Determinação da taxa de fecundação cruzada natural e diversidade

Universidade Federal Do Piauí
Determinação da taxa de fecundação cruzada natural e diversidade
genética em feijão-fava por marcadores microssatélites
Josilane Souza da Penha
Dissertação apresentada à Universidade Federal do
Piauí como parte das exigências do Programa de Pósgraduação em Genética e Melhoramento para obtenção
do título de “Mestre”.
Teresina
2014
Josilane Souza da Penha
Bacharel em Ciências Biológicas
Determinação da taxa de fecundação cruzada natural e diversidade genética
em feijão-fava por marcadores microssatélites
Orientadora:
Profa. Dra. ÂNGELA CELIS DE ALMEIDA LOPES
Co-orientadora:
Profa. Dra. REGINA LUCIA FERREIRA GOMES
Dissertação apresentada à Universidade Federal do
Piauí como parte das exigências do Programa de Pósgraduação em Genética e Melhoramento para obtenção
do título de “Mestre”.
Teresina
2014
Determinação da taxa de fecundação cruzada natural e diversidade genética
em feijão-fava por marcadores microssatélites
Josilane Souza da Penha
Aprovada em _____/_____/_______
Comissão julgadora:
_______________________________________________________
Prof. Dr. Giancarlo Conde Xavier Oliveira – ESALQ/USP
_______________________________________________________
Prof. Dr. Fábio Barros Brito – CCN/UFPI
_______________________________________________________
Profa. Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes – CCA/UFPI
(Co-orientadora)
_______________________________________________________
Profa. Dra. Ângela Celis de Almeida Lopes – CCN/UFPI
(Orientadora)
Aos meus queridos pais João e Edinir por tudo que sou e tenho,
aos meus irmãos e ao meu namorado Ribamar pelo amor e
carinho e por estarem sempre presente.
Dedico
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela a vida, pela força e por não me deixar desanimar, permitindo concluir
mais essa etapa de minha vida;
À Universidade Federal do Piauí, pela oportunidade de realização do curso de
Mestrado em Genética e Melhoramento;
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa de estudos;
À Escola Superior de Agronomia Luis de Queiroz, em especial ao Laboratório de
Diversidade Genética e Melhoramento, pelo apoio técnico na realização das análises
moleculares;
À professora e orientadora Dra. Ângela Celis de Almeida Lopes, pela amizade,
preocupação, apoio e ensinamentos transmitidos, sempre pronta a ajudar;
À professora e co-orientadora Dra. Regina Lucia Ferreira Gomes, pelo apoio,
amizade e compreensão, servindo de exemplo a todos;
Ao professor Dr. José Baldin Pinheiro, pela paciência, incentivo e apoio durante o
treinamento na ESALQ, pela co-orientação;
Aos
professores
da
pós-graduação
em
Genética
e
Melhoramento
pelos
ensinamentos obtidos durante o mestrado;
A todos do Laboratório de Diversidade Genética e Melhoramento, principalmente a
Jaqueline Campos, Éllida Aguiar, Clesivan Pereira e Diane Rozzeto, pela amizade e
apoio durante a execução do meu trabalho;
À minha turma de mestrado, em especial a Rafael Almeida, Joseane Inácio,
Rosimere Xavier, Polyanna Bacelar e Carolline Pires, pela convivência e momentos
de estudos e também de diversão;
Ao meu namorado, José Ribamar, pela paciência, apoio, carinho e dedicação
desprendidos;
À minha família, em especial a meus pais Edinir e João e meus irmãos, pelo apoio e
amor e por estarem sempre torcendo por mim.
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................................... 6
ABSTRACT................................................................................................................. 7
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 8
2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 10
2.1. Espécie Phaseolus lunatus ............................................................................. 10
2.2. Origem e domesticação .................................................................................. 11
2.3. Recursos genéticos vegetais .......................................................................... 12
2.5. Sistema de reprodução em plantas................................................................. 13
2.6. Determinação da taxa de fecundação cruzada natural ................................... 15
2.4. Diversidade genética em populações de plantas ............................................ 16
2.7. Marcadores moleculares microssatélites ........................................................ 17
3. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 19
3.1. Material vegetal ............................................................................................... 19
3.2. Extração e quantificação do DNA ................................................................... 20
3.3. Amplificação dos locos microssatélites ........................................................... 21
3. 4. Análises dos dados ........................................................................................ 22
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 23
4.1 Taxa de fecundação cruzada natural em feijão-fava........................................ 23
4.2 Diversidade genética ........................................................................................ 24
5. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 29
6. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 30
6
RESUMO
PENHA, J. S. Determinação da taxa de fecundação cruzada natural e
diversidade genética em feijão-fava por marcadores microssatélites. 2014.
Dissertação – Mestrado em Genética e Melhoramento, Universidade Federal do
Piauí, 2014.
O feijão-fava (Phaseolus lunatus) pertence à família Fabaceae, uma das
maiores nas angiospermas. É uma importante fonte de alimento no país,
principalmente no nordeste onde seu consumo é maior. Para melhor aproveitamento
dos recursos genéticos em programas de melhoramento é de suma importância o
estudo do sistema reprodutivo e da diversidade genética da espécie. Assim, no
presente estudo objetivou-se estimar a taxa de fecundação cruzada natural e
estudar a diversidade genética em feijão-fava através de marcadores
microssatélites. Foram utilizados 14 acessos de feijão-fava para formar as
populações, com 12 progênies cada. No estudo da taxa de fecundação cruzada
foram obtidas taxas de cruzamentos multilocos (tm) de 0,381 e unilocos (ts) de 0,078,
mostrando uma taxa de cruzamento de 38,1%. A proporção de autofecundação (1 tm) foi de 61,9%, evidenciando um sistema de cruzamento misto com predominância
de autofecundação. A taxa de cruzamento entre indivíduos aparentados foi alta e
significativa (tm - ts = 0,303). A correlação multiloco de paternidade foi muito alta (rp(m)
= 0,889) mostrando que as progênies são constituídas principalmente por irmãoscompletos. O número médio de indivíduos polinizadores que efetivos por plantas
(Nep) foi muito baixo (1,12). O índice de fixação dos genótipos maternos (Fm) foi de
0,945 e mostra que a maior parte dos parentais foram produzidos por endogamia. A
partir das frequências alélicas foram determinados os parâmetros de diversidade
como número total de alelos (61), número de alelos por locos (A = 6,10),
porcentagem de locos polimórficos (P = 30%), heterozigosidade esperada (He =
0,60) e heterozigosidade observada (Ho = 0,077). Mostrando alta variabilidade
genética nessas populações. O índice de fixação (f) para as populações foi de 0,316. As estimativas de Cockerham (1969) foram obtidas ( ̂ = 0,880 e ̂p = 0,908) e
mostraram que 90,8% da diversidade genética se encontram entre as populações.
Os parâmetros de diversidade de Nei (1973) mostraram uma grande variabilidade
total (HT = 0,596), sendo distribuída uma pequena parte dentro das populações (H S =
0,058). Entre as populações a variabilidade foi maior (DST = 0,538), a proporção de
diferenciação entre as populações foi de 90,2% (GST = 0,902) do total. Assim, as
populações de feijão-fava estudadas apresentaram um sistema misto com
predomínio de autogamia e diversidade genética intra e interpopulacional.
Palavras-chave: Phaseolus lunatus, sistema de reprodução, variabilidade genética,
recursos genéticos vegetais.
7
ABSTRACT
PENHA, J. S. Determination of the rate of natural outcrossing and genetic
diversity in lima bean using microsatellite markers. 2014. Dissertation - Master in
Genetics and Breeding, Federal University of Piauí, 2014.
The lima bean (Phaseolus lunatus) belongs to the family Fabaceae, one of the
largest in the angiosperms. It is an important source of food in the country, especially
in the northeast where its consumption is higher. For better utilization of genetic
resources in breeding programs is of paramount importance to study the mating
system and genetic diversity of the species. Thus, the present study aimed to
estimate the rate of natural outcrossing and study the genetic diversity in lima bean
by microsatellite markers. Fourteen accessions of lima bean were used to form the
populations, with 12 progeny each. In the study of the rate of outcrossing, was
obtained rates crossing multilocus (tm) and 0.381 unilocos (ts) of 0.078, showing a
crossing rate of 38.1%. The proportion of selfing (1 - tm) was 61.9%, showing a mixed
system of mating with predominantly selfing. The outcrossing rate among related
individuals was high and significant (tm - ts = 0.303). The multilocus paternity
correlation was very high (rp(m) = 0.889) showing that families are composed primarily
of full-sib. The average number of individuals that effective pollinators for plants (N ep)
was very low (1.12). The fixation index of maternal genotype (F m) was 0,945 and
shows that the majority of parents were produced by inbreeding. From the allele
frequencies were determined the diversity and total number of alleles (61), number of
alleles per locus (A = 6.10), percentage of polymorphic loci (P = 30%), expected
heterozygosity (He = 0 60) and observed heterozygosity (Ho = 0.077). Presenting high
genetic variability in these populations. The fixation index (f) for the populations was 0.316. Estimates of Cockerham (1969) were obtained ( ̂ = 0.880 and ̂p = 0.908) and
showed that 90.8% of the genetic diversity found among populations. The
parameters of diversity of Nei (1973) showed a large total variability (H T = 0.596),
with a small portion distributed within populations (HS = 0.058). Variability among was
higher (DST = 0.538), the proportion of differentiation among populations was 90.2 %
(GST = 0.902) of the total. Thus, populations of lima bean studied showed a mixed
system with a predominance of autogamy and inter and intra genetic diversity.
