Dissertação em PDF

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE, UNICENTRO-PR
EXTRATO AQUOSO DE SHIITAKE NA INDUÇÃO
DE RESISTÊNCIA E CONTROLE DE DOENÇAS
DE FEIJOEIRO E VIDEIRA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ANNA CLAUDIA OLIVEIRA
GUARAPUAVA-PR
2015
ANNA CLAUDIA OLIVEIRA
EXTRATO AQUOSO DE SHIITAKE NA INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA E
CONTROLE DE DOENÇAS DE FEIJOEIRO E VIDEIRA
Dissertação apresentada à Universidade
Estadual do Centro-Oeste, como parte
das exigências do Programa de PósGraduação em Agronomia, área de
concentração em Produção Vegetal, para
a obtenção do título de Mestre.
Profa. Dra. Cacilda Márcia Duarte Rios Faria
Orientadora
Profa. Dra. Patrícia Carla Giloni de Lima
Co-Orientadora
GUARAPUAVA-PR
2015
Catalogação na Publicação
Biblioteca Central da Unicentro, Campus Cedeteg
O48e
Oliveira, Anna Claudia
Extrato aquoso de shiitake na indução de resistência e controle de
doenças de feijoeiro e videira / Anna Claudia Oliveira. – – Guarapuava,
2015
xi, 66 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual do Centro-Oeste,
Programa de Pós-Graduação em Agronomia, área de concentração em
Produção Vegetal, 2015
Orientadora: Cacilda Márcia Duarte Rios Faria
Co-orientadora: Patrícia Carla Giloni de Lima
Banca examinadora: Kátia Regina Freitas Schwan Estrada, Aline José
Maia
Bibliografia
1. Agronomia. 2. Produção vegetal. 3. Phaseolus vulgaris. 4. Vitis
vinifera. 5. Manejo alternativo. I. Título. II. Programa de Pós-Graduação em
Agronomia.
CDD 633.372
À Deus, meus pais e minha filha,
Dedico.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus, por conceder todas as graças pedidas.
Aos meus pais, Rita e Moacir, primeiramente por todo amor dedicado durante
todos os anos de minha vida, segundo, por me darem todo o apoio necessário durante
toda a minha jornada na vida acadêmica.
À minha filha, minha princesinha, Mariana, por aguentar dois anos de quase
minha ausência total em sua vida, e por me ajudar sempre que necessário em “molhar as
plantinhas”.
À professora Dra. Cacilda, a qual sempre que solicitada nunca negou apoio, que
passou de além de orientadora e agiu sempre como uma “mãe”. À professora Dra.
Patrícia, por ter-me “adotado” deste a graduação como sua orientada, e me apoiar e
auxiliar em toda a jornada da pós-graduação.
Aos professores Juliano e Renato pelo empréstimo dos laboratórios e de
equipamentos por diversas vezes.
À amiguinha Aline Maia, a qual me ensinou os primeiros passos na pósgraduação, e sempre ajudou em tudo que era necessário.
Às minhas amigas Rildânia e Ires, pelos ensinamentos, auxílio e pela amizade
incondicional.
Às colegas de laboratório Carla Leite, Tainara e Beatriz, pela ajuda durante todo
o trabalho, e aos demais colegas, que ajudaram sempre que solicitados.
À CAPES pela concessão de bolsa.
Enfim, a todos que participaram da minha jornada durante o mestrado, meu
muito obrigado.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS E TABELAS ................................................................................. i
RESUMO ........................................................................................................................ iii
ABSTRACT .................................................................................................................... iv
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
2. OBJETIVOS ................................................................................................................. 2
2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 2
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................... 2
3. REFERENCIAL TEÓRICO ......................................................................................... 3
3.1. CULTURA DO FEIJOEIRO ..................................................................................... 3
3.1.1. CULTIVAR IPR TUIUIU ...................................................................................... 3
3.2. DOENÇAS DO FEIJOEIRO ..................................................................................... 3
3.2.1. ANTRACNOSE - Glomerella cingulata f. sp. phaseoli (Colletotrichum
lindemuthianum (Sacc. & Magn.) Br. & Cav.) Br. & Cav.) ............................................. 4
3.3. CULTURA DA VIDEIRA ........................................................................................ 5
3.3.1. CULTIVAR BENITAKA ...................................................................................... 6
3.4. DOENÇAS DA VIDEIRA ........................................................................................ 6
3.4.1. ANTRACNOSE - Elsinoe ampelina (de Bary) Schear .......................................... 6
3.4.2. MÍLDIO - Plasmopara viticola (Berkeley e M. A. Curtis) Berlese e De Toni ..... 7
3.5. CONTROLE ALTERNATIVO DE DOENÇAS DE PLANTAS ............................. 8
3.5.1. INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA ............................................................................. 8
3.5.1.1. FITOALEXINAS ................................................................................................ 9
3.5.1.2. ENZIMAS RELACIONADAS À DEFESA DA PLANTA .............................. 10
3.5.1.2.1. PEROXIDASES (POX) (POX, EC 1.11.1.7) ................................................. 10
3.5.1.2.2. CATALASE (CAT) (CAT, EC 1.11.60) ........................................................ 10
3.5.1.2.3. POLIFENOLOXIDASE (PPO) (PPO, EC 1.10.3.1) ...................................... 10
3.6. FOTOSSÍNTESE .................................................................................................... 11
3.6.1. FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA ............................................................... 11
3.7. USO DE BASIDIOMICETOS NO CONTROLE DE DOENÇAS DE PLANTAS 12
3.7.1. SHIITAKE (Lentinula edodes)............................................................................. 12
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 13
CAPÍTULO I. EXTRATO AQUOSO DE SHIITAKE NA INDUÇÃO DE
FITOALEXINAS E ATIVIDADE DE PEROXIDASES EM FEIJÃO, SORGO E
SOJA................................................................................................................................23
RESUMO ....................................................................................................................... 23
ABSTRACT ................................................................................................................... 24
1.
INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 25
2.
MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 26
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 28
4.
CONCLUSÕES ....................................................................................................... 31
5.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 31
CAPÍTULO II. EXTRATO AQUOSO DE SHIITAKE NO CONTROLE E NA
INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA A PATÓGENOS DO FEIJOEIRO ............................. 34
RESUMO ....................................................................................................................... 34
ABSTRACT ................................................................................................................... 35
1.
INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 36
2.
MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 37
3.
RESULTADOS E DISCUSSÕES .......................................................................... 40
4.
CONCLUSÕES ....................................................................................................... 45
5.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 45
CAPÍTULO III. EXTRATO AQUOSO DE SHIITAKE NA INDUÇÃO DE
RESISTÊNCIA E NO CONTROLE DE PATÓGENOS DE VIDEIRAS CV.
BENITAKA .................................................................................................................... 50
RESUMO ....................................................................................................................... 50
ABSTRACT ................................................................................................................... 51
1.
INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 52
2.
MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 53
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 56
4.
CONCLUSÕES ....................................................................................................... 62
5.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 63
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Indução de faseolinas em hipocótilos de feijão pelo tratamento com extrato aquoso
de Lentinula edodes e acibenzolar-S-metil (ASM); Médias seguidas pela mesma letra não
diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade. ........................... 28
Figura 2. Indução de desoxiantocianidinas em mesocótilos de sorgo pelo tratamento com
extrato aquoso de Lentinula edodes e acibenzolar-S-metil (ASM); Médias seguidas pela
mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade. 29
Figura 3. Indução de gliseolinas em cotilédones de soja pelo tratamento com extrato aquoso
de Lentinula edodes e acibenzolar-S-metil (ASM); Médias seguidas pela mesma letra não
diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade. ........................... 29
Figura 4. Atividade específica de peroxidases de guaiacol (POX) em cotilédones de soja pelo
tratamento com extrato aquoso de Lentinula edodes e acibenzolar-S-metil (ASM); Médias
seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de
probabilidade. ........................................................................................................................... 30
Figura 5. Atividade específica de peroxidase (POX), catalase (CAT) e polifenoloxidase (PPO)
em plantas de feijoeiro tratadas com EA de Lentinula edodes nas concentrações de 0, 1, 5, 10
e 20%, acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida Piraclostrobina; (**) indica diferença
estatística significativa pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade. HAA:
horas antes da aplicação e HDA: horas depois da aplicação dos tratamentos. ......................... 42
Figura 6. (A) Crescimento micelial e (B) esporulação de Elsinoe ampelina pelo tratamento
com EA de Lentinula edodes e fungicida Mancozeb. Médias seguidas pela mesma letra não
diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. .......................................... 56
Figura 7. Germinação de esporos de Elsinoe ampelina 24 horas após o tratamento com EA de
Lentinula edodes e fungicida Mancozeb. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre
si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. ................................................................. 57
Figura 8. Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) do míldio em discos de
folha de videira tratadas com EA de L. edodes, acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida
Mancozeb. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a
5% de probabilidade. ................................................................................................................ 58
Figura 9. Esporulação (106 esporos mL-1) do míldio em discos de folha de videira tratadas
com EA de Lentinula edodes, acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida Mancozeb. Médias
seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de
probabilidade. ........................................................................................................................... 59
i
Figura 10. Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) do míldio estacas de
videira tratadas com EA de Lentinula edodes. Médias seguidas pela mesma letra não diferem
entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. ........................................................ 60
Figura 11. (A) Fluorescência basal (F‟0) e (B) máxima (F‟m); (C) Fluorescência variável (F‟v);
(D) Eficiência máxima do PSII (F‟v/F‟m); (E) Rendimento quântico fotoquímico do PSII (Y
(II)); (F) Taxa relativa de transferência de elétrons (ETR) de folhas de videira cv. Benitaka
adaptadas ao claro; 24 horas depois da aplicação (HDA) dos tratamentos e 24 horas depois da
inoculação (HDI) do patógeno Plasmopara viticola. ............................................................... 61
Tabela 1. Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) da antracnose em feijoeiro
sob condições de campo, tratados com EA de Lentinula edodes, acibenzolar-S-metil (ASM) e
fungicida Piraclostrobina ............................................................................................40
Tabela 2. Número de sementes/ vagem de feijoeiro tratado com extrato aquoso de L. edodes,
acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre
si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade ............................................44
ii
RESUMO
OLIVEIRA, Anna Claudia. Extrato aquoso de shiitake na indução de resistência e
controle de doenças de feijoeiro e videira. 2015. 66p. Dissertação (Mestrado em
Agronomia). UNICENTRO/PR.
A indução de resistência ativa mecanismos de defesa das plantas, promovendo alterações
morfológicas ou fisiológicas, após a aplicação de elicitores. Dentre os elicitores, tem se
destacado o uso de extratos de cogumelos. Este trabalho teve como objetivo verificar o
potencial do extrato aquoso (EA) de Lentinula edodes na indução de resistência e avaliar se o
mesmo pode controlar doenças de feijoeiro e videira. Os tratamentos para indução de
fitoalexinas e atividade de peroxidases em hipocótilos de feijão, mesocótilos de sorgo e
cotilédones de soja foram a aplicação de 0, 1, 5, 10 e 20% do EA e acibenzolar-S-metil
(ASM) como tratamento padrão. Para o experimento em campo com feijoeiro, além destes
tratamentos utilizou-se o fungicida Piraclostrobina como padrão. Para o experimento com
videira, o fungicida padrão utilizado foi o Mancozeb. No experimento em campo com o
feijoeiro foram avaliados: severidade de antracnose, mancha angular e crestamento
bacteriano, atividade das enzimas peroxidase (POX), catalase (CAT) e polifenoloxidase
(PPO) e componentes de produção. Na cultura da videira foram realizados testes in vitro com
o fungo Elsinoe ampelina, em discos de folha foram avaliados a severidade e esporulação de
Plasmopora viticola, nas estacas foram avaliados a severidade de míldio e a fluorescência da
clorofila a. O EA nas maiores concentrações (10 e 20%) possui atividade indutora de
fitoalexinas e para a ativação de peroxidases, o extrato incrementa a atividade desta enzima
até uma concentração de 10%. O EA na concentração de 20% não reduziu a severidade da
antracnose em feijoeiro, no entanto, aumentou os níveis de atividade das enzimas POX, CAT
e PPO, as quais compensaram o estresse causado pelo ataque do fitopatógeno, aumentando a
produtividade do feijoeiro. Em videira, o EA não apresentou efeito antimicrobiano direto no
crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos de Elsinoe ampelina, nem sobre
Plasmopora viticola em discos de folha. Nas estacas, a concentração de 5% reduziu a
AACPD, além de aumentar o F‟v/F‟m e o YII. O EA de L. edodes possui potencial no controle
do míldio em estacas de videira.
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, Vitis vinifera, manejo alternativo
iii
ABSTRACT
OLIVEIRA, Anna Claudia. Aqueous extract of shiitake in induction of resistance and
disease control of bean and vine. 2015. 66p. Dissertation (Master of Science in Agronomy).
UNICENTRO/PR.
