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Dois relatórios de Iniciação Científica
UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Metabólitos secundários de sementes e parte aérea de
Crotalaria pallida para controle de nematoides
BOLSISTA: Mônica Grôppo Parma
ORIENTADOR: Antônio Jacinto Demuner
Relatório Final, referente ao período de
março/2015 a fevereiro/2016, apresentado à
Universidade Federal de Viçosa, como parte
das exigências do PROBIC/FAPEMIG.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
FEVEREIRO/2016
Índice
1.
Resumo ................................................................................................................. 3
2.
Introdução.............................................................................................................. 4
2.1.
Propriedades biológicas dos alcalóides pirrolizidínicos. .............................. 5
2.2.
Compostos orgânicos bioativos e o potencial inseticida. ............................. 6
3.
Objetivos................................................................................................................ 6
4.
Materiais e Métodos .............................................................................................. 7
5.
4.1.
Material Vegetal .......................................................................................... 7
4.2.
Obtenção dos Extratos ................................................................................ 7
4.3.
Análise Qualitativa e Quantitativa dos Alcalóides ........................................ 8
Resultados e Discussões ....................................................................................... 8
5.1.
Extrato etanólico e extrato alcaloídico bruto ................................................ 8
5.2.
Espectroscopia de massas ......................................................................... 9
5.2.1. Espectroscopia de massas por impacto de elétrons de alcalóides
pirrolizidínicos..............................................................................................................9
5.2.2. Espectrometria de massas por ionização química de alcalóides
pirrolizidínicos ........................................................................................................... 9
5.2.3. Espectrometria de massas das frações alcaloídicas das espécies em
estudo.......................................................................................................................9
5.3.
Identificação dos alcalóides pirrolizidínicos pelos cromatogramas...............10
5.3.1. CR4 (Crotalaria ochroleuca).................................................................10
5.3.2. CR9 (Crotalaria spectabilis)..................................................................13
5.3.3. CR10 (espécie ainda não identificada).................................................15
5.4. Abundância relativa.......................................................................................18
6. Conclusão.......................................................................................................... ..19
7.
Referências Bibliográficas.................................................................................... 19
2
UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
1. Resumo
Metabólitos secundários de sementes e parte aérea de Crotalaria
pallida para controle de nematoides
Espécies de plantas do gênero Crotalaria têm despertado grande
interesse para o controle de nematóides, adubação verde, controle da erosão
do solo e atividades farmacológicas. Algumas espécies são tóxicas devido aos
alcalóides pirrolizidínicos (APs), que apresentam importante papel na defesa
química destas plantas. O presente trabalho tem por objetivo identificar os APs
presentes nas folhas de três espécies de Crotalaria por meio de análises
utilizando cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas CG/EM, para um posterior trabalho de isolamento e caracterização das
substâncias presente no extrato alcaloídico bruto da espécie que apresentar
maior diversidade de APs, visando obter um produto natural bioativo que seja
eficaz e menos tóxico no controle de nematoides. A espécie C. ochroleuca
apresentou um composto tipo monocrotalina desconhecido e a monocrotalina;
a espécie C.spectabilis apresentou um tipo monocrotalina desconhecido, um
tipo senecionina (platifilina) e a monocrotalina; uma espécie ainda não
identificada apresentou um tipo monocrotalina, senecionina ou integerrimina e
um tipo senecionina desconhecido. Das espécies estudadas, a monocrotalina
foi o alcalóide pirrolizidínico mais abundante.
3
2. Introdução
As espécies pertencentes ao gênero Crotalaria possuem elevada plasticidade
e rusticidade tendo, portanto, a característica de se adaptar a diversas condições
ambientais, conseguindo até mesmo sobreviver em solos com poucos nutrientes
como, por exemplo, solos secos, cascalhentos e em áreas arenosas da região
costeira. Diante disso, estas espécies são ditas oportunistas, ocorrendo
comumente no Brasil em locais alternados, como margem de estradas e como
invasoras de culturas5. Pelo fato de serem plantas invasoras, as Crotalarias são
facilmente encontradas em plantações de grãos e em pastagens1.
Espécies pertencentes a este gênero são extensivamente cultivadas com
inúmeros potenciais de uso e benefícios, incluindo a cultura de adubo verde, em
que o cultivo é realizado com um ciclo de rotação para melhorar as condições do
solo, no controle da erosão, na eliminação de ervas daninhas e na redução de
nematóides nos solos2,3. Estes parasitas afetam diretamente na qualidade da
produção levando a perdas que podem chegar a 12% na produção mundial a cada
ano. O controle destas pragas é atualmente um grande problema para os
produtores, uma vez que as opções de tratamento são restritas a nematicidas que
são extremamente tóxicos para o meio ambiente e para os seres-humanos.
Entretanto, estratégias químicas e biológicas têm sido utilizadas para o
controle de nematóides como, por exemplo, o uso de plantas tolerantes e ou
resistentes como uma armadilha para os patógenos. As espécies do gênero
Crotalaria têm a característica de atrair e capturar estes patogênicos. Por
consequência, um estudo foi realizado com vinte espécies deste gênero, sendo a
Crotalaria junceae mencionada como um bom candidato antagonista para fins de
reprodução,
inibindo
o
crescimento
de
Meloidogyneincognitae
Rotylenchulusreniformis quando comparado com o controle4,5,6. Em outro estudo
realizado, a espécie Crotalaria ochroleuca quando utilizada em meio de rotação de
cultura no verão, apresenta potencial para o manejo de áreas infestadas por R.
reniformis, comparada ao monocultivo de soja51.
Plantas do gênero Crotalaria são ricas em alcalóides pirrolizidínicos (APs).
Estima-se que mais de 6000 espécies de plantas contenham APs, o que
corresponde a 3% das angiospermas. Estes metabólitos ocorrem principalmente
em plantas do gênero Senecio (Compositae), Crotalaria (Leguminosae) e
4
Heliotropium (Boraginaceae)7. Hoje são conhecidos quase 700 alcalóides
pirrolizidínicos47.
A maioria dos APs têm a estrutura geral com o núcleo biciclo (retronecina)
esterificado com o ácido nécico. Dessa forma, temos um alcalóide como a
monocrotalina, que foi o primeiro alcaloide isolado do gênero Crotalaria47.
Me OH MeOH
Me
O
O
O
O
H
N
monocrotalina
2.1. Propriedades biológicas dos alcalóides pirrolizidínicos.
As diversas estruturas apresentadas pelos alcalóides estão diretamente
relacionadas com as inúmeras atividades biológicas descritas para esta classe de
metabólito8. Desta forma, podemos citar os APs como substâncias utilizadas por
determinados grupos de borboletas em defesa contra predadores, como as
aranhas. Além disso, estes alcalóides são utilizados para a biossíntese de
feromônios necessários ao acasalamento, e que são provenientes de plantas que
servem de alimentos às larvas9,10.
Muitos APs causam sérias doenças em animais domésticos e humanos 11. Do
ponto de vista toxicológico, duas classificações de APs são importantes: os
saturados na base necina, que são não tóxicos e utilizados na medicina popular,
como os APs da Arnica Montana, e os insaturados na base necina que são
hepatotóxicos, genotóxicos e pneumotóxicos6,12,13,14, estes possuem em sua
estrutura ésteres e 1,2 hidroximetildihidropirrolizidina insaturado (HDP) 48. A maior
toxicidade das plantas, por conta dos APs, pode ocorrer em seu período de
floração, no entanto estudos feitos com sementes indicam que essas possuem
maior quantidade de APs, indicando que a planta madura tem maior toxicidade do
que a planta ainda em desenvolvimento49.