Keywords: Phaseolus lunatus, mating system, genetic variability, plants genetics
resources.
8
1. INTRODUÇÃO
O feijão-fava pertence à espécie Phaseolus lunatus L., é também conhecida
com fava, feijão-lima, fava-belém e feijão sieva (GRIN, 2013). É uma das espécies
do gênero Phaseolus explorada comercialmente, sendo considerada mais tolerante
a seca, ao excesso de umidade e de calor, em relação ao feijão-comum (VIEIRA,
1992).
No Brasil, o feijão-fava é produzido principalmente no nordeste. Em 2011,
essa região teve uma produção de 4.455 toneladas de grãos secos, em uma área
plantada de 25.872 hectares, sendo colhidos 19.879 hectares. Os maiores estados
produtores foram Ceará, Pernambuco, Paraíba e Piauí. A produtividade média foi de
0,24 t. ha-1, destacando-se o Ceará com 0,27 t. ha-1, Pernambuco com 0,24 t. ha-1 e
Piauí com 0,15 t. ha-1 (IBGE, 2012). Sua baixa produtividade está associada
principalmente ao cultivo por pequenos produtores, geralmente em consórcio com
milho, mandioca e mamona e sem adoção de tecnologia que aumentem a
produtividade (SANTOS et al., 2002). Mesmo com sua importância no país, o feijãofava ainda tem sido pouco explorado por falta de informações, mostrando a
necessidade de mais estudos sobre melhoramento na espécie.
Em programas de melhoramento e conservação genética é fundamental a
determinação do sistema reprodutivo e o estudo da diversidade genética das
espécies para melhor aproveitamento dos recursos genéticos vegetais disponíveis.
Permitindo delinear estratégias para a seleção de genótipos superiores e determinar
o tamanho amostral para a conservação genética (BRESSAN, 2011). O sistema
reprodutivo e os mecanismos de dispersão de pólen e sementes desempenham um
papel importante na composição genéticas das populações, pois determinam a
forma como os genes são passados para outras gerações, influenciando a forma
como a diversidade genética se distribui entre e dentro das populações
(GOODWILLIE et al., 2005).
A diversidade genética se expressa pelas variações nas combinações alélicas
que ocorrem em conjuntos de indivíduos nas populações. Atuando sobre diversos
fatores como o sistema de reprodução, a segregação cromossômica e os fatores
evolutivos. Além isso, assegura às espécies um alto potencial adaptativo para
contrapor os efeitos do ambiente, como as mudanças climáticas, poluição e doenças
(TARAZI, 2009).
9
A caracterização da variabilidade genética nas diferentes espécies tem sido
bastante estudada. Os marcadores moleculares estão sendo cada vez mais usados
na determinação da diversidade genética. Esses marcadores revelam diferenças
genéticas em maior nível de detalhamento e sem as interferências causadas pelo
efeito ambiental (PEREIRA, 2010).
No presente estudo objetivou-se determinar a taxa de fecundação cruzada
natural e estudar a diversidade genética em feijão-fava através do uso de
marcadores moleculares microssatélites.
10
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Espécie Phaseolus lunatus
O feijão-fava pertence ao gênero Phaseolus, um dos maiores entre as
dicotiledôneas,
estando
classificado
na
divisão
Angiospermae,
classe
Dycotiledoneae, subclasse Rosidae, ordem Fabales, subordem Leguminoseae,
família Leguminosae (Fabaceae), subfamília Faboideae, tribo Phaseoleae e subtribo
Phaseolineae. A família Fabaceae tem distribuição mundial, com cerca de 650
gêneros e aproximadamente 18.000 espécies e está entre as maiores famílias das
angiospermas. Suas espécies são de grande interesse econômico, principalmente
para alimentação humana e adubação verde (SOUZA, 2008).
Dentre 40 tribos
pertencentes à família Fabaceae, a tribo Phaseoleae se destaca por possuí 75% das
leguminosas comercializadas mundialmente, tais como: feijão-comum (Phaseolus
vulgaris), soja (Glycine Max) e feijão-caupi (Vigna unguiculata) (BROUGHTON,
2003).
A espécie é dividida em duas subespécies: P. lunatus var. lunatus, que inclui
as populações domesticadas, e P. lunatus var. silvestre, que possui as populações
silvestres (BAUDET, 1977). Indivíduos silvestres são caracterizados com hábito de
crescimento indeterminado, período prolongado de floração e grande produção de
vagens (ZORO BI et al., 2003). Enquanto os indivíduos domesticados possuem
hábito de crescimento determinado e período de floração curto e uniforme.
O feijão-fava apresenta ciclo anual, bianual ou perene, germinação epígea e
hábito de crescimento indeterminado ou determinado (BEYRA; ARTILES, 2004).
Uma característica marcante que o distingue facilmente de outros feijões, são as
linhas que se irradiam do hilo para a região dorsal das sementes, mas em algumas
variedades essas linhas podem não ser tão facilmente observadas ou até ausentes
(VIEIRA, 1992).
Fenologicamente possui inflorescência composta, axilar e em cachos. É do
tipo hermafrodita, papilonácea, o cálice é gamossépalo, a corola apresenta pétalas
de cores variadas. O androceu é formado por dez estames diadelfos, as anteras são
bitecas, dorsifixas com deiscência longitudinal, ovário unilocular, apresentando 2 a 3
óvulos. A viabilidade polínica é considerada alta, com cerca de 90% de grãos de
pólen viáveis (LOPES; GOMES; ARAÚJO, 2010).
11
Na floração ocorre grande produção diária de muitas flores por planta, sendo
assim vantajosa, por aumentar a atratividade dos polinizadores devido a maior
disponibilização de néctar. Hardy (1997) observou a presença de abelhas (Apis
mellifera) como principal agente polinizador em feijão-fava. A presença desses
agentes polinizadores é um dos fatores que contribui para alteração das taxas de
cruzamentos naturais.
O feijão-fava tem sua grande importância dentro do gênero Phaseolus
juntamente com o feijão comum. Seu cultivo ocorre na América do Norte, América do
Sul, Europa, leste e oeste da África e sudeste da Ásia (BAUDOIN, 1988).
Seus grãos constituem-se uma importante fonte de alimento rica em proteínas
para a população em vários municípios nordestinos, juntamente com o feijão-caupi,
milho e mandioca (AZEVEDO et al., 2003). É considerado mais tolerante à seca, ao
excesso de umidade e ao calor, podendo ser consumido pelo homem sob a forma
de grãos verdes e secos, vagens verdes e folhas. Além disso, esta espécie também
pode ser utilizada na alimentação animal (VIEIRA, 1992).
2.2 Origem e domesticação
A provável origem da espécie é na Guatemala, por conter formas silvestres e
trepadeiras com sementes pequenas (VIEIRA, 1967). A ampla distribuição e a falta
de germoplasma silvestres de feijão-fava em muitas áreas de distribuição natural
tem dificultado a determinação dos centros de domesticação da espécie
(ANDRUEZA-NOH et al., 2013). Estudos feitos por Motta-Aldana et al. (2010) a partir
de DNA de cloroplasto de 109 acessos de feijão-fava apontaram para dois grandes
centros de domesticação: Andino, localizado no Equador e norte do Peru, que
possui
sementes
grandes
e
adaptado
a
elevadas altitudes e
o
centro
Mesoamericano, que se estende do centro-oeste do México a Honduras, com
sementes pequenas ocorrendo em altitudes mais baixas.
Serrano-Serrano et al. (2010) a partir de trabalhos feitos com DNA ribossomal
de 151 acessos selvagens e domesticados, propuseram
a existência de dois
conjuntos gênicos: Andino (AG) e mesoamericano (MA). Sendo que o conjunto
gênico mesoamericano possui dois grupos geneticamente e geograficamente
distintos (MI e MII). O AG ocorrendo no Equador e oeste e norte do Peru, o MI no
noroeste do Istmo de Tehuantepec, no México e o MII se estendendo do sul do
México, ao longo do Caribe e da América do Sul.
12
Outros trabalhos vêm confirmando essa hipótese, como o de Andrueza-Noh
et al. (2013), que ao estudarem 262 de acessos feijão-fava utilizando DNA de
cloroplasto, obtiveram resultados semelhantes, sugerindo múltiplos centros de
domesticação para a espécie. Outra espécie de grande importância com múltiplos
eventos de domesticação é o feijão-comum (P. vulgaris).