The induction of resistance active plant defense mechanisms promoting morphological or
physiological changes, after the application of elicitors. Among the elicitors, it has
highlighted the use of mushroom extracts. This study verified the potential of the aqueous
extract (AE) of Lentinula edodes in induction of resistance, and evaluate whether it can
control bean and vine diseases. The treatments for induction of phytoalexins, and peroxidase
activity in bean hypocotyl, sorghum mesocotyls and soybean cotyledons application were 0,
1, 5, 10 and 20% AE and acibenzolar-S-methyl (ASM) control. For the field experiment with
beans, besides these treatments we used the fungicide Pyraclostrobin as standardcontrol. For
the experiment with vine, the control was the Mancozeb fungicide used. In the field
experiment with bean were assessed: severity of anthracnose, angular leaf spot and bacterial
blight, activity of peroxidase (POX), catalase (CAT) and polyphenoloxidase (PPO) and
production components. In vine were carried out in vitro tests with the fungus Elsinoe
ampelina, in leaf discs were evaluated the severity and sporulation of Plasmopara viticola, the
stakes were assessed the severity of mildew and chlorophyll a fluorescence. The AE in higher
concentrations (10 and 20%) have phytoalexin-inducing activity and peroxidases activation,
the extract increases the activity of this enzyme to a concentration of 10%. AE in the
concentration of 20% did not reduce the severity of anthracnose in beans, however, increased
levels of activity of enzymes POX, CAT and PPO, which offset the stress caused by the
pathogen attack, increasing the productivity of bean. In vine, AE showed no direct
antimicrobial effect on mycelial growth, sporulation and germination Elsinoe ampelina spores
or on Plasmopara viticola in leaf discs. The stakes, the concentration of 5% reduced the
AUDPC, in addition to increasing the F‟v / F‟m and YII. The AE L. edodes has potential in
controlling mildew in grapevine cuttings.
Keywords: Phaseolus vulgaris, Vitis vinifera, alternative management
iv
1. INTRODUÇÃO
Diversos inconvenientes têm sido gerados pelo uso da agricultura convencional: o
êxodo rural, o esgotamento dos recursos naturais e, principalmente, a poluição ambiental
(COSTA, 2010). Outro fator que a agricultura convencional vem afetando, é no controle de
fitopatógenos, pois com o uso indiscriminado de agrotóxicos tem-se observado uma maior
suscetibilidade das plantas a doenças.
Como a medida mais utilizada no controle de doenças é baseada em aplicação de
defensivos químicos, a curto prazo este método pode trazer benefícios, no entanto, a longo
prazo, seus resíduos podem contaminar os solos e lençóis freáticos, e ainda provocar a
resistência dos patógenos ao seu princípio ativo. A preocupação da sociedade com o impacto
das práticas agrícolas no ambiente vem alterando o cenário agrícola, resultando na presença
de segmentos de mercado que visam à aquisição de produtos diferenciados. Além disso, a
agricultura orgânica também vem crescendo, necessitando, portanto, de produtos alternativos
ao uso de agroquímicos. Como método alternativo para controle de doenças tem-se utilizado a
indução de resistência (MORANDI e BETTIOL, 2009).
A resistência induzida consiste em aumentar o nível de resistência das plantas através
do uso de agentes externos, chamados de elicitores ou eliciadores, sem causar qualquer
alteração em seus genomas (BONALDO et al., 2005). Como resposta de defesa podem
ocorrer alterações morfológicas, como a formação de papilas, ou alterações fisiológicas, como
a produção de fitoalexinas, de proteínas relacionadas à patogênese ou de espécies reativas de
oxigênio (EROs) (STANGARLIN et al., 2011). Dentre os elicitores, o uso de agentes de
origem biótica tem se destacado, como extratos de plantas medicinais ou cogumelos.
Trabalhos com extratos de basidiomicetos têm indicado que estes possuem grande
potencial no controle de doenças, tanto por terem ação direta, diminuindo o crescimento
micelial, a esporulação ou a germinação de esporos, quanto por terem ação indireta,
aumentando os níveis de resistência da planta. Extrato aquoso de Lentinula edodes não
apresenta efeito inibitório sobre o crescimento da bactéria Ralstonia solanacearum, no
entanto, atua como indutor de resistência, alterando os níveis enzimáticos de plantas de
berinjela e tomateiro, controlando a murcha bacteriana (SILVA et al., 2008; SILVA et al.,
2007). Este extrato também pode ser eficiente no controle de doenças fúngicas, como no oídio
da soja (ARRUDA et al., 2012) e doenças foliares do sorgo (PICCININ et al., 2010).
1
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Verificar o potencial do extrato aquoso de Lentinula edodes na indução de resistência,
e avaliar se o mesmo pode controlar doenças de feijoeiro e videira.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar a atividade in vitro dos extratos no crescimento micelial, esporulação e germinação
de esporos de Elsinoe ampelina, patógeno causador da antracnose em videira;
- Verificar a ação in vivo do extrato no controle de doenças foliares (antracnose, crestamento
bacteriano e mancha angular) em feijoeiro em campo e míldio em estacas de videira;
- Verificar a ação in vivo do extrato na indução de resistência, através da indução de
fitoalexinas, atividade de enzimas de defesa (peroxidases, catalase e polifenoloxidase);
- Verificar a ação in vivo do extrato na fluorescência da clorofila a após sua aplicação e após
inoculação do fitopatógeno Plasmopara viticola em estacas de videira.
2
3. REFERENCIAL TEÓRICO
3.1. CULTURA DO FEIJOEIRO
O feijoeiro comum é uma planta anual, pertencente à família Leguminosae, subfamília
Papipilionoideae, gênero Phaseolus, espécie P. vulgaris L. Possui sistema radicular composto
por raiz principal, raízes basais, raízes adventícias e raízes laterais. Seu caule herbáceo é
classificado morfologicamente como haste. Possui dois tipos de folhas, as simples e também
chamadas de primárias, e as compostas ou trifoliadas com forma oval ou triangular. O fruto é
legume ou vagem (SANTOS e GAVILANES, 2006; RUBIO e LYNCH, 2007).
Esta leguminosa é cultivada por pequenos e grandes produtores em todas as regiões
brasileiras, tendo como principal produtora a agricultura familiar. É a principal fonte de
proteína vegetal da dieta humana, conferindo a esta cultura grande importância econômica e
social (AIDAR, 2003; YOKOYAMA, 2003; SIOLVA e WANDER, 2013). A produção de
feijão no Brasil em 2013 foi de 2.946.358 ton, em uma área de 2.872.358 ha. O Estado do
Paraná é o maior produtor nacional, com participação de 25,7% desta produção (IBGE, 2013).
3.1.1. CULTIVAR IPR TUIUIU
Cultivar do grupo preto, registrada para cultivo a partir de abril de 2010 e indicada
para cultivo para os estados do PR e SP e em fase de extensão de registro para os estados do
RS, SC e GO. Apresenta hábito de crescimento indeterminado tipo II e porte ereto
favorecendo a colheita mecânica direta. Apresenta-se como resistente a murcha de Fusarium e
ao mosaico comum e moderadamente resistente a ferrugem, mancha angular e oídio,
moderadamente suscetível à murcha de Curtobacterium e suscetível a antracnose e
crestamento bacteriano comum. Apresenta tolerância intermediaria a altas temperaturas e à
seca ocorridas durante a fase reprodutiva e tolerância a baixa disponibilidade de fósforo e
acidez do solo. O ciclo médio da emergência a colheita é de 88 dias e o potencial de
rendimento é em torno de 3.950kg/ha. As sementes apresentam tempo médio de cozimento de
17 minutos, teor médio de proteína de 24%, teor médio de Fe de 7mg/100g e teor médio de
Zn de 4mg/100g. O peso médio de mil sementes é de 227g (IAPAR, 2010).
3.2. DOENÇAS DO FEIJOEIRO
O maior comprometimento na produtividade no feijoeiro está na alta suscetibilidade à
patógenos. A cultura pode ser afetada por mais de 300 doenças causadas por vírus, bactérias e
3
fungos (VIECELLI et al., 2010). Nos Estados da região Sul do Brasil, a antracnose
(Colletotrichum lindemuthianum), a mancha-angular (Pseudocercospora griseola) e o
crestamento bacteriano comum (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) foram classificadas
por Thung e Sartorato (2002) como as doenças de maior importância nesta cultura.
3.2.1. ANTRACNOSE - Glomerella cingulata f. sp. phaseoli (Colletotrichum
lindemuthianum (Sacc. & Magn.) Br. & Cav.) Br. & Cav.)
A antracnose do feijoeiro é causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum,
pertencente à subdivisão Deuteromycotina. A fase perfeita corresponde ao ascomiceto
Glomerella cingulata f. sp. phaseoli (BIANCHINI et al., 2005).
O micélio é ramificado, septado e sua coloração varia de hialina a quase negra. Os
conídios são hialinos, unicelulares, oblongos a cilíndricos, apresentando as extremidades
redondas ou uma delas pontiaguda. Normalmente, apresentam na parte central uma área clara
semelhante a um vacúolo. A massa de esporos formada nos acérvulos possui coloração rósea.
Os conidióforos são hialinos, eretos e sem ramificações. Os acérvulos possuem setas,
encontradas no hospedeiro, que são produzidas entre os conidióforos ou nas margens dos
acérvulos, são pontiagudas, rígidas, septadas e de coloração castanha (RAVA e
SARTORATO, 1994; BIANCHINI et al., 2005). Os conídios que chegam a atingir a área
foliar podem germinar entre seis e nove horas em condições de ambiente favorável para o
desenvolvimento da doença, formando de um a quatro tubos germinativos e apressório. O
fungo se prende à superfície do hospedeiro pela sua camada gelatinosa. A penetração ocorre
de forma direta pela pressão exercida pelo apressório do fungo na região da epiderme e
cutícula. Hifas infectivas crescem entre a parede celular e o protoplasto durante um período de
dois a quatro dias. Após vários dias, as células da parede são degradadas pela ação de enzimas
específicas, levando ao surgimento de lesões (DALLA PRIA e SILVA, 2010).
A esporulação e a infecção do hospedeiro são favorecidas por temperaturas entre 13 e
27°C, com ótimo em 17°C. Para incubação e subsequente germinação de conídios é
necessária umidade relativa superior a 92% ou água livre. Temperaturas superiores a 30°C e
inferiores a 6°C são limitantes tanto para a infecção 11 quanto para o desenvolvimento do
fungo
e
consequentemente
desenvolvimento
da
SARTORATO, 1994; DALLA PRIA e SILVA, 2010).
4
doença
(HALL,
1994;
RAVA;
Os sintomas da antracnose ocorrem em toda a parte aérea da planta. As lesões
formadas no hipocótilo podem atingir tamanho considerável, iniciando-se por uma mancha
diminuta que evolui gradualmente no caule, no sentido longitudinal. Finalmente, as lesões
tornam-se deprimidas e de coloração marrom escura (ABREU, 2005).
A utilização de cultivares resistentes mostra-se a forma mais prática e menos onerosa
de controle para os produtores, entretanto, a imensa variabilidade patogênica do fungo torna
por muitas vezes quase que obrigatória a utilização de produtos químicos para o controle
efetivo da doença (RAVA, 2002; BIANCHINI et al., 2005).
3.3. CULTURA DA VIDEIRA
A videira é uma planta perene, lenhosa, caducifólia e sarmentosa, com órgão de
sustentação chamado gavinha. Possui sistema radicial amplamente ramificado, caule ereto,
folhas com a presença de pelos na parte abaxial, flores completas ou hermafroditas, frutos tipo
baga. Pertencente a família Vitaceae e ao gênero Vitis, que possui duas espécies de maior
interesse comercial, V. vinifera e V. labrusca (KISHINO, 2007).
A viticultura é um importante segmento da fruticultura e está presente em diversos
estados do Brasil. Em 2013 foram produzidas 1.465.734 toneladas em 80.600 ha (IBGE,
2013). Seus frutos são utilizados tanto para a fabricação de vinhos, quanto para o
processamento e consumo in natura. Há grande variabilidade genética do material utilizado,
com mais de 120 cultivares de V. vinifera e mais de 40 cultivares de híbridas americanas
(CAMARGO et al., 2011). Uvas europeias (V. vinifera) são utilizadas para a fabricação de
vinhos finos, enquanto as de origem americana (V. labrusca) produzem vinhos comuns
(GARRIDO et al., 2004).
A prática da viticultura subtropical caracteriza-se em locais de invernos amenos e
curtos, sujeita a geadas, ocorrendo um ciclo tradicional, e sob o uso de sistemas de manejo
especiais, ocorrem dois ciclos vegetativos (CAMARGO et al., 2011). No Paraná tem se
destacado a produção de uvas finas caracterizada por duas safras anuais na região Norte
(SATO et al. 2011). O cultivo de uvas americanas está presente em menor escala, as quais são
destinadas principalmente ao processamento (KISHINO e ROBERTO, 2007).
5
3.3.1. CULTIVAR BENITAKA
A cultivar Benitaka é uma mutação da Itália, destacando-se pelo intenso
desenvolvimento da coloração rosada escura, mesmo quando ainda imatura, em qualquer
época do ano. Os cachos são grandes, com peso médio de aproximadamente 400g e bagas
grandes (8 a 12 g) (LEÃO, 2010). Esta variedade necessita cerca de 2.370 graus-dias de
temperatura para completar seu ciclo (NAGATA et al., 2000).
3.4. DOENÇAS DA VIDEIRA
A incidência de doenças sobre a cultura pode reduzir a qualidade e a produtividade dos
frutos, aumentando os custos da produção. Em sua maioria, são causadas por fungos que
afetam a parte aérea das plantas, provocando doenças como a antracnose e o míldio
(AMORIM e KUNIYUKI, 2005). No Paraná, as condições de temperatura e umidade do ar
durante o ciclo de produção da videira, aumentam a suscetibilidade às doenças fúngicas
(RICCE et al., 2013).