Segundo análise de dados apresentados na literatura, Parkash15 e
colaboradores chegaram à conclusão que a exposição de seres humanos aos APs
não gera o câncer. Todavia, em caso de exposição a estas substâncias, poderá
haver indução de doenças veno-oclusivas e cirrose infantil, responsáveis por vários
5
casos de óbito16. Entre outras atividades biológicas descritas na literatura até o
momento,
podemos
citar
a
atividade
antibacteriana,
antifúngica,
inibição
enzimática, anti-ulcerogénico (citoprotetor) e “antifeedant”17,18,19,20,21,22,23,24,25. As
intoxicações por APs no organismo é dose-dependente, sendo que as
consequências de uma exposição podem variar de uma intoxicação aguda a
subaguda e crônica50.
2.2. Compostos orgânicos bioativos e o potencial inseticida.
Segundo o ponto de vista agroquímico, são relatados cerca de cem mil
substâncias
naturais
ecoquimicamente
ativas26.
Estes
compostos
podem
apresentar atividades repelentes, fagorrepelentes alimentares e de oviposição,
inibidores de crescimento e tóxicas, formando, desta maneira, uma ampla defesa
química contra insetos e microrganismos invasores27.
Sabe-se que é de praxe a aplicação sucessiva de inseticidas sintéticos para o
controle de pragas. Porém, o uso indiscriminado dos sintéticos é indesejável, uma
vez que este gera inúmeros problemas, a saber: o desenvolvimento de resistência
do inseto a estes produtos; aparecimento de novas pragas ou ressurgências das
existentes; desequilíbrio biológico; efeitos prejudiciais ao homem, peixes e outros
animais; além dos altos custos por trás da sua aplicação28.
Desta forma, isolar, caracterizar, realizar os testes biológicos e até mesmo
sintetizar ou biossintetizar compostos com atividade alelopática tem se tornado um
desafio constante29. Bioensaios com a espécie Crotalaria pallida demonstraram
atividades
contra
Meloidogyneincognita
a
enzima
proteinase
apresentando,
portanto,
digestiva
efeitos
do
nematóide
nematicida
e
5,6
nematostático . Além deste, trabalhos recentes mostram que os APs apresentam
propriedades nematicidas, ovicida e repelente sobre nematóides parasitas de
plantas e de vida livre afetando diversos estágios do seu desenvolvimento 30,31,32.
3. Objetivo
O objetivo deste trabalho é a obtenção de um produto natural bioativo que seja
eficaz e menos tóxico no controle de nematóides.
6
4. Materiais e Métodos
4.1. Material Vegetal
Sementes de Crotalaria foram adquiridas de empresas especializadas ou
obtidas de plantas cultivadas na Horta do Departamento de Fitotecnia da
Universidade Federal de Viçosa.
Das plantas crescidas foram separadas suas partes aéreas, que foram
submetidas à secagem em estufa de circulação de ar forçada regulada a uma
temperatura de 50ºC. Na sequência, estas folhas foram trituradas em moinho tipo
Willye da marca Tecnal, modelo TE 650.
4.2. Obtenção dos Extratos
As folhas de Crotalaria ochroleuca, Crotalaria spectabilis, e uma espécie ainda
não identificada foram submetidas ao processo de extração por maceração com
etanol comercial (96ºGL) durante sete dias, com agitação diária e trocando o
solvente a cada 48 horas. O volume de solvente utilizado foi de 500 mL e a massa
foi de aproximadamente 180 g para todas as amostras. As soluções etanólicas
obtidas foram filtradas em papel de filtro; e os filtrados concentrados, evaporados
em evaporador rotatório sob vácuo com temperatura do banho-maria mantido a
aproximadamente 50ºC, obtendo-se, assim, os extratos etanólicos.
Para a obtenção dos extratos alcaloídicos foi feito o procedimento de extração
ácido-base, sendo os extratos dissolvidos parcialmente em água destilada em pH
ajustado entre 2-3 por adição de gotas de H2SO4 1 mol/L. As soluções obtidas
foram filtradas em papel de filtro e particionadas três vezes com igual volume de
CH2Cl2 (3 x 150 mL) em funil de separação, até a obtenção de uma fase orgânica
com teste negativo para alcalóides utilizando reagente de Dragendorff, que
evidencia a presença de nitrogênio através de manchas com coloração
alaranjada33,34,35.
Na sequência, as frações resultantes foram submetidas à reação de redução
com excesso de Zn em pó durante 3 horas, sendo o pH da reação mantido entre 2–
3. Em seguida, as soluções ácidas foram filtradas e alcalinizadas com NH 4OH
concentrado até pH 11-12. Estas soluções aquosas básicas obtidas foram
particionadas com igual volume de CH2Cl2 e MeOH na proporção 4:1,
7
respectivamente, até a obtenção de uma fase aquosa com teste negativo para
alcalóides utilizando reagente de Dragendorff. As frações orgânicas assim obtidas
foram secas com Na2SO4 anidro, filtradas e evaporadas, obtendo-se os extratos
alcaloídicos brutos.
4.3. Análise Qualitativa e Quantitativa dos Alcalóides
Para análise dos extratos alcaloídicos obtidos por CCD, utilizou-se como fase
estacionaria placas de sílica gel 60 F254, e como fase móvel o eluente
CH2Cl2:MeOH. A detecção dos alcaloides na análise por CCD foi feita sob luz UV a
254 nm para os alcaloides com ligações duplas conjugadas e por pulverização da
placa com solução de Dragendorff.
As análises por CG/EM dos extratos alcaloídicos foram realizadas em
cromatógrafo Shimadzu GCMS-QP5050A com coluna capilar RestekRTx 5, de
dimensão (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) acoplado a um detector de massas com
impacto de elétrons de 70 eV. As amostras foram injetadas com o aparelho
configurado da seguinte forma: Injetor 250ºC, detector 280ºC, programa de
temperatura 70 – 300º C, 4º C/min, gás de arraste He 1 mL/min, volume de
amostra injetada 1µL36,37,38.
5. Resultados e Discussões
5.1. Extrato etanólico e extrato alcaloídico bruto
Após a realização das extrações e do fracionamento ácido-base, foram obtidos
os extratos etanólicos e os extratos alcaloídicos brutos, cujas massas e seus
respectivos rendimentos podem ser visualizados na tabela abaixo.
Tabela 1. Conteúdo e rendimento (% em relação ao material vegetal seco) do extrato
etanólico e alcaloídico das espécies de Crotalaria.
Espécie
Folhas
secas (g)
Extrato
etanólico (g)
Rendimento
(%/peso seco)
Extrato
alcaloídico (g)
Rendimento
(%/peso seco)
CR4
180,126
20,771
11,53
0,2503
0,1389
CR9
180,362
23,750
13,17
0,5634
0,3124
CR10
180,125
25,090
13,93
0,0832
0.0461
CR4: C. ochroleuca; CR9: C. spectabilis; CR10: ainda não identificada.
8
5.2. Espectroscopia de massas
5.2.1. Espectroscopia de massas por impacto de elétrons de alcalóides
pirrolizidínicos
A espectrometria de massas (EM) é uma excelente ferramenta na
identificação
e
elucidação
estrutural
de
alcalóides
pirrolizidínicos
(APs),
principalmente porque define o modo como os ésteres estão agrupados. A
espectrometria de massas por impacto de elétrons (EM/IE) em APs caracteriza
principalmente as sequências de fragmentação dos variados tipos de base necina.
A espectroscopia de massas por impacto de elétrons (70eV) normalmente
fornece inúmeras informações estruturais sobre a molécula alvo, uma vez que a
grande quantidade de energia transferida acarreta quebras e reações de rearranjos
estruturais, levando a espectros complexos e, usualmente, com a presença do íon
molecular em baixa abundância ou até mesmo ausente.