O processo de domesticação tem como principais características a perda dos
mecanismos de dispersão e dormência das sementes, que dificulta a disseminação
e sobrevivência em novos ambientes. Outras características são o hábito de
crescimento determinado e a ausência de fibras nas vagens, que leva a indeiscência
das vagens e falta de dispersão das sementes (BROUNGHTON et al., 2003).
2.3 Recursos genéticos vegetais
O estudo dos recursos genéticos e melhoramento vegetal tem dado grande
contribuição para a agricultura brasileira nas últimas décadas. O processo de
melhoramento genético é altamente dependente da base genética disponível
principalmente
nos
bancos
de
germoplasma,
que
são
a
base
para
o
desenvolvimento de cultivares (QUEIROZ; LOPES, 2007).
Os recursos genéticos vegetais referem-se à variabilidade de espécies de
plantas de uso atual ou com potencial para futura utilização em programas de
melhoramento, constituindo parte importante da biodiversidade e promovendo o
desenvolvimento da agricultura (PEREIRA; SILVA; PEREIRA, 2010). Servindo de
matéria-prima para o melhoramento genético, na busca por genótipos mais
adaptados a fim de atender às necessidades dos agricultores e do mercado atual
(NASS, 2007).
A conservação dos recursos genéticos vegetais engloba um conjunto de
atividades e políticas desenvolvidas para assegurar a existência e a contínua
disponibilidade de plantas para fins diversos (PEREIRA; SILVA; PEREIRA, 2010).
Estas atividades envolvem a coleta, documentação, conservação, caracterização,
avaliação e utilização do germoplasma (NICK et al., 2010).
A conservação ex situ é uma estratégia de conservação em longo prazo para
manter com máxima integridade genética e biológica, espécies cultivadas e
silvestres fora do seu ambiente natural. Estando incluída a conservação de coleções
de sementes, material vegetativo in vitro, DNA, pólen, coleções a campo, amostras
em casas de vegetação e em jardins botânicos. Outra forma de conservação é a in
13
situ que consisti na manutenção e recuperação de populações de espécies em seus
meios naturais (NASS, 2007).
A variabilidade genética disponível nas espécies é ampla e cada espécie
pode apresentar milhares de variantes. Assim, pode-se admitir que uma coleção de
germoplasma, por maior que seja, é apenas uma pequena amostra da variabilidade
total (ALLARD, 1970). No entanto, a conservação de germoplasma em bancos de
sementes tem mostrado um estreitamento da base genética pelo uso contínuo de
um pequeno conjunto de linhagens aparentadas, além da carência de informação
genética
sobre
os
acessos
conservados,
necessitando
de
uma
eficiente
caracterização e organização do material genético (FERREIRA; MORETZSOHN;
BUSO, 2007).
A caracterização da diversidade genética proporciona o melhor conhecimento
do germoplasma e é necessário para etapas posteriores de desenvolvimento de
materiais melhorados e estratégias de conservação das espécies. A diversidade
genética tem sido estudada através de análises fenotípicas e mensuração de
características agromorfológicas, além da variação a nível molecular (NASS, 2007).
2.5 Sistema de reprodução em plantas
As plantas são organismos sésseis, que desenvolveram estratégias para o
sucesso reprodutivo como flores e frutos capazes de atrair polinizadores e
dispersores de sementes, mantendo altos níveis de variação genética (BRESSAN,
2011). Assim, o modo de reprodução de uma espécie de planta determina como a
informação genética é passada de uma geração a outra (WRIGHT, 1921).
O conhecimento do modo de reprodução é necessário para o sucesso de um
programa de melhoramento, podendo poupar anos de insucesso na conduta de
trabalhos com germoplasma, além de fornecer informações de uso direto para o
melhoramento (VALLS, 2007).
O sistema reprodutivo refere-se à forma como um indivíduo, população ou
espécie transfere suas informações genéticas de uma geração para a outra,
podendo ser assexuado ou sexuado. Na reprodução assexuada não ocorre à
formação de gametas e os indivíduos se formam a partir de um organismo por
divisão mitótica, assim os descendentes possuem a mesma constituição genética
(BRESSAN, 2011).
14
Na reprodução sexuada, há formação de gametas diferentes que se fundem
gerando zigotos com constituição genética diferente. Em espécies sexuadas, o
sistema reprodutivo é classificado em: autógama, alógama e mista. Na autogamia
com flores hermafroditas autocompatíveis, ocorre a fusão de gametas masculinos e
femininos de uma mesma flor. Já a alogamia possui plantas hermafroditas, dioicas
(planta com sexo separado) e monoicas (flores com sexo separado em uma mesma
planta) que envolve o cruzamento de indivíduos diferentes, assim como a
transferência de pólen entre diferentes flores, podendo ser da mesma planta ou não
(GOODWILLIE et al., 2005). As espécies alógamas com flores hermafroditas
geralmente apresentam um sistema de autoincompatibilidade, o qual evita a
ocorrência de autofecundação (KALISZ; VOGLER; HANLEY, 2004). No sistema
misto, os dois processos anteriores ocorre com predominância de um deles
(GOODWILLIE et al., 2005).
Dentre estas formas de reprodução, a alogamia (polinização cruzada) é a
forma que mais gera rearranjo da diversidade genética, levando a infinitas
combinações, as quais servem de base para fatores evolutivos, determinando a
capacidade genética ao longo das gerações (RICHARDS, 1990). No entanto, a
autofecundação é comum em plantas, sendo 20% autógamas e 33% intermediários
entre autofecundação e cruzamento (sistema misto) (KALISZ; VOGLER; HANLEY,
2004).
Populações
de
espécie
predominantemente
autógama
apresentam
homozigose para a maioria dos locos, assim há homogeneidade dentro e entre
populações, o que leva a uma maior suscetibilidade a mudanças nas condições
ambientais (RICHARDS, 1997).
Como o sistema reprodutivo é muito importante para a determinação da
estrutura e da diversidade em populações naturais, espécies autógamas necessitam
de atenção especial, pois é preciso determinar o maior número de populações para
se obter e preservar a diversidade ao máximo (KARASAWA, 2005).
O estudo do sistema reprodutivo nas plantas permite estimar a taxa de
cruzamento entre indivíduos e determinar o modo de transmissão dos genes de uma
geração para outra, permitindo delinear estratégias que quantifiquem a variabilidade
genética e criando modelos genético-estatísticos apropriados para o manejo dos
recursos genéticos de uma espécie em programa de melhoramento e conservação
genética (HAMRICK; LOVELLESS, 1986).
15
O sistema reprodutivo pode ser avaliado através da observação dos
cruzamentos, comportamento dos agentes polinizadores e biologia floral e dos
resultados de experimentos de polinização controlada. Esses métodos fornecem
indicações sobre o sistema reprodutivo de uma espécie, porém não permitem uma
medida direta do sucesso reprodutivo das populações (PAIVA et al., 1994).
A avaliação do sistema reprodutivo também pode ser feita por marcadores
genéticos morfológicos. A metodologia utiliza um caráter monogênico, com herança
genética dominante, cujo fenótipo das duas classes seja de fácil distinção. Esta
forma de avaliação apresenta baixo custo de implantação, fácil manipulação
experimental e de análise dos dados. Porém é limitado a espécies de interesse
econômico, nas quais os marcadores morfológicos estão disponíveis (SILVA;
BANDEL; MARTINS, 2003).
O feijão-fava possui autocompatibilidade, com sistema reprodutivo misto que
é predominantemente autógama, mas apresenta níveis de cruzamento de até 48%
(BAUDOIN et al., 1998). Diferenças nas taxas de cruzamentos são atribuídas à
variação no tamanho da população, a densidade populacional, morfologia floral,
fenologia floral e disponibilidade de polinizadores (FAUSTO et al., 2001).
2.6 Determinação da taxa de fecundação cruzada natural
A taxa de fecundação cruzada natural de uma espécie é um importante
aspecto a ser considerado, a fim de estabelecer estratégias para a gestão e
conservação de germoplasma e melhoramento de plantas. Na sua determinação,
podem ser empregados modelos multilocos que possibilitam a obtenção de
estimativas mais adequadas, pois levam em consideração as combinações
genotípicas envolvendo todos os locos (CONTE, 2004).
Nesse sentido, o modelo proposto por Ritland e Jain (1981) vem sendo o mais
empregado ultimamente. Ele admite que as populações se reproduzem por
autofecundação a uma taxa s e por cruzamentos aleatórios a uma taxa t. As
pressuposições básicas para sua aplicação são: i) que o conjunto de pólen é
homogêneo para os cruzamentos como todos os genótipos maternos; (ii) que os
alelos de diferentes locos se segregam independentemente; (iii) que os locos não
são afetados pela seleção ou mutação entre evento reprodutivo e a análise
(RITLAND; JAIN, 1981; RITLAND, 1990). No entanto, violações da pressuposição de
homogeneidade das frequências alélicas de óvulos e do pólen têm pouco efeito
16
sobre a estimativa da taxa de cruzamento multilocos da população (tm) quando o
número de locos empregados nas estimativas for superior a quatro ou cinco locos
(RITLAND; JAIN, 1981).