3.4.1. ANTRACNOSE - Elsinoe ampelina (de Bary) Schear
Também conhecida como olho de passarinho, varola ou varíola, é causada pelo fungo
Elsinoe ampelina (de Bary) Schear, com forma sexuada de Sphaceloma ampelinum de Bary
(=Gloeosporium ampelophagum (Pass) Sacc.). Originou-se na Europa, enquanto no Brasil a
doença surgiu após introdução de cultivares americanas procedentes do Hemisfério Norte. Os
conídios de S. ampelinum são unicelulares, medindo 3-6 x 2-8 µm, hialinos, oblongos ou
ovóides, curtos e cilíndricos, formados sobre conidióforos emersos numa base estromática
dentro de acérvulos (SOUZA e PINHEIRO, 1996; AMORIM e KUNIYUKI, 2005).
A antracnose pode causar graves perdas nas safras em áreas com chuva frequente,
principalmente porque o E. ampelina pode infectar todas as partes aéreas da videira,
induzindo numerosas lesões nas folhas, brotos, pecíolos, ramos e bagas, causando desfolha
prematura e a queda das bagas (CARISSE e MORISSETTE-THOMAS, 2013).
Nas folhas, formam-se, inicialmente, manchas circulares castanho-escuras e
levemente deprimidas que, posteriormente, necrosam. Essas lesões são, normalmente, muito
numerosas e podem se unir, tomando grande parte da folha, ou permanecer isoladas. O tecido
morto pode desprender-se da lesão, originando um pequeno furo. No pecíolo e nas nervuras
da folha essas lesões são mais alongadas, sendo mais facilmente perceptíveis na face inferior.
6
Caso ocorram nas nervuras, provocam o desenvolvimento desuniforme dos tecidos foliares,
causando a deformação da folha. Nos brotos, ramos e gavinhas, aparecem lesões necróticas
pardo-escuras que vão se alargando, aprofundando-se no centro e transformando-se em
cancros, de coloração cinzenta no centro e bordos negros levemente salientes. Nos ramos
maduros, os cancros tornam-se profundos, semelhantes a danos causados por granizo,
podendo provocar rachaduras ou quebra dos mesmos. Nas bagas, a doença manifesta-se como
manchas arredondadas, necróticas e isoladas. O tecido atacado torna-se mumificado
adquirindo coloração cinza-escura no centro e pardo- avermelhada nos bordos (GARRIDO e
SÔNEGO, 2003; NAVES et al., 2006).
O fungo sobrevive de um ano para o outro nas lesões dos sarmentos e gavinhas, bem
como sobre os restos culturais no solo. Ao final do ciclo da cultura, pode haver formação de
escleródios, que são estruturas de resistência, nos bordos das lesões que, no início da
primavera, em condições de alta umidade, dão origem aos conídios. Pela ação dos respingos
da água de orvalho ou da chuva e do vento, os conídios são disseminados para as partes
verdes da planta em desenvolvimento, iniciando novas infecções. Nas lesões primárias
resultantes, produz-se inóculo secundário responsável por lesões em outras partes da planta,
como as gavinhas, pecíolos, folhas, pedúnculos e bagas. Em regiões tropicais, onde a videira
não entra em dormência e as podas são escalonadas, pode haver constantemente no vinhedo
plantas com tecido suscetível, permitindo a produção do inóculo em todas as estações do ano
(NAVES et al., 2006).
O método de controle mais utilizado é o químico. Devem ser feitas pulverizações a
cada 7 ou 14 dias, dependendo das condições climáticas, com fungicidas, desde o período de
brotação até o início da colheita (estádio fenológico 5), com produtos à base de clorotalonil,
clorotalonil + tiofanato metílico, difenoconazole, tiofanato metílico, folpet, mancozeb,
dithianon ou ziram (NOGUEIRA, 2002).
3.4.2. MÍLDIO - Plasmopara viticola (Berkeley e M. A. Curtis) Berlese e De Toni
O fungo Plasmopara viticola, agente causal do míldio, é considerado um dos mais
importantes patógenos da videira. Também é conhecido como mufa ou mofo, e teve origem
nos Estados Unidos, em 1834. É uma doença de difícil controle e de vasta ocorrência nos
vinhedos brasileiros, podendo reduzir em até 75% a produção de uva (AMORIM e
KUNIYUKI, 2005; MATASCI et al., 2008).
7
Os sintomas de míldio apresentam-se muito severos como os da antracnose, por
surgirem em todas as partes verdes da planta. Na parte superior da folha aparecem manchas
verde-claras e aspecto oleoso e na face inferior pode-se observar as frutificações do patógeno.
Estas lesões evoluem para necrose e em condições de alta severidade a doença causa desfolha
prematura da planta. Nas inflorescências, pode causar deformação, na floração a doença causa
escurecimento e destruição das flores, sintoma muito semelhante ao causado pela antracnose.
A infecção nos ramos, quando ocorre, normalmente realiza-se nos estádios iniciais de
crescimento, ou nas extremidades, antes de ocorrerem crescimento secundário (SÔNEGO e
GARRIDO, 2003; AMORIM e KUNIYUKI, 2005; GUBLER et al., 2013).
A temperatura ideal para o desenvolvimento do patógeno situa-se entre 20 a 25 ºC, e a
umidade ótima acima de 95 %, sendo necessária a presença de água livre por um período
mínimo de 2 horas para haver novas infecções. O principal meio de sobrevivência do
patógeno no inverno em regiões de clima temperado dá-se por uma estrutura de resistência
denominada de oósporos, persistindo estes no solo e em folhas mortas. Quando o solo atinge
uma temperatura de 18 ºC e alta umidade, os esporângios são produzidos, os quais contem os
zoósporos que são responsáveis por infectar o órgão vegetativo (SÔNEGO e GARRIDO,
2003; GOBBIN et al., 2005; GUBLER et al., 2013).
A pulverização com fungicidas e a utilização de cultivares resistentes, quando
disponíveis, são alguns dos métodos usualmente recomendados para o manejo do míldio. O
método de controle adotado com maior frequência pelos produtores é a pulverização com
fungicidas de contato e sistêmicos, que requerem diversas aplicações durante o ciclo de
crescimento e produção da videira (MADDEN et al., 2000; AMORIM e KUNIYUKI, 2005;
SÔNEGO e GARRIDO, 2005).
3.5. CONTROLE ALTERNATIVO DE DOENÇAS DE PLANTAS
3.5.1. INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA
A indução de resistência em plantas envolve a ativação de mecanismos de defesa em
resposta ao tratamento com agentes elicitores, os quais são moléculas capazes de proteger
contra infecções subsequentes por patógenos. Entre os elicitores estão agentes de origem
biótica ou abiótica (STANGARLIN e PASCHOLATI, 1994; STANGARLIN et al., 1999;
BARROS et al., 2010; STANGARLIN et al., 2011).
8
Vários eventos de sinalização acontecem após elicitação, incluindo a fosforilação de
proteínas reversíveis, mudanças nas atividades de proteínas da membrana plasmática,
variações nas concentrações de cálcio no citosol e no núcleo, produção de óxido nítrico e de
espécies reativas de oxigénio. Estes eventos ocorrerem dentro dos primeiros minutos ou até
algumas horas após a percepção do elicitor. A via específica de transdução elicitora pode
utilizar uma combinação ou várias combinações parciais de tais eventos que podem diferir em
cinética e dependem da intensidade do estímulo. As ligações entre os eventos de sinalização
permitem a amplificação da transdução do sinal e asseguraram a especificidade para obteremse reações de defesa da planta (GARCIA-BRUGGER et al., 2006).
Entre os mecanismos de defesa da planta em resposta à elicitação, podem ocorrer
alterações fisiológicas, como uma rápida explosão oxidativa levando a formação de espécies
reativas de oxigênio (RESENDE et al., 2003), produção de substâncias antimicrobianas
(fitoalexinas) ou a ativação/produção de enzimas relacionadas à defesa da planta. Além disso,
a exposição do tecido vegetal à substâncias elicitoras podem alterar outros aspectos
fisiológicos das plantas, como na fotossíntese.
3.5.1.1. FITOALEXINAS
Fitoalexinas são metabólitos secundários de natureza química diversa, principalmente
flavonóides, com baixo peso molecular e sintetizados em plantas após a infecção microbiana.
A síntese pode ser desencadeada por diversos fatores, como a ação de indutores, tanto
produzidos exógenamente por patógenos, produtos químicos, danos mecânicos, como
produzidos endógenamente pelas plantas em resposta a determinadas situações de estresse. A
indução da síntese e acumulação de fitoalexinas não apenas provêm da planta hospedeira, mas
também do patógeno (fungos, bactérias e vírus) (GARCÍA-MATEOS e PÉREZ-LEAL,
2003).
De forma geral, o modo de ação das fitoalexinas inclui granulação citoplasmática,
desorganização dos conteúdos celulares, ruptura da membrana plasmática e inibição de
enzimas fúngicas. Esses efeitos refletem-se na inibição da germinação e elongação do tubo
germinativo e redução ou inibição do crescimento micelial (LO et al., 1996).
Existe uma grande variedade de fitoalexinas descobertas que são produzidas pelas
plantas cultivadas. No feijão, a fitoalexina mais importante na interação patógeno-planta é a
faseolina, que foi primeiramente detectada por Müller (1958) e, desde então, estudos vem
9
comprovando sua ação antifúngica contra Collethotrichum lindemuthianum (DURANGO et
al., 2002). Na soja, a gliceolina é a principal fitoalexina acumulada nos tecidos vegetais após
exposição a um elicitor (BURDEN e BARLEY, 1975; SMITH, 1996). No sorgo, são
produzidos compostos fenólicos, derivados de antocianidinas (desoxiantocianidinas),
luteolinidinas, apigeninidinas e metoxiluteolinidinas (NICHOLSON et al., 1987; LO et al.,
1996).
3.5.1.2. ENZIMAS RELACIONADAS À DEFESA DA PLANTA
3.5.1.2.1. PEROXIDASES (POX) (POX, EC 1.11.1.7)
Peroxidases são enzimas da classe III, e estão envolvidas em uma ampla variedade de
processos fisiológicos de todo o ciclo de vida da planta, devido ao elevado número de
isoformas enzimáticas (isoenzimas) e a versatilidade de as suas reações catalizadas por estas.
São enzimas que participam na lignificação, suberização e no metabolismo da parede celular,
por isso são classificadas como proteínas relacionadas à patogênese (PR-proteínas)
pertencentes a família PR-9. As macromoléculas polimerizadas pelas POXs são depositadas
na superfície extracelular, fortalecendo a parede celular, restringindo assim a invasão por
patógenos e a expansão celular, contribuindo ao enrijecimento do corpo da planta (VAN
LOON e VAN STREIN, 1999; HIRAGA et al., 2001; ALMAGRO et al., 2009).
3.5.1.2.2. CATALASE (CAT) (CAT, EC 1.11.60)
A catalase foi a primeira enzima antioxidante a ser descoberta e caracterizada. Como
catalase degrada peróxido sem qualquer poder redutor, esta enzima fornece as plantas uma
forma eficiente de energia para remover H2O2. No entanto, a catalase só está ativa durante
concentrações relativamente elevadas de H2O2. Menores níveis são eliminados pelas
peroxidases (GECHEV et al., 2006; MHAMDI et al., 2010). A organela de maior produção de
peróxido são os peroxissomos, portanto local de maior acúmulo de catalase. A presença de
atividade de catalase no citosol, cloroplastos e mitocôndrias é menos frequente (SHARMA et
al., 2012).
3.5.1.2.3. POLIFENOLOXIDASE (PPO) (PPO, EC 1.10.3.1)
As polifenoloxidases catalisam a oxidação de um ou dois elétrons de fenóis em
quinonas. São metaloproteínas de cobre que catalisam a hidroxilação de um monofenol,
10
seguida pela sua oxidação para diquinona (atividade da cresolase), ou a oxidação de um odihidroxifenol para diquinona (atividade da catecolase). Os produtos de reação quinonóide
formadas pela PPO são familiares para qualquer pessoa que tenha homogeneizado tecidos
vegetais. As quinonas geradas por ela são moléculas altamente reativas, eletrofílicas que
modificam de forma covalente e reticulam uma variedade de componentes celulares,
incluindo proteínas nucleófilas, tais como sulfidrilo, amina, amida e substituintes indole e
imidazole. A formação de quinonas (geralmente de cor marrom ou preta) representa o efeito
prejudicial primária da enzima no processamento de alimentos e fisiologia pós-colheita de
produtos vegetais, e é a principal razão para a importância desta para a indústria alimentícia.
Por outro lado, o potencial de quinonas para modificar covalentemente e reduzir o valor de
proteínas vegetais também tem gerado interesse em estratégias baseadas em PPO para
aumentar a resistência de plantas (STEFFENS et al. 1994).
3.6. FOTOSSÍNTESE
Diferentes componentes do processo fotossintético são afetados quando as plantas são
submetidas a estresses. A fluorescência, emitida pelo fotossistema II, pode ser utilizada como
parâmetro de avaliação dos danos causados por algum estresse.