5.2.2. Espectrometria de massas por ionização química de alcalóides
pirrolizidínicos
Para a obtenção de espectros levando à pouca fragmentação da estrutura e
a maior intensidade do pico do íon molecular M+, torna-se necessário a utilização
do sistema CG/EM por ionização química, no qual podemos visualizar o íon
molecular sem os fragmentos complexos obtidos a partir de rearranjos reacionais
na molécula, como ocorre na EM por impacto de elétrons.
5.2.3. Espectrometria de massas das frações alcaloídicas das espécies
em estudo
Diante dos espectros de massas feitos, não foi possível observar a presença
do íon molecular devido à utilização de um espectrômetro de massas com
ionização por impacto de elétrons que, devido a elevada energia utilizada, promove
9
a fragmentação excessiva de algumas moléculas. Desta forma, o tempo de vida do
íon molecular se torna muito curto para ser detectado pelo analisador de massa39.
No mais, pode-se constatar no desenvolver deste trabalho que as bibliotecas
utilizadas (NIST e WILEY) não contêm o espectro de todos os alcalóides
pirrolizidínicos já relatados na literatura e, devido à similaridade estrutural destes
compostos, não foi possível identificar de forma inequívoca todos os picos
observados nos cromatogramas. Logo, a biblioteca acabou sugerindo a mesma
substância para picos com tempos de retenção distintos.
Diante deste fato, os alcalóides foram identificados através da comparação
do padrão de fragmentação do espectro de massas e pela comparação com o
índice de Kovats de compostos já relatados na literatura40.
É possível que sejam identificados diésteres macrocíclicos, pois todas as
espécies em estudo pertencem à família Fabaceae. Estes diesteres macrociclicos
podem ser classificados como sendo do tipo monocrotalina e senecionina com anel
macrocíclico apresentando 11 e 12 membros, respectivamente. Tanto os
compostos do tipo monocrotalina quanto os do tipo senecionica usualmente são
acompanhados por uma base necina denominada retronecina, que nos informa o
seguinte padrão de fragmentação: m/z 136, 120, 119, 93 e 80.
Para diferenciarmos compostos com anel macrociclico de 11 e 12 membros,
tomamos por base o estudo feito por Rashkes, em que foi constatado que a
presença de um íon [M - 89]+ em m/z 236 é característico da monocrotalina. Os
diésteres macrocíclicos de 12 membros característicos de compostos do tipo
senecionina apresentam um íon em m/z 220 (podendo também ser encontrado o
222 ou 218, dependendo do seu substituinte em C – 14).
5.3. Identificação dos alcalóides pirrolizidínicos pelos cromatogramas
Os APs foram enquadrados dentro de quatro grupos categorizados por
Hartmann e Witte46, a saber: senecionina, monocrotalina, triangularina e
miscelaneos.
5.3.1. CR4 (Crotalaria ochroleuca)
10
O cromatograma referente ao extrato alcaloídico bruto da espécie C.
ochroleuca pode ser visto pela figura 1, constatando-se dois picos referentes à
APs.
Figura 1. Cromatograma parcial do extrato alcaloídico bruto da espécie C. ochroleuca.
Na tabela 2 é feita a identificação destes picos através do tempo de
retenção, padrão de fragmentação e seu íon molecular.
Tabela 2. Compostos identificados via CG/EM no extrato alcaloídico bruto das folhas de
Crotalaria ochroleuca.
Pico Nº
Tr (min)
m/z
Íon Molecular
Identificação
1
38,108
251; 194; 136; 120; 119; 93; 80
325
Tipo monocrotalina
desconhecido
2
43,050
254; 236; 136; 120; 119; 93; 80
325
Monocrotalina
 Pico Nº1
Em relação ao padrão de fragmentação deste pico, pode-se inferir que se
trata de um diéster macrocíclico com base necina insaturada devido aos picos m/z:
93, 94, 95; 119, 120, 121 e 136, 137, 138. Adicionalmente, é observado picos em
m/z 251, 194 e o íon molecular em m/z 325, o que nos induz a suspeitar da
presença de um alcalóide do tipo monocrotalina desconhecido 41.
11
Figura 2. Espectro de massas do pico N°1 do extrato alcaloídico bruto das folhas
da espécie C. ochroleuca.
 Pico N°2
Observa-se no espectro de massas mostrado abaixo o padrão de
fragmentação característico de APs macrocíclicos 1,2 insaturados, conforme
discutido anteriormente, além de fragmentos referentes a compostos do tipo
monocrotalina em m/z 254, 236, 136, 120, 119, 93, 80; e a presença do íon
molecular em m/z 32542.
Figura 3. Espectro de massas do pico N°2 do extrato alcaloídico bruto das folhas
da espécie C. ochroleuca.
12
5.3.2. CR9 (Crotalaria spectabilis)
A análise por CG/EM do extrato alcaloídico bruto da espécie Crotalaria
spectabilis apresentou três picos com padrão de fragmentação correspondente a
alcalóides pirrolizidínicos, conforme cromatograma abaixo.
Figura 4. Cromatograma parcial do extrato alcaloídico bruto da espécie C. spectabilis.
A identificação dos respectivos compostos foi feita através da comparação
do padrão de fragmentação e da analise do íon molecular, mostrado na tabela 3.
Tabela 3. Compostos identificados via CG/EM no extrato alcaloídico bruto das folhas de
Crotalaria spectabilis.
Pico Nº
Tr (min)
m/z
Íon Molecular
Identificação
1
38,117
251; 194; 136; 120; 93; 80
2
39,925
3
43,042
154;140; 138; 123; 122; 96; 95;
82
254; 236; 136; 120; 119; 93; 80
Não
identificado
311
Tipo monocrotalina
desconhecido
Tipo senecionina
(Platifilina)
Monocrotalina
325
 Pico N°1
Neste espectro de massas é possível observar a presença de
fragmentos característicos de um diéster macrocíclico com base necina tipo
retronecina, a saber: m/z 136; 120; 93 e 80. No mais, observam-se fragmentos
13
em m/z 251 e 194 característico de um AP do tipo monocrotalina
desconhecido43.
Figura 5. Espectro de massas do pico N°1 do extrato alcaloídico bruto das folhas
da espécie C. spectabilis.
 Pico N°2
É possível a identificação de fragmentos característicos de um diéster
macrocíclico com base necina saturada com m/z em 140; 138; 123; 122; 96; 95; 82.
Além destes fragmentos, é notória a presença do íon molecular em m/z 311,
induzindo, desta forma, a pensar na presença da molécula do tipo platifilina 44.
Figura 6. Espectro de massas do pico N°2 do extrato alcaloídico bruto das folhas
da espécie C. spectabilis.
14
 Pico N°3
A presença dos fragmentos em m/z 138, 137 e 136; 121, 120 e 119; e
95, 94 e 93, nos faz deduzir a presença de um diester macrociclico com base
necina tipo retronecina. Além disso, temos fragmentos em m/z 254 e 236, o que no
leva a um composto do tipo monocrotalina42.
Figura 7. Espectro de massas do pico N°3 do extrato alcaloídico bruto das folhas
da espécie C. spectabilis.
5.3.3. CR10 (espécie ainda não identificada)
Analisando o extrato alcaloídico bruto da espécie CR10, constata-se a
presença de três picos referentes à APs, de acordo com o cromatograma abaixo.
15
Figura 8. Cromatograma parcial do extrato alcaloídico bruto da espécie CR10.
A identificação destes compostos foram feitas através da interpretação da
fragmentação do espectro de massas, o IK calculado e o íon molecular, conforme
pode ser observado na tabela abaixo.
Tabela 4. Compostos identificados via CG/EM no extrato alcaloídico bruto das folhas de
CR10.