O programa MLTR (Multilocus mating system program) desenvolvido por
Ritland (1990), baseado no modelo de cruzamento misto, fornece estimativas dos
seguintes parâmetros: a taxa de cruzamento multilocos da população (tm); a taxa de
cruzamento unilocos da população (ts); a taxa de cruzamento entre aparentados (tmts); correlação de autofecundação (rs); correlação multilocos de paternidade (rp(m)) e o
coeficiente de endogamia dos genótipos maternos (F(m)).
2.4 Diversidade genética em populações de plantas
A diversidade genética se refere a toda variação biológica hereditária
acumulada durante o processo evolutivo, gerada por mutação na sequência
nucleotídica. Quando esta variação ocorre entre indivíduos da mesma espécie,
chama-se de diversidade intraespecífica. Quando ela ocorre entre espécies, sendo
fixada em cada táxon, denomina-se diversidade interespecífica. As variações
genéticas intraespecíficas são estudadas quando procuramos entender as relações
entre indivíduos e populações de cada espécie, como grau de parentesco e fluxo
gênico. Já a diversidade entre espécies é estudada para compreender as relações
filogenéticas nos vários níveis taxonômicos ou caracterizar espécies por meio da
identificação de marcadores conservados que permitam sua diferenciação (SANTOS
et al., 2009).
Nos estudos de variabilidade genética em populações naturais devem ser
priorizadas a quantificação da variação existente e a caracterização dos níveis de
variabilidade das populações, devendo lembrar que, em espécies de plantas, os
fatores que influenciam na distribuição da variabilidade genética incluem o tamanho
efetivo da população, a distribuição geográfica da espécie, o modo de reprodução e
o mecanismo de dispersão de sementes (HAMRICK, 1982).
A variabilidade genética tem sido quantificada principalmente pelos números
de alelos por loco (A), percentagem de locos polimórficos (P), heterozigosidade
observada (Ho) e esperada (He) e índice de fixação (f) (HAMRICK, 1982). Segundo
Pinto (2001), em vários estudos para quantificar a variabilidade genética em
populações de plantas, o número de alelos por locos, a heterozigosidade esperada e
observada têm sido os parâmetros genéticos mais utilizados.
17
A determinação das frequências alélicas é de grande importância para os
estudos evolutivos, pois a mudança genética nas populações pode ser avaliada por
estas frequências (NEI, 1978). O número de alelos observado por locos aumenta em
decorrência do tamanho das amostras, assim amostras grandes possuem maior
chance de serem detectados alelos raros (ZUCCHI, 2002).
Segundo Weir e Basten (1990), a frequência de heterozigotos é um
importante indicador da diversidade genética, pois cada heterozigoto detém alelos
diferentes e, portanto, representa melhor a variação existente. No entanto, a
heterozigosidade esperada ou diversidade gênica é uma das medidas mais
apropriada por apresentar a variação tanto em populações de espécies autógamas
como alógamas (NEI, 1973).
A caracterização da estrutura genética entre populações a partir de marcadores
genéticos codominantes pode ser realizada pela metodologia de Nei (1977). A
análise da diversidade genética com base nessa metodologia é usada em locos
multialélicos e fornece a proporção da variabilidade genética contida entre e dentro
das populações e os níveis de heterozigosidade esperados. Tal medida pode ser
usada em qualquer população, independente do número de alelos por locos, sistema
reprodutivo e da atuação de processos evolutivos (seleção, migração, deriva e
mutação).
2.7 Marcadores moleculares microssatélites
Atualmente,
diversos
métodos
moleculares
de
caracterização
de
germoplasma vêm sendo desenvolvidos. Entre esses métodos, aqueles que revelam
polimorfismo de sequências de DNA, conhecidos como marcadores moleculares,
têm sido de grande importância para a análise de diversidade genética (FERREIRA;
MORETZSONH; BUSO, 2007).
Os marcadores moleculares são fragmentos de DNA que permitem a
distinção de indivíduos geneticamente diferentes. Seu número é ilimitado e são
desprovidos de efeito epistático ou pleiotrópico, não sofrem influência ambiental ou
gênica, além de possuir um número maior de locos quando comparados aos
marcadores fenotípicos (NASS, 2007).
Inúmeras aplicações têm sido identificadas para os marcadores moleculares,
se destacando o estudo da diversidade genética, construção de mapas genéticos e
mapeamento de características de interesse, caracterização de germoplasma,
18
seleção assistida, seleção em gerações precoces, estimar níveis de alogamia e
endogamia em uma espécie (NASS, 2007; BORÉM; MIRANDA, 2009).
Dentre os marcadores moleculares, os microssatélites se destacam por sua
eficiência. Também conhecidos como SSR (simple sequence repeats), são formados
por fragmentos de duas a seis bases repetidas denominadas tandem. Esses
seguimentos são bastante encontrados em eucariotos e por isso são muito usados
para diferenciá-los (BORÉM; MIRANDA, 2009). Eles consistem no uso de um par de
primers que se anela em sequências conservadas de DNA, flanqueando um
segmento de DNA repetitivo. Utilizando-se da PCR para amplificação dos
fragmentos que podem ocorrer aleatoriamente ao longo do genoma ou dentro de
genes, sendo específicos nesse caso (RAMALHO et al., 2012).
As sequências repetitivas são sequências de nucleotídeos que se repetem
inúmeras vezes lado a lado na fita de DNA. A técnica de SSR revela polimorfismo
em um loco devido a diferenças no número de vezes em que as sequências se
repetem no mesmo (FERREIRA; MORETZSONH; BUSO, 2007).
As variações encontradas nos microssatélites são devido a mutações, que
podem adicionar ou deletar pares de bases. Os mecanismos propostos para explicar
essas variações seriam o elevado número de permuta desigual e erros da DNA
polimerase durante a replicação. A importância dos microssatélites reside
principalmente na alta variabilidade encontrada (BORÉM; CAIXETA, 2009).
As vantagens dos SSRs são: a codominância, pois são mais informativos
para diferenciação de heterozigotos e homozigotos; o alto polimorfismo, sendo
importante para espécies com base genética estreita; a boa reprodutibilidade e
simplicidade da técnica e a pequena quantidade de DNA requerida devido à
utilização de PCR. A limitação dos SSRs está na necessidade de serem específicos
para cada espécie, não sendo utilizados como “primers universais”. Suas vantagens
fazem com que esses marcadores sejam ferramentas eficientes usados em
diferentes estudos e em várias espécies (BORÉM; CAIXETA, 2009).
Nos estudos com SSRs, a genotipagem convencional é realizada pela
visualização dos produtos da PCR em géis de agarose e/ou acrilamida corados com
brometo de etídio e nitrato de prata, respectivamente, levando em consideração a
presença
e
ausência
de
fragmentos
na
forma
de
bandas
(FERREIRA;
GRATTAPAGLIA, 1998). Os SSRs também podem ser marcados com uma
fluorescência na extremidade 5’ (MISSIAGRIA; GRATTAPAGLIA, 2006) de modo
19
que quando excitado por determinado comprimento de onda emite uma
luminescência. Essa absorção e reflexão de fluorescência permitem a visualização e
análise dos fragmentos obtidos em sequenciador automático (ALKCEVETCH, 2013).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material vegetal
O estudo foi realizado no Laboratório de Diversidade Genética e
Melhoramento, na Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ),
Universidade de São Paulo (USP), no ano de 2013.
Os acessos usados foram provenientes do Banco de Germoplasma de Feijãofava da Universidade Federal do Piauí. De um total de 156 acessos plantados em
campo, selecionou-se 14 plantas para formar as populações (Tabela 1). O critério de
seleção foi com base na diversidade genética e a disposição destas no campo,
escolhendo-se plantas equidistantes. De cada planta matriz foram usadas 12
progênies plantadas em vasos em casa de vegetação.
Tabela 1 - Identificação de acessos matrizes usadas na determinação da taxa de
fecundação cruzada e no estudo de diversidade genética em feijão-fava.
Populações
Acessos/Matrizes
Procedência
1
UFPI 252
Durnesia – MG
2
UFPI 267
Francinópolis – PI
3
UFPI 464
Tanque do Piauí – PI
4
UFPI 503
Colinas – MA
5
UFPI 537
6
UFPI 587
Paraíba
7
UFPI 596
Paraíba
8
UFPI 613
Paraíba
9
UFPI 627
Paraíba
10
UFPI 713
Piauí
11
UFPI 731
Ceará
12
UFPI 740
Ceará
13
UFPI 743
Ceará
14
UFPI 755
Ceará
20
O tecido vegetal foi colhido com aproximadamente 25 dias após a semeadura,
quando as primeiras folhas trifoliares estavam totalmente expandidas. As folhas
retiradas foram imediatamente imersas em nitrogênio líquido e depois liofilizadas por
48h (-50ºC, pressão de 0,04 mbar). Em seguida, o tecido foi moído em moinho
mecânico (MA048, MARCONI) e o tecido macerado acondicionado em tubo falcon e
armazenado em temperatura ambiente.