3.6.1. FLUORESCÊNCIA DA CLOROFILA
A energia absorvida pelas plantas é distribuída ao longo de três processos
concorrentes: fotossíntese, dissipação térmica e emissão de fluorescência da clorofila
(BUSCHMANN, 1999). Fluorescência da clorofila é uma medição não invasiva do
fotossistema II (PSII) e é uma técnica utilizada em fisiologia vegetal para avaliar a
sensibilidade na atividade deste fotossistema a fatores bióticos e abióticos, e também como
um indicador mais amplo de como as plantas respondem a mudanças ambientais (MURCHIE
e LAWSON, 2013). Interações compatíveis com agentes patogênicos reduzem o rendimento
quântico do PSII, isto porque a indução de defesa das plantas contra fitopatógenos necessita
de custo elevado de energia para ativar as respostas de defesa, pois aumenta a demanda de
fotoassimilados para a geração destes mecanismos, aumentando assim o metabolismo
respiratório (BERGER et al., 2007). Plantas apresentando maior resistência a doenças
apresentam menor fluorescência da clorofila quando comparadas com plantas sensíveis.
11
3.7. USO DE BASIDIOMICETOS NO CONTROLE DE DOENÇAS DE PLANTAS
Os basidiomicetos possuem grande capacidade de produção de metabólitos
secundários, os quais podem exercer diversas atividades biológicas, como antioxidante,
antimicrobiana, antifúngica, antiviral ou como reguladores de crescimento vegetal.
(BRIZUELA et al., 1998; BARROS et al., 2007; FERREIRA et al., 2007; OYETAYO, 2009).
Uma das características dos extratos provenientes de cogumelos é sua capacidade de atuar na
constituição fisiológica do mecanismo de defesa do hospedeiro, melhorando sua resistência à
doenças (KITZBERGER, 2005).
A utilização de extratos de basidiomicetos no controle de doenças de plantas, por ação
tanto direta quanto através da indução de resistência, vem sendo comprovada. Domingues et
al. (2011) comprovaram que o extrato do basidiomiceto Oudemansiella canarii proporcionou
os menores valores de crescimento micelial de Alternaria solani, Colletotrichum acutatum e
Sclerotium rolfsii, além inibir totalmente a germinação de conídios de A. solani e C. acutatum
e de escleródios de S. rolfsii. Extratos de Pycnoporus sanguineus indicaram potencial na
indução de ERO's em feijoeiro no início da infecção por Colletotrichum lindemuthianum e
aumentaram a atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase e os teores de proteínas e
clorofilas quando inoculado o fungo Pseudocercospora griseola (VIECELLI et al., 2009;
BALDO et al., 2011). No trabalho de Coqueiro et al. (2011), o tratamento com extrato de
Agaricus blazei associado à fécula de mandioca (3%) apresentou uma redução significativa da
área necrosada por Colletotrichum gloeosporioides em frutos de maracujá-azedo.
3.7.1. SHIITAKE (Lentinula edodes)
A classificação taxonômica atualmente empregada para o cogumelo Lentinula edodes
(Berk.) Pegler é (NAPPI e MORETTO, 1998):
Reino: Fungi
Divisão: Mycota
Classe: Basiodiomycetes
Subclasse: Holobasiodiomycetidae
Ordem: Agaricales
Família: Tricholomataceae
Gênero: Lentinula
Espécie: Lentinula edodes.
12
É um dos 11 mais conhecidos e mais bem caracterizados cogumelos usados com
propósitos medicinais (OOI, 2000). Apresenta em sua composição 85-95% de água, 10-17%
de proteínas (matéria seca), 25-40% de aminoácidos totais, mas com quantidades restritas de
metionina, cistina, valina e isoleucinas (CRISAN e SANDS, 1978), 83% de carboidratos
(matéria seca) dos quais 13% são fibras (BREENE, 1990). Mattila et al. (2001) determinou o
conteúdo de ácidos fenólicos em shiitake, encontrando as seguintes quantidades: 160, 760,
139 e <50 μg/100g em peso seco de tr-cinâmico, p-hidroxibenzóico, protocatequinico e
caféico, respectivamente. O principal componente do extrato aquoso deste cogumelo pode ser
a lentionina, que é um composto sulfatado, detectado tanto no basidiocarpo como na biomassa
micelial produzida em cultura submersa e apresenta forte atividade antibacteriana e
antifúngica (HATVANI, 2001; ISHIKAWA et al., 2001; DI PIERO, 2003).
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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22
CultivodoFeijoeiro/index.
CAPÍTULO I. EXTRATO AQUOSO DE SHIITAKE NA INDUÇÃO DE
FITOALEXINAS E ATIVIDADE DE PEROXIDASES EM FEIJÃO, SORGO E SOJA
RESUMO
A indução de resistência em plantas pode ser verificada através da produção de fitoalexinas e
atividade de peroxidases nas células vegetais, podendo ser uma alternativa no controle de
fitopatógenos. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo verificar o efeito de
diferentes doses do extrato aquoso (EA) do cogumelo Lentinula edodes na síntese de
fitoalexinas e atividade de peroxidases em hipocótilos de feijão, mesocótilos de sorgo e
cotilédones de soja. O pó seco do basidiocarpo foi hidratado na proporção de 1 g para 14 mL
de água destilada, durante 24 h a 4°C. Os tratamentos foram 0, 5, 10 ou 20% do EA e
acibenzolar-S-metil (ASM) como tratamento padrão. Mensurou-se a produção de fitoalexinas
e atividade de peroxidases por espectrofotometria de absorbância. A produção de fitoalexinas
faseolinas em feijão, desoxiantocianidinas em sorgo e gliceolinas em soja tiveram um
aumento significativo, sendo a concentração que mais induziu a de 20%. Para a atividade de
peroxidases, apenas em cotilédones de soja ocorreu diferença estatística, com a dose de 10
diferindo da testemunha. O EA de L. edodes nas maiores doses pode ser uma alternativa no
controle de fitopatógenos através da indução de fitoalexinas e ativação de peroxidases.
Palavras-chave: indução de resistência, Lentinula edodes, extrato de cogumelo
23
AQUEOUS EXTRACT OF SHIITAKE IN PHYTOALEXINS INDUCTION AND
PEROXIDASE ACTIVITY IN BEANS, SORGHUM AND SOYBEAN
ABSTRACT
Induction of resistance in plants can be verified through the production of phytoalexins and
peroxidase activity in plant cells, may be an alternative for the control of plant pathogens.
This study verified the effect of different doses of the aqueous extract (AE) of the mushroom
Lentinula edodes in phytoalexin synthesis and peroxidase activity in bean hypocotyls,
mesocotyls sorghum and soybean cotyledons. The dried powder of the basidiocarp was
hydrated in ratio of 1 g in 14 ml distilled water for 24 h at 4 ° C. The treatments were 0, 5, 10
or 20% AE and acibenzolar-S-methyl (ASM) as control. It was measured the production of
phytoalexins and peroxidase activity by spectrophotometric absorbance. The production of
phytoalexins phaseolin in bean, desoxyanthocyanidins in sorghum and gliceollins in soybean
have increased significantly with the concentration that induced more than 20%. For
peroxidase activity statistical difference was found only in soybean cotyledons with the dose
of 10 differed from the control. The AE of L. edodes in larger doses can be an alternative for
the control of plant pathogens by phytoalexin induction and peroxidase activation.
Keywords: Induced resistance, Lentinula edodes, mushroom extract
24
1. INTRODUÇÃO
A indução de resistência em plantas sobre fitopatógenos caracteriza-se como um
processo ativado após o contato de um elicitor com o tecido vegetal, promovendo respostas de
defesa. Tais mecanismos são induzidos após exposição da planta aos agentes de indução, estes
podendo ser de origem biótica ou abiótica (BARROS et al., 2010; STANGARLIN et al.,
2011). Dentre as respostas celulares desencadeadas estão a produção de fitoalexinas e a
ativação de peroxidases.
As fitoalexinas são compostos antimicrobianos de baixo peso molecular, os quais são
caracterizados como mecanismos de defesa bioquímicos pós-formados, produzidos em
resposta a infecção ou estresse (JEANDET et al., 2013). As peroxidases são PR-proteínas,
presentes nos tecidos das plantas, as quais podem ser ativadas através dos elicitores. Sua
função na proteção contra patógenos está relacionada com a participação nos processos de
lignificação e suberização da parede celular (ALMAGRO et al., 2009).
Extratos de cogumelos têm sido utilizados no controle de doenças de plantas através
da resistência induzida. Trabalhos com tais extratos tem verificado o potencial destes na
ativação dos mecanismos de defesa vegetal. Peiter-Beninca et al. (2008) trabalhando com
extratos do basidiocarpo de Pycnoporus sanguineus verificaram suas ações elicitoras na
indução de fitoalexinas e ativação de peroxidases em sorgo e soja. Arruda et al. (2012)
observaram um acúmulo de fitoalexinas em cotilédones de soja com a aplicação de extratos
aquosos de Agaricus blazei, Lentinula edodes e P. sanguineus.
Outros trabalhos também tem verificado o controle de doenças em plantas através da
indução de resistência por extratos de basidiomicetos. Silva et al. (2007) observaram que a
atividade das peroxidases foi aumentada com a aplicação de extrato aquoso de L. edodes em
tomateiro, reduzindo a murcha bacteriana. Plantas de berinjela também obtiveram a atividade
das peroxidases aumentada após aplicação de extrato de A. blazei, reduzindo a ocorrência de
folhas murchas por Ralstonia solanacearum (SILVA et al., 2008).
O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito do extrato
aquoso do basidiocarpo de Lentinula edodes na indução de fitoalexinas e ativação de
peroxidases em feijão, sorgo e soja.
25
2. MATERIAL E MÉTODOS
Para obtenção dos extratos, o pó do basidiocarpo seco do cogumelo Lentinula edodes
foi hidratado na concentração de 1 g 14 mL-1 de água destilada e armazenado a 4 °C por 24
horas no escuro. A suspensão foi filtrada em papel filtro comum e o filtrado foi diluído nas
concentrações de 1, 5, 10 e 20 %. Para todos os experimentos os tratamentos consistiram das
quatro doses do extrato e como testemunhas, foram utilizadas água destilada e o ativador de
defesa vegetal acibenzolar-S-metil (ASM) (200mg L-1 do produto comercial).
Para o bioensaio de produção de fitoalexinas faseolinas em hipocótilos de feijão
(Phaseolus vulgaris L.), sementes da cultivar IPR Tuiuiu foram semeadas em substrato
comercial e mantidas em sala climatizada a 25 °C no escuro para estiolamento dos
hipocótilos. Após 10 dias, os hipocótilos foram lavados em água destilada, secos e cortados
em segmentos de 5 cm. Cinco hipocótilos foram colocados em placa de Petri com papel filtro
umedecido com água destilada estéril. Foi aplicada sobre cada hipocótilo uma alíquota de
75µL de cada tratamento. As placas de Petri foram mantidas a 25 ºC no escuro por 48 horas.
Após esse período, quatro hipocótilos (totalizando ±1 g) foram transferidos para tubos de
ensaio contendo 10 mL de etanol e mantidos a 4 °C por 48 horas. Em seguida, foram agitados
por uma hora para extração da fitoalexina formada. A absorbância foi determinada a 280 nm
(BAILEY e BURDEN, 1983). O total de faseolinas formadas foi expresso em absorbância
280 nm por grama de peso fresco (ABS 280 nm g-1 p.f.). Um hipocótilo foi acondicionado em
envelope de papel alumínio, congelado e posteriormente utilizado no teste de peroxidases.
Para o bioensaio de produção de fitoalexinas desoxiantocianidinas em mesocótilos de
sorgo [Sorghum bicolor (L) Moench], sementes da cultivar BRS 810 foram desinfestadas
superficialmente com hipoclorito de sódio 1% por 2 minutos, lavadas e deixadas submersas
em água destilada por 6 horas. Posteriormente, foram enroladas entre folhas de papel de
germinação umedecidas e incubadas a 29 °C por 4 dias no escuro. Após este período, as
plântulas foram mantidas por 4 horas na luz visando paralisar a elongação dos mesocótilos.
Os mesocótilos foram excisados 0,5 cm acima do nó escutelar e colocados em tubos de ensaio
(seis mesocótilos/tubo) contendo uma alíquota de 1 mL de cada tratamento. Os tubos de
ensaio foram mantidos em câmara úmida a 25 °C sob luz. Após 60 horas, os mesocótilos
foram secos e os 5 mm basais foram excisados e descartados. A porção superior (excetuandose as folhas) foi pesada, cortada em pequenos segmentos e colocada em tubos de vidro
contendo 3 mL de metanol 80% acidificado (0,1% HCl; v/v). Os mesocótilos cortados foram
26
mantidos a 4 °C no metanol por 96 horas para extração dos pigmentos e a absorbância
determinada em espectrofotômetro a 480 nm (NICHOLSON et al., 1987; NICHOLSON et al.,
1988; WULFF e PASCHOLATI, 1999). O total de desoxiantocianidinas formadas foi
expresso em absorbância 480 nm por grama de peso fresco (ABS 480 nm g-1 p.f.). As folhas
foram acondicionadas em envelope de papel alumínio, congeladas e posteriormente utilizadas
no teste de peroxidases.