Pico Nº
1
Tr
(min)
42,683
2
44,083
3
49,317
m/z
254; 236; 136; 120; 119; 93; 80
291; 248; 246; 220; 138; 137; 136;
121; 120; 119; 95; 94; 93; 80
224; 195; 143; 136; 120; 93; 80
Íon
Molecular
Não
identificado
335
Não
idenficado
Identificação
Tipo
monocrotalina
Senecionina ou
Integerrimina
Tipo senecionina
desconhecido
 Pico N°1
No espectro abaixo se percebe a presença de fragmentos usualmente
encontrados em APs macrocíclicos com base necina tipo retronecina. Além destes,
temos fragmentos em m/z 254, 236 e 136, característicos da molécula de
monocrotalina39.
Figura 9. Espectro de massas do pico N°1 do extrato alcaloídico bruto das folhas
da espécie CR10.
 Pico N°2
16
Observa-se no espectro de massas mostrado abaixo fragmentos típicos
de um diéster macrocíclico com base necina tipo retronecina, a saber: m/z 138, 137
e 136; 121, 120 e 119; e 95, 94 e 93. Além destes, temos a presença de
fragmentos em m/z 291; 248; 246 e 220, e a presença em baixa intensidade do íon
molecular em m/z 335. Logo, com base na fragmentação obtida, pode-se suspeitar
da presença do composto Senecionina ou Integerrimina 45. Sabe-se que analisando
apenas o espectro de massas desses compostos fica inviável sua distinção, sendo,
para esta finalidade, necessário um estudo detalhado de RMN, o que não foi feito
nesse trabalho.
Figura 10. Espectro de massas do pico N°2 do extrato alcaloídico bruto das
folhas da espécie CR10.
Figura
de massas do pico N°3 do extrato alcaloídico bruto das
 11.
PicoEspectro
N°3
folhas da espécie CR10.
A presença de fragmentos em m/z 138, 137 e 136; 121, 120 e 119; e 95, 94
e 93 caracterizam a presença de um diéster macrocíclico com base necina tipo
retronecina. No mais, têm-se fragmentos em m/z 224; 195 e 143, o que nos leva a
deduzir a presença de um AP do tipo senecionina desconhecido 45.
5.4. Abundância relativa
17
A tabela abaixo nos permite visualizar com clareza a presença de um AP
majoritário nas espécies estudadas, além de outros APs presentes em baixas
concentrações. É mostrado também o íon molecular e o tempo de retenção dos
compostos.
Tabela 5. Abundãncia relativa (%) dos APs nas espécies de Crotalaria estudadas.
Identificação do alcalóide (IM)
Tr. (min)
CR4 (%)
CR9 (%)
CR10 (%)
Tipo monocrotalina com estrutura
38,108
6,89
12,22
-
Monocrotalina (IM 325)
43,050
93,11
85,55
52,51
Senecionina – Tipo platifinina (IM 311)
39,925
-
2,23
-
Senecionina/Integerrimina (IM 335)
44,083
-
-
36,73
Tipo senecionina desconhecido
49,317
-
-
10,76
desconhecida (IM 325)
CR4: C. ochroleuca; CR9: C. spectabilis; CR10: ainda não identificada.
6. Conclusão
Diante desse estudo, podemos concluir que a monocrotalina foi o alcalóide
pirrolizidínico majoritário em todas as espécies de Crotalarias estudadas. Para a
identificação dos APs nos extratos, foi comprovado que a espectrometria de
massas (EM) é uma ótima ferramenta. No entanto, é necessário mesclar os
resultados obtidos pela espectroscopia de massas por impacto de elétrons (EM/IE)
com os do sistema CG/EM por ionização química.
Como perspectivas futuras na continuação desse trabalho, os extratos
alcaloídicos brutos oriundos das espécies Crotalaria ochroleuca, Crotalaria
18
spectabilis, e da espécie ainda não identificada, serão fracionados para isolar e
caracterizar os compostos identificados. Todas as frações e as substâncias puras
obtidas serão submetidas a ensaios biológicos inseticida e nematicida.
7. Referências Bibliográficas
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21
UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
CENTRO DE CIENCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Metabólitos das folhas e raiz de Mucuna pruriens
com atividade nematicida
Relatório final apresentado à Universidade Federal
de Viçosa, como parte das exigências da bolsa
PIBIC/CNPq, referente ao período de agosto 2014 a
julho2015.
Bolsista: Gabriella Almeida de Moura-70671
Orientador: Antônio Jacinto Demuner
Julho 2015
Viçosa - MG
1
Sumário
1-Introdução .............................................................................................................................. 4
1.1. Nematoides ................................................................................................................. 5
1.2. Mucuna sp .................................................................................................................. 6
2. Objetivos ............................................................................................................................ 9
3. Material e Métodos............................................................................................................ 9
3.1-Fracionamento do extrato dos exudados radiculares de M. pruriens ...................... 10
3.2-Avaliação da atividade nematicida ............................................................................. 11
4-Resultados e discussões ....................................................................................................... 12
4.1-Elucidação estrutural do Glutinol .............................................................................. 12
4.2-Caracterização do extrato e das frações LA e LM dos exsudados radiculares de
Mucuna pruriens ................................................................................................................ 16
4.3- Avaliação da atividade nematicida ............................................................................ 18
5-Conclusão ............................................................................................................................. 19
2
Resumo
Dentre as plantas mais utilizadas no controle de nematoides encontra-se a Mucuna, uma
leguminosa forrageira que produz alta quantidade de matéria vegetal. Ela pode diminuir a
população de plantas daninhas e nematoides do solo além de controlar a erosão e proporcionar
um aumento de fixação de nitrogênio no solo. É por isso, que são necessários os controles
alternativos para nematoides o quais incluem a obtenção de compostos a partir de planta e
nesse trabalho foi proposto um estudo dos metabólitos secundários presentes na parte aérea e
dos exudatos na raiz da planta (Mucuna pruriens var. utilis) com vistas ao controle de
nematoides do solo. Foram obtidos extrato dos exsudatos radiculares de Mucuna pruriens por
meio de cultivo hidropônico. Após 30 dias de cultivo a solução aquosa foi submetida a
extração com acetato de etila. A solução aquosa foi liofilizada e foi obtido um extratao
metanólico desse material. Das folhas de Mucuna pruriens foi obtido o extrato metanólico por
extração por maceração. Desse extrato foi isolado e caracterizado um triterpeno (Glutinol) que
não tinha sido descrito na literatura da planta. Os extratos em acetato de etila e metanólico do
exsudato da raiz foram fracionados e pode perceber que no extrato em acetato de etila pelos
espectros no infravermelho tinham características de ácidos graxos e terpenos. No extrato
metanólicos apareceram bandas correspondentes a compostos com grande quantidade de
hidroxilas que podem ser de glicosídeos. No entanto não foi possível identificar os seus
componentes. Tanto a solução aquosa quanto as frações foram avaliadas contra o nematoide
das galhas Meloidogyne javanica. O Glutinol apresentou uma porcentagem de mortalidade na
atividade nematicida de 31,61%. Podemos concluir, que o ensaio biológico de atividade
nematicida para o extrato metanólico, da fração de acetato de etila , do Glutinol (composto
isolado) e também o extrato de exsudados radiculares de Mucuna pruriens. sobre
Meloidogyne javanica apresentaram porcentagens de controle de nematoides maior a
70%,confirmando o fato da mucuna de ser uma planta utilizada como adubo verde que pode
atuar na diminuição e controle biológico de nematoides.