3.2 Extração e quantificação do DNA
A extração do DNA se deu a partir do material macerado liofilizado, por meio
do protocolo CTAB, descrito por Doyle e Doyle (1987). Para a extração foram
usados cerca de 30 mg de tecido foliar de cada subamostra, colocadas em
microtubos de 2 mL, que receberam 800 μL de tampão de extração CTAB (préaquecido a 65ºC) e foram fechados e agitados para ressuspender o tecido no
tampão. Em seguida, os tubos foram levados ao banho-maria (65ºC) por 60 minutos
e agitados manualmente por inversão a cada 10 minutos.
Após os tubos atingirem a temperatura ambiente, adicionou-se em cada tubo
800 μL de solução composta de clorofórmio e álcool isoamílico, na proporção de
24:1, sendo agitados por inversão até o ponto de homogeneidade da solução. A
etapa seguinte foi a centrifugação por 10 minutos a 10.000 rotações por minuto
(rpm), seguida da transferência do sobrenadante para novos tubos com a mesma
identificação dos primeiros. Depois, adicionou-se 500 μL de isopropanol gelado e
agitou-se os tubos novamente por inversão, levando-os ao freezer -20 °C por 60
minutos para ocorrer precipitação do DNA, após isso os tubos foram centrifugados
por 5 minutos a 10.000 rpm para descarte do sobrenadante ficando-se apenas com
o precipitado.
Em seguida, lavou-se o precipitado com 500 μL de etanol 70 % gelado,
invertendo os tubos levemente e levando-os à centrífuga por 5 minutos a 10.000
rpm, com posterior descarte do sobrenadante. O precipitado foi deixado à
temperatura ambiente por 12 horas (overnight) para evaporação do etanol. Após a
secagem, adicionou-se 100 μL de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0; 1mM de EDTA pH
8,0) deixando diluir por 12 horas. Posteriormente, adicionou-se 2 μL de RNAse (10
mg mL-1) e foram levados ao banho-maria a 37 °C por 4 horas e armazenados no
freezer em seguida.
21
A quantificação do DNA foi feita com eletroforese de gel de agarose a 0,8%
com Syber safe e comparados com diferentes concentrações de DNA padrão do
fago lambda. As amostras foram diluídas para a concentração final de 10 ng/μL.
3.3 Amplificação dos locos microssatélites
Foram usados 10 pares de primers (Tabela 2) desenvolvidos e otimizados
para feijão comum. (GAITÁN-SOLÍS et al., 2002).
Tabela 2 - Relação de primers usados na genotipagem de 168 amostras de feijãofava.
Nome
Sequências
Motivo
F: CATGCAGAGGAAGCAGAGTG
(GA)8GGTA(GA)5GGG
AG 1
R: GAGCGTCGTCGTTTCGAT
GACG(AG)4
F: TGCACAACACACATTTAGTGAC
BM 140
(GA)30
R: CCTACCAAGATTGATTTATGGG
F: TGAGGAGGAACAATGGTGGC
BM 141
(GA)29
R: CTCACAAACCACAACGCACC
F: GAGATGAGTCCTTTCCCTACCC
(CTGTTG)4(CTG)4
BM 146
R: TCGAGACACAATTTATGAAGGC
(TTG)3(CTG)3 (CTG)4
F: TCTTGCGACCGAGCTTCTCC
BM 154
(CT)17
R: CTGAATCTGAGGAACGATGACCAG
F: CTTGTTCCACCTCCCATCATAGC
BM 156
(CT)32
R: TGCTTGCATCTCAGCCAGAATC
F: CGTGCTTGGCGAATAGCTTTG
BM 160
(GA)15(GAA)5
R: CGCGGTTCTGATCGTGACTTC
F: ATACCCACATGCACAAGTTTGG
BM 211
(CT)16
R: CCACCATGTGCTCATGAAGAT
F: AGGAAGGGATCCAAAGTCACTC
BM 212
(CA)13
R: TGAACTTTCAGGTATTGATGAATGAAG
F: GAGTGCGGAAGCGAGTAGAG
GATS 91
(GA)17
R: TCCGTGTTCCTCTGTCTGTG
Os primers foram sintetizados com uma cauda M13 de plasmídio bacteriano
na extremidade 5’ do iniciador forward. As reações de amplificações foram feitas
com 10 ng de DNA, tampão 1X PCR, 2,0 mM de MgCl2, 250 μg/ml BSA, 2,0 μM de
dNTP, 1U de Taq, 0,2 μM de primer forward, 0,4 μM de primer reverse, 0,2 μM de
M13-IrDye 700 ou 800, completando com água para um volume final de 20 μL. As
amplificações feitas em termociclador LifePro (BIOER) utilizando desnaturação inicial
22
a 94 °C por 2 minutos, seguido de 45 ciclos de amplificações com 94 °C por 30 seg,
49 °C por 30 seg e 72 °C por 30 seg e extensão final a 72 °C por 10 minutos.
A genotipagem foi realizada em um sequenciador automático LI-COR 4300 DNA
Analyzer (Li-Cor, Biosciences), que utiliza tecnologia de fluorescência infravermelha.
A leitura dos dados foi feita com o auxílio do software SAGA GT (LI-COR,
Biosciences) para a identificação dos alelos em cada amostra.
3. 4 Análises dos dados
Foram estimados os dados de diversidade genética para os locos utilizados e
para as populações, tais como: número de alelos por locos, porcentagem de locos
polimórficos, heterozigosidade esperada e observada, índice de fixação e os
parâmetros de diversidade de Cockerham, obtidos com o auxílio do programa GDA
(Genetic Data Analysis) (LEWIS; ZAYKIN, 2000). As frequências alélicas e a
distribuição da diversidade genética entre e dentro das populações, verificada pela
estatística de Nei (1973), foram estimados utilizando o programa FSTAT (GOUDET,
2002).
A análise do sistema reprodutivo foi baseada no modelo misto de reprodução
(RITLAND; JAIN, 1981), através do programa “Multilocos MLTR” versão 3.2
(RITLAND, 2008). Os parâmetros estimados foram: a taxa de cruzamento multilocos
da população (tm), a taxa de cruzamento unilocos da população (ts), taxa de
cruzamento entre aparentados (tm- ts), correlação de autofecundação (rs); correlação
multilocos de paternidade (rp(m)), proporção de autofecundação (1 - tm), o número
médio de indivíduos polinizadores efetivos por plantas (Nep) e o coeficiente de
endogamia dos genótipos maternos (F(m)).
23
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Taxa de fecundação cruzada natural em feijão-fava
Na análise do sistema de fecundação cruzada em feijão-fava, as estimativas
das taxas de cruzamentos multiloco (tm) e uniloco (ts) foram, respectivamente, 0,381
e 0,078, evidenciando um sistema de cruzamento misto (t<0,95) com predominância
de autofecundação (Tabela 7). Zoro Bi; Maquet e Baudoin (2005), estudando dez
populações silvestres de feijão-fava através de marcadores isoenzimáticos,
encontraram variação nas taxas de cruzamentos multiloco (0,027 – 0,268) e uniloco
(0,024 – 0,246), mostrando uma taxa de cruzamento natural de 2,4% a 24,6%.
Resultados semelhantes foram descritos por Harding e Tucker (1969), que
estudaram cultivares a partir de marcadores morfológicos e obtiveram taxas de 3,2%
a 24,2%. A taxa de cruzamentos encontrada neste trabalho (38,1%) foi maior que os
relatados por esses autores. Assim, a proporção de autofecundação (1 - tm) é de
61,9%. O feijão-fava é uma espécie hermafrodita com estruturas reprodutivas que
facilitam a autofecundação. Segundo Baudoin (1998), os prováveis fatores
responsáveis pela alta taxa de cruzamento natural em feijão-fava são: a projeção do
estigma e do estilete para fora da quilha e a duração da receptividade do estigma
por muitas horas. Além disso, a presença de polinizadores e as condições
ambientais também contribuem para o aumento da fecundação cruzada.
A diferença entre a taxa de cruzamento multiloco e uniloco (tm - ts) têm sido
usada para quantificar a ocorrência de cruzamentos endogâmicos, em outros
termos, entre indivíduos aparentados. A diferença das taxas de cruzamento
multiloco e uniloco foi positiva (0,303), mostrando a ocorrência de 30,3% de
cruzamentos entre indivíduos aparentados. O cruzamento entre parentes aumenta a
endogamia nas populações, juntamente com a autofecundação. Zoro Bi; Maquet e
Baudoin (2005) encontraram diferenças entre as taxas de cruzamento multiloco e
uniloco (0,002 a 0,022) não significativas, indicando a ausência de cruzamentos
endogâmicos.