Para o bioensaio de produção de fitoalexinas gliseolinas em cotilédones de soja
(Glycine max L.), sementes da cultivar ND 5680 foram semeadas em substrato comercial e
mantidas em condições ambientais. Após 10 dias, os cotilédones foram destacados das
plântulas, lavados em água destilada, secos e cortados em secção aproximada de 1 mm de
espessura e 6 mm de diâmetro a partir da superfície inferior. Cinco cotilédones foram
colocados em placa de Petri com papel filtro umedecido com água destilada estéril. Foi
aplicada sobre cada cotilédone uma alíquota de 75µL de cada tratamento. As placas de Petri
foram mantidas a 25 ºC no escuro por 20 horas, e em seguida, quatro cotilédones (totalizando
± 1 g) foram transferidos para tubos de ensaio contendo 12 mL de água destilada esterilizada
e deixados em agitação por uma hora para extração da fitoalexina formada. A absorbância foi
determinada a 285 nm (ZIEGLER e PONTZEN, 1982). O total de gliseolinas formada foi
expresso em absorbância 285 nm por grama de peso fresco (ABS 285 nm g-1 p.f.). Um
cotilédone foi acondicionado em envelope de papel alumínio, congelado e posteriormente
utilizado no teste de peroxidases.
Para o bioensaio de peroxidases de guaiacol (POX), as amostras remanescentes dos
testes de fitoalexinas (um hipocótilo de feijão, folhas do sorgo e um cotilédone de soja) foram
homogeneizadas em 2 mL de tampão fosfato 0,01M (pH 7,0) em almofariz de porcelana. O
homogeneizado foi centrifugado a 15 000 g durante 30 minutos. O sobrenadante foi
considerado como fração contendo a enzima. A atividade específica das peroxidases de
guaiacol foi determinada a 30 ºC em espectrofotômetro a 470 nm. A mistura da solução
consistiu de 2,9 mL de solução contendo 250 μL de guaiacol e 306 μL de peróxido de
hidrogênio em 100 mL de tampão fosfato 0,01 M (pH 6,0) e 100 μL de preparação enzimática
(LUSSO e PASCHOLATI, 1999). Os resultados foram expressos em variação de unidades de
absorbância min-1 mg-1 proteína (U.A. min-1 mg-1 Proteína). O teor de proteínas foi
determinado conforme método de Bradford (1976).
27
Todos os bioensaios foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado,
com quatro repetições por tratamento. A análise de variância foi realizada através do
programa estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011), a comparação das médias entre os
tratamentos foi realizada pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade e a análise
de regressão para as doses foi ajustada para uma equação de segundo grau.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O extrato aquoso desencadeou um acúmulo significativo de faseolinas em hipocótilos
de feijão (Figura 1). Houve um aumento quadrático negativo em função das doses, o qual nas
maiores concentrações observou-se uma maior produção deste composto. Nas concentrações
de 10 e 20% ocorreu um aumento de aproximadamente 25 e 14%, respectivamente, quando
comparadas à testemunha.
Figura 1. Indução de faseolinas em hipocótilos de feijão pelo tratamento com extrato aquoso de
Lentinula edodes e acibenzolar-S-metil (ASM); Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si
pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
Em mesocótilos de sorgo ocorreu diferença estatística significativa na indução de
fitoalexinas entre o extrato, testemunha e controle ASM. O extrato na concentração de 20%
proporcionou um aumento quadrático positivo de 88% quando comparado à testemunha,
embora o ASM foi superior aos tratamentos testados (Figura 2).
28
Figura 2. Indução de desoxiantocianidinas em mesocótilos de sorgo pelo tratamento com extrato
aquoso de Lentinula edodes e acibenzolar-S-metil (ASM); Médias seguidas pela mesma letra não
diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
Para a indução de fitoalexina em cotilédones de soja, ocorreu diferença estatística
significativa. O extrato aquoso diferiu da testemunha e do controle ASM, aumentando em
aproximadamente 265% e 452% a produção deste composto, respectivamente, quando
comparados com a maior concentração. Em relação às doses, houve um aumento quadrático
na indução, proporcional com o incremento destas (Figura 3).
Figura 3. Indução de gliseolinas em cotilédones de soja pelo tratamento com extrato aquoso de
Lentinula edodes e acibenzolar-S-metil (ASM); Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si
pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
Os resultados obtidos na pesquisa confirmam que a indução de fitoalexinas através da
aplicação de um elicitor depende de diversos aspectos como: concentração do elicitor,
29
duração da exposição do elicitor com o tecido vegetal, idade e tipo de cultura utilizada e
composição de nutrientes do elicitor (NAMDEO, 2007). O EA de Lentinula edodes em baixas
doses foi menos efetivo na indução de fitoalexinas, sendo que o mesmo resultado também foi
comprovado por outros pesquisadores (PICCININ et al., 2010; ARRUDA et al., 2012).
Também se observou diferença quanto ao tipo de cultura utilizada, pois quando comparadas
as testemunhas, houve um maior acúmulo, em porcentagem, de gliseolinas em cotilédones de
soja do que faseolinas em hipocótilos de feijão e desoxiantocianidinas em mesocótilos de
sorgo. Resultados similares foram observados por Peiter-Beninca et al. (2008), que
trabalhando com o extrato hexânico do basidiomiceto Pycnoporus sanguineus na dose de 750
mg L-1, verificaram ação elicitora na cultura do sorgo, no entanto não verificaram na cultura
da soja.
Na ativação de peroxidases, o extrato foi efetivo apenas em cotilédones de soja, onde o
EA de L. edodes proporcionou um incremento na atividade da enzima, com a aplicação das
doses de 1, 5 e 10% (Figura 4).
Figura 4. Atividade específica de peroxidases de guaiacol (POX) em cotilédones de soja pelo
tratamento com extrato aquoso de Lentinula edodes e acibenzolar-S-metil (ASM); Médias seguidas
pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
Para a atividade de peroxidases, os resultados apontam que a ativação da mesma
através do uso deste elicitor é efetiva até a concentração de 10%. Silva et al. (2007)
verificaram maior atividade desta enzima em folhas de tomate tratadas com 10% de extrato
aquoso de L. edodes e consequentemente observaram uma redução da severidade da murcha
bacteriana por Ralstonia solanacearum. A ativação de peroxidases possivelmente depende da
cultura utilizada, pois este mecanismo de defesa foi mais induzido em cotilédones de soja do
30
que em mesocótilos de sorgo em trabalho realizado com o cogumelo P. sanguineus (PEITERBENINCA et al., 2008).
4. CONCLUSÕES
O extrato aquoso de Lentinula edodes nas maiores concentrações (10 e 20%) possui
atividade indutora de fitoalexinas em hipocótilos de feijão, mesocótilos de sorgo e cotilédones
de soja, porém é mais efetivado em soja. Para a ativação de peroxidases, o extrato incrementa
a atividade desta enzima até uma concentração de 10%. O efeito do extrato aquoso de L.
edodes na ativação dos mecanismos de defesa, fitoalexinas e peroxidases, é dependente da
concentração e da cultura em que é aplicado.
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33
CAPÍTULO II. EXTRATO AQUOSO DE SHIITAKE NO CONTROLE E NA
INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA A PATÓGENOS DO FEIJOEIRO
RESUMO
O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) está entre as principais culturas da agricultura nacional e
pode ser afetada por diversas doenças. Com o objetivo de desenvolver métodos alternativos
ao químico, verificou-se o potencial do extrato aquoso (EA) de Lentinula edodes no controle
de doenças do feijoeiro e para indução de resistência na ativação de enzimas de defesa, como
peroxidase, catalase e polifenoloxidase, além de avaliar os componentes de produção. O
experimento em campo foi constituído pelos tratamentos com EA nas concentrações de 0, 5,
10 ou 20%, acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida Piraclostrobina como tratamentos
padrões. O EA foi efetivo no controle da antracnose nas doses de 1 e 5%. A atividade de todas
as enzimas avaliadas foi mais elevada as 12 e 24 horas depois da aplicação dos tratamentos,
destacando-se a concentração de 20%. O EA nesta mesma dose aumentou o número de
sementes por vagem e a produtividade. O extrato aquoso de Lentinula edodes na concentração
de 20% pode ser efetivo na indução de resistência, aumentando os níveis enzimáticos e
incrementando nos valores de produtividade.
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, Collethotrichum lindemuthianum, manejo alternativo
34
AQUEOUS EXTRACT OF SHIITAKE IN CONTROL AND RESISTANCE
INDUCTION TO PATHOGENS OF BEAN
ABSTRACT
The common bean (Phaseolus vulgaris L.) is one of the main crops of national agriculture and
can be affected by various diseases. With the objective of developing alternative methods to
chemical, there was the potential of the aqueous extract (AE) of Lentinula edodes in diseases
control bean and the induction of resistance in the activation of defense enzymes such as
peroxidase, catalase and polyphenoloxidase, more evaluating the production components. The
field experiment was by treatments with AE at concentrations of 0, 5, 10 or 20%, acibenzolarS-methyl (ASM) and Pyraclostrobin as the control. The AE was effective in anthracnose
control in doses of 1 and 5%. The activity of all enzymes was evaluated higher 12 and 24
hours after treatment application, highlighting the concentration of 20%. AE in the same dose
increased the number of seeds per pod and productivity. The aqueous extract from Lentinula
edodes 20% can be effective for induction of resistance, increasing enzyme levels and
increasing the productivity.
Keywords: Phaseolus vulgaris, Collethotrichum lindemuthianum , alternative management
35
1. INTRODUÇÃO
O feijoeiro (Phaseolus vulgaris) é uma leguminosa muito cultivada no Sul do Brasil,
sendo um dos grãos mais consumidos na alimentação humana diária, principalmente por seu
alto teor de proteínas e ferro. Um dos maiores problemas que comprometem a produtividade
da cultura é a susceptibilidade a doenças. Segundo Thung e Sartorato (2002), a antracnose
(Colletotrichum lindemuthianum), a mancha-angular (Pseudocercospora griseola) e o
crestamento bacteriano comum (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli) são as doenças de
maior importância da cultura.
Diversos métodos de controle podem ser utilizados no manejo destas doenças, no
entanto, o uso de agrotóxicos ainda é o mais utilizado. Esta forma de controlar doenças pode
ser muito efetiva a curto prazo, porém pode causar danos ao ambiente e/ou resistência dos
patógenos ao seu princípio ativo a longo prazo. Diante disso, surge a necessidade de um
método alternativo ao uso de agrotóxicos, sendo a indução de resistência uma forma de
controlar fitopatógenos através da aplicação de um agente elicitor, a qual desencadeia
diferentes eventos na planta a fim de aumentar a sua defesa (STANGARLIN et al., 2011).
Dentre os agentes de elicitação, tem-se destacado os extratos provenientes de
basidiomicetos, que podem aumentar os níveis de resistência da planta através de diferentes
mecanismos. Silva et al. (2007; 2008) ao estudarem a aplicação de extratos aquosos de
Lentinula edodes e Agaricus blazei sobre plantas de berinjela e tomateiro no controle de
Ralstonia solanacearum observaram um aumento na atividade de quitinase e peroxidase.
Estas enzimas são PR-proteínas capazes de induzir resistência às plantas, tendo ação direta no
patógeno ou aumentando a barreira para penetração deste. Viecelli et al. (2009; 2010) também
observaram um aumento na atividade de peroxidases e polifenoloxidase após aplicação de
extratos de Pycnoporus sanguineus em feijoeiro, diminuindo a severidade de mancha angular.
Diante do exposto, o trabalho teve como objetivos investigar o potencial do extrato
aquoso de Lentinula edodes no controle de doenças do feijoeiro e na indução de resistência
por meio da ativação das enzimas peroxidase, catalase e polifenoloxidase, além de avaliar os
componentes de produção.
36
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Local dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos no laboratório de Fitopatologia do departamento
de Agronomia e em campo, na Universidade Estadual do Centro-Oeste, campus CEDETEG,
sob as coordenadas geográficas de 25°23‟36”S e 51°27‟19”O e aproximadamente 1.120 m de
altitude, durante a safra 2014/2015. O clima é classificado como subtropical mesotérmico
úmido (Cfb), sem estação seca, com verões frescos e inverno moderado. O solo da área
experimental é um Latossolo bruno.
2.2. Preparação dos extratos e tratamentos
O basidiocarpo seco do cogumelo Lentinula edodes foi obtido comercialmente e
posteriormente moído em moinho de facas com peneira de 1 mm. O pó seco foi hidratado na
proporção de 1 g 14 mL-1 de água destilada, durante 24 h a 4 °C. Após hidratação o extrato
aquoso bruto foi filtrado em papel-filtro comum. Em seguida foi diluído em água destilada
para obterem-se as concentrações finais. Como tratamentos utilizaram-se: 1) controle
negativo: água, 2) controles positivos: acibenzolar-S-metil (ASM, 200 mg L-1 do produto
comercial) e o fungicida piraclostrobina da classe das estrobirulinas (0,3 L ha-1 do produto
comercial), e 3) as doses de 1, 5, 10 e 20% do extrato aquoso (EA) de L. edodes.
2.3. Experimento in vivo
O experimento em campo foi realizado no período de novembro/2014 a fevereiro/2015
e constituiu de três blocos casualizados, sendo que cada bloco era composto por sete parcelas,
e cada parcela dentro de um bloco representava um tratamento, totalizando sete tratamentos.
