpê
2.ITA90
1.Sicala3-2
Distâncias genéticas
0,4
G1
G2
G3
G4
G5
G6
G7
Figura 2 – Dendograma construído com base nas medidas de dissimilaridade e usando o método das médias das
distâncias (UPGMA). Os grupos indicados abaixo da figura (G1, G2, G3, G4, G5, G6 e G7) foram obtidos considerando um
limite superior de 35% da distância genética (linha tracejada).
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