Os cruzamentos biparentais foram medidos pela correlação de paternidade
(rp(m)), que mede a probabilidade de dois indivíduos ao acaso terem o mesmo doador
de pólen, sendo de 0,889. Esse alto valor para correlação de paternidade indica que
grande parte das progênies são aparentadas. A partir da correlação de paternidade
é possível estimar o número médio de indivíduos polinizadores efetivos por plantas
24
(Nep), ou seja, a média dos indivíduos que contribuíram com pólen para uma planta
materna. O número de polinizadores foi extremamente baixo (1,12). O período de
florescimento diferenciado entre as matrizes pode ter levado a cruzamentos
preferenciais entre poucos indivíduos, onde plantas que floresceram juntas trocaram
mais pólen que outras.
A estimação da correlação de autofecundação (rs), que mede a probabilidade
de se encontrar dois indivíduos gerados por autofecundação juntos, foi baixa e
significativa (0,174), mostrando que os indivíduos advindos de autofecundação estão
distribuídos aleatoriamente nas progênies. O índice de fixação dos genótipos
maternos (Fm) foi de 0,945, essa alta taxa de Fm indica que a geração parental foi
produzida em grande parte por cruzamentos endogâmicos. Índice de fixação menor
foi encontrado por Zoro Bi; Maquet e Baudoin (2005) com F = 0,504.
Tabela 7 - Estimativas de parâmetros do sistema reprodutivo a partir de dez locos
microssatélites em 14 populações de feijão-fava.
Parâmetros
Estimativas (erro padrão)*
Taxa de cruzamento multilocos (tm)
0,381 (0,026)
Taxa de cruzamento unilocos (ts)
0,078 (0,013)
Taxa de cruzamento entre parentes (tm - ts)
0,303 (0,057)
Correlação de autofecundação (rs)
0,174 (0,111)
Correlação multilocos de paternidade (rp(m))
0,889 (0,221)
Número médio de polinizadores (Nep)
1,12
Índice de fixação das matrizes (Fm)
0,945 (0,026)
* estimado com 1.000 bootstraps.
4.2 Diversidade genética
Os dez locos de microssatélites usados se mostraram polimórficos. Perfis de
géis genotipados estão apresentados na Figura 1. Foram detectados 61 alelos, onde
o número de alelos por locos variou de quatro a dez, tendo uma média de 6,10. Os
locos que apresentaram o maior número de alelos foram BM212 e GATS19 (dez
alelos) e com o menor número foram AG1, BM146 e BM154 (quatro alelos). Entre as
populações, o número médio de alelos variou de 1,1 (populações 4, 13 e 14) a 1,8
(população 9) (Tabelas 3 e 4). Esses números mostram uma considerável riqueza
alélica nas populações estudadas, tendo em vista o sistema reprodutivo
predominantemente autógamo.
25
Figura 1. Perfil de géis correspondendo aos primers BM140, BM154 e BM160
genotipados no estudo de 14 populações de feijão-fava.
- Números ao lado indicam tamanho dos marcadores (bp). As setas mostram a posição dos
locos.
Valores alélicos semelhantes foram encontrados por Martínez-Castillo (2006),
que estudando 11 populações silvestres de feijão-fava a partir de oito locos
microssatélites obteve 59 alelos, que variam de quatro (BM160) a 16 (BM211)
alelos, com média de 7,38. Já Ouédraogo et al. (2005), usando 10 locos
microssatélites em nove populações, encontraram 25 alelos e uma média de 1,64 de
alelos por loco, sendo valores inferiores ao encontrado nesse estudo. Essas
diferenças encontradas podem estar relacionadas aos genótipos e locos usados.
A porcentagem de locos polimórficos (P) intrapopulacional variou de 10%
(populações 4, 13 e 14) a 60% (população 9), com média de 30%. Ouédraogo et al.
(2005), usando marcadores microssatélites em nove populações encontraram
polimorfismos de 20% a 80% e média de 48,89%.
A heterozigosidade esperada (He) ou índice de diversidade genética mostrou
valores altos para a maioria dos locos, variando de 0,167 (AG1) a 0,784 (GATS91)
com média de 0,60. As populações apresentaram valores de He entre 0,015
(população 13) a 0,120 (população 8), com média de 0,060. Martínez-Castillo et al.
(2006), estudando populações silvestres encontraram valor semelhante para a
média dos locos, He = 0,69. Esses valores mostram que há grande variabilidade
26
genética entre as populações estudadas. Altos valores como estes podem estar
relacionados ao conjunto gênico não-domesticado, pois populações domesticadas
de feijão-fava possuem baixos índices de diversidade genética (MARTÍNEZCASTILLO et al., 2008).
A heterozigosidade observada (Ho) para os locos variou de 0,024 (BM211) a
0,292 (BM160), com média de 0,077. Ouédraogo e Baudoin (2002), usando quatro
locos microssatélites em dez populações, reportaram a Ho = 0,031, valores estes
inferiores ao encontrado aqui. Já Martínez-Castillo et al. (2006) encontraram valor
muito superior, Ho = 0,67, em populações silvestres.
Tabela 3 - Parâmetros de diversidade genética por locos, número de alelos por loco
(A), heterozigosidade esperada (He) e heterozigosidade observada (Ho),
avaliados em dez locos microssatélites em 14 populações de feijão-fava.
Locos
A
He
Ho
AG1
4
0,166
0,071
BM140
5
0,713
0,065
BM141
6
0,745
0,048
BM146
4
0,686
0,065
BM154
4
0,524
0,065
BM156
7
0,619
0,042
BM160
5
0,417
0,292
BM211
6
0,680
0,024
BM212
10
0,642
0,053
GATS19
10
0,784
0,042
Média
6,1
0,600
0,077
A nível de população a heterozigosidade observada (Ho) ficou entre 0,016
(população 13) e 0,20 (população 8), com média de 0,077. A H o foi maior que a He
dentro das populações, mostrando uma tendência a heterozigose em relação ao
Equilíbrio de Hardy-Weinberg.
O índice de fixação (f) para as diferentes populações mostrou-se negativo
(média = -0,316), com exceção da população três, com f=0. Isso mostra um baixo
coeficiente de endogamia dentro das populações e sugerindo uma seleção para
heterozigotos, decorrente da taxa de fecundação cruzada observada nas progênies.
Martínez-Castillo et al. (2006) usando marcadores SSR em 11 populações silvestres,
encontraram valor semelhante (-0,31).
27
Tabela 4 - Parâmetros de diversidade genética por populações, número médio de
alelos por loco (A), porcentagem de locos polimórficos (P),
heterozigosidade esperada (He), heterozigosidade observada (Ho) e índice
de fixação (f), avaliados em 10 locos microssatélites em 14 populações de
feijão-fava.
Populações
A
P(%)
He
Ho
f
1
1,40
30
0,095
0,141
-0,527
2
1,50
30
0,048
0,050
-0,312
3
1,30
30
0,025
0,025
0,000
4
1,10
10
0,029
0,033
-0,158
5
1,60
50
0,110
0,158
-0,467
6
1,30
30
0,032
0,033
-0,023
7
1,40
40
0,077
0,125
-0.667
8
1,40
30
0,120
0,200
-0,714
9
1,80
60
0,088
0,092
-0,043
10
1,40
20
0,053
0,058
-0,092
11
1,20
20
0,031
0,033
-0,047
12
1,50
50
0,078
0,083
-0,068
13
1,10
10
0,015
0,016
-0.048
14
1,10
10
0,022
0,025
-0,100
Média
1,36
30
0,060
0,077
-0.316
No estudo da distribuição da variabilidade genética dentro e entre populações,
foram
determinados
os
coeficientes
de
coancestralidade
do
Cockerham
(COCKERHAM, 1969), no qual ̂ é o índice de fixação médio dentro das populações,
̂ é o índice de fixação para o conjunto das populações, ̂p é a divergência genética
entre populações (Tabela 5). A estimativa da endogamia para o conjunto das
populações ( ̂ = 0,880) foi alta para a espécie. A estimativa de endogamia média
dentro das populações ̂ mostra alta heterozigose (-0,316). A divergência genética
entre populações ( ̂p) foi alta (0,908), isto significa que 90,8% da variabilidade
genética encontra-se entre as populações e 9,2% dentro das populações.
Com relação aos parâmetros de diversidade genética de Nei (1973), foi
verificada a existência de grande variabilidade para o total dos acessos analisados
(HT = 0,596), sendo uma pequena parte atribuída à diversidade interpopulacional (HS
= 0,058). A diversidade entre as populações (DST) correspondeu a 0,538 (Tabela 6).
Ouédraogo e Baudoin (2002) usando quatro locos microssatélites em 10 populações
encontraram HT = 0,489, HS = 0,215 e DST = 0,273, mostrando um equilíbrio na
distribuição da diversidade total entre e dentro das populações por eles estudadas.