Cada parcela teve quatro linhas de 4 m de comprimento, espaçadas 0,5 m entre si. As duas
linhas centrais, descontando-se 0,5 m da bordadura anterior e posterior, foram consideradas
área útil para todas as avaliações. Foi utilizada a cultivar IPR Tuiuiu. Foram aplicados 480 kg
ha-1 de NPK (04-14-08) no sulco da semeadura e os demais tratos culturais, como capinas
manuais, foram realizados sempre que necessário.
Os tratamentos foram aplicados por aspersão em toda a planta (0,5 L parcela-1),
divididas em duas aplicações: a primeira no estádio vegetativo (V4) e a segunda no estádio
reprodutivo (R6).
37
2.3.1. Efeito do EA de L. edodes no controle do crestamento bacteriano, antracnose e mancha
angular
A severidade das doenças foi avaliada aos 54, 57, 60, 63, 68 dias após semeadura
(DAS) e aos 2, 5, 8, 11, 16 dias após a 2ª aplicação (DAA) dos tratamentos, após ocorrência
natural dos sintomas das doenças (sem inoculação artificial), através de escalas diagramáticas
elaborada por Godoy et al. (1997), Dalla Pria et al. (2003) e Lima et al. (2013), obtendo-se
cinco avaliações da porção mediana inferior das plantas. Com as avaliações de severidade da
doença, procedeu-se a construção da curva de progresso da doença e a determinação da área
abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) (CAMPBELL e MADDEN, 1990).
2.3.2. Efeito do EA de L. edodes na indução de resistência
2.3.2.1. Coleta de amostras para análises bioquímicas
As coletas foram realizadas na 2ª aplicação, 52 dias após semeadura (DAS). Discos de
folha com 12 mm de diâmetro (cinco discos parcela-1) foram coletados às 12 horas antes da
aplicação (HAA), 3, 6, 12 e 24 horas depois da aplicação (HDA). Durante o procedimento,
cada amostra coletada foi imediatamente acondicionada em envelopes de papel alumínio e
congelada com nitrogênio líquido. Foram coletadas amostras no folíolo central do trifólio
superior.
2.3.2.2. Obtenção dos extratos proteicos
As amostras de folhas foram homogeneizadas mecanicamente em 2 mL de tampão
fosfato de potássio 0,01M (pH 7,0) (tampão de extração), em almofariz de porcelana. O
homogenato foi centrifugado a 13.500 g durante 30 min a 4 ºC, sendo o sobrenadante obtido
considerado como extrato enzimático para posterior determinação da atividade de peroxidase,
catalase, polifenoloxidase e conteúdo proteico.
2.3.2.3. Atividade de peroxidases de guaiacol (POX, EC 1.11.1.7)
A atividade específica das peroxidases de guaiacol foi determinada a 30 ºC em
espectrofotômetro a 470 nm, durante 2 min. A mistura da solução consistiu de 2,9 mL de
solução contendo 250 μL de guaiacol e 306 μL de peróxido de hidrogênio (H2O2) em 100 mL
de tampão fosfato de potássio 0,01 M (pH 6,0) e 100 μL de preparação enzimática (LUSSO e
38
PASCHOLATI, 1999). A atividade específica da enzima foi expressa em unidades de
absorbância por minuto por mg de proteína (U.A. min-1 mg-1 Proteína).
2.3.2.4. Atividade de catalase (CAT, EC 1.11.60)
A atividade específica da catalase foi determinada foi determinada através da
quantificação do complexo estável formado pelo molibdato de amônio com o peróxido de
hidrogênio (TOMANKOVÁ et al., 2006). O extrato enzimático (100 μL) foi incubado em
banho-maria a 38 °C juntamente com 0,5 mL da mistura de reação contendo de peróxido de
hidrogênio em tampão fosfato de potássio 0,06 M (pH 7,4) por 2 min. Após esse período
adicionou-se 0,5 mL de molibdato de amônio para deter o consumo de peróxido de hidrogênio
pela enzima presente no extrato. Foi preparado um branco para cada amostra através da
adição de molibdato de amônio à mistura de reação, omitindo o período de incubação. O
complexo amarelo de molibdato e peróxido de hidrogênio foram medidos a 405 nm. A
diferença entre a absorbância do branco e a amostra incubada indicou a quantidade de
peróxido de hidrogênio utilizada pela enzima. A concentração de H2O2 foi determinada
utilizando-se o coeficiente de extinção є = 0,0655 mM cm-1. A atividade específica da enzima
foi expressa em umol por minuto por mg de proteína (umol min-1 mg-1 Proteína).
2.3.2.5. Atividade de polifenoloxidase (PPO, EC 1.10.3.1)
A atividade específica da polifenoloxidase foi determinada a 30 ºC em
espectrofotômetro a 420 nm, durante 2 min. A mistura da solução consistiu de 0,9 mL de
solução contendo 1,001 g de catecol em 50 mL de tampão fosfato de potássio 0,01 M (pH 6,8)
e 100 μL de preparação enzimática (DUANGMAL e APENTEN, 1999). A atividade
específica da enzima foi expressa em unidades de absorbância por minuto por mg de proteína
(U.A. min-1 mg-1 Proteína).
2.3.2.6. Teor de proteína
O teor de proteínas totais foi avaliado pelo método de Bradford (1976). A
concentração de proteínas, expressa em termos equivalentes de μg de albumina de soro
bovino (ASB) em um mL de amostra (μg proteína mL-1), foi determinada utilizando-se curva
padrão de concentrações de ASB.
39
2.4. Componentes de produção
Por ocasião da colheita, foi avaliado o rendimento de sementes, os componentes do
rendimento (número de vagens por planta, número de sementes por vagem e a massa de mil
sementes). As sementes provenientes da debulha manual de todas as vagens forneceram por
pesagem o rendimento de sementes (corrigidos para 13% de umidade e transformados em kg
ha-1). Todos os componentes de produção foram determinados na área útil da parcela.
2.5. Análise estatística
A análise de variância foi realizada através do programa estatístico SISVAR
(FERREIRA, 2011) e a comparação das médias entre os tratamentos foi realizada pelo teste
de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
3.1. Efeito do EA de L. edodes no controle da antracnose, do crestamento bacteriano e da
mancha angular em campo
Para o controle da antracnose, a diferença estatística foi significativa, sendo que as
menores doses foram estatisticamente iguais ao fungicida e ao acibenzolar-S-metil (ASM), a
concentração de 1% do EA diminuiu em 58% e a de 5% em 37% a severidade da doença
quando comparadas a testemunha (Tabela 1). Não houve diferença estatística para o controle
de crestamento bacteriano e mancha angular.
Tabela 1. Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) da antracnose em feijoeiro
sob condições de campo, tratados com EA de Lentinula edodes, acibenzolar-S-metil (ASM) e
fungicida Piraclostrobina.
Tratamento
Testemunha
1% EA
5% EA
10% EA
20% EA
ASM
Piraclostrobina
CV (%)
AACPD**
7,48b
3,17a
4,68a
10,49b
7,19b
4,68a
3,33a
42,14
** Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo
teste F; Médias seguidas pela mesma letra não diferem
entre si pelo teste de Scott-Knott
40
Resultados similares foram encontrados por Viecelli et al. (2010), que ao aplicarem
extrato aquoso do micélio de Pycnoporus sanguineus nas concentrações de 10 e 20% em
feijoeiro a campo não obtiveram controle da mancha angular na porção inferior das plantas.
Baldo (2008), ao utilizar a concentração de 5% do extrato do basidiocarpo de P. sanguineus,
observou uma redução no índice de antracnose em hipocótilos de feijão inoculados com
Collethotrichum lindemuthianum. Piccinin et al. (2010) obtiveram controle sobre os
patógenos Exserohilum turcicum e Colletotrichum sublineolum utilizando a concentração de
2% do extrato aquoso do basidiocarpo de L. edodes, reduzindo a severidade das doenças
foliares em sorgo.
3.2. Efeito do EA de L. edodes na indução de resistência
Pelos valores obtidos na determinação de peroxidases (POX), catalase (CAT) e
polifenoloxidase (PPO), os tratamentos aplicados apresentaram diferenças estatísticas
significativas. Observou-se que para o tratamento com o EA a 20% a resposta da atividade de
todas as enzimas avaliadas ultrapassou o valor máximo obtido através dos demais
tratamentos, tendo seus picos as 12 e 24 horas depois da aplicação (HDA) (Figura 6).
Para a enzima peroxidase, o valor médio alcançado pelos tratamentos ficou em torno
de 15 U.A.-1 min-1 mg Proteína, enquanto com o tratamento de 20%, as 24 HDA, houve um
aumento significativo da atividade enzimática, com valor acima de 22 U.A.-1 min-1 mg
Proteína, diferindo estatisticamente dos demais tratamentos (Figura 6.A). Na atividade de
catalase, o pico enzimático alcançado através deste tratamento, ocorreu as 12 HDA, a qual foi
estatisticamente superior, com valor de aproximadamente 105 umol-1 min-1 mg Proteína,
ultrapassando a média dos demais tratamentos (80 umol-1 min-1 mg Proteína) (Figura 6.B). A
concentração de 20% do extrato resultou num incremento na atividade da polifenoloxidase as
12 e 24 HDA, diferindo estatisticamente dos demais tratamentos, e passando os valores
médios de 0,4 U.A.-1 min-1 mg Proteína destes em aproximadamente 237% (Figura 6.C).
41
Figura 5. Atividade específica de peroxidase (POX), catalase (CAT) e polifenoloxidase (PPO) em
plantas de feijoeiro tratadas com EA de Lentinula edodes nas concentrações de 0, 1, 5, 10 e 20%,
acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida Piraclostrobina; (**) indica diferença estatística significativa
pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade. HAA: horas antes da aplicação e HDA:
horas depois da aplicação dos tratamentos.
42
Essa oscilação na atividade de enzimas após a aplicação de extratos de basidiomicetos
como elicitor é comum e encontrada em diversos trabalhos (TOILLIER et al., 2010;
VIECELLI et al., 2010; VIECELLI et al., 2009; SILVA et al., 2008; SILVA et al., 2007).
No trabalho de Toillier et al. (2010), o extrato aquoso do basidiocarpo de Pycnoporus
sanguineus nas concentrações de 5 e 10% proporcionaram um incremento na atividade de
peroxidase e polifenoloxidase em plantas de feijão após o tratamento e inoculação com a
bactéria Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Ainda em trabalho com feijoeiro, Viecelli et
al. (2010) relataram que atividade das enzimas peroxidase e polifenoloxidase foram maiores
nas plantas tratadas com extrato do micélio de P. sanguineus na concentração de 20%, quando
comparadas com os controles. Silva et al. (2008) observaram uma elevação na atividade de
peroxidases e polifenoloxidase em plantas de berinjela tratadas com extrato aquoso de
Agaricus blazei e inoculadas com a bactéria Ralstonia solanacearum. Silva et al. (2007)
trabalhando com extratos aquosos do basidiocarpo de A. blazei e Lentinula edodes nas
concentrações de 10 e 20% no controle da murcha bacteriana por R. solanacearum, obtiveram
um aumento na atividade enzimática de tomateiro após aplicação dos tratamentos sem a
inoculação do patógeno, comprovando o efeito indutor de resistência, através da elevação
enzimática, proporcionado pelos extratos.
As peroxidases são enzimas responsáveis pela remoção de átomos de hidrogênio dos
grupos álcoois hidroxicinâmicos, cujos radicais se polimerizam para formar lignina nas
paredes celulares (CAVALCANTI et al., 2005). Essa modificação estrutural pode ser
importante para as plantas, visto que pode ocorrer um aumento na resistência mecânica e
química sob condições de estresse, pois com a produção desta enzima e posterior lignificação
das paredes celulares há um aumento da rigidez das mesmas e diminuição do seu crescimento
(CAMPOS e SILVEIRA, 2003). Os flavonoides são importantes na proteção de plantas a
diversos estresses bióticos ou abióticos, principalmente pelo seu potencial citotóxico e
capacidade antioxidante. A polifenoloxidase é a principal enzima responsável pela oxidação
desses flavonoides nas células vegetais, e normalmente é induzida após algum estresse
causado a planta (POURCE et al., 2007).
Uma maior atividade de enzimas antioxidantes, como peroxidase, catalase e
polifenoloxidase, reflete uma condição de maior estresse, o que foi observado no trabalho
com a aplicação da maior concentração do extrato. Uma diminuição na atividade da catalase
ou peroxidase pode levar a um aumento na quantidade de peróxido de hidrogênio nas células,
43
o que pode provocar morte celular, caracterizada como uma resposta de hipersensibilidade
(SOARES e MACHADO, 2007). Quando o elicitor entra em contato com a célula vegetal,
ocorre um aumento no fluxo iônico, na fosforilação/desfosforilação de proteínas produção de
moléculas sinalizadoras, tais como o ácido jasmônico, ácido salicílico, etileno e de espécies
reativas de oxigênio (BERGER et al., 2007). Portanto, os altos níveis enzimáticos encontrados
após aplicação do elicitor, refletem num incremento dos mecanismos de defesa para futuras
condições de estresse que a planta possa enfrentar.
3.3. Componentes de produção
Para os componentes de produção, o extrato nas concentrações de 1, 10 e 20%
aumentou o número de sementes por vagem, sendo estatisticamente igual ao tratamento
padrão com fungicida. No entanto, para massa de mil sementes, as duas maiores doses
reduziram este valor. Para produtividade, o EA de 10 e 20% não diferiu dos dois tratamentos
padrões (Tabela 2).