_______________________________
Antônio Jacinto Demuner
_________________________________
Gabriella Almeida de Moura
3
1-Introdução
Devido à crescente demanda por alimentos no mundo, os fatores que acarretam
reduções em produtividade agrícola, especialmente os fitopatógenos, devem receber
prioridade nas investigações científicas. Nas regiões tropicais, por exemplo, a presença de
fitonematóides, muitas vezes em solos de alta fertilidade, tem trazido elevados prejuízos aos
agricultores, em virtude da redução que induzem às colheitas causando enfraquecimento no
crescimento das plantas, redução na qualidade do produto colhido e, em algumas regiões,
devido à desvalorização da propriedade rural, para obtenção de crédito bancário (Sharma et
al., 2014).
Quase todas as culturas sofrem com o ataque de uma ou mais espécies destes
organismos os quais só se alimentam no citoplasma das células vegetais vivas (Williamson e
Gleason, 2003). Em tais situações, a produção de alimentos e de outros produtos agrícolas é
sempre severamente afetada, por isso precisa-se de esforços no controle destes fitonematóides
a fim de reduzir as perdas de produtividade (Kayani et al., 2013).
No Brasil, dentre os fitonematóides mais importantes encontram-se os do gênero
Meloidogyne e Heterodera que causam, respectivamente, galhas e cistos e abrangem cerca de
30 espécies, atacando quase todas as culturas (Akhtar e Malik, 2000). A importância destes
gêneros é devido à sua ampla distribuição, polifagia, diferenciação biológica ligada ao
parasitismo entre a população da mesma espécie e alta capacidade de multiplicação durante a
estação de crescimento da planta. Estas características vêm dificultando a implementação de
programas de rotação e resistência de culturas, que se constituem em medidas de controle
mais efetivas e viáveis para o agricultor (Akhtar e Malik, 2000). Como visto, os prejuízos
causados por estes fitonematóides são diversos e podem inviabilizar a utilização de grandes
áreas, pois atacam raízes, bulbos, sementes e folhas tornando antieconômica a exploração de
determinadas culturas, além de interagirem ou servir de vetores para outros patógenos de
plantas, o que aumenta ainda mais a severidade das doenças de plantas (Luc et al., 1990; Tsai
et al., 1991).
O desenvolvimento de sistemas de gestão de nematóides pode evitar o uso excessivo
de pesticidas, por conseguinte, utilizar os exsudados da planta como nematicida, que pode ser
liberado por volatilização ou lixiviação para o solo circundante, o que se torna um dos
maiores desafios na pesquisa de agrotóxicos (Oka, 2010).
4
Uma das plantas mais utilizadas para controle de nematóides é a mucuna, uma
leguminosa forrageira que pode diminuir a população de plantas daninhas e nematóides no
solo, além de reduzir a erosão e ajudar na fixação de nitrogênio, também pode assimilar e
sequestrar nutrientes aumentando o rendimento nos cultivos, quando utilizada como adubo
verde (Rojano-Delgado et al., 2012).
Todavia, Resende (1986) estudou o efeito sobre seis espécies diferentes de mucuna
mostrou que estas se comportaram como hospedeiras desfavoráveis a Meloidogyne incognita.
Foi ressaltado pelo autor que o estudo foi baseado apenas em relação ao efeito do sistema
radicular sobre os nematóides, devendo ser feitos novos estudos utilizando-se a parte aérea de
mucuna.
Para a realização destes estudos tem sido utilizadas diferentes técnicas na
identificação de produtos naturais em extratos brutos de plantas, uma das técnicas combinadas
que têm desempenhado um papel fundamental é LC-ESI-MS/MS, a qual permite identificar
compostos que pertencem a diferentes classes como alcalóides, flavonóides, triterpenos, etc.
Sem precisar do isolamento dos mesmos, facilitando este processo (Dias et al., 2012).
1.1. Nematoides
O filo Nematoda é uma dos maiores e mais diversos grupos de organismos. A
maioria das espécies é encontrada em ecossistemas oceânicos, de água doce e do solo, e
apenas um pequeno número é patógeno de animais e plantas. Estima-se que existam cerca de
4.100 espécies de nematóides parasitas de plantas. As espécies mais importantes em termos de
danos 14 agronômicos pertencem às endoparasitas sedentários das galhas (Meloidogyne spp.),
nematóides de cisto (Heterodera spp. e Globodera spp.) e o endoparasita migratório de lesão
da raiz (Pratylenchus spp.). Nematóides endoparasitas sedentários induzem estruturas de
alimentação in vivo dentro das plantas as quais servem como alimento constante. No entanto
os nematóides endoparasitas migratórios se movimentam de forma intracelular nos tecidos da
planta e absorvem os nutrientes das células em seu caminho de migração, levando à morte da
célula e do tecido. Os nematóides também são indicadores biológicos úteis da saúde do solo
(Humphreys-Pereira e Elling, 2014).
Mais de 100 espécies de Meloidogyne foram registados em diferentes partes do
mundo. Dentre eles, a Meloidogyne incognita, M. javanica, M. arenaria e M. hapla são
5
economicamente importantes e respondem por 95% de todas as infecções em terra cultivada.
Estes são apresentados na seguinte ordem: M. incognita 47%, M. javanica 40%, M. arenaria
e M. hapla 7% e 6%, respetivamente (Kayani et al., 2013).
Nematóides das galhas Meloidogyne (spp.), são os nematóides parasitas de plantas
mais frequentemente observados e prejudiciais para as culturas. Podem alterar a função da
raiz e atuam como dissipadores de nutrientes, reduzindo assim o rendimento da cultura. O
controle desses fitonematóides em sistemas de produção de culturas atualmente conta com
nematicidas químicos que aplicados ao solo são altamente tóxicos para os seres humanos e,
portanto, podem contaminar as águas subterrâneas. No entanto, os temores sobre os riscos
ambientais e de saúde tornam necessária a descoberta de meios alternativos para o controle
biológico (Sharma et al., 2014).
O uso de cultivares resistentes a nematóides é uma das alternativas, uma vez que são
ambientalmente benignos, seguros e economicamente viáveis. Culturas resistentes também
podem ser usadas como um componente de gestão de nematóides integrado com outras
estratégias de controle, como aditivos orgânicos no solo, controle biológico, solarização do
solo, tratamento térmico, e rotação de culturas. (Mukhtar et al., 2014).
1.2. Mucuna sp
As sementes de mucuna são fonte de proteína crua na dieta do gado. No entanto, em
animais que possuem um só estômago esta planta produz uma diminuição no consumo de
alimento e aumenta o risco de morte (Chikagwa Malunga et al., 2009). Isto se deve ao
conteúdo de metabólitos secundários como o L-Dopa, ácido fítico, taninos e saponinas, entre
outros. No caso dos seres humanos o consumo de mucuna crua causa diarréia, lesões na pele e
vômito. Além do conteúdo de L-Dopa, a mucuna possui altos níveis de tirosinase, podendo
ser usada também no processo de biotransformação de L-tirosina em melanina, a qual tem
grande aplicação na cosmética, agricultura e medicina (Inamdar et al., 2014).
Mucuna cochinchinensis também tem uso na medicina tradicional para o tratamento
de muitas doenças, além de pesquisas para uso farmacológico, fitoquímico e avaliação quanto
ao potencial antimicrobiano dos extratos das sementes e sua atuação como agentes
controladores de patógenos (Natarajan et al., 2013).
6
Os medicamentos fitoterápicos podem ser uma fonte alternativa e valiosa para a
descoberta de drogas anti-parkinsonianos. Compostos como estilbenos, flavonóides, catecóis
e terpenos podem ser os candidatos mais promissores para pesquisas futuras. Alguns
compostos como baicaleína, puerarina, resveratrol, curcumina e ginsenosídeos merecem uma
análise mais aprofundada em ensaios clínicos (Song et al., 2012). O tratamento para a doença
Parkinson foi investigado com o extrato aquoso de sementes de Mucuna pruriens (L.), erva
medicina tradicional usada na Índia desde 1500 aC, como agente neuroprotetor e foi
observada uma redução da tirosina hidroxilase (Yadav et al., 2013).