28
Do total de diversidade genética encontrada, 90,2% ocorrem devido à
diferenciação genética entre as populações (GST = 0,902). Os valores de diversidade
(HS, DST e GST) encontrados neste trabalho estão em conformidade com o sistema
predominantemente autógamo da espécie, que leva a pouca diversidade genética
dentro das populações (HS baixo) e altos valores (DST e GST) entre elas. Resultados
diferentes foram encontrados por Martínez-Castillo et al. (2007) e Ouédraogo e
Baudoin (2002) que obtiveram valores de GST = 0,470 e 0,303, respectivamente.
Tabela 5 - Coeficientes de coancestralidade de Cockerham: índice de fixação médio
dentro das populações ( ̂), índice de fixação para o conjunto das
populações ( ̂ ) e divergência genética entre as populações ( ̂ p), em 14
populações de feijão-fava.
Estimativas [I. C. 95%]
Parâmetros
̂
̂
̂p
- 0,316 [- 0,052 a -0,587]
0.880 [0,770 a 0,936]
0,908 [0,852 a 0,942]
Tabela 6 - Parâmetros de diversidade genética de Nei (1973): diversidade
intrapopulacional (Hs), diversidade total (HT), diversidade entre as
populações (DST) e proporção da diversidade genética entre as
populações (GST), avaliados de dez locos microssatélites, em 14
populações de feijão-fava.
Locos
AG1
BM140
BM141
BM146
BM154
BM156
BM160
BM211
BM212
GATS19
Média
Hs
0,065
0,063
0,043
0,042
0,060
0,040
0,155
0,023
0,052
0,040
0,058
HT
0,165
0,712
0,743
0,684
0,524
0,618
0,416
0,679
0,641
0,782
0,538
DST
0,100
0,649
0,700
0,642
0,463
0,577
0,261
0,655
0,588
0,742
0,538
GST
0,606
0,911
0,942
0,939
0,885
0,935
0,628
0,966
0,918
0,948
0,902
29
5 CONCLUSÕES
Os dez locos microssatélites foram polimórficos e mostraram ampla
diversidade genética entre os acessos de feijão-fava.
O feijão-fava apresentou taxa de 38,1% de cruzamento natural, indicando um
sistema misto com predomínio de autofecundação.
A diversidade genética teve baixo valor dentro das populações, sendo que
90,2% da diversidade total ocorreu entre elas.
30
6 REFERÊNCIAS
ALEKCEVETCH, J. C. Estudo da diversidade genética, por meio de marcadores
moleculares de uma população de Coffea canephora var. Conilon. 2013. 92 p.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Lavras.
ALLARD, R. W. Princípios do melhoramento genético das plantas. São Paulo:
Edgard Blucher, 1970. 381 p.
ANDRUEZA-NOH, R. H.; SERRANO-SERRANO, M. L.; CHACÓN SÁNCHEZ, M. I.;
SANCHÉZ DEL PINO, I.; CAMACHO-PÉREZ, L.; COELLO-COELLO, J. MIJANGOS
CORTE, J.; DEBOUCK, D. G.; MARTÍNEZ-CASTILO, J. Multiple domestications of
the Mesoamerican gene pool of lima bean (Phaseolus lunatus L.): evidence from
chloroplast DNA sequences. Genetic Resources Crop Evolution, v.60, p.10691086, 2013.
AZEVEDO, J. N.; FRANCO, L. J. D.; ARAÚJO, R. O. C. Composição química de
sete variedades de feijão-fava. Teresina, 2003. 4p. (Embrapa Meio-Norte:
Comunicado Técnico, 152).
BAUDET, J. C. The taxonomic status of the cultivated types of lima bean (Phaseolus
lunatus L.). Tropical Grain Legume, Ibadan, v.7, p.29–30, 1977.
BAUDOIN, J. P. Genetic resources, domestication and evolution of lima bean,
Phaseolus lunatus. In: GEPTS, P. (Ed.). Genetic resources of Phaseolus bean.
Amsterdam: Kluwer Academic Publishers, p.393-407, 1988.
BEYRA, A.; ARTILES, G. R. Revisión taxonômica de los gêneros Phaseolus y Vigna
(Leguminosae – Papilionoideae) en Cuba. Anales Del Jardín Botánico de Madrid,
v.61, n.2, p.135-154, 2004.
BORÉM, A.; CAIXETA, E.T. Marcadores moleculares. Viçosa: Editora UFV, 2009.
BORÉM, A.; MIRANDA, G. V. Melhoramento de plantas. 5. ed. Viçosa: UFV, 2009,
525p.
BRESSAN, E. A. Variabilidade genética e estimação da taxa de cruzamento do
pinhão manso empregando marcadores moleculares. 2011. 208 p. Tese
(Doutorado em Ciências). Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de
São Paulo.
31
BROUGHTON, W.J.; HERNÁNDEZ, G.; BLAIR, M.; BEEBE, S.; GEPTS, P.;
VANDERLEYDEN, J. Beans (Phaseolus spp.) - model food legumes. Plant and soil.
v.252, n.1, p.55-128, 2003.
COCKERHAM, C. C. Variance of gene frequencies. Evolution, Lancaster, v.23,
p.72-84, 1969.
CONTE, R. Estrutura genética de populações de Esterpe edulis Mart. submetida a
ação antrópica utilizando marcadores alozímicos e microssatélites. 2004. 124p. Tese
(doutorado) – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São
Paulo.
DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v.12,
p.13-15, 1987.
FAUSTO, J. A.; ECKHART, V. M.; GEBER, M. A. Reproductive assurance and the
evolutionary ecology of self-pollination in Calrkia xantiana. American Journal of
Botany, v.88, p.1794-1800, 2001.
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores
moleculares em análise genética. Brasília: Embrapa- CENARGEN, 1998. 220p.
FERREIRA, M. E.; MORETZSOHN, M. C.; BUSO, G. S. C. Fundamentos de
caracterização molecular de germoplasma vegetal. In: NASS, L. L. (Ed.). Recursos
genéticos vegetais. Brasília, DF: Embrapa Recursos genéticos e Biotecnologia,
2007. p.379-420.
GAITÁN-SOLÍS, E.; DUQUE, M.C.; EDWARDS, K.J.; TOHME, J. Microsatellite
repeats in common bean (Phaseolus vulgaris L.): isolation, characterization, and
cross-species amplification in Phaseolus ssp. Crop Science, v.42, n.6, p.2128-2136,
2002.
GOODWILLIE, C.; KALISZ, S; ECKERT, C. G. The evolutionary enigma of mixed
mating systems in plants: occurrence, theoretical explanations, and empirical
evidence. Annual Review of Ecology, Evolution and Systematics. Palo Alto, v.36,
p.47-79, 2005
GOUDET, J. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and
fixation indices (version 2.9.3.2). Lausanne, Université de Lausanne, 2002.
32
Disponível
em:
http://www.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm.
Acessado
em:
22/12/2013.
GRIN - Germplasm Resources Information Network. National Germplasm
Resources Laboratory, Beltsville, Maryland. Disponível em: <http://www.arsgrin.gov/cgi-bin/npgs/html/tax_search.pl?language=pt>. 10 dezembro de 2013.
HAMRICK, J. L. Plant population genetics and evolution. American Journal of
Botany, v.69, n.10, p.1685-1693, 1982.
HAMRICK, J. L.; LOVELESS, M. D. Isozyme variation in tropical trees; procedures
and preliminary results. Biotropica. Washington, DC, v.8, p.201-207, 1986.
HARDY, O.; S. DUBOIS; ZORO BI; I.; BAUDOIN, J. P. Gene dispersal and its
consequences on the genetic structure of wild populations of Lima bean (Phaseolus
lunatus) in Costa Rica. Plant Genetic Resources Newsletter, v.109, p.1–6, 1997
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. Banco de dados
agregados: produção agrícola municipal. Rio de Janeiro, 2012. Disponível em:
<http://www.sidra.ibge.gov.br./bda/tabela/listabl.asp?c=1612&z=p&o=23>.
Acesso
em: 12 de dezembro de 2013.
KALISZ, S.; VOGLER,. D, W.; HANLEY, K. M. Context-dependent autonomous selffertilization yields reproductive assurance and mixed mating. Nature. London, v.430,
p.884-887, 2004.
KARASAWA, M. M. G. Análise da estrutura genética de populações e sistema
reprodutivo de Oryza glumaepatula por meio de microssatélites. 2005. 91 p.
Tese (doutorado) – Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de
São Paulo.
LEWIS, P.; ZAYKIN, D. Genetic Data Analysis: computer program for the analysis of
allelic
data
(software).
Version
1.0,
2000.
http://www.eeb.uconn.edu/people/plewis/software.php. Acesso em: 27/12/2013.
LOPES, A. C. A.; GOMES, R. L. F.; ARAÚJO, A. S. F. (org.). A cultura do feijãofava no Meio-Norte do Brasil. Teresina: EDUFPI, 2010. 272 p.