Tabela 2. Número de sementes/ vagem de feijoeiro tratado com extrato aquoso de L. edodes,
acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre
si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
Tratamento
Testemunha
1% EA
5% EA
10% EA
20% EA
ASM
Piraclostrobina
CV (%)
Vagens/
Planta (n°)
10,28a
10,73a
12,86a
12,98a
12,3a
14,13a
11,53a
18,57
Sementes/
Vagem** (n°)
5,05b
5,79a
4,83b
6,36a
6,3a
5,43b
5,61a
8,65
MMS**
(g)
255,87a
233,7a
229,2a
210,17b
210,27b
233,9a
243,1a
5,28
Produtividade**
(Kg ha-1)
2030,6b
2223,7b
2023,8b
2579,9a
2475,9a
2747,7a
2413,3a
12,87
** Significativo ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F; Médias seguidas pela mesma
letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott
Há poucos estudos relacionando o uso de indutores de resistência e produtividade das
plantas. Mazaro et al. (2012) não encontraram interferência na produtividade e massa média
de frutos de morango com o uso de quitosana e ASM como indutores de resistência. Já
Junqueira et al. (2011), obtiveram uma maior produtividade de maracujazeiros aplicando
produtos alternativos indutores de resistência. Kehlenbeck e Schönbeck (1995) utilizando
Bacillus subtilis na indução de resistência de cevada em condições de campo contra Erysiphe
44
graminis f. sp. hordei, observaram uma redução de 40% na severidade da doença contra 93%
do fungicida. No entanto, com o uso do indutor obtiveram uma produtividade maior e a
qualidade dos grãos foi melhorada, com maiores teores de amido.
No presente estudo, observou-se um aumento na atividade das enzimas antioxidantes, as
quais podem atuar nas plantas como anti-estressantes. Um aumento na atividade das enzimas
de estresse oxidativo é observado através da aplicação de biorreguladores de crescimento
(ZAVALETA-MACERA et al., 2007), os quais favorecem o desenvolvimento ou evitam as
limitações na produção (ALBRECHT et al. 2012), aumentando a produtividade na cultura
aplicada.
4. CONCLUSÕES
O extrato aquoso de Lentinula edodes na concentração de 20% não reduziu a
severidade da antracnose, no entanto, aumentou os níveis de atividade das enzimas POX,
CAT e PPO, as quais compensaram o estresse causado pelo ataque do fitopatógeno,
aumentando a produtividade do feijoeiro.
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49
CAPÍTULO III. EXTRATO AQUOSO DE SHIITAKE NA INDUÇÃO DE
RESISTÊNCIA E NO CONTROLE DE PATÓGENOS DE VIDEIRAS CV.
BENITAKA
RESUMO
O míldio e a antracnose estão entre as principais doenças da videira e tem-se buscado métodos
alternativos ao uso de agrotóxicos no controle destes fitopatógenos. O presente trabalho teve
como objetivo avaliar o potencial do extrato aquoso (EA) de Lentinula edodes no controle e
na indução de resistência de videira a estes patógenos, além de avaliar o efeito do extrato na
fluorescência da clorofila a. Os experimentos foram constituídos pelos tratamentos com 0, 1,
5, 10 ou 20% do EA, acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida Mancozeb como padrões. O EA
não apresentou efeito antimicrobiano direto no crescimento micelial, esporulação e
germinação de esporos de Elsinoe ampelina, nem sobre Plasmopora viticola em discos de
folha. Nas estacas, a concentração de 5% reduziu a AACPD, além de aumentar o F‟v/F‟m e o
YII. O EA de L. edodes possui potencial no controle do míldio em estacas de videira.
Palavras-chave: Vitis vinífera, Lentinula edodes, manejo alternativo, fluorescência da
clorofila a
50
AQUEOUS EXTRACT OF SHIITAKE IN CONTROL AND RESISTANCE
INDUCTION TO PATHOGENS OF VINE CV.BENITAKA
ABSTRACT
The mildew and anthracnose are among the major diseases of the vine and have sought
alternative methods to the use of pesticides to control these pathogens. This study verified the
potential of the aqueous extract (AE) of Lentinula edodes the control and induction of
resistance to vine these pathogens and to evaluate the effect of the extract on the chlorophyll a
fluorescence. Experiments were made by the treatments with 0, 1, 5, 10 or 20% AE,
acibenzolar-S-methyl (ASM) and Mancozeb as control. AE showed no direct antimicrobial
effect on mycelial growth, sporulation and spores germination Elsinoe ampelina or on
Plasmopara viticola in leaf discs. The stakes, the concentration of 5% reduced the AUDPC,
in addition to increasing the F‟v / F‟m and YII. The AE L. edodes has potential in controlling
mildew in grapevine cuttings.
Keywords: Vitis vinifera, Lentinula edodes, alternative management, chlorophyll a
fluorescence
51
1. INTRODUÇÃO
A videira (Vitis sp.) é uma frutífera muito cultivada no Sul do Brasil. Seu fruto, a uva,
é utilizada tanto para o consumo in natura quanto para a fabricação de vinhos. Um dos
maiores problemas que comprometem a produtividade da cultura é a susceptibilidade à
doenças. Dentre estas, a antracnose e o míldio, que tem como agente etiológico os fungos
Elsinoe ampelina e Plasmopara viticola, respectivamente, afetam o cultivo desta cultura
(SÔNEGO e GARRIDO, 2005).
O método de controle destas doenças mais utilizado pelos agricultores é a aplicação de
fungicidas, que, no entanto, pode ser prejudicial ao ambiente. Como método alternativo ao
uso de defensivos químicos, tem se destacado a indução de resistência, que consiste em
aumentar os níveis de defesa da planta contra o ataque de fitopatógenos através da aplicação
de um elicitor, o qual ativa mecanismos defesa antes latentes. Como agente de elicitação temse os de origem abiótica, como o acibenzolar-S-metil, ou de origem biótica, como extratos de
plantas medicinais ou de cogumelos (BARROS et al., 2010; STANGARLIN et al., 2011).
Diversos trabalhos têm utilizado extratos de basidiomicetos para verificar o potencial
elicitor destes, em diferentes patossistemas. Silva et al. (2007) verificaram o potencial de
extratos aquosos de Lentinula edodes e Agaricus blazei contra Ralstonia solanacearum em
tomateiro. Silva et al. (2008) testaram os mesmos extratos no controle da murcha por
Ralstonia em berinjela. Viecelli et al. (2009; 2010) analisaram o potencial de diferentes
preparados do cogumelo Pycnoporus sanguineus contra o patógeno causador da mancha
angular em feijoeiro. O potencial destes três basidiomicetos no controle do oídio da soja
foram testados por Arruda et al. (2012).
Além do efeito de induzir resistência, estes extratos também podem ter ação direta
sobre os fitopatógenos, alterando a taxa de crescimento micelial, esporulação e germinação de
esporos. Pacumbaba et al. (1999) verificaram o efeito antimicrobiano do micélio de L. edodes
sobre várias bactérias fitopatogênicas. Sasaki et al. (2001) observaram um efeito antagônico
sobre os fungos Helminthosporium euphorbia, Helminthosporium sp., Fusarium solani e
Phomopsis sojae no crescimento micelial destes patógenos. Piccinin et al. (2010) através de
extratos aquosos obtidos do basidiocarpo inteiro e de suas partes individualizadas, avaliaram a
taxa de crescimento micelial de Exserohilum turcicum e Colletotrichum sublineolum.
52
O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito do extrato
aquoso do basidiocarpo de Lentinula edodes na indução de resistência, na fluorescência da
clorofila a e controle de patógenos da videira.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Local dos experimentos
Os experimentos foram conduzidos no laboratório e casa de vegetação de
Fitopatologia do departamento de Agronomia, na Universidade Estadual do Centro-Oeste,
campus CEDETEG.
2.2. Preparação do extrato e tratamentos
O basidiocarpo seco do cogumelo Lentinula edodes foi obtido comercialmente e
posteriormente moído em moinho de facas com peneira de 1 mm. O pó seco foi hidratado na
proporção de 1 g/14 mL de água destilada, durante 24 h a 4°C. Após hidratação o extrato
aquoso bruto foi filtrado em papel-filtro comum. Em seguida foi diluído em água destilada
para obterem-se as concentrações finais. Como tratamentos utilizaram-se: 1) controle negativo
água, 2) controles positivos acibenzolar-S-metil (ASM, 200 mg L-1 do produto comercial)
(somente nos experimentos in vivo) e o fungicida mancozeb (350g 100 L-1), e 3) as doses de
1, 5, 10 e 20% do extrato aquoso (EA) de L. edodes.
2.3. Experimentos in vitro
2.3.1. Teste de crescimento micelial e esporulação de Elsinoe ampelina
O isolado do fungo Elsinoe ampelina foi obtido da coleção do Laboratório de
Fitopatologia da Unicentro, provenientes de plantas doentes de videira.
Para o teste de crescimento micelial, após esterilização do meio batata-dextrose-ágar
(BDA) em autoclave, durante 15 minutos a 120ºC, sob pressão de 1,1 kgf cm-2, os tratamentos
foram adicionados ao meio fundente. Os meios de cultura foram vertidos em placas de Petri
de 90 mm, e em seguida feita a repicagem de discos de 8 mm de diâmetro, contendo a colônia
do fungo, para o centro de cada placa. As placas foram armazenadas em câmara de
crescimento (BOD) à 25 ± 1 °C e fotoperíodo de 12 horas. Mensurou-se o diâmetro da
colônia de cada fungo, com auxílio de uma régua, após a primeira colônia tomar conta da
placa.
53
Ao final do teste de crescimento micelial, foi avaliada a esporulação de cada uma das
colônias. Para isto, preparou-se uma suspensão de esporos através da adição de 10 mL de
água destilada esterilizada com Tween 20 na placa, raspando a colônia com alça de Drigalski
e filtragem em gaze, determinando-se o número de 106 esporos mL-1 com o auxílio de câmara
de Neubauer.
2.3.2. Teste de germinação de esporos de Elsinoe ampelina
A suspensão de esporos de E. ampelina foi obtida a partir colônias puras do isolado
cultivado em meio BDA com idade de 8 dias. Foram adicionados 10 mL de água destilada
com Tween 20 sobre as colônias, na placa de Petri. Posteriormente, com o auxílio de uma alça
de Drigalski, as colônias foram raspadas, obtendo-se uma suspensão de esporos. Utilizou-se
uma alíquota de 40 µL de suspensão (4 x 104 esporos mL-1), calibradas com o auxílio da
câmara de Neubauer, acrescidas de 40 µL de cada tratamento, colocadas em cavidades
individuais de placas de teste ELISA (REGENTE et al., 1997). As placas foram incubadas em
fotoperíodo de 12 horas à 25 ± 1 °. A porcentagem de germinação foi determinada 24 horas
após o início do experimento, através do emprego de 20 µL do corante azul algodão de
lactofenol para paralisar a germinação. Em seguida, foram quantificados 100 esporos
aleatórios por repetição, considerando como germinado aquele que apresentava tubo
germinativo maior ou igual ao tamanho do esporo (BONALDO et al., 2004).
2.4. Experimentos in vivo
O material propagativo foi retirado por ocasião de poda de videiras cv. Benitaka, de
vinhedo comercial localizado em Maringá/PR.. As estacas lenhosas, contendo de 2 a 3 gemas,
foram transferidas para vasos de plástico medindo 45x17x17 cm contendo substrato para
mudas florestais a base de casca de pinus Mecplant®, e mantidas em casa de vegetação.
2.4.1. Efeito do EA de L. edodes no controle e esporulação do míldio em discos de folha
Discos de folhas sadias com 18 mm de diâmetro foram tratados, acondicionados em
caixas do tipo gerbox com espuma umedecida e armazenados em sala aclimatizada a 25 ±1°C,
com fotoperíodo de 12h. Transcorridas 24 h, inoculou-se uma suspensão de 104 esporos mL-1
de Plasmopara viticola sobre os discos de folha, seguida da re-incubação na sala
aclimatizada. Após aparecimento dos primeiros sintomas, diariamente avaliou-se a severidade
54
do míldio de acordo com a escala diagramática proposta por Azevedo (1997). Com as
avaliações de severidade da doença, procedeu-se a construção da curva de progresso da
doença e a determinação da área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD)
(CAMPBELL e MADDEN, 1990).
Após término das avaliações de severidade, os discos de folha foram lavados em água
destilada com Tween 20, e raspados com auxílio de alça de Dringalski, para contagem de
esporos, determinando-se o número de esporos (104 esporos mL-1) com o auxílio de câmara
de Neubauer.
2.4.2. Efeito do EA de L. edodes no controle do míldio em estacas
Após a brotação das primeiras folhas, as videiras foram tratadas com pulverizador
manual até o ponto de escorrimento. Foram realizadas 4 pulverizações (quinzenais). A
inoculação de P. viticola (104 esporos mL-1) foi realizada na 4ª pulverização, 24 h após o
tratamento. A severidade da doença foi avaliada logo após aparecimento dos primeiros
sintomas, e as avaliações foram realizadas a cada 3 dias, em 6 folhas por planta, através de
escala diagramática elaborada por Azevedo (1997), obtendo-se seis avaliações. Com as
avaliações de severidade da doença, procedeu-se a construção da curva de progresso da
doença e a determinação da área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD)
(CAMPBELL e MADDEN, 1990).
2.5. Efeito do EA de L. edodes na fluorescência da clorofila a
Foram medidos alguns parâmetros da fluorescência da clorofila a em estacas de
plantas de videira adaptadas ao claro (F‟o - fluorescência basal; F‟m - fluorescência máxima;
F‟v - fluorescência variável, que é a diferença entre a fluorescência máxima e basal; F‟v/F‟m –
eficiência máxima do PSII; Y(II) - rendimento quântico fotoquímico do PSII; e ETR - Taxa
de relativa de transferência de elétrons) com um fluorômetro modulado modelo PAM-2500
(Walz, Effeltrich, Alemanha) e computador acoplado ao console. As avaliações foram
realizadas na 4ª aplicação dos tratamentos, as 24 horas depois da aplicação e 24 horas depois
da inoculação do fitopatógeno Plasmopara viticola, na quinta folha jovem e completamente
expandida.
55
2.6. Análise estatística
Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado. A
análise de variância foi realizada através do programa estatístico SISVAR (FERREIRA,
2011), a comparação das médias entre os tratamentos foi realizada pelo teste de Scott-Knott
ao nível de 5% de probabilidade e a análise de regressão, quando significativa, foi ajustada
para uma equação de 1° ou 2° grau.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Teste de crescimento micelial e esporulação de Elsinoe ampelina
O extrato não apresentou efeito inibitório no crescimento micelial do fungo,
apresentando mesmo diâmetro das colônias que a testemunha e apenas diferindo
estatisticamente do tratamento com fungicida (figura 6A). No entanto, observou-se um
estímulo na esporulação com a adição do extrato ao meio BDA (figura 6B), sendo que todas
as concentrações diferiram estatisticamente do controle negativo e do controle positivo.
Figura 6. (A) Crescimento micelial e (B) esporulação de Elsinoe ampelina pelo tratamento com EA
de Lentinula edodes e fungicida Mancozeb. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si
pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Fiori-Tutida et al. (2007) não encontraram atividade antimicrobiana direta do extrato
de L. edodes sobre os fitopatógenos Bipolaris sorokiniana e Puccinia recondita f. sp. tritici.
Os extratos aquosos do basidiocarpo de Agaricus blazei e L. edodes não exerceram efeito
inibitório no desenvolvimento de Ralstonia solanacearum (SILVA et al., 2007; SILVA et al.,
2008). Apesar do extrato do basidiocarpo não apresentar efeito fungitóxico sobre o
crescimento micelial de Elsinoe ampelina, Pacumbaba et al. (1999) verificaram efeito
antimicrobiano do micélio deste cogumelo sobre várias bactérias fitopatogênicas. Sasaki et al.
(2001) observaram um efeito antagônico sobre os fungos Helminthosporium euphorbia,
56
Helminthosporium sp., Fusarium solani e Phomopsis sojae quando extrato do micélio de L.
edodes foi incorporado em meio BDA na proporção de 10, 20 e 30%. Piccinin et al. (2010)
através de extratos aquosos obtidos do basidiocarpo inteiro e de suas partes individualizadas,
píleo e estipe, reduziram a taxa de crescimento micelial de Exserohilum turcicum e
Colletotrichum sublineolum. Extratos com outros cogumelos também foram testados na
atividade in vitro sobre fungos fitopatogênicos. O filtrado de Pycnoporus sanguineus não
apresentou efeito inibitório sobre Pseudocercospora griseola, no entanto, extratos de micélio
deste cogumelo reduziram o crescimento micelial deste fungo (VIECELLI et al., 2009;
VIECELLI et al., 2010). Portanto, a lentinana, que é um composto sulfatado com atividade
antimicrobiana direta (DI PIERO, 2003), provavelmente está presente em maior quantidade
no micélio de Lentinula edodes e não no corpo de frutificação. A maioria das substâncias
produzidas pelos fungos é processada nos corpos de frutificação ou micélio cultivado em
meio nutritivo, mas as suas composições químicas podem variar de acordo com o local onde
os cogumelos são produzidos, bem como da espécie produzida (STERNER et al., 1982).
3.2. Teste de germinação de esporos de Elsinoe ampelina
Para a germinação de esporos de Elsinoe ampelina houve um efeito linear em função
das doses, sendo que estas estimularam a germinação, com todas as concentrações diferindo
do fungicida padrão, e as doses de 5, 10 e 20% diferindo também da testemunha. Na
concentração de 20% todos os esporos encontravam-se germinados 24 horas após aplicação
do tratamento (Figura 7).
Figura 7. Germinação de esporos de Elsinoe ampelina 24 horas após o tratamento com EA de
Lentinula edodes e fungicida Mancozeb. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo
teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
57
Resultados similares foram obtidos por Di Piero (2003) também que verificou um
estímulo na germinação in vitro de Colletotrichum lagenarium com aplicação de extratos de
basidiocarpo de L. edodes e Agaricus blazei. Camili et al. (2009) observaram que os extratos
brutos de A. blazei e L. edodes estimularam a germinação de conídios de Botrytis cineria,
agente causador do mofo cinzento em uvas. Garcia (2014) ao estudar o efeito da suspensão
miceliada de Agaricus. brasiliensis, observou um efeito inibitório desta na germinação de
esporos de Plasmopara viticola. Fiori-Tutida et al.(2007) não encontraram nenhum efeito do
extrato aquoso bruto de A. blazei e L. edodes sobre a germinação de esporos de Bipolaris
sorokiniana, no entanto, os extratos inibiram a germinação de esporos de Puccinia recondita
f. sp. tritici.
Com estes resultados, sugere-se que o estímulo tanto na esporulação quanto na
germinação de esporos de Elsinoe ampelina deve-se ao fato de o basidiocarpo do cogumelo L.
edodes ser rico em substâncias nutritivas, as quais podem estimular o desenvolvimento do
patógeno, e as substâncias com efeito antimicrobiano direto devem estar presentes em maior
quantidade no micélio dos cogumelos. Stangarlin et al. (2011) ressaltam ainda que os
cogumelos possuem compostos fenólicos que podem ter ação antimicrobiana direta, porém
esse efeito inibitório pode variar de acordo com a espécie.
3.3. Efeito do EA de L. edodes no controle e esporulação do míldio em discos de folha
No teste de controle de míldio do em discos de folhas diferentes doses do EA não
reduziram a AACPD (Figura 8) e a esporulação de Plasmopara viticola (Figura 9).
Figura 8. Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) do míldio em discos de folha de
videira tratadas com EA de L. edodes, acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida Mancozeb. Médias
seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
58
Figura 9. Esporulação (106 esporos mL-1) do míldio em discos de folha de videira tratadas com EA de
Lentinula edodes, acibenzolar-S-metil (ASM) e fungicida Mancozeb. Médias seguidas pela mesma
letra não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Garcia (2014) não obteve controle sobre o míldio de videiras em casa de vegetação
com uma única aplicação da suspensão miceliada de Agaricus brasiliensis. Este fato confirma
que o extrato aquoso do cogumelo L. edodes também não apresenta efeito inibitório direto
sobre o fitopatógeno causador do míldio Plasmopara viticola, e o efeito protetor como indutor
de resistência depende da concentração do cogumelo e do intervalo de tempo entre a
aplicação dos tratamentos, para que ocorra a indução, para posterior inoculação do patógeno
(VIECELLI et al., 2010).
3.4. Efeito do EA de L. edodes no controle do míldio em estacas
Para o controle de míldio em estacas, ocorreu um efeito quadrático positivo em função
das doses, onde as concentrações de 1, 5 e 10% diferiram estatisticamente da testemunha, e
ficaram iguais aos controles ASM e fungicida (Figura 10), a dose de 1% diminuiu em 58% e a
de 5% em 52% a severidade da doença quando comparadas a testemunha.
59
Figura 10. Área abaixo da curva do progresso da doença (AACPD) do míldio estacas de videira
tratadas com EA de Lentinula edodes. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo
teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Como foram realizadas três aplicações preventivas antes da inoculação do patógeno,
sendo que a primeira foi feita logo após o brotamento das primeiras folhas, os tratamentos
foram eficazes no efeito protetor como indutor de resistência em plantas de videira,
comprovando que para serem efetivos, os indutores dependem da concentração do cogumelo e
do intervalo de tempo das aplicações (VIECELLE et al., 2010).
Di Piero et al. (2010) relataram que o extrato aquoso do basidiocarpo de L. edodes
controlou a severidade do vírus Cowpea aphid-borne mosaic virus em maracujazeiro, quando
aplicado 5 dias antes da inoculação. Piccinin et al. (2010) observaram que o extrato de L.
edodes reduziram parcialmente a severidade de doenças foliares em sorgo causadas por
Exserohilum turcicum e Colletotrichum sublineolum, quando pulverizadas 48 horas antes da
inoculação das plantas. Em plantas de soja cultivadas em casa de vegetação, o extrato aquoso
do cogumelo shiitake foi eficiente no controle de oídio (ARRUDA et al., 2012).
3.5. Efeito do EA de L. edodes na fluorescência da clorofila a
Houve diferença significativa às 24 horas depois da aplicação para os parâmetros
fluorescência variável (F‟v), eficiência máxima do PSII (F‟v/F‟m) e rendimento quântico
fotoquímico efetivo do PSII (Y(II)) (Figuras 11B, 11C e 11E) e às 24 horas depois da
inoculação apenas para o parâmetro taxa relativa de transferência de elétrons (ETR) (Figura
11F).
60
Figura 11. (A) Fluorescência basal (F‟0) e (B) máxima (F‟m); (C) Fluorescência variável (F‟v); (D)
Eficiência máxima do PSII (F‟v/F‟m); (E) Rendimento quântico fotoquímico do PSII (Y (II)); (F) Taxa
relativa de transferência de elétrons (ETR) de folhas de videira cv. Benitaka adaptadas ao claro; 24
horas depois da aplicação (HDA) dos tratamentos e 24 horas depois da inoculação (HDI) do patógeno
Plasmopara viticola.
Após a aplicação do EA nas concentrações de 5, 10 e 20%, os parâmetros
fluorescência variável (F‟v), eficiência máxima do PSII (F‟v/F‟m) e rendimento quântico
fotoquímico do PSII (Y (II)) foram estatisticamente superiores à testemunha e aos controles
positivos. Após a inoculação do fitopatógeno, ocorreu uma redução na taxa relativa de
transferência de elétrons apenas nas doses de 10 e 20% e na testemunha. Esse aumento na
taxa relativa de transporte de elétrons pode ter ocorrido para compensar as dificuldades com
as condições fisiológicas do PSII, pois as plantas que receberam esses tratamentos
61
apresentaram os maiores valores de AACPD. Em geral, as plantas quando estão submetidas a
algum tipo de estresse, biótico ou abiótico, diminuem a sua eficiência fotossintética, e
consequentemente aumentam a absorção de energia luminosa (CHAERLE et al., 2007). Com
esse aumento nos níveis de radiação sobre os fotossistemas, há também um incremento na
taxa de transporte de elétrons destes, para compensar os altos níveis de energia.
Foi observado que os parâmetros eficiência máxima do PSII e rendimento quântico
fotoquímico do PSII foram reduzidos após a inoculação do patógeno. Este fato pode ser
explicado, visto que o Plasmopara viticola é um agente biotrófico, e sua penetração e
esporulação ocorrem via estomatal (ALLÈGRE et al., 2006). Com isso, há uma redução na
absorção do CO2 e consequentemente uma queda na atividade fotoquímica. Cséfalvay et al.
(2009) relataram mudanças significativas no Fv/Fm e Y(II) de videiras inoculadas com o
patógeno Plasmopora viticola. Esses parâmetros foram quantificados antes do aparecimento
dos sintomas, e já apresentavam-se reduzidos. Imagens de fluorescência da clorofila em
folhas de tabaco durante interação incompatível com Phytophthora nicotianae revelaram que
ocorreu uma diminuição na fotossíntese (SCHARTE et al., 2005), propondo-se que plantas
diminuem os processos fotossintéticos para iniciar a respiração e outros processos necessárias
à sua defesa. Swarbrick et al., 2006 estudando interações entre cevada e Blumeria graminis,
causador do oídio, também observaram que as taxas fotossintéticas diminuíram na presença
do patógeno.
Outro parâmetro observado, é que as plantas de videira deveriam já estar passando por
algum outro tipo de estresse, visto que a relação Fv/Fm pode variar numa faixa de 0,75 a 0,85
em plantas em condições ambientais ótimas. A diminuição da relação Fv/Fm é um excelente
indicador de efeito fotoinibitório quando as plantas estão submetidas a qualquer tipo de
estresse e pode representar tanto uma regulação fotoprotetora reversível ou uma inativação
irreversível do PSII (ARAUJO e DEMINICIS, 2009). Zulini et al. (2010) observaram uma
redução na variável Fv/Fm em gemas de videiras sob estresse de congelamento. Os autores
também obtiveram valores baixos (média de 0,2) após a aplicação do estresse, quando
comparado com plantas sob condições normais que ficaram com valores em torno de 0,7.
4. CONCLUSÕES
O extrato aquoso de Lentinula edodes não apresenta efeito antimicrobiano direto sob os
fungos fitopatogênicos Elsinoe ampelina e Plasmopora viticola. No entanto, o EA foi efetivo
62
no controle do míldio na concentração de 5%, reduzindo a AACPD, e também aumentou os
parâmetros Fv/Fm e o YII da fluorescência da clorofila a.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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