A utilização de mucuna em sistema de rotação de culturas para reduzir os níveis
populacionais de nematóides formadores de galhas (Meloidogyne sp.) é uma prática que
ocorre desde os anos 20 na região sudeste dos Estados Unidos (McSorley et al., 1994).
Tenente (1980) classificou a mucuna-preta (Mucuna aterrima) como planta
hospedeira desfavorável a Meloidogyne incognita raça 3, após verificar que a planta pode ser
parasitada, entretanto, somente um pequeno número de juvenis conseguiu chegar à fase
adulta. A mucuna-preta foi também considerada hospedeira desfavorável a M. incognita raça
4 (Tenente e Lordello, 1987) a M. incognita raça 2 (Jaehn, 1993). (Santos e Ruano, 1987)
afirmaram que Mucuna spp., Crotalaria spp., Tagetes spp. e algumas variedades de Avena
sativa foram materiais promissores no controle de Meloidogyne incognita raça 3 e
Meloidogyne javanica.
A atividade estrogênica de 12 flavonóides isolados de Mucuna sempervirens foi
avaliada pelo ensaio de luciferase com base na linha de células MVLN. Os resultados indicam
que as folhas de M. sempervirens são uma fonte rica em flavonóides com propriedades
antioxidantes e propriedades estrogênicas para o corpo humano (Du e Li, 2012).
A Mucuna sp. foi utilizada para redução do nematóide de cisto da soja Heterodera
glycines Ichinohe, considerado o parasita mais destrutivo dentre os que atacam a soja (Valle,
1996). Resultados obtidos em casa de vegetação mostram que a mucuna-preta é eficiente em
reduzir a população deste nematoide no solo (Dias et al., 1995; Valle, 1996). No que tange a
composição química, poucos estudos foram realizados no gênero Mucuna. As sementes de M.
pruriens (L.) DC., variedade utilis, são utilizadas na alimentação humana, por apresentarem
alto teor de proteína. Na Índia, em um estudo sobre legumes, a M. prurita e a M. capitata
apresentaram teores de proteína de 32 e 36 %, respectivamente (Nirajan e Katiyar, 1979).
Apesar de várias substâncias terem sido isoladas das espécies de mucuna, apenas a
L-Dopa tem uma função reconhecida pelos pesquisadores até o momento, pois confere ação
7
alelopática à mucuna contra insetos e plantas daninhas. Além disso, essa substância vem
sendo testada, a partir de estudos 17 iniciais da década de 70, quanto à sua utilização em
pacientes portadores do mal de Parkinson (Bell e Janzen, 1971).
A espécie Mucuna pruriens é utilizada na medicina tradicional indiana como planta
medicinal para melhorar a fertilidade, no entanto, nenhuma validação científica até hoje foi
realizada (Suresh et al., 2013).
A planta é rica em alcalóides, triterpenos e esteróides presentes na raiz e sementes.
As sementes também contêm proteínas, e aminoácidos, tais como L-Dopa, metionina,
tirosina, lisina, glicina, ácido aspártico, ácido glutâmico, leucina e serina, com globulinas e
albuminas, ácidos, carboidratos, e compostos relacionados, tais como o ácido oléico, ácido
linoléico e ácido palmítico. A pesquisa dos extratos de caule e raízes de Mucuna pruriens var.
utilis levou ao isolamento de compostos com misturas de ácidos graxos, triacilgliceróis,
estigmasterol, estigmasterol D-glicosideo, L-Dopa e alantoína (Barbosa et al., 1999), além de
alcalóides tetraidroisoquinolínicos (Misra e Wagner, 2004) e compostos como triacosanato de
triacontila e triacontanol (Nogueira et al., 1996) em suas sementes . Estudos de laboratório
revelaram também que o extrato de sementes desta espécie possui uma grande quantidade de
L-dopa, saponinas, D-quiro-Inosital e arginina (Suresh et al., 2013).
Sementes de M. pruriens demonstraram efeito antiinflamatório, antipirético e
antivenenoso, além de atividade afrodisíaca, melhora na fertilidade, propriedades
anabolizantes, e antiespasmódica. É relatado que esta planta tem sido utilizada na Índia,
Brasil, Espanha e Alemanha no tratamento da diabetes. (Majekodunmi et al., 2011).
M. pruriens exsuda L-Dopa em concentração suficiente na rizosfera para inibir o
crescimento de outras espécies de plantas. Este é eficazmente absorvido pelas raízes das
plantas e é oxidado para as respectivas quinonas (dopaquinona e dopaminaquinona entre
outros) pela polifenol oxidase ou por auto-oxidação. As quinonas são altamente reativas e
podem formar ligações 19 covalentes com as proteínas para produzir adutos cisteínicos. A
formação de quinoproteínas pode perturbar o funcionamento normal das células por ligação
cruzada de proteínas de membrana, desativação de enzimas e afetando a respiração
mitocondrial (Mushtaq et al., 2013).
Além disso, M. pruriens exibe uma resistência muito elevada ao glifosato,
semelhante à das plantas que tem adquirido resistência a este herbicida. Dados de [ 14C] do
glifosato das folhas e sua translocação para os tecidos meristemáticos foram analisados.
Utilizou-se a microscopia eletrônica de varredura e eletroforese capilar para investigar o
8
metabolismo capaz de degradar o herbicida. M. pruriens exibiu absorção e translocação
limitada do glifosato, além de degradação do composto para os tecidos meristemáticos. Tendo
como conclusão que a combinação de três características, ação: limitando a absorção, a
translocação deficiente e degradação aumentada, são as responsáveis pela degradação do
glifosato (Rojano-Delgado et al., 2012).
Os compostos que conferem atividade nematicida às plantas do gênero Mucuna ainda
não foram caracterizados, apesar da reconhecida atividade e de sua vasta utilização como
planta antagonista a nematóides e helmínticos (Huisden et al., 2014).
2. Objetivos
Estudar a composição química dos extratos de folhas e exudados radiculares de
Mucuna pruriens variedade utilis, visando isolar e identificar os constituintes químicos
responsáveis pela atividade nematicida dessa espécie. Uma vez identificado os compostos
ativos pretende-se avaliar o potencial uso desses como nematicidas naturais.
3. Material e Métodos
As sementes de Mucuna pruriens variedade utilis foram cultivadas no setor de
Agroecologia da UFV, adquiridas de empresas especializadas. As plantas adultas em estado
de floração foram coletadas e as partes separadas (caule e folhas) para obtenção dos extratos.
A doação de uma amostra da espécie M. pruriens encontra-se registrada no herbário
do departamento de biologia vegetal da Universidade Federal de Viçosa sob o número VIC.
43870.
Para a preparação do extrato metanólico foram coletados 13,7 Kg de parte aérea de
Mucuna pruriens, secados durante 10 h a 50 °C com ar quente. Depois de secos foram moídos
e, obteve-se uma massa de 2,7 Kg de extrato bruto. Para a realização do extrato metanólico
por maceração foram colocados 3 L de metanol por Kg de material vegetal seco e moído, e
deixados durante 4 dias. Após esse período, o material foi filtrado e o sólido vegetal foi
extraído novamente com metanol por 4 dias. A solução metanólica foi separada e concentrada
sob pressão reduzida obtendo finalmente 319,8 g de extrato metanólico .
9
O extrato metanólico foi sometido a separação por coluna filtrante com solventes
de diferentes polaridades. Foram feitas três colunas filtrantes em sílica gel com 40 g de
amostra e 1 L de cada um dos solventes, para um total de 120 g de amostra totalizando 3 L de
cada uma das frações. Após da coluna os solventes foram removidos a pressão reduzida em
evaporador rotatório para a obtenção das frações em hexano (H), diclorometano (D), acetato
de etila (A), metanol (M) e água (H2O).
A fração em diclorometano foi parcialmente estudada após de fracionamento
sucessivo por cromatografia em coluna de sílica gel, partindo de 120 g de amostra e, com as
seguintes fases moveis: em primeiro momento hexano/éter(95:5), hexano/acetato de etila (9:1)
na qual conseguiu-se extrair glutinol isolado e por último hexano/diclorometano (6:4). As
frações encontradas no final da coluna apresentaram 26 compostas por misturas de ácidos
graxos e um Glutinol isolado que, não tinha sido relatado na literatura da planta.
Figura 1: formula estrutural do glutinol
3.1-Fracionamento do extrato dos exudados radiculares de M. pruriens
Para a obtenção dos exsudados radiculares de M. pruriens, foram coletadas 538
sementes que foram lavadas com uma solução 50 % de hipoclorito de sódio e colocadas em
câmara de germinação a 27 °C durante 5 dias, destas só 324 sementes germinaram e foram
colocadas em sistema de hidroponia em casa de vegetação, inicialmente foi colocada uma
capela de plástico acima das sementes durante dois semanas ate elas estarem adaptadas ao
ambiente. A solução hidropônica utilizada foi composta por nitrato de cálcio, mineral misto,
fosfatos, sulfato de magnésio, micronutrientes e EDTA com ferro, esta solução é utilizada no
cultivo de alface, 125 mL de cada uma destas soluções foram adicionados em uma bandeja e
10
completadas com 25 L de água. A condutividade elétrica da solução hidropônica foi
monitorada durante todo o processo de crescimento das plantas, para garantir que a
concentração de sais na solução fosse mantida, entre 1,65 e 2,57 mS/cm, em pH 5,5.
As plantas foram mantidas na hidroponia por 30 dias. Depois de decorrido esse tempo
foram retiradas do sistema e a de solução hidropônica (50 L) foi coletada e submetida a
extração líquido-líquido com acetato de etila. Cada um dos litros de solução foi extraído por
triplicata com 250 mL de solvente durante 10 minutos. A fase orgânica foi separada da fase
aquosa e concentrada sob pressão reduzida para obter finalmente 480 mg de extrato dos
exsudados radiculares.
A fase aquosa foi liofilizada fornecendo 19 g do resíduo, dos quais 9 g foram
incorporados em sílica gel e utilizados para realização de coluna filtrante em sílica gel
utilizando como fase móvel acetato de etila e metanol. Foram obtidas duas frações, a fração
de acetato de etila (LA) com uma massa de 0,074 g e a fração de metanol (LM) com 4,28 g.
3.2-Avaliação da atividade nematicida
Para a realização desta atividade, ovos do nematóide das galhas, caracterizados por
meio de corte perineal, foram obtidos a partir de galhas de raízes de tomateiro mantidos em
casa de vegetação em solo previamente tratado com brometo de metila na proporção de 150
cm3 /m3 de solo. Para a extração dos ovos, as raízes foram lavadas e picadas em pedaços de
aproximadamente 1cm e em seguida transferidas para o liquidificador com solução de
hipoclorito de sódio 0,5%. Foram trituradas por 20 segundos na menor velocidade. Os juvenis
de segundo estádio (J2) foram obtidos a partir de câmara de eclosão feita em funil de
Baermann. Os J2 obtidos após 24 h foram descartados e coletados aqueles produzidos após 48
h. A suspensão de J2 foi calibrada em câmara de Peters para 1000 J2/mL. O efeito dos
extratos, frações e compostos puros de M. pruriens na mortalidade dos J2 de M. javanica foi
avaliado colocando-se 100 µL de cada dose em concentração de 100 ppm em cada célula da
placa Elisa (capacidade de 300 µL/célula) e 100 µL da suspensão de J2 (concentração de 150
J2/µL). após 48 h adicionou-se a cada célula da placa Elisa uma a duas gotas de NaOH 1
mol/L e imediatamente foi realizada a contagem dos nematoides, caraterizados como mortos
aqueles que apresentavam o corpo reto e imóveis, e aqueles com o corpo retorcido como
vivos (Ribeiro et al., 2012).
11
4-Resultados e discussões
4.1-Elucidação estrutural do Glutinol
Após realização de coluna cromatográfica de sílica da fração em diclorometano foi
possível isolar um composto branco que foi recristalizado em metanol. Esse composto
apresentou
temperatura
de
fusão
de
202°C
(lit.207-
210°C;Kupchan,S.M.,Lacadie,J.A.1975) Na análise do seu espectro no
infravermelho (Figura 2) foi possível observar as seguintes bandas: banda na região de 3446
cm-1, referente a estiramento do OH. Nota-se outras bandas em, 2949 cm-1 e 2867 cm-1,
devidas a vibrações Csp3–H, a banda encontrada em 1636 cm-1 , está associada à banda em
3446 cm-1 o qual indica a presença de água no KBr utilizado para a realização do espectro. As
bandas em 1382 cm-1 e 1180 cm-1, são referente às vibrações de estiramento C-O.
Figura 2: Espectro infravermelho (KBr)do Glutinol
No espectro de massas, observou-se que o composto possui pico de íon molecular de
426 [M+.], e um padrão de fragmentação característico de triterpenos, com picos em (m/z =
411, 274, 259 e 205) dos quais o fragmento em m/z = 274 , acontece por meio de uma
fragmentação retro-Diels Alder, indicando o local da dupla ligação. Este fragmento é
12
importante na elucidação estrutural devido ao local da dupla na molécula. Com base nesses
dados e comparação com a literatura o composto foi identificado como glutinol.
Figura 3 :Espectro de massas do Glutinol
Figura 4 :Fragmento m/z =274 do glutinol
Para a confirmação estrutural do composto foram realizados espectros de RMN de
1
13
H e de C. No espectro de RMN de 1H, observa-se um dupleto em δ = 5,63 (d, J = 6,3 Hz,
1H), correspondente ao H6, um hidrogênio ligado ao carbono olefínico C-6. Um tripleto em δ
= 3,47 (t, J = 2,4 Hz, 1H), relativo ao hidrogênio ligado ao carbono C-3. Finalmente observase 8 sinais simpletos correspondentes ao hidrogênios dos grupos metilas do glutinol.
No espectro de RMN de
13
C observa-se sinais de simpletos referentes aos metílicos
dos carbonos metílicos (25, 24, 27, 23, 28, 26, 29, 30. O assinalamento foi feito pela
comparação dos dados obtidos na literatura (Lee et al., 2009).
13
Figura 5: RMN de 1H do Glutinol
No RMN de
13
C nota-se um sinal em δ = 76,3 devido ao carbono 3 ligado ao
oxigênio. Além disso são observadas duas sinais em δ = 141,6 e δ = 122,0 que são referentes
aos carbonos C-5 e C-6, os quais tem um maior deslocamento causado pela dupla ligação. As
atribuições foram realizadas em comparação com os deslocamentos em comparação com a
literatura (Lee et al., 2009).
Figura 6: RMN de 13C do Glutinol
14
Tabela 1: Comparação dos dados obtidos no RMN de 1H (300 MHz, CDCl3)
para glutinol com os relatados na literatura (Lee et al., 2009).
Tabela 2: Comparação dos dados obtidos no RMN de 1H (300 MHz, CDCl3) para glutinol
com os relatados na literatura (Lee et al., 2009).
O Glutinol pertence á classe dos triterpenos pentacíclicos. Os triterpenos são um dos
grupos de terpenos mais estruturalmente diversificados. Terpenos constituem uma ampla
classe de produtos naturais, que possuem muitas funções no reino vegetal e na saúde humana.
15
Esta classe de substâncias faz parte da defesa de muitas espécies de plantas, animais e
microrganismos contra predadores, patógenos e competidores, e estão envolvidos na
transmissão de mensagens sobre a presença de alimento e organismos nocivos. Os triterpenos
pentacíclicos são de grande interesse devido às diversas atividades biológicas apresentadas,
servindo como candidatos ou protótipos de novos medicamentos (Silva et al., 2014). Este
composto ainda não tem sido relatado na literatura para Mucuna pruriens.
4.2-Caracterização do extrato e das frações LA e LM dos exsudados radiculares de
Mucuna pruriens
Observa-se no espectro de infravermelho do extrato dos exsudados radiculares de M.
pruriens bandas características de estiramento de O-H em 3434 cm-1. Também se notam
bandas em 2961 cm-1 e 2932 cm-1 referentes às vibrações de estiramento Csp3 –H. A banda em
1730 cm-1 é referente ao estiramento C=O para ésteres, a banda em 1465 cm-1 é referente às
vibrações de deformação angular de CH2. A banda em 1258 cm-1 é devida ao estiramento CO-C, a banda em 1095 cm-1 produzida pelo estiramento C-CO-O e, finalmente, uma banda
forte e aguda em 808 cm-1 referente à deformação angular fora do plano de CH2 (Figura 7).
80
60
1381
1730
2932
2961
40
1465
50
3434
Transmitância (%)
70
3000
2500
2000
1500
1000
808
3500
1095
4000
1258
30
500
-1
Número de onda (cm )
Figura 7-Espectro no infravermelho (KBr) do extrato dos exsudados radiculares de Mucuna
pruriens.
No espectro IV da fração LA observam-se bandas característica em 3432 cm-1 devida
ao estiramento O-H. Bandas em 2924 e 2853 cm-1, referentes a vibrações de estiramento de
Csp2 –H e Csp3 –H, uma banda presente em 1717 cm-1 referente a estiramento C=O, banda em
16
1209 cm-1 devida a vibrações de estiramento C-O-C, e finalmente apresenta uma banda de
deformação angular de C-CO-C em 585 cm-1 (Figura 8).
70
850
586
1718
1734
2853
1209
2955
30
1067
1378
1464
40
1008
50
3432
Transmitância (%)
60
2924
20
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Número de onda (cm )
Figura 8-Espectro no infravermelho (KBr) da fração em acetato de etila do liofilizado dos
exsudados de Mucuna pruriens.
No espectro de IV (Figura 9) para a fração LM do liofilizado dos exsudados de
Mucuna pruriens verifica-se uma banda característica de estiramento O-H em 3361 cm-1.
Além disso, nota-se uma banda em 1636 cm-1, referente ao estiramento C=O, a banda em
1384 cm-1 devida ao estiramento C-O. Finalmente, uma banda em 825 cm-1 é referente à
deformação angular fora do plano de CH.
40
20
10
825
3361
1636
Transmitância (%)
30
0
4000
1384
-10
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Número de onda (cm )
Figura 9-Espectro no infravermelho
(KBr) da fração em metanol do liofilizado dos
exsudados de Mucuna pruriens var. utilis.
17
O extrato dos exsudados radiculares e as frações em acetato de etila (LA) e metanol
(LM) do resíduo liofilizado, obtido do cultivo hidropônico de Mucuna pruriens foram
submetidos a análises de HPLC-MS para caracterizar os compostos presentes neles.
Infelizmente não foi possível sua caracterização mesmo devido a esta técnica ser muito
interessante para a identificação do peso molecular ou fórmula molecular. Entretanto, ela
representa inconvenientes para estudos estruturais de elucidação, que são baseados na
fragmentação dos íons. Por outro lado, as bibliotecas espectrais utilizadas neste estudo foram
insuficientes para conseguir a identificação dos compostos presentes no extrato e nas frações
de exsudados radiculares.
4.3- Avaliação da atividade nematicida
A avaliação da atividade nematicida dos extratos e frações da parte aérea e, da raiz de
Mucuna pruriens foi realizada sobre o nematoide Meloidogyne javanica, em uma
concentração de 100 ppm. Os tratamentos testados correspondem ao extrato bruto
metanólico,e suas frações obtidas da coluna filtrante, compostos isolados, exsudados
radiculares e frações do material liofilizado obtido dos exsudados radiculares de Mucuna
pruriens. Cada tratamento foi realizado por quintuplicata. Foi utilizada água como testemunha
no caso dos extratos das frações e compostos puros de folhas e caule, também foi testada a
solução hidropônica utilizada para a obtenção dos exsudados radiculares, esta solução não
teve diferencia com a testemunha, fato pelo qual esta solução foi utilizada como testemunha
para a análise dos dados correspondentes aos exsudados e as frações em acetado de etila e
metanol obtidas do material liofilizado. Os dados estão na tabela abaixo:
Tabela3: Porcentagem de mortalidade para o extrato metanólico, frações e compostos puros
de caule e folhas de Mucuna pruriens.
Tratamento
Extrato metanólico
Fração em acetato de etila
Fração em metanol
Fração em H2O
Glutinol
Exudados
Mortalidade(%)
47,76
17,13
20,24
69,85
31,61
64,55
Desvio padrão
2,89
5,73
3,25
2,08
2,89
2,89
18
No caso dos exsudados radiculares a porcentagem de mortalidade foi de 64,55% o que
não apresenta um efeito significativo do tratamento sobre os juvenis de segundo estádio de
Meloidogyne javanica. Aliás, a fração em acetato de etila (LA) obtida do liofilizado dos
exsudados radiculares de Mucuna pruriens causou uma porcentagem de inibição de 92,20%
em relação ao controle sobre este gênero de nematoides. Não foi possível isolar nenhum dos
compostos presentes nesta fração pois , encontramos dificuldades em encontrar fase móveis
para separar os constituintes da fração que, se apresentavam muito retidos na sílica.
No entanto as substâncias como triterpenos, esteróis e flavonoides glicosilados podem
ter efeito desfavorável para nematoides podem estar presentes nesta fração, o que poderia ser
uma explicação para a alta porcentagem de mortalidade exibida.
Estes resultados favoráveis no controle de Meloidogyne javanica são importantes e a
caracterização dos compostos presentes nos extratos obtidos desta planta deve ser continuada
com vistas à obtenção de compostos nematicidas a partir de produtos naturais sem efeitos
secundários desfavoráveis para os seres humanos e o meio ambiente.
5-Conclusão
Foi obtido extrato dos exsudados radiculares de Mucuna pruriens por meio de cultivo
hidropônico, assim como frações em acetato de etila e metanol do material liofilizado
proveniente da hidroponia. Tanto o extrato como as frações foram avaliadas contra o
nematoide das galhas Meloidogyne javanica. Como já mencionado anteriormente, não foi
possível isolar nenhum dos compostos presentes na fração de exudados radiculares pois ,
encontramos dificuldades em encontrar fase móveis para separar os constituintes da fração
que, se apresentavam muito retidos na sílica.
Foi obtido o extrato metanólico de folhas de Mucuna pruriens, utilizando a técnica de
extração por maceração e, desse extrato obteve-se um composto isolado (Glutinol) que não
tinha sido descrito na literatura para essa espécie. O Glutinol apresentou uma porcentagem de
mortalidade na atividade nematicida de 31,61%.
Podemos concluir, que o ensaio biológico de atividade nematicida para o extrato
metanólico, da fração de acetato de etila, do Glutinol (composto isolado) e também o extrato
de exsudados radiculares de Mucuna pruriens. sobre Meloidogyne javanica apresentaram
porcentagens de controle de nematoides maior a 70%, confirmando o fato da mucuna ser uma
19
planta utilizada como adubo verde que ausilia na diminuição e controle biológico de
nematoides.
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