MARTÍNEZ-CASTILLO, J.; COLUNGA-GARCÍAMARÍN, P.; ZIZUMBO-VILLARREAL,
D. Genetic erosion and in situ conservation of Lima bean (Phaseolus lunatus L.)
33
landraces in its Mesoamerican diversity center. Genetic Resources and Crop
Evolution, v.55, n.7, p.1065-1077, 2008.
MARTINEZ-CASTILLO, J.; ZIZUMBO-VILLARREAL, D.; GEPTS, P.; COLUNGAGARCÍAMARÍN, P. Gene Flow and Genetic Struture in the Wild-Weedydomesticated Complex of Phaseolus lunatus L. in it Mesoamerican Center of
Domestication and Diversity. Crop Science, v.47, p.58-66, 2007.
MARTINEZ-CASTILLO, J.; ZIZUMBO-VILLARREAL, D.; GEPTS, P.; DELGADOVALERIO, P.; COLUNGA-GARCÍAMARÍN, P. Structure and genetic diversity of wild
population of lima bean (Phaseolus lunatus L.) from the Yucatan Peninsula, Mexico.
Crop Science, v.46, p.1071-1080, 2006.
MAQUET, A.; ZORO BI, I.; DELVAUX, M.; WATHELET, B.; BAUDOIN, J. P. Genetic
structure of a Lima bean base collection using allozyme markers. Theoretical and
Applied Genetics, v.95, p.980-991, 1997.
MISSIAGGIA, A; GRATTAPAGLIA, D. Plant microsatellite genotyping with 4-colour
fluorescent detection using multiple-tailed primers. Genetics and Molecular
Research, v.5, p.72-78, 2006.
MOTTA-ALDANA , J.; SERRANO-SERRANO, M. L.; TORRES, H. J.; VILLAMIZAR,
C. G.; DEBOUCK, G. D.; CHACÓN, M. I. Multiple origins of lima bean landraces in
the Americas: evidence from chloroplast and nuclear DNA polymorphisms. Crop
Science, v.50, p.1773–1787, 2010.
NASS, L. L. Recursos genéticos vegetais. Brasília – DF: Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia, 2007. 858 p.
NEI, M. Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceding of the
National Academy of Sciences of the USA, v.70, n.12, p.3321-3323, 1973.
NEI, M. F-statistics ande analysis of gene diversity in subdivided population. Annals
of Human Genetics, v.41, p.225-233, 1977.
NEI, M. Estimation of average heterozigosity and genetic distance from a small
number of individuals. Genetics, v.89, p.583-590, 1978.
NICK, C.; SILVA, D. J. H.; MATTEDI, A. P.; PEDROSA, D. A. Conservação ex situ
dos recursos fitogenéticos. In: PEREIRA, T. N. S. Germoplasma: Conservação,
manejo e uso no melhoramento de plantas. Viçosa, MG: Arca, 2010.
34
OUÉDRAOGO, M.; BAUDOIN, J. P. Comparative analysis of genetic structure and
diversity in wild Lima bean populations from the Central Valley of Costa Rica, using
microsatellite and isozyme markers. Annual Report of the Bean Improvement
Cooperative, v.45, p.240–241, 2002.
OUÉDRAOGO, M.; MAQUET, A.; BAUDOIN, J. P. Étude comparative de la diversité
et de la structure génétique de populations sauvages de Phaseolus lunatus L. à
l’aide des marqueurs enzymatiques et microsatellites. Biotechnologie, Agronomie,
Société et Environnement, v.9, p.195-205, 2005.
PAIVA, J. R.; KAGEYAMA, P. Y.; VENCOVSKY, R. Genetic of rubber tree (Hevea
brasiliensis (Willd. Ex. Adr.) Mueller Arg.). 2. Mating system. Silvae Genetica,
Frankfurt. v. 43, p. 373-376, 1994.
PEREIRA, T. N. S. Germoplasma: Conservação, manejo e uso no melhoramento
de plantas. Viçosa, MG: Arca, 2010.
PEREIRA, M. P.; SILVA, F. F.; PEREIRA, T. N. S. Recursos genéticos vegetais e o
melhoramento de plantas. In: PEREIRA, T. N. S. Germoplasma: Conservação,
manejo e uso no melhoramento de plantas. Viçosa, MG: Arca, 2010.
PINTO, L. R. Análise da estrutura genética das populações de milho (Zea mays
L.) BR 105 e BR 106 e respectivos sintéticos por meio de microssatélites. 2001.
142 p. Tese (Doutorado) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo.
QUEIROZ, M. A.; LOPES, M. A. Importância dos recursos genéticos vegetais para o
agronegócio. In: NASS, L. L. (Ed.) Recursos genéticos vegetais. Brasília, DF:
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2007. p.61-119.
RAMALHO, M. A. P.; SANTOS, J. B.; ABREU, A. F. B.; NUNES, J. A. R. Aplicações
de genética quantitativa no melhoramento de plantas autógamas. 1. Ed. Lavras:
Editora UFLA, 2012. 522 p.
RICHARDS, A. J. Plant breeding systems. 2n ed. London: Chapman; Hall. 1990.
529 p.
RITLAND, K. A series of FORTRAN computed programs for estimating plant mating
systems. Journal of Heredity, v.81, n.3, p.235-237, 1990.
35
RITLAND, K. Multilocus mating system program MLTR (Software). Version 3.2,
2008. http://genetics.forestry.ubc.ca/ritland/programs.html. Acesso em: 27/12/2013.
RITLAND, K.; JAIN, S. K. A model for the estimation of outcrossing rate and gene
frequencies using independent loci. Heredity, v.47, p.35-52, 1981.
SANTOS, D.; CORLETT, F. M. F.; MENDES, J. E. M. F.; WANDERLEY JÚNIOR, J.
S. A. Produtividade e morfologia de vagens e sementes de variedades de fava no
Estado da Paraíba. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.37, n.10, p.1407-1412,
2002.
SANTOS, F. R.; FONSECA, C G.; SOUZA, E. C.; BORBA, E. L.; DERGAM, J. A.;
LOVATO, M. B. Diversidade Genética. IN: Biota Minas: diagnóstico do
conhecimento sobre a biodiversidade no Estado de Minas Gerais. (ed) Gláucia
Moreira Drummond. Belo Horizonte: Fundação Biodiversitas, 2009.
SERRANO-SERRANO,
M.L.,
J.
HERNANDEZ-TORRES,
G.
CASTILLO-
VILLAMIZAR, D.G. DEBOUCK, AND M.I. CHACONS. Gene pools in wild Lima bean
(Phaseolus lunatus L.) from the Americas: Evidences for an Andean origin and past
migrations. Molecular phylogenetics and Evolution, v.54, p.76–87, 2010.
SILVA, R. M.; BANDEL, G.; MARTINS, P. S. Mating system in na experimental
garden composed of cassava (Manihot esculenta Crantz) ehnnovarietiens.
Euphytica, Wageningen, v.134, p.127-135, 2003.
SOUZA, V. C. Botânica sistemática: guia ilustrado para identificação das famílias
de fanerógamas nativas e exóticas no Brasil, baseado em APG II. In: SOUZA, V. C.,
LORENZI, H. 2. ed. Nova Odessa, SP: Instituto Plantarum, 2008.
TARAZI, R. Diversidade genética , estrutura genética espacial, sistema de
reproduçaõe fluxo gênico em uma população de Copaifera langsdorffii no
cerrado. 2009. 139 p. Tese (Doutorado). Escola Superior de Agricultura “Luiz de
Queiroz”, São Paulo, 2009.
VALLS, J. F. M. Caracterização de recursos genéticos vegetais. In: NASS, L. L.
Recursos genéticos vegetais. Brasília – DF: Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, p.281-342, 2007.
VIEIRA, C. O feijoeiro-comum: cultura, doenças e melhoramento. Viçosa: Imprensa
Universitária, 1967. 220 p.
36
VIEIRA, R. F. A cultura do feijão-fava. Informe Agropecuário. Belo Horizonte, v.16,
n.174, p.30-37, 1992.
WEIR, B. S.; BASTEN, C. J. Sampling strategies for DNA sequence distance.
Biometrics. Washington, v.26, p.551-582, 1990.
WRIGHT, S. Systems of mating. Genetics, v.6, p.111-178, 1921.
ZORO BI, I.; MAQUET, A.; BAUDOIN, J. P. Population genetic structure of wild
Phaseolus lunatus (Fabaceae), with special reference to population sizes. American
Journal of Botany, v.90, p.897–904, 2003.
ZORO BI, I.; MAQUET, A.; BAUDOIN, J. P. Mating system of wild Phaseolus lunatus
L. and its relationships with population size. Heredity, v.94, p.153–158, 2005.
ZUCCHI, M. I. Análise da estrutura genética de Eugenia dysenterca DC
utilizando marcadores RAPD e SSR. 2002. Tese (doutorado) – Escola Superior de
Